Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Mätning av Larvernas aktivitet i Published: April 30, 2015 doi: 10.3791/52684

Protocol

1. Framställning av larver

  1. För att analysera en önskad larv för transport eller positionsinställning, växa larver under standardförhållanden till önskad ålder för att analysera 10 användning av standard fluga mat 11.
  2. Gör ett nätfilter genom att sträcka silkscreenkvalitet nylonnät över en tratt. Säkra nät på tratten halsen med gummiband. Placera tratten i en bägare.
  3. För att samla larver för analys, scoop en spatel full av livsmedel som innehåller födosökande larver från odlingsflaskan och tvätta med RT kranvatten över nätfiltret, samla individuella larver direkt från nätet med en pensel 10.

2. Framställning av analysrören

  1. För att förbereda sig för att plugga analysrören försiktigt koka en 4% agargel och häll i en petriskål till ett djup av 1,5 cm. Detta kommer att ge en kontakt för vardera sidan av röret, när djuret är innesluten. Den 4% lösning är tillräckligt tät för att hindra larverna från penetrating pluggarna.
  2. Se till att rören är ren och klar före införandet av larv. Om de inte är, kan detta blockera rörelser från spelas in.
  3. För att säkerställa larver har tillräckligt med fukt för rörelse, förbereda en klämflaska som innehåller en liten mängd varmt vatten. Vänd flaskan försiktigt orientera utloppet mot ett handfat och pressa försiktigt för att driva ut vattnet från upptagningsröret.
  4. Sätt i flaskan utlopp i analysröret. Ihop flaskan för att leverera vattenånga in i analysröret tills ett tunt lager av kondens visas på väggen av röret. Video 1 visar en larv som rör sig i ett rör med en lämplig mängd av fukt.
  5. För att täta larven i röret, ta bort 1,5 cm tjockt agargel från petriskål och placera över en mask yta för att medge luftflöde under agar så att en agarplugg kan införas i röret. Tryck på en ände av analysröret in i gelén två gånger för att infoga två pluggar av gelén i en ände.
  6. Med en paintbrusa, placera en larv i röret cirka 1,5 inches djup och försegla röret genom att trycka på änden närmast larven i agargel. Den resulterande trycket kommer att tvinga ut den andra plugg av agargel från den motsatta änden och försegla djuret inuti röret.
  7. Placera rören i MB5 Multi-Beam Drosophila Aktivitetskontroll (DAM) enhet, och justera rör ståndpunkter så att djuren inte kan gå längre än intervallet av sensorerna.
  8. För att säkerställa att analysrören inte glida ut ur anordningens infraröd läsram under transport, hålla röret på plats genom att fästa en ring av spackel runt varje rör där den kommer i kontakt med lagringsanordningen.

3. Mätning Verksamhet

  1. Spela aktivitet i en inkubator för att förhindra felaktiga mätningar som kan uppstå på grund av skuggor, lysrör eller temperaturvariationer i labbet. Se figur 5 för en föreslagna arrangemang av systemet.
  2. Ställ en inkubator till 20 ° C (se figur 1). För att undvika felaktiga inspelningar på grund av störningar från glödande ljuskällor under inspelning, stänger fluorescerande inkubator lampor och använda en separat LED-ljuskälla medan du spelar in i inkubatorn. Gör en rättegång utan några djur för att säkerställa att ljusförhållandena inte avvikande utlösa sensorer. Det får inte finnas några inspelade rörelsedata efter detta test.
  3. Låt larver att acklimatisera sig till de 20 ° C inkubator inställningar under 5 min före start av analysen.
  4. För att ställa in dammsystem till önskade inspelningsintervall (t.ex. 1 min), se DAM programvarusystem inspelning hämtas till värddatorn 12 och öppna DAM systemfilen innan du ansluter inspelningen kammaren till PSIU gränssnittet.
  5. För att ställa in önskad inspelnings frekvens vid vilken data sparas, väljer du inställningar och sedan klicka ovanför eller nedanför läsning intervallet möjlighet att välja olika tidsramar där datakommer att lagras. Till exempel väljer att läsa intervalltider från 1 sekund till 1 timme.
  6. För att välja olika parametrar för inspelning av data, välj inställningar och välj sedan motsvarande rutorna under utgångs datatyp (räkningar, flyttar, positioner och bo, se tabell 1). Varje parameter ger en unik analys av larv aktivitet inuti röret.
  7. För att börja spela in, ansluta monitorn till nätaggregatet Interface Unit (PSIU) använder CAB6 telefonkabel. Anslut PSIU till ett eluttag. En grön lampa indikerar lämplig anslutning.
  8. Anslut PSIU genom en Universal Serial Bus (USB) kabel till en Macintosh eller Windows PC för datainsamling. Öppna DAM SystemMB1v6x programmet på datorn för att starta automatiskt dataregistrering.
  9. Efter den önskade insamling tid är klar, väljer Avsluta, och sedan på Avsluta nu på DAM aktivitetsskärmen; Uppgifterna kommer sedan automatiskt sparas under DAM System Data. Ta denna datafil (t.ex. övervaka 1) och dra i en separat mapp. Detta kommer att lagra rådata från DAM-programvara, så att de senare kan bearbetas.

4. Förbereda data för Processing (DAM FileScan)

  1. För att bearbeta rådata till en begriplig form öppna DAM FileScan programmet och välj Välj Indata mapp. Välj sedan datamappen och önskad fil, och välj alternativet skanning. Slutligen väljer bin längden till den önskade behandlingen perioden. Detta kommer att organisera rådata till parametrar som operatören och programmet kommer att rapportera de uppgifter som samlats in i just intervall.
  2. Välj typ av utdata att analysera önskad inställning rörelse (monitor räknas, flyttar, bor). Under extra avläsningar menyn, välj summan till bin (detta om bin längd är större än den valda avläsningssystem intervall).
  3. Döp filen på lämpligt sätt och spara. Filen sparas på samma plats som mappen från steg 3,9.
_title "> 5. få tillgång till uppgifter för analys

  1. För att samla genomsnittliga rörelser, process rådata som genererats från steg 4. Om du vill skapa en tabell i ett kalkylprogram, öppna filen som tidigare sparades (steg 4,3), och när Textimportguiden visas, för att välja FINISH öppna datafiler i en kalkylbladsformat.
    Obs: Beroende på typ data analyseras, kommer kalkylblad läsas på olika sätt. Typiskt att mäta monitor flyttar eller räknas, tidsperioden för studien kommer att registreras numeriskt, medan varje enskild läsning rör får en utsedd brev. När du visar data i kalkylbladet, KZ kolumner representerar spåren för analysrören 1-16 respektive. Raderna representerar datapunkter uppsamlades.
  2. Till exempel, om drag samlades under 20 minuter i 1 min intervaller, i genomsnitt 20 rader för att beräkna ett genomsnittligt antal drag / minut och andra mätningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 visar resultaten från en temperaturresponsstudie av kontroll tredje stadiets larver, w 1118, med hjälp av övervakningsanordningen för att detektera skillnader i larv förflyttning vid sju olika temperaturer. Larver tvättades och placerades i DAM-aktivitet anordning som beskrivits ovan, och placerades i en inkubator inställd till den önskade temperaturen. Anordningen fick sedan acklimatisera sig till miljön under 5 min innan inspelningen påbörjades. Varje larv individuellt analyseras för transport under en 20-minutersperiod och det genomsnittliga antalet drag per minut beräknades för varje djur och i genomsnitt för varje uppsättning av 32 djur. Data analyserades och visas med hjälp av ett kalkylprogram. Larver uppvisade signifikant ökad aktivitet när temperaturen ökat på motsvarande 5-35 ° C i steg om 5 grader, med undantag för ett trendbrott vid 20 ° C och 25 ° C.

För att kontrollera att skillnader pald påvisas mellan en kontroll och en mutant som tidigare beskrivits som hypoaktivt, inaktiv larver (IAV 1) testades. Data analyserades som rör sig / minut för var och en av de 32 djuren och ett medelvärde beräknades sedan. Såsom visas i figur 2, indikerar analysen att inaktiva larver var signifikant mindre rörliga än en kontroll. Medan de är mycket mindre än tredje stadiets larver, aktivitet av första och andra stadiets larver var också mätbara, såsom visas i fig 3. Aktivitet av tredje stadiet larver i varje minut av 20 min-analysen visade sig förbli relativt konsekvent under hela perioden ( Figur 4).

Figur 1
Figur 1. w 1118 larv förflyttning noterades vid temperaturer som varierar från 5 ° C -. 35 ° C Each kolumn representerar den genomsnittliga rörelse 32 tredje stadiet djur med individuella rörelser per minut i genomsnitt bland uppsättningen. * Alla medelvärden är signifikant skilda från varandra förutom 10 ° C och 15 ° C (p = 0,116) (Olika bokstäver indikerar en signifikant skillnad, Students t-test).

Figur 2
Figur 2. Tredje stadiets styr larver jämfört med inaktiva (IAV 1) larver vid 20 ° C. IAV en larver uppvisar signifikant mindre rörlighet jämfört med kontroll.

Figur 3
Figur 3. Mätning av aktivitet hos första, andra och tredje stadiet larver under en 20 minuters registreringsintervall på 20 ° N = 32 C. För varje larvstadiet.


Figur 4. Histogram visar genomsnittligt antal drag som förekommer i varje minut av 20 minuter inspelningsintervallet. 32 tredje stadiet larver analyserades vid 20 ° C. Den röda linjen representerar antalet drag per minut i genomsnitt för hela 20 minuters intervall.

Figur 5
Figur 5. Diagram som illustrerar Drosophila Activity Monitor set-up och dess anslutning till PSIU gränssnittsenhet och en stationär dator. Insidan av inkubatorn avbildas, men under inspelning inkubatorn skall stängas.

Beskrivning Parameter
Spelar in uppgifter varje gången larv korsar en stråle, och ytterligare räknar registreras om larv rör sig samtidigt i en enda stråle. Räknar
Spelar in uppgifter endast när en fluga omplacerar mellan separata strålar, det inte att spela in rörelse i en balk. Flyttar
Spelar djuren position vid varje sekund under en inspelningsintervallet. Dessa data visar positionsinställning som en funktion av tiden tillbringas på varje sensor under loppet av en analys. Dwell
Denna inställning analyserar djurets allmänna ståndpunkt i röret, som anger vilka givare djuret utlöser under förflyttning. Position
Denna inställning bestämmer frekvensen med vilken data som samlats in under en fastställd tidsram sparas till den stationära datorn. Inspelning Intervall

Tabell 1. Beskrivning av measudF parametrar (Counts, Flyttar, Dwell och positioner).

Video 1
Video 1. DAM systemet analysrör före införing i manöverdon. Fukt tillhandahålls genom kondensation från andetag. Denna nivå är tillräcklig för att bibehålla larver förflyttning hela studieperioden utan att orsaka djuret att flyta eller simma. Klicka här för att se filmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aktivitet hos Drosophila larver påverkas av en mångfald faktorer, däribland genotyp 8, 13 ålder och omgivningstemperatur 2. Även om kraftfulla Videografiska metoder som kan mycket detaljerad analys har utvecklats av dem som studerar rörelse 5, kan denna detaljnivå vara överflödiga för dem som vill bestämma grundläggande parametrar för aktivitet. Den metod som beskrivs här använder en enhet som finns i många laboratorier, är lätt att använda, ger mycket reproducerbara resultat, och är hanterbar även för dem vars främsta forskningsfokus är inte förflyttning. Exempel resultat visar att denna analys kan användas för att detektera signifikanta förändringar i motilitet i larver som utsätts för olika temperaturer (fig 1) och av olika genotyper (figur 2).

När larverna mättes vid temperaturer som sträcker sig från 5 ° C - 35 ° C, derasaktiviteten ökade med temperaturen, med undantag för ett trendbrott mellan 20 ° C och 25 ° C (Figur 1). Det har visats av Ainsley och medarbetare att födosök tidigt tredje stadiets larver föredrar temperaturer inom +/- 2 ° C från den typiska 25 ° C odlingstemperatur. Men när larver ange vandrade mitten av tredje stadiet fas de föredrar något svalare temperaturer 2. Detta konstaterande överensstämmer med observationen att rörelseaktivitet för tredje stadiet larver är större vid 20 ° C än 25 ° C, vilket tyder på att en viss del av djur analyserade var i vandrande scenen och mer aktiva på de svalare temperaturer, och i mindre utsträckning på normal odlingstemperatur av 25 ° C.

Denna metod erbjuder enkelhet, objektivitet och robust genomströmning, men det finns begränsningar. De ansökningar som beskrivs ovan representerar analyser som inträffar under en relativt kort tid, delvis på grund av nuvarande upplägget inte prOvide larver med en näringskälla. Säkerställa tillräcklig näring skulle krävas för att studera förändringar i verksamheten under längre tidsperioder eller för att mäta dygnsrytm på längre sikt. De 4% agarpluggar kan begränsa gasutbyte mellan kammaren och den yttre miljön, vilket kan resultera i larverna upplever hypoxiska förhållanden. Men detta verkar inte påverka aktiviteten inom en 20 min analysperioden, eftersom när den genomsnittliga rörelser per minut larver under varje minut av perioden analyserades, hade larver inte verkar visa någon förändring i aktivitet under registreringsperioden (Figur 4) .

Eftersom enhetens register läget kontinuerligt representerar en förbättring i att fånga mer rörelse i förhållande till de icke-automatiska metoder citerade, men vissa rörelser gör undgå upptäckt. Mycket små förflyttningar av djur kanske inte utlösa ett svar från den här enheten, och larver kan röra sig i en omkrets sätt inom en infraröd stråle utan att bryta grann balkar, vilket resulterar i felaktigt låga värden. Eftersom emellertid skulle förväntas denna typ av fel att uppstå i alla behandlingsgrupper, är det osannolikt att orsaka missvisande resultat. Även tredje stadiet larver är det primära målet för denna analys är anordningen kan mäta rörelse mycket mindre första och andra stadiet larver samt (Figur 3). Som väntat är det antal drag som registrerats per minut i de yngre djuren lägre än de större tredje stadiet djur.

Även hela användningsområde för den här enheten har ännu inte visat att det finns en mängd andra anpassningar som kan diversifiera användningen av denna apparat för studier med larver. Till exempel kan anordningen en "uppehållstid" mätning, som representerar tiden tillbringas i en bestämd region i röret. Detta kan ge värdefull information när de används i olika Drosophila larv taxibilar enssays. Genom att placera apparaten på sidan så att rören är orienterade vertikalt istället för horisontellt, kan man mäta larv geotaxis. För att mäta phototaxis, kunde en lätt lutning fastställas i rören, testa om larver har en preferens för ljus eller dess frånvaro. För att studera chemotaxis, kan en testkemikalie placeras på en av de agarpluggar och läget för larverna kan då avslöja fastställa deras preferens för eller undvikande av kemikalien.

Monitorn systemet tillåter analys av olika rörelseparametrar, som sammanfattas i Tabell 1. Genom att välja alla parametrar under pre-analysen installationsprogrammet (se steg 3,6), försöks kan välja vilken parameter för att analysera efter analysen. Men om någon inställning inte är vald, att uppgifterna inte kommer att vara tillgängliga för post hoc-analys. Det bör noteras att efter varje vald tidsperiod, är data som fryses i löpande räkningar och sparas till värddatorn. Datainsamling återställs sedan tillnoll efter denna period och börjar igen, vilket ger en serie tidsintervallet datapunkter. Man måste manuellt avsluta för att avsluta dataregistrering.

Framtida studier med denna metod kommer att fokusera på användningen av parametern uppehålls och dess olika tillämpningar. Det kan också vara möjligt att utveckla ett protokoll som skulle göra det möjligt för studier ske över en längre tidsperiod, såsom dygnsrytm studier, genom att tillhandahålla mat och utbyta agarpluggar för mer gas genomsläppligt material 14. Fuktnivåer skulle behöva kontrolleras också, eftersom torra förhållanden hämmar förflyttning 15. För närvarande ger detta protokoll ett korrekt, enkel och kostnadseffektiv metod för att utvärdera grundläggande parametrar för larv aktivitet under olika experimentella betingelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila Activity Monitor, Multibeam, 16 tubes, including wires TriKinetics Inc.  MB5
Power Supply Interface for Activity Monitor  TriKinetics Inc.  PSIU24
Glass 80 x 5 mm tubes for Activity Monitor (100) TriKinetics Inc.  PGT 5x80
DAMsystemMB1v6x Data Acquisitions Software for Macintonsh OSX (Intel) www.trikinetics.com free download
DAMFileScan 108x software for Macintosh www.trikinetics.com free download
USB software (PSIUdrivers.zip). www.trikinetics.com free download
DAMSystem Notes 308 www.trikinetics.com free download
Zeiss Stemi 2000C- Stereo Microscope Spectra Services SP-STEMI2000C-BS
Carbon Dioxide Maine Oxy anaesthesia
Fly Pad Genesee 59-114 surface for sorting anaesthetized flies
Small paint brush  Winsor & Newton #2 ROUND or similar, used for sorting anaesthetized flies
Silk Screen Printing Mesh (160) msj-gallery.com SM160W63-3YD pore sized used in this protocol was ~ 0.1 mm
Tegosept Genesee 20-258 preservative
Ethanol (190proof) Pharmco 111000190 used to dissolve Tegosept
6 oz Square Bottom Bottle (PP) Genesee 32-130
"Flugs" for Plastic Fly bottles Genesee 49-100
Drosophila Vials, Wide (PS) Genesee 32-117
Flugs for wide plastic vials Genesee 49-101
Yellow Degerminated Corn Meal Gold Medal
Drosophila agar LabScientific FLY 8020
Baker's Yeast - Red Star King Arthur Flour 1270
Granulated Sugar - Extra Fine Domino

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila.gene essential for nociception. Cell. 113, 261-273 (2003).
  2. Ainsley, J. A., Kim, M. J., Wegman, L. J., Pettus, J. M., Johnson, W. A. Sensory mechanisms controlling the timing of larval developmental and behavioral transitions require the Drosophila.DEG/ENaC subunit. Pickpocket1. Dev. Biol. 322 (1), 46-55 (2008).
  3. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila. melanogaster.and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol. Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
  4. Cattaert, D., Birman, S. Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila.larvae. J. Neurobiol. 48 (1), 58-73 (2001).
  5. Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila. hordotonal organ mutants. PNAS. 100 (26), 16053-16058 (2003).
  6. Nichols, C. D., Bechnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. (61), (2012).
  7. Godoy-Herrera, R. The development and genetics of digging behavior in Drosophila. arvae. Heredity. 56, 33-41 (1986).
  8. Sinadinos, C., Cowan, C. M., Wyttenbach, A., Mudher, A. Increased throughput assays of locomotor dysfunction in Drosophila. larvae. Journal of Neuroscience Methods. 203 (2), 325-334 (2012).
  9. Homyk, T., Sheppard, D. E. Behavioral mutants of Drosophila melanogaster. I. Isolation and mapping of mutations which decrease flight ability. Genetics. 87 (1), 95-104 (1977).
  10. Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila. larvae. J. Vis. Exp. (63), e3837 (2012).
  11. Model Organisms I: yeast, Drosophila and C. elegans. Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education-database/3/essentials-of-biology-1-yeast-drosophila-and-c-elegans (2015).
  12. Woods, J. K., Kowalski, S., Rogina, B. Determination of the spontaneous locomotor activity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (86), e51449 (2014).
  13. Troncoso, B., Godoy-Herrera, R., Waldo, M. The development of larval movement patterns in Drosophila). Heredity. 58 (1), 321-329 (1987).
  14. Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian rhythm of the locomotor activity in Drosophila. melanogaster.and its mutants ‘sine oculis’ and ‘small optic lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
  15. Johnson, A. W., Carder, W. J. Drosophila, ociceptors mediate larval aversion to dry surface environments utilizing both the painless TRP channel and the DEG/ENaC subunit, PPK1. PLoS ONE. 7 (3), (2012).

Tags

Beteende neurovetenskap, Fruktflugor larver Life Science beteendevetenskap Locomotion TriKinetics aktivitet Fly Beteende
Mätning av Larvernas aktivitet i<em&gt; Drosophila</em&gt; Aktivitetskontroll
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McParland, A. L., Follansbee, T. L., More

McParland, A. L., Follansbee, T. L., Ganter, G. K. Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor. J. Vis. Exp. (98), e52684, doi:10.3791/52684 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter