Protocol
1. 물 수집 및 여과
- 여러 사이트 (그림 1)에서 담수 샘플을 수집합니다. 일련의 필터를 통해 샘플을 통과 : 1 μm의 필터, 0.2 μm의 필터, 30 kDa의 차단 접선 흐름 필터 각각 체계적으로 별도의 진핵 세포, 세균 및 바이러스 크기의 입자로합니다.
참고 : 정제하고 0.2 ㎛의 필터 (유리 살아있는 박테리아)에 회수 된 물질의 분석이보고에서 설명하지만, 유사한 접근법이 필터로부터 회수 다른 입자에 사용될 수있다.
2. 세균 농도 DNA 추출 및 정제
- 물 여과 시스템 (개략도, 그림 2)에서 0.2 μm의 멤브레인 필터를 분리합니다. 반으로 0.2 μm의 디스크 필터를 접어 오픈면을 위로하여 50 ㎖ 튜브에 배치합니다. 에 1X 인산 완충 용액 5 ㎖ (PBS)와 0.01 % 트윈, pH가 7.4 추가튜브. 하나 이상의 필터가 공정 중에 사용되는 경우마다 다른 필터 튜브를 이용한다. 4 ° C에서 필터를 저장 튜브 (들)까지 처리. 그렇지 않으면, 2.2 단계로 진행합니다.
- 멸균 집게로 50 ML 튜브에서 0.2 μm의 멤브레인 필터를 제거합니다. 페트리 접시에 놓고 필터 (들) (튜브에서 PBS 버퍼를 떠나).
- 멸균 집게 및 멸균 가위, 작은 스트립에 필터 (1cm X 1cm)을 잘라. , 70 % 이소프로판올에 몸을 담근 DNA 표면 오염 제거제로 닦아 다른 샘플 사이의 제 1 형의 초순수로 세척하여 집게와 가위를 소독.
- 다시 같은 50 ㎖ 튜브에 스트립으로 절단 필터를 놓습니다. 50 ML 튜브에 버퍼의 15 ml의 총이 때문에 필터에 1X PBS 10 ml의 0.01 % 트윈, 산도 7.4을 추가합니다.
- 각 50 ㎖ 튜브에 6 청소 텅스텐 구슬 (3 mm 직경)를 추가 20 분 (50 ㎖ 튜브 소용돌이 어댑터를 사용)에 대해 적극적으로 파라 필름과 튜브, 소용돌이 커버. 멀티 포트의 경우이플 필터는 깨끗한 50 ML 튜브에 하나의 샘플, 전송 및 풀 모든 균질 처리됩니다. 4 ℃에서 15 분 동안 3,300 XG에서 튜브를 원심 분리기.
- 1.7 ml의 마이크로 원심 튜브에 펠릿과 나누어지는 박테리아 세포 (~ 1 분취 량)을 재현 탁. 샘플 당 5 마이크로 원심 튜브가 될 것이라고합니다.
- 10 분 동안 10,000 XG에서 마이크로 원심 튜브를 스핀 다운, 200 ~ μl에 마크 아래 상층 액의 대부분을 제거합니다.
- -80 ° C에서 샘플을 보관하거나 제조업체의 지침에 따라 시중에서 판매하는 DNA 분리 키트를 사용하여 세균의 DNA를 추출로 진행합니다. 세균성 DNA 추출 사용하거나 또는 물 PBS 네거티브 대조군으로서 추출하고, E. 중 양성 대조군으로서 추출 대장균.
- 여러 개의 튜브에서 DNA 추출되기 때문에, 하나 둘 ML 튜브에 동일한 샘플에서 병렬 서브 분주 수영장. 이어서 0.1 이루어지는 용액을 사용하여 O / N 침전을 실시3 M 아세트산 나트륨, 100 % 에탄올 2 부피 및 5 ㎍ / μL 선형 아크릴 아미드 5 μL의 볼륨. 잘 혼합 및 저장 샘플 -80 ° C에서.
- 4 ℃에서 30 분 동안 최대 속도 (17,000 XG) 원심 분리기. 10 mM 트리스 - CL, 산도 8.5의 34 μL에 더 이상 5 분에 resuspend DNA 펠릿에 대한 생물 안전 캐비닛에 얼음처럼 차가운 70 % 에탄올, 건조 공기의 1 ml로 펠렛을 씻으십시오.
참고 : 선형 아크릴 아미드가 O / N 침전 후 DNA 펠렛을 시각화하는 데 도움이 될 것입니다. - 제조업체의 지침 (재료의 표 참조), 각각 고감도 형광 핵산 정량 분석 및 microvolume 분광 광도계를 사용하여 다음과 같은 DNA의 양과 질을 결정합니다.
주의 : 샘플을 여러 시간에 제조하는 경우 dsDNA 접시 계 형광 / 분광 정량 고감도 형광 핵산 분석 방법 대신에 사용될 수있다.
3. DNA 라이브러리 준비
- 트랜스포존 기반 방법 (tagmentation)를 사용하여 세균 DNA 단편의 효소 적 하나 나노 그램. 제조업체의 지침에 따라 조각난 DNA에 어댑터와 인덱스 시퀀스를 추가합니다. 시퀀싱 인덱스가 통합되는 시점에서 제조업체의 지침에 표시된 주제 PCR의 12주기에 샘플을 tagmented.
4. 자동 젤 사이즈 선택
- 제조업체의 지침에 설명 된 표준 포스트-PCR 청소 단계를 건너 뛰십시오 (재료의 표 참조). 사이즈 선택 PCR 후 시료를 직접 자동 겔 기반 사이즈 선택 플랫폼을 사용.
- 각 샘플에 로딩 버퍼의 3.5 μl를 추가합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라, 300 μl의 추출물에서, 500 ~ 800 bp의 크기 선택 대상을 지정하여 전기 영동 워크 스테이션에 샘플을로드프리 캐스트 1.5 % 아가로 오스를 사용하여 카세트 이온 볼륨.
- 에탄올 침전을 통해 25 μL까지 원시 출력 재료 (300 μl를) 집중.
주 : 대안 적으로, 필터 판 및 진공 매니 폴드를 통해 더 많은 수의 샘플에 대한 농도를 자동화하는 전기 워크 스테이션을 사용한다.- 3 M 아세트산 나트륨 0.1 부피의 100 % 에탄올의 양이 5 ㎍ / μL 선형 아크릴 아미드 5 μL를 사용하여 원시 용출 부피를 석출. -80 ° CO / N에서 잘 장소 샘플을 섞는다. 원심 분리기 샘플을 30 분 동안 17,000 XG에.
- 상층 액을 버리고 얼음처럼 차가운 70 % 에탄올 1 ml의 DNA 펠렛을 씻어 진행합니다.
- 원심 분리기 샘플은 다시 30 분 동안 17,000 XG에서, 상층 액, 건조 공기를 폐기하고, 마지막으로 10 mM 트리스 - CL, 산도 8.5의 25 μL에 DNA 펠렛을 재현 탁.
- (선택 사항) 다섯을 할 수있는 자동화 된 젤 크기 선택 플랫폼 선택 DNA 라이브러리 크기의 1 μl를 사용하여트리스 EDTA 완충액, pH가 8.0를 사용하여 희석 -fold. 제조업체의 지시에 따라 dsDNA 품질을 분석하는 칩 기반 모세관 전기 기기를 사용하여 라이브러리를 분석한다.
5. 도서관 정상화 및 시퀀싱
- 제조업체의 준비 가이드에 설명 된대로 (트랜스포존 기반 라이브러리 준비 키트에 포함) 라이브러리 정규화 구슬을 사용하여 샘플을 정상화 진행합니다.
- 대안 적으로, 2 nm의 dsDNA의 최종 농도에 도달 할 등몰 비율로 풀링 하였다 고감도 형광 핵산 정량 분석을 사용 dsDNA 라이브러리를 측정한다. 풀링 라이브러리의 10 μL 0.2 N NaOH를 10 μl를 사용하여 라이브러리를 변성 진행, RT에서 5 분 동안 품어. 오후 11시 5분의 최종 1 ml의 부피와 농도 (트랜스포존 기반 준비 키트 포함) 하이브리드 버퍼를 사용하여 변성 라이브러리를 희석.
- 로드 샘플제조사의 표준 프로토콜을 시퀀싱 따라 차세대 시퀀싱 플랫폼들.
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Representative Results
DNA 농도 및 품질 평가
세균성 DNA 농도는 0.01 내지 0.11 NG / 유역 다른 사이트의 물 샘플 당 ㎖ (표 1)의 범위였다. 박테리아로부터 단리 DNA 분획은 각각 1.6 260/280 1.8 1.4 0.3 비율 230분의 260 있었다. 230분의 260 비의 일부는 상대적으로 낮은 동안, 명백한 억제 준비된 다른 라이브러리와 하류 어플리케이션에서 관찰되지 않았다. 이러한 응용 프로그램은 PCR 및 qPCR에 16S rRNA 유전자의 CPN 및 60, 그리고 후속 앰플 리콘 시퀀싱 (데이터 미기재) 타겟팅 테스트입니다.
레인저 기술
높은 처리량 자동화 플랫폼 선택된 트랜스포존 - 기반 방법 및 규모로 제조 겔 DNA 라이브러리는 500~800 BP (도 3) 사이의 DNA 단편의 범위를 꽉 수득 하였다. 이 대안 홍보otocol는 0.3에서 3.4 NG / μL (표 1)에 이르기까지 농도를 얻었다. DNA 단편의 크기는 650 염기쌍의 평균을 이용하여,이 라이브러리는 평균 농도 입력 재료의 3.81 nm였다. 도서관은 지속적으로 여러 유역 위치에서 준비 모든 DNA 라이브러리에서 선택한 크기 하였다.
DNA 시퀀싱 QC 매개 변수
Illumina의 MiSeq이 라이브러리의 DNA 염기 서열은 1198 K / mm 2의 클러스터 밀도를 생성합니다. 클러스터 통과 필터의 백분율은 84.2 %, 9.2 GB가 예상 수율이었다. 또한, 7.4 GB 이상 82.8 %가 품질 평가 점수 ≥30했다 읽습니다. 자동화 겔 사이즈 선택 플랫폼 활용 일관 적당한 수율의 결과, 200 bp의 단편하에 불필요한 클러스터링을 최소화.
<BR />도 1 물 샘플은 도시의 (A) 및 농업면 (B)의 영향 유역으로부터 수집 하였다.
그림 2. 담수 샘플로부터 트랜스포존 기반 DNA 라이브러리를 생성하기 위해 사용되는 방법의 도식 표현. 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 민물 샘플로부터 생성 된 DNA 라이브러리를 Electropherograms 3. (A)의 크기의 선택과 (B) DNA 라이브러리 크기 전에 후 PCR DNA 라이브러리를 이용하여 자동으로 선정젤 크기 선택 플랫폼 (대상 범위 : 500-800 BP). 모든 샘플은 TE 완충액으로 5 배 희석 하였다.
| 환경 샘플 | 세균의 DNA 농도 (NG / ㎖) * | 280 분의 260 | 230분의 260 | 사이즈 선택하기 전에 DNA 농도 (NG / μL), 볼륨 : 25 μL | DNA 농도 (NG / μL) 사이즈 선택 후, 부피 : 25 μL |
| (1) | 0.11 (0.16) | 1.8 | 1.4 | (27) | 1.2 |
| 이 | 0.11 (0.20) | 1.8 | 1.3 | 27.4 | 3.3 |
| 3 | 0.10 (0.37) | 1.8 | 1.6 | 19.5 | 3.4 |
| 4 | <TD> 0.04 (0.04)1.5 | 0.5 | 24.4 | 1.6 | |
| (5) | 0.11 (0.13) | 1.7 | 1.0 | 26.1 | 1.1 |
| (6) | 0.05 (0.03) | 1.5 | 0.7 | 15.2 | 0.4 |
| 7 | 0.01 (0.01) | 1.4 | 0.3 | 15.1 | 0.3 |
| 8 | 0.03 (0.05) | 1.6 | 0.7 | (17) | 0.9 |
| * 값은 고감도 형광 핵산 정량 분석을 이용 dsDNA 농도를 나타낸다. 괄호 안의 숫자는 microvolume 분광 광도계를 사용하여 농도를 나타냅니다. | |||||
표 1. 품질과 환경 담수 시료에서 추출한 DNA의 양 평가, 전후 트랜스포존 기반 라이브러리자동화 된 젤 크기를 선택합니다.
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Discussion
어댑터 이량 체 우선적으로 현재 플랫폼에서 염기 서열되는 작은 인서트 크기의 클러스터링의 존재는 가능한 수익률과 과소 활용 장비의 용량 (15)의 감소를 나타냅니다. 라이브러리를 준비하는 트랜스포존 기반의 접근 방식과 결합 된 비드 치는 방법의 사용은 추출 4,5의 다른 방법에 비해 DNA 전단이 발생할 수 있습니다. 순서의 분포가 8, 16을 읽고에 그럼에도 불구하고, 추출 및 라이브러리 준비의 모든 방법은 잠재적 편견을 소개합니다. 결찰 기반 방식을 조합 자동 핵산 추출 플랫폼을 사용하여 실험 관찰, 샷건 라이브러리로부터 어댑터 다이머의 과량을 제거하는 것처럼 보이지 않았다 (데이터는 보이지 않음). 본 연구함으로써 어댑터 다이머 또는 작은의 캐리 오버를 최소화 매우 특정한 크기 범위 내에서 선택에 의해 DNA 단편 환경 시료로부터의 라이브러리를 제조하는 변형 된 프로토콜을 채용DNA 단편. 자동화 겔 사이즈 선택 플랫폼의 사용은 500-800 BP (도 3)의 특정 범위 내에서 DNA 라이브러리의 재현성 흔적 생성. 원시의 큰 수를 읽는 동안 (~ 150 만)가 다른 정리의 (즉, 2 0.5 배 비율로 회)과 수정 된 프로토콜은 여기에 설명, 만 55 %에 비해 표준 치료 (0.5 배 비율로 상자성 구슬)를 사용하여 얻을 수 있었다 그보다 큰 225 bp의했다 샘플 당 읽습니다. 백분율은 225 bp의보다 큰 판독의 변성 프로토콜은 적어도 75 %를 사용하여 생성 된 샘플 당 읽는다. 표준 치료에 판독의 짧은 다수의 표현이 위에 보관함 판독 나타냈다. 겔 크기 선택에 비해 상자성 비드 (표준 치료)와 함께 선택된 조각 크기는 17 접근 변수 인 것으로보고되었다. 이 수정 된 프로토콜은 더 많은 정보를 상자성 구슬보다 읽기 생성. 라이브러리를 구축하는 선택 겔의 사용 갖는다LSO는 ~ 5 % 내지 0.02 % 9 키메라의 발생률 감소를 나타내었다.
본 프로토콜의 중요한 단계는 PCR 마스터 믹스의 입력 DNA, 도서관에서 DNA의 양, 화학 정상화를위한 고려 사항을 포함한다. 출발 입력 DNA의 농도에 따라, 시간 소모적 측정하고 또한 입력 DNA 정상화 여기함으로써 빠른 오토메이션 비드 기반 접근법 수 사용될 트랜스포존 기반 방법에서 요구 한 NG의 양 아래로 DNA를 희석 할 수있다 초기 샘플 제조 (18)에서 고려 될 수있다. 인덱스 tagmentation 및 혼합 이후, 샘플을 본 연구에 기재된 전기 영동 워크 스테이션을 이용하여 크기를 직접 선택했다. 이 과정에서 중요한 단계는 시스템에 로딩 DNA의 양이다. 광 검출 용 시료 DNA의 최소 농도는 시료의 특성 (앰플 리콘 대 샷건 서열)에 의존한다. 내장 복구 금리가되었습니다낮은 입력 샘플 및 복구 효율성> 75 %와 함께 개최하는 것으로. 여기에 설명 된 자동화 된 겔 사이즈 선택 시스템에 의해 검출 될 수있는 최저 DNA 량은 총 DNA (네스 빗, M. 및 Slodoban, J., 2014, 미발표) 1.5 NG이다. 이중 염료 마커 위치를 크기에 결정 특정 대상을 선택하는 데 사용됩니다 그럼에도 불구하고, 시료의 광학 검출, 크기 선택을 수행 할 필요가 없습니다. 환경 시료로부터 제조 된 라이브러리가 플랫폼에로드하기 전에, DNA 농도를 사용하여 형광을 정량 하였다. DNA 농도 범위는 비교적 좁은 후 PCR 샘플 (표 1)에서 검출되었다. 이러한 샘플은 염, 이량 체, DNA 중합 효소의 혼합물, 증폭 된 DNA 환경, 그리고 공개되지 않은 시약 (19), 적어도 표현이 농도를 포함하고 있었기 때문에 전기 워크 스테이션에 의해 검출 DNA의보고 된 가장 낮은 금액보다 252 배. 일반적으로, DNA의 파편의 크기 선택대신 사항 PCR 마스터 믹스의 완충액에서 수행 될 것이다. 이 프로토콜에서 사용하는 정보에 대한 PCR 마스터 믹스의 제조 미공개 되었더라도 예비 시험 믹스 이중 염료 마커의 이동을 추적하기 위해 수행되었다 (데이타 미기재). PCR 마스터 믹스의 고 이온 강도 완충액은 샘플의 전기 영동 이동성을 변경할 것이고, 따라서이 변수에 대한 수용 할 필요가있다. 이 연구에 기술 된 자동화 된 겔 선택 플랫폼은 샘플이 높은 이온 세기로 나타낼 수 있으면 옵션을 노출시킨다. 이 옵션이 사용되는 경우, 변경된 전기 영동 이동 후 커브와 지연 밴드 트래킹 파라미터가 사용된다. 따라서, PCR 믹스 화학 로딩 버퍼 표식 영향을 미칠 가능성이 있으며, 겔에 DNA 단편의 이동에 영향을 미친다.
자동 또는 반자동 겔 사이즈 선택 시판 몇몇 시스템이있다. 이들악기는 또한보다 1 시간에서 분리, 복구 및 문서를 제공합니다. 이는 이러한 시스템이 처리 할 수있는 샘플 17, 20 및 소모품과 관련된 비용의 수에 관해서 그럼에도 한계가있다. 이러한 맥락에서, 여기에 기재된 기술은 아가로 스겔 사이즈 선택 및 분석의 양쪽 측면을 처리한다. 최대 192 샘플 높은 해상도 전기로 특징 될 수있다 최대 96 샘플은 단일 실행에서 선택한 크기가 될 수 있습니다. 또한, 악기는 또한 사용자가 자동화 된 워크 스테이션에서 기대할 수있는 일반적인 액체 처리 작업을 완료 할 수 있습니다.
이 프로토콜의 원시 용출 부피는 목표 범위 (25 bp의 40 KB)에 따라 100 내지 400 μL 내지. 악기의이 양태가 제한으로서 인식 될 수 있지만, 300 μL의 부피로 용출 DNA 라이브러리 (301)의 PM 평균 농도 것이 주목되어야한다 (데이터는 보이지 않음). 이 결과 값의 파트 :변위량 MiSeq 플랫폼에서 시퀀싱에 필요한 최종 농도 (~ 오후 11시 5분)보다 26 배. 본 연구에서, 에탄올 침전 라이브러리 제조에 사용한 시간의 관점에서 추가의 공정을 나타낸다. 현재, 용출 부피는 더 상용 필터 판과 데크 (업그레이드)에 적합한 진공 매니 폴드를 사용하여 온 - 데크 진공 여과 단계를 이용함으로써 감소 될 수있다. 이 설정을 사용하여, 원료 용출 부피는 필터 플레이트로 이송하고, 농축 물을 25 μL (Slodoban, J., 2014, 개인 통신)에 재현 탁된다. 본 연구를 위해, DNA 침전이 트랜스포존 계 키트에 기술 된 바와 같이 정규화 샘플 단계에 필요한 입력 음량과 일치 흐름을 유지하기 위해 실시 하였다.
이 수정 기술은 해수, 폐수 처리장, 퇴적물, 토양, 또는 미생물 매트와 같은 다른 환경 시료로부터 제조 된 DNA 또는 cDNA를 라이브러리에 적용 할 수 있습니다. 자동여기에보고 메이트 겔 사이즈 선택 플랫폼 일루미나 시퀀싱 플랫폼뿐만 아니라, 로체 (454), 라이프 테크놀로지스, 태평양 바이오 사이언스 포함한 다른 차세대 시퀀싱 플랫폼뿐만 아니라, 최소한의 수정을 적용 할 수있다. 다른 플랫폼로드 웰 (51 μL까지) 용량, 크기 참조 또는 마커 및 아가 로스 겔 카세트의 비율 (목표 비율에 따라)을 포함에 특별한 고려 사항이 기술을 적용합니다. 이것은 높은 처리량 자동화 겔 사이즈 선택 방법은 정제 형태 판별 저비용 영동 특성화에 적합하다. 이 기술의 혜택을 누릴 수있는 다른 응용 프로그램은 RNA-SEQ 프로젝트 (기능 메타 지노믹스 포함) 긴 단편의 염기 서열, 유전자 합성, 친구 쌍 라이브러리 건설, 새로이 복잡한 게놈 시퀀싱, 제한 분석을 소화하고 유전자형을 포함한다.
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Disclosures
제라드 R. 슬로 보단 매튜 J. 네스 빗 모두 해안 유전체학, 레인저 기술을 제공하는 개인 소유의 브리티시 컬럼비아 기업의 주식을 보유.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic pump Masterflex P/S 1400 Series | Thermo Scientific | 1400-1620 | |
| 0.2 µm Supor Membrane | VWR | CA28143-969 | Pall Corporation, Ann Harbor, MI |
| Tungsten carbide beads 3 mm (200) | Qiagen | 69997 | |
| Isopropyl alcohol 70% | Jedmon Products | 825751 | Healthcare Plus |
| DNA away | VWR | 7010 | Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA |
| Milli-Q water purification system | Fisher Scientific | ZMQS6VF0Y | Merck Millipore. This system has been discontinued. |
| 20x PBS pH 7.5 | VWR | E703-1L | Amresco, Inc., Solon, OH |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | Fisher chemicals |
| Vortex adapter for 2 (50 ml) tubes | VWR | 13000-V1-50 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Vortex-Genie 2, 120 V (Model G560) | VWR | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. |
| Beckman Centrifuge | Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd | Model J-6B | |
| PowerLyzer Powersoil DNA isolation kit | VWR | 12855-100 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Vortex adapter for 24 (1.5-2 ml) tubes | VWR | 13000-V1-24 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Microfuge 18 centrifuge | Beckman Coulter | 367160 | |
| Nimbus Select workstation with Ranger Technology | Hamilton Robotics | 92720-01 | Includes the liquid handling workstation and integrated Ranger Tech (electrophoresis hardware) |
| Ranger reagent kit | Coastal Genomics | CG-10600-150-12-21 | Includes loading buffer and cassettes |
| Ethyl alcohol (anhydrous) | Commercial Alcohols | P016EAAN | Greenfield Ethanol |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250G | |
| Linear acrylamide (5 mg/ml) | Life Technologies | AM9520 | Ambion |
| Eppendorf refrigerated centrifuge | Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd. | 5417R | |
| Buffer EB (250 ml) | Qiagen | 19086 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Qubit fluorometer | Life Technologies | Q32857 | Invitrogen. This product has been discontinued. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Life Technologies | Q32854 | Invitrogen |
| High sensitivity DNA reagent | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| High sensitivity DNA chips | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent 2011 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938B | |
| Nextera XT DNA sample preparation kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT index kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| MiSeq reagent kit v2 (500-cycles) | Illumina | MS-102-2003 | |
| Miseq system | Illumina | SY-410-1003 |
References
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