Protocol
1. Preparación de las larvas
- Para analizar una larva deseada para la locomoción o la posición de preferencia, crecer larvas bajo condiciones estándar para la edad deseada para ensayar el uso de alimentos 10 mosca estándar 11.
- Haga un filtro de malla por el estiramiento de nylon de grado serigrafía malla sobre un embudo. Asegure la malla en el cuello de embudo con la goma. Colocar el embudo en un vaso de precipitados.
- Para recoger las larvas para el análisis, scoop una espátula llena de alimentos que contienen larvas alimentándose de la botella de cultivo y lavar con agua del grifo RT sobre el filtro de malla, la recogida de larvas individual directamente de la malla con un pincel 10.
2. Preparación de tubos de ensayo
- Para preparar para tapar los tubos de ensayo, hervir cuidadosamente un gel de agar al 4% y se vierte en una placa de Petri a una profundidad de 1,5 cm. Esto proporcionará un enchufe para cada lado del tubo cuando está encerrado animal. La solución de 4% es suficientemente densa para evitar que las larvas de penetrating los enchufes.
- Asegúrese de que los tubos estén limpios y claros antes de la inserción de la larva. Si no lo son, esto puede bloquear los movimientos de que se está grabando.
- Para asegurar larvas tienen suficiente humedad para el movimiento, prepare un frasco que contiene una pequeña cantidad de agua caliente. Invierta la botella, orientar cuidadosamente la salida hacia un lavabo y apretar suavemente para expulsar el agua del tubo de recogida.
- Inserte la salida de la botella en el tubo de ensayo. Apriete la botella para entregar vapor de agua en el tubo de ensayo hasta que aparezca una fina capa de condensación en la pared del tubo. Video 1 muestra una larva se mueve en un tubo con una cantidad apropiada de la humedad.
- Para sellar la larva en el tubo, quitar el gel de agar 1,5 cm de espesor de la placa de Petri y colocar sobre una superficie de malla para permitir el flujo de aire por debajo de la agar de modo que un tapón de agar puede ser insertado en el tubo. Presione un extremo del tubo de ensayo en el gel dos veces para insertar dos tapones de gel en un extremo.
- Con un paintbprecipitarse, coloque una larva en el tubo de aproximadamente 1,5 pulgadas de profundidad y sellar el tubo presionando el extremo más cercano a la larva en el gel de agar. La presión resultante forzará a cabo el segundo tapón de gel de agar desde el extremo opuesto y sellar el animal dentro del tubo.
- Colocar los tubos en el dispositivo MB5 Multi-Beam Drosophila Activity Monitor (DAM), y ajustar las posiciones de los tubos para que los animales no pueden ir más allá de la gama de los sensores.
- Para asegurarse de que los tubos de ensayo no se deslizan fuera del marco de lectura de infrarrojos del dispositivo durante el transporte, mantenga el tubo en su lugar mediante la fijación de un anillo de masilla alrededor de cada tubo, donde entra en contacto con el dispositivo de grabación.
3. Medición de la Actividad
- La actividad de registro en una incubadora para evitar lecturas erróneas que pueden ocurrir debido a las sombras, luces fluorescentes o de las variaciones de temperatura en el laboratorio. Consulte la Figura 5 para un arreglo sugerido del sistema.
- Establecer una incubadora a 20 ° C (ver Figura 1). Para evitar falsas grabaciones debido a la interferencia de fuentes de luz incandescentes durante la grabación, apague las luces fluorescentes de la incubadora y el uso de una fuente de luz LED por separado durante la grabación en la incubadora. Realizar un ensayo sin animales para garantizar que las condiciones de luz no desencadenar aberrante sensores. No debe haber datos de movimiento grabadas después de esta prueba.
- Permita que las larvas se adapte a la configuración de la incubadora 20 ° C durante 5 minutos antes de comenzar el ensayo.
- Para establecer el sistema DAM a intervalos de grabación que desee (por ejemplo, 1 min), asegúrese de software de grabación del sistema DAM se descarga al ordenador central 12 y abrir el archivo del sistema DAM antes de conectar la cámara de grabación a la interfaz Psiu.
- Para ajustar la frecuencia de grabación deseado en el que se guardarán los datos, seleccione las preferencias y haga clic encima o por debajo de la opción intervalo de lectura para seleccionar diferentes marcos de tiempo en el que los datosserá almacenado. Por ejemplo, seleccione la lectura de tiempos de intervalo de 1 segundo a 1 hora.
- Para seleccionar el parámetro que varía para grabar datos, elegir preferencias y luego seleccione las casillas correspondientes en virtud de salida de tipo de datos (cuentas, movimientos, posiciones y habitar, ver Tabla 1). Cada parámetro proporciona un análisis único de la actividad larval dentro del tubo.
- Para iniciar la grabación, conecte el monitor a la unidad de interfaz de fuente de alimentación (Psiu) utilizando cable telefónico CAB6. Conecte el Psiu a una toma de corriente. Una luz verde indicará conexión apropiada.
- Conecte el Psiu a través de un cable de bus serie universal (USB) a un Macintosh o PC con Windows para la grabación de datos. Abra el programa DAM SystemMB1v6x en el equipo para iniciar automáticamente la grabación de datos.
- Después se completa el tiempo de recogida deseada, seleccione Salir y salga ahora en la pantalla de la actividad DAM; los datos se guardará automáticamente bajo DAM de datos del sistema. Tome este archivo de datos (por ejemplo, monitorear 1) y arrastre en una carpeta separada. Esto almacenará los datos en bruto desde el software DAM para que más tarde pueden ser procesados.
4. Preparación de los datos para el procesamiento (DAM FileScan)
- Para procesar los datos en bruto en un formato comprensible abrir la aplicación DAM FileScan y seleccione Seleccionar carpeta de datos de entrada. A continuación, seleccione la carpeta de datos y el archivo deseado y seleccione la opción de escaneado. Por último, seleccione la longitud bin al período lectura deseada. Esto va a organizar los datos en bruto en los parámetros establecidos por el operador y el programa informará de los datos recogidos en ese rango particular.
- Seleccione el tipo de datos de salida para analizar el ajuste movimiento deseado (recuento del monitor, se mueve, moran). Bajo el menú de lecturas adicionales, seleccione suma a bin (esto es si la longitud bin es mayor que el intervalo de lectura sistema seleccionado).
- Nombre del archivo de manera adecuada y guardar. El archivo se almacena en la misma ubicación que la carpeta del paso 3.9.
- Con el fin de recoger promedio mueve, proceso los datos brutos generados desde el paso 4. Para generar una tabla en una hoja de cálculo, abra el archivo que se guardó previamente (paso 4.3), y cuando aparezca la ventana del asistente de importación de texto, seleccione acabado para abrir los archivos de datos en un formato de hoja de cálculo.
Nota: Dependiendo del tipo de datos analizados, la hoja de cálculo se leerá de manera diferente. Normalmente para medir movimientos de monitor o recuentos, el período de tiempo del estudio se registró numéricamente, mientras que cada tubo de lectura individual recibirá una carta designado. Cuando la visualización de los datos en la hoja de cálculo, las columnas representan KZ las ranuras para tubos de ensayo 1-16, respectivamente. Las filas representan los puntos de datos recogidos. - Por ejemplo, si se recogieron mueve durante 20 min en intervalos de 1 min, promediar las 20 filas para calcular un número medio de movimientos / minuto y otras mediciones.
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Representative Results
La Figura 1 muestra los resultados de un estudio de respuesta de la temperatura de control de larvas de tercer instar, 1118 w, utilizando el dispositivo de monitorización para detectar diferencias en la locomoción de larvas en siete diferentes temperaturas. Las larvas se lava y se coloca en el dispositivo de la actividad DAM como se describe anteriormente, y se coloca en una incubadora a la temperatura deseada. A continuación, el aparato se dejó aclimatar al medio ambiente durante 5 minutos antes de que comenzara la grabación. Cada larva fue analizada individualmente para la locomoción en un período de 20 min y el número medio de movimientos por minuto se calculó para cada animal y se promediaron para cada conjunto de 32 animales. Se analizaron los datos y se representan mediante un programa de hoja de cálculo. Las larvas exhibió aumentar significativamente la actividad como la temperatura aumenta correspondientemente 5-35 ° C en incrementos de 5 grados, con excepción de un descanso en esta tendencia a 20 ° C y 25 ° C.
Para verificar que las diferencias coudetectarse ld entre un control y un mutante descrito previamente como hipoactivo, larvas inactiva (IAV 1) fueron probados. Los datos se analizaron como se mueve / minuto para cada uno de los 32 animales y se calculó entonces un promedio. Como se muestra en la Figura 2, el análisis indica que las larvas inactivo fueron significativamente menos móvil que un control. Mientras que son mucho más pequeñas que las larvas de tercer estadio, la actividad de primero y segundo estadio las larvas también era medible, como se muestra en la Figura 3. Actividad de larvas de tercer instar en cada minuto del ensayo de 20 min se muestra a permanecer relativamente constante durante todo el período ( la Figura 4).
Figura 1. w 1118 locomoción larval se registró a temperaturas que varían desde 5 ° C -. 35 ° C Eaccolumna h representa el movimiento promedio de 32 animales tercera instar con jugadas individuales por minuto en promedio, entre el conjunto. * Todos los promedios son significativamente diferentes entre sí excepto 10 ° C y 15 ° C (p = 0,116) (Letras diferentes indican una diferencia significativa, test t de Student).
Figura 2. Control de larvas de tercer estadio en comparación con (iav 1) larvas inactiva a 20 ° C. Iav 1 larvas exhiben significativamente menos movilidad en comparación con el control.
Figura 3. Medición de la actividad de primera, segunda y tercera estadio las larvas durante un intervalo de grabación de 20 min a 20 ° C. N = 32 para cada etapa larval.
Figura 4. Histograma que muestra número medio de movimientos que se producen en cada minuto del intervalo de grabación 20 min. 32 larvas de tercer instar se ensayaron a 20 ° C. La línea roja representa el número de movimientos por minuto en promedio para todo el intervalo de 20 min.
Figura 5. Diagrama que ilustra la Drosophila Activity Monitor puesta en marcha y su conectividad con la unidad de interfaz Psiu y una computadora de escritorio. El interior de la incubadora se representa, pero durante la grabación de la incubadora es que ser cerrado.
| Descripción | Parámetro |
| Registros de datos cada vezuna larva atraviesa un rayo, y se registran los recuentos adicionales si la larva se mueve mientras dentro de un solo haz. | Condes |
| Registros de datos sólo cuando una mosca reposiciona entre vigas separadas, que no registra movimiento dentro de una viga. | Movimientos |
| Registra la posición de los animales en cada segundo durante un intervalo de grabación. Estos datos revelan la preferencia de posición como una función del tiempo pasado en cada sensor en el transcurso de un ensayo. | Morar |
| Esta configuración analiza la posición general del animal dentro del tubo, lo que indica que el sensor del animal está provocando durante el movimiento. | Posición |
| Este ajuste determina la frecuencia con la que los datos recogidos durante un plazo establecido se guardan en el ordenador de sobremesa. | Grabación a intervalos |
Tabla 1. Descripción de measuparámetros rement (Condes, Moves: Quédate y puestos).
Vídeo 1. DAM tubo de ensayo del sistema antes de la inserción en el dispositivo operativo. La humedad es proporcionada por la condensación del aliento. Este nivel es suficiente para mantener la locomoción de larvas durante todo el período de estudio, sin causar el animal para flotar o nadar. Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo.
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Discussion
Actividad de las larvas de Drosophila está influenciada por una variedad de factores incluyendo el genotipo 8, 13 años de edad y la temperatura ambiente 2. Aunque poderosos métodos videográficos capaces de análisis muy detallado han sido desarrollados por los que estudian la locomoción 5, este nivel de detalle puede ser superfluo para aquellos que deseen para determinar los parámetros básicos de la actividad. El método descrito aquí emplea un dispositivo que está disponible en muchos laboratorios, es fácil de operar, genera resultados altamente reproducibles, y es manejable incluso para aquellos cuyo principal foco de investigación no es la locomoción. Los ejemplos de resultados demuestran que este ensayo se puede utilizar para detectar cambios significativos en la motilidad en larvas sometidas a diferentes temperaturas (Figura 1) y de diferentes genotipos (Figura 2).
Cuando se midieron las larvas a temperaturas comprendidas entre 5 ° C - 35 ° C, suactividad aumenta con la temperatura, a excepción de un quiebre en la tendencia entre 20 ° C y 25 ° C (Figura 1). Se ha demostrado por Ainsley y compañeros de trabajo que forrajeo larvas de tercer estadio temprano prefieren temperaturas dentro de +/- 2 ° C de la temperatura de 25 ° C típico de cultivo. Sin embargo, cuando las larvas entran vagando mediados tercera fase instar prefieren temperaturas algo más frescas 2. Ese hallazgo es consistente con la observación de que la actividad locomotora para las larvas de tercer estadio es mayor a 20 ° C a 25 ° C, lo que sugiere que una parte de los animales ensayados estaban en la etapa errante y más activa a las temperaturas más frías, y en menor medida en la temperatura de cultivo normal de 25 ° C.
Este método ofrece simplicidad, objetividad y robusto rendimiento, pero hay limitaciones. Las aplicaciones descritas anteriormente representan ensayos tienen lugar durante un período de tiempo relativamente corto, en parte debido a que la configuración actual no se prlarvas ovide con una fuente de alimento. Garantizar una nutrición adecuada sería necesario estudiar los cambios en la actividad durante períodos prolongados de tiempo o para medir el ritmo circadiano en el largo plazo. Los tapones de agar 4% pueden restringir el intercambio de gases entre la cámara y el entorno externo, lo que podría resultar en que las larvas experimentando condiciones de hipoxia. Sin embargo, esto no parece afectar a la actividad dentro de un período de ensayo de 20 min, porque cuando se analizaron mueve promedio por minuto de las larvas durante cada minuto de la época, las larvas no parece mostrar ningún cambio en la actividad durante el periodo de grabación (Figura 4) .
Debido a que el dispositivo registra continuamente la posición que representa una mejora en la captura de más movimiento en comparación con los métodos no automatizados citados, sin embargo algunos movimiento hace escapar a la detección. Muy pequeños movimientos de los animales no podrían desencadenar una respuesta de este dispositivo, y las larvas se pueden mover de forma circunferencial dentro de una infraestructurahaz rojo sin romper vigas vecinos, dando lugar a lecturas erróneamente bajas. Sin embargo, dado que este tipo de error se espera que se produzca en todos los grupos de tratamiento, es poco probable que cause resultados engañosos. Aunque larvas de tercer estadio son el foco principal de este análisis, el dispositivo es capaz de medir el movimiento de las larvas primero y segundo instar mucho más pequeño, así (Figura 3). Como se esperaba, el número de movimientos registrados por minuto en los animales más jóvenes es menor que la de los animales más grandes tercera fase larval.
Aunque la gama de usos para este dispositivo aún no se ha demostrado, hay una variedad de otras adaptaciones que podrían diversificar los usos de este aparato para estudios con larvas. Por ejemplo, el dispositivo permite una medición 'permanencia', que representa el tiempo pasado en una región determinada del tubo. Esto puede proporcionar información valiosa cuando se emplea en diversos Drosophila larval taxis unssays. Al colocar el aparato en su lado de manera que los tubos están orientados verticalmente en lugar de horizontalmente, uno podría medir geotaxis larvales. Para medir fototaxis, un gradiente de luz se pudo establecer en los tubos, probando si las larvas tienen una preferencia por la luz o su ausencia. Para estudiar la quimiotaxis, la sustancia de ensayo podría ser colocado en uno de los tapones de agar y la posición de las larvas podría revelar entonces determinar su preferencia por o la evitación de la sustancia química.
El sistema de monitorización permite el análisis de diversos parámetros de movimiento, que se resumen en la Tabla 1. Al seleccionar todos los parámetros durante la configuración pre-ensayo (véase el paso 3.6), el experimentador puede elegir el parámetro a analizar después del ensayo. Sin embargo, si no se ha seleccionado ninguna opción, que los datos no estará disponible para el análisis post hoc. Cabe señalar que después de cada período de tiempo seleccionado, los datos se congelan a los recuentos actuales y guardan en el ordenador anfitrión. La recolección de datos se restablece acero después de este periodo y comienza de nuevo, proporcionando una serie de puntos de datos intervalo de tiempo. Hay que dejar de fumar de forma manual para finalizar la grabación de datos.
Los estudios futuros que implican este método se centrará en el uso del parámetro de permanencia y sus diversas aplicaciones. También puede ser posible desarrollar un protocolo que permita que se produzcan estudios durante un período de tiempo más largo, tales como estudios circadianos, por el suministro de alimentos y el intercambio de tapones de agar para un material más permeable a los gases 14. Necesitarían niveles de humedad para ser controlado, así como las condiciones secas inhiben la locomoción 15. Actualmente, este protocolo proporciona un método preciso, simple y rentable para evaluar los parámetros básicos de la actividad de las larvas bajo una variedad de condiciones experimentales.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Activity Monitor, Multibeam, 16 tubes, including wires | TriKinetics Inc. | MB5 | |
| Power Supply Interface for Activity Monitor | TriKinetics Inc. | PSIU24 | |
| Glass 80 x 5 mm tubes for Activity Monitor (100) | TriKinetics Inc. | PGT 5x80 | |
| DAMsystemMB1v6x Data Acquisitions Software for Macintonsh OSX (Intel) | www.trikinetics.com | free download | |
| DAMFileScan 108x software for Macintosh | www.trikinetics.com | free download | |
| USB software (PSIUdrivers.zip). | www.trikinetics.com | free download | |
| DAMSystem Notes 308 | www.trikinetics.com | free download | |
| Zeiss Stemi 2000C- Stereo Microscope | Spectra Services | SP-STEMI2000C-BS | |
| Carbon Dioxide | Maine Oxy | anaesthesia | |
| Fly Pad | Genesee | 59-114 | surface for sorting anaesthetized flies |
| Small paint brush | Winsor & Newton | #2 ROUND | or similar, used for sorting anaesthetized flies |
| Silk Screen Printing Mesh (160) | msj-gallery.com | SM160W63-3YD | pore sized used in this protocol was ~ 0.1 mm |
| Tegosept | Genesee | 20-258 | preservative |
| Ethanol (190proof) | Pharmco | 111000190 | used to dissolve Tegosept |
| 6 oz Square Bottom Bottle (PP) | Genesee | 32-130 | |
| "Flugs" for Plastic Fly bottles | Genesee | 49-100 | |
| Drosophila Vials, Wide (PS) | Genesee | 32-117 | |
| Flugs for wide plastic vials | Genesee | 49-101 | |
| Yellow Degerminated Corn Meal | Gold Medal | ||
| Drosophila agar | LabScientific | FLY 8020 | |
| Baker's Yeast - Red Star | King Arthur Flour | 1270 | |
| Granulated Sugar - Extra Fine | Domino |
References
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- Ainsley, J. A., Kim, M. J., Wegman, L. J., Pettus, J. M., Johnson, W. A. Sensory mechanisms controlling the timing of larval developmental and behavioral transitions require the Drosophila.DEG/ENaC subunit. Pickpocket1. Dev. Biol. 322 (1), 46-55 (2008).
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