Protocol
1. Raccolta Acqua e Filtrazione
- Raccogliere campioni di acqua dolce provenienti da vari siti (Figura 1). Passare campioni attraverso una serie di filtri: 1 micron filtro, filtro 0,2 micron, e 30 kDa taglio del filtro a flusso tangenziale sistematicamente eucariotica separata, particelle di dimensioni batteriche e virali, rispettivamente.
Nota: Solo la purificazione e analisi del materiale recuperato sui 0,2 micron filtri (batteri a vita libera) è descritta in questa relazione, ma approcci simili possono essere utilizzati per le altre particelle recuperate dai filtri.
2. Concentrazione batterica, estrazione e purificazione del DNA
- Rimuovere il filtro a membrana 0,2 micron (s) dal sistema di filtrazione dell'acqua (diagramma schematico, Figura 2). Piegare il filtro 0,2 micron disco a metà e posizionarlo in un tubo da 50 ml con il lato aperto in alto. Aggiungere 5 ml di soluzione tampone fosfato 1x (PBS) e 0,01% Tween, pH 7.4 inil tubo. Se più di un filtro viene utilizzato durante il processo di impiegare un tubo diverso per filtro. Tubo negozio (s) con filtro a 4 ° C fino elaborato. In caso contrario, passare al punto 2.2.
- Rimuovere il filtro 0,2 micron membrana dal tubo 50 ml con una pinza sterile. Filtro Place (s) su una piastra di Petri (lasciare il tampone PBS nel tubo).
- Con pinze sterili e forbici sterili, tagliate il filtro in piccole strisce (1 cm x 1 cm). Disinfettare pinze e forbici immergendo nel 70% isopropanolo, asciugandosi con un DNA di superficie decontaminante e risciacquo con acqua ultrapura di tipo 1 tra i diversi campioni.
- Posizionare il filtro tagliato a striscioline di nuovo nello stesso tubo da 50 ml. Aggiungere 10 ml di PBS 1x e 0,01% Tween, pH 7.4 al filtro quindi c'è un totale di 15 ml di tampone nella provetta 50 ml.
- Aggiungere 6 perle di tungsteno pulite (3 mm di diametro) in ciascun tubo 50 ml, coprire il tubo con Parafilm, e vortex energicamente per 20 minuti (utilizzare 50 ml tubi adattatore vortex). Se multiple filtri vengono elaborati da un campione, trasferimento e piscina tutto l'omogeneizzato in una provetta pulita 50 ml. Centrifugare le provette a 3.300 xg per 15 min a 4 ° C.
- Risospendere il pellet e aliquote cellule batteriche (~ 1 ml Aliquote) in 1,7 ml microprovette. Si noti che ci saranno 5 provette da microcentrifuga per campione.
- Centrifugare le provette da microcentrifuga a 10.000 xg per 10 min, e rimuovere la maggior parte del surnatante fino a ~ 200 microlitri mark.
- Conservare i campioni a -80 ° C, o procedi per estrarre DNA batterico utilizzando un kit di isolamento di DNA disponibile in commercio come da istruzioni del produttore. Durante l'uso batterica estrazione del DNA sia PBS o acqua come controllo di estrazione negativo e E. coli come controllo di estrazione positivo.
- Poiché DNA da più tubi vengono estratti, piscina sub-aliquote parallele dello stesso campione in una provetta 2 ml. Poi condurre / N precipitazione O utilizzando una soluzione composta da 0,1volumi di 3 M acetato di sodio, 2 volumi di etanolo al 100%, e 5 ml di 5 mg / mL acrilammide lineare. Mescolare bene e conservare i campioni a -80 ° C.
- Centrifugare alla massima velocità (17.000 xg) per 30 minuti a 4 ° C. Lavare pellet con 1 ml di ghiacciata etanolo al 70%, aria secca in un armadio biosicurezza per non più di 5 min e risospendere pellet di DNA in 34 ml di 10 mM Tris-Cl, pH 8,5.
Nota: acrilamide lineare aiuterà a visualizzare pellet di DNA dopo la O / N precipitazione. - Determinare la quantità di DNA e di qualità utilizzando una sensibilità elevata fluorescenza nucleico test acido quantificazione e uno spettrofotometro microvolumi, rispettivamente, seguendo le istruzioni del fabbricante (vedi tabella dei Materiali).
Nota: Se più campioni vengono preparati al momento, una fluorescenza test acido nucleico ultrasensibile per quantificare dsDNA e basata su piastra fluorimetro / spettrofotometro può essere usato al posto.
3. DNA Biblioteca Preparazione
- Enzimaticamente frammento uno nanogrammi di DNA batterico utilizzando un metodo basato trasposone-(tagmentation). Aggiungere adattatore e index sequenze sul DNA frammentato seguendo le istruzioni del produttore. Soggetto tagmented campioni a 12 cicli di PCR, come indicato nelle istruzioni del produttore, a quel punto gli indici di sequenziamento sono incorporati.
4. Automated Gel Selezione Size
- Salta standard di post-PCR clean-up step descritto nelle istruzioni del produttore (Vedi Tabella dei Materiali). Formato selezionare campioni post-PCR direttamente utilizzando una piattaforma automatizzata di selezione del formato a base di gel.
- Aggiungere 3,5 ml di tampone di caricamento per ogni campione.
- Dopo il protocollo del produttore, caricare i campioni alla workstation elettroforesi, specificando un target formato-selezione di 500-800 bp, in un estratto di 300 mlvolume di ioni, con un 1,5% di agarosio cassette pre-cast.
- Concentrare il materiale in uscita prima (300 ml), fino a 25 ml di etanolo tramite precipitazione.
Nota: In alternativa, utilizzare la workstation elettroforesi per automatizzare la concentrazione per un maggior numero di campioni tramite piastra di filtraggio e del collettore di aspirazione.- Precipitare il volume di eluizione grezzo utilizzando 0,1 volumi di 3 M acetato di sodio, 2 volumi di etanolo 100% e 5 ml di 5 mg / mL acrilammide lineare. Mescolare bene, posto i campioni a -80 ° CO / N. Centrifugare i campioni a 17.000 xg per 30 min.
- Eliminare surnatanti e procedere a lavare pellet di DNA con 1 ml di ghiacciata etanolo al 70%.
- Centrifugare i campioni di nuovo a 17.000 xg per 30 min, scartano surnatanti, aria secca, e infine risospendere pellet di DNA in 25 ml di 10 mM Tris-Cl, pH 8,5.
- (Opzionale) Utilizzare 1 ml di dimensioni librerie DNA selezionato con la piattaforma di selezione formato gel automatico per fare un cinquediluizione -fold con soluzione tampone Tris-EDTA, pH 8.0. Analizzare le librerie con uno strumento elettroforesi capillare basato su chip per analizzare dsDNA qualità secondo le istruzioni del produttore.
5. Biblioteca Normalizzazione e Sequencing
- Procedere per normalizzare i campioni utilizzando perline di normalizzazione della biblioteca (inclusi nel kit di preparazione biblioteca basato transposon-) come descritto nella guida di preparazione del produttore.
- In alternativa, misura librerie dsDNA usando un'alta sensibilità fluorescente nucleico dosaggio acido quantificazione, seguita riunendo a rapporti equimolari per raggiungere una concentrazione finale di dsDNA 2 nM. Procedere a denaturare librerie utilizzando 10 ml di biblioteche in pool e 10 ml di 0,2 N NaOH, incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Diluire librerie denaturati mediante tampone di ibridazione (incluso con il kit di preparazione a base transposon-) per un volume finale di 1 ml e la concentrazione di 11:05.
- Caricare il campiones in una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione seguendo i protocolli standard di sequenziamento del produttore.
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Representative Results
Concentrazione DNA, e valutazione della qualità
Concentrazioni DNA batterico variava ,01-0,11 ng / ml per campione dei vari siti di bacino (Tabella 1). DNA isolato da frazione batterica aveva A 260/280 e 260/230 A rapporti di 1,4-1,8 e 0,3-1,6 rispettivamente. Mentre alcuni dei coefficienti A 260/230 erano relativamente bassa, nessuna inibizione apparente è stata osservata nella biblioteca preparato e altre applicazioni a valle. Queste applicazioni incluse PCR e qPCR test destinati 16S rRNA e cpn 60, e la successiva sequenza amplicone (dati non riportati).
Ranger Tecnologia
Librerie di DNA preparati con un metodo e gel formato basato trasposone-selezionato con una piattaforma alta velocità automatizzato produssero una gamma stretta di frammenti di DNA tra 500-800 bp (Figura 3). Questo pr alternativaotocol prodotto concentrazioni comprese 0,3-3,4 ng / ml (Tabella 1). Utilizzando una media di 650 bp della dimensione del frammento di DNA, concentrazione media di questo biblioteca era 3.81 nM di materiale in entrata. Biblioteche sono stati costantemente formato selezionato in tutte le librerie del DNA preparati da più postazioni di spartiacque.
Parametri DNA Sequencing QC
Sequenziamento del DNA di questa biblioteca sul Illumina MiSeq generato una densità gruppo di 1.198 K / mm 2. La percentuale di filtri passeggera grappolo era 84,2% con una resa stimata di 9.2 Gb. Inoltre, 7.4 Gb o 82,8% del le letture avevano un punteggio di qualità ≥30. L'utilizzo di un gel piattaforma di selezione del formato automatizzata costantemente provocato rendimenti adeguati e ridurre al minimo il raggruppamento dei frammenti indesiderati sotto 200 bp.
<br /> Figura 1. I campioni di acqua sono stati raccolti da urbana (A) e agricolo (B) spartiacque influenzato.
Figura 2. Rappresentazione schematica dei metodi utilizzati per generare le librerie di DNA basato trasposoni-da campioni di acqua dolce. Cliccate qui per vedere una versione più grande della figura.
Figura 3. elettroferogrammi delle librerie di DNA generati da campioni d'acqua dolce: (A) librerie post PCR-DNA prima di selezione di formato e dimensioni (B) librerie DNA selezionate usando automatizzatoDimensioni gel (target range: 500-800 bp) piattaforma di selezione. Tutti i campioni sono stati diluiti cinque volte con tampone TE.
| Campione ambientale | Concentrazione di DNA batterico (Ng / ml) * | A 260/280 | A 260/230 | Concentrazione di DNA (ng / ml) prima selezione della dimensione, il volume: 25 microlitri | Concentrazione di DNA (ng / ml) dopo la selezione dimensione, volume: 25 microlitri |
| 1 | 0,11 (0,16) | 1.8 | 1.4 | 27 | 1.2 |
| 2 | 0.11 (0.20) | 1.8 | 1.3 | 27.4 | 3.3 |
| 3 | 0,10 (0,37) | 1.8 | 1.6 | 19.5 | 3.4 |
| 4 | <td> 0,04 (0,04)1.5 | 0.5 | 24.4 | 1.6 | |
| 5 | 0,11 (0,13) | 1.7 | 1.0 | 26.1 | 1.1 |
| 6 | 0,05 (0,03) | 1.5 | 0.7 | 15.2 | 0.4 |
| 7 | 0,01 (0,01) | 1.4 | 0.3 | 15.1 | 0.3 |
| 8 | 0,03 (0,05) | 1.6 | 0.7 | 17 | 0.9 |
| * I valori indicano la concentrazione dsDNA con un'alta sensibilità fluorescente nucleico dosaggio dell'acido quantificazione. Numero in parentesi che rappresenta la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro microvolumi. | |||||
Tabella 1. La qualità e la valutazione quantità di DNA estratto da campioni di acqua dolce ambientali, e le librerie basate trasposoni-prima e doposelezione delle dimensioni gel automatizzato.
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Discussion
La presenza di dimeri adattatori e raggruppamento di piccole dimensioni inserto preferenzialmente essere sequenziati in piattaforme attuali rappresentano una diminuzione delle rese utilizzabili e sotto-utilizzo della capacità di 15 dell'apparecchiatura. L'uso di metodi branello battitori combinati con un approccio basato trasposone-per preparare librerie può comportare più di taglio DNA rispetto ad altri metodi di estrazione 4,5. Tuttavia, tutti i metodi di estrazione e biblioteca preparazione potenzialmente introducono distorsioni alla distribuzione di sequenziamento legge 8,16. Osservazioni sperimentali che utilizzano una piattaforma di estrazione degli acidi nucleici automatica, in combinazione con un metodo basato legatura-, non sembravano per rimuovere l'eccesso di dimeri adattatori da librerie di fucile (dati non riportati). Questo studio ha utilizzato un protocollo modificato per preparare librerie di campioni ambientali di frammenti di DNA dimensioni di selezione all'interno di una gamma molto specifico, riducendo al minimo riporto di dimeri adattatori o piccoliFrammenti di DNA. L'uso di un gel piattaforma di selezione del formato automatizzato generato tracce riproducibili di librerie di DNA all'interno di un intervallo specifico di 500-800 bp (Figura 3). Mentre un numero maggiore di prima legge (~ 1,5 milioni) sono stati ottenuti mediante il trattamento standard (perline paramagnetiche a 0.5x ratio) rispetto alle altre pulizie (cioè, 2 volte a 0,5x rapporto) e il protocollo modificato qui descritte, solo il 55% dei quelle letture per campione fosse superiore a 225 bp. La percentuale di letture per campione utilizzando il protocollo modificato generato almeno il 75% delle letture superiore a 225 bp. Nel trattamento standard, il gran numero di letture indicata una sovra rappresentazione di breve legge nella libreria. Dimensioni Frammento selezionati con perline paramagnetiche (trattamento standard) sono stati segnalati per essere variabile rispetto alla selezione dimensioni gel approcci 17. Questo protocollo modificato generato più istruttiva legge di perline paramagnetiche. L'uso di selezione gel per costruire librerie ha unLSO indica una riduzione dell'incidenza di chimere da ~ 5% allo 0,02% 9.
Passaggi critici nel presente protocollo comprendono considerazioni per la normalizzazione del DNA di ingresso, quantità di DNA nelle biblioteche, e la chimica della master mix PCR. A seconda della concentrazione di partenza del DNA di ingresso, può essere quello di misurare e diluire il DNA fino a una quantità di 1 ng richiesto dal metodo basato trasposone-usato qui e approcci basati branello-quindi più veloce automatizzabili per normalizzare DNA di ingresso possono anche richiede tempo essere considerati nella preparazione del campione iniziale 18. Dopo tagmentation e l'incorporazione di indici, campioni erano direttamente formato selezionato utilizzando la workstation elettroforesi descritto in questo studio. Un punto critico in questa procedura è la quantità di DNA caricata al sistema. La concentrazione di DNA campione minimo per il rilevamento ottico dipende dalla natura del campione (amplicone rispetto shotgun sequencing). I rendimenti recupero intrinseche sono statidimostrato di tenere il passo con i campioni a basso input e le efficienze di recupero> 75%. La quantità di DNA più basso che può essere rilevato dal sistema di selezione del formato gel automatizzato qui descritto è di 1,5 ng di DNA totale (Nesbitt, M. e Slodoban, J., 2014, dati non pubblicati). Tuttavia, la rilevazione ottica del campione non è tenuto ad effettuare la selezione formato, come marcatori doppio tintura sono utilizzati per determinare dove dimensione selezionare un target specifico. Prima librerie preparate da campioni ambientali sono stati caricati nella piattaforma, concentrazione di DNA è stato quantificato utilizzando un fluorimetro. Un intervallo relativamente ristretto di concentrazioni di DNA è stato rilevato in campioni-PCR postali (Tabella 1). Anche se questi campioni contenevano una miscela di sali, dimeri, DNA polimerasi, amplificato DNA ambientale, e reagenti riservate 19, queste concentrazioni pari ad almeno 252 volte superiore al valore minimo riportato DNA rilevabile dalla workstation elettroforesi. Normalmente, selezione delle dimensioni di frag DNAmenti sarebbero effettuate in una soluzione tampone al posto della master mix PCR. Anche se le informazioni riguardanti PCR master mix utilizzato in questo protocollo è stata rivelata dal produttore, i test preliminari sono stati condotti per monitorare la migrazione dei marcatori doppia tintura nel mix (dati non riportati). Un alto buffer di forza ionica nel master mix PCR altererà la mobilità elettroforetica del campione, e quindi questa variabile deve essere stabulati per. La piattaforma di selezione gel automatizzata descritto in questo studio espone un'opzione per indicare se un campione è in alta forza ionica. Quando si utilizza questa opzione, quindi alterati curve mobilità elettroforetico e parametri di monitoraggio banda ritardati sono impiegati. Pertanto, è possibile che la chimica della miscela PCR avrà un impatto sul tampone di caricamento e marcatori, e colpisce migrazione dei frammenti di DNA nel gel.
Ci sono alcuni sistemi disponibili in commercio per la selezione automatica o semi-automatica dimensione gel. Questestrumenti forniscono anche la separazione, il recupero e la documentazione in meno di 1 ora. Tuttavia, ci sono limitazioni per quanto riguarda il numero di campioni che questi sistemi in grado di gestire, ed i costi associati con materiali di consumo 17,20. In questo contesto, la tecnica qui descritta gestisce aspetti sia gel di agarosio selezione del formato e analisi. Fino a 96 campioni possono essere formato selezionato in un unico passaggio, mentre fino a 192 campioni possono essere caratterizzati da alta risoluzione elettroforesi. Inoltre, lo strumento può anche completare le attività di gestione dei liquidi generici gli utenti si aspettano da una workstation automatizzata.
Volume RAW eluizione di questo protocollo varia da 100 a 400 microlitri, a seconda del campo di destinazione (25 bp a 40 kb). Mentre questo aspetto dello strumento può essere percepito come una limitazione, si deve notare che le librerie di DNA eluite con un volume di 300 microlitri avrebbero una concentrazione media di 301 pM (dati non mostrati). Questo valore rappre risultantesenta un 26 volte superiore alla concentrazione richiesta finale per il sequenziamento in una piattaforma MiSeq (~ 11:05). Nel presente studio, precipitazione con etanolo rappresentato un ulteriore passo in termini di tempo impiegato in preparazione libreria. Attualmente, il volume di eluizione può essere ulteriormente ridotto utilizzando una fase di filtrazione su-piattaforma vuoto che utilizza una piastra filtrante commerciale e un collettore di vuoto che si inserisce sul ponte (aggiornamento). Usando questa configurazione, il volume di eluizione grezzo viene trasferito nella piastra di filtraggio, concentrato e quindi risospeso in 25 microlitri (Slodoban, J., 2014, comunicazione personale). Per questo studio, la precipitazione del DNA è stata condotta per mantenere il flusso di lavoro coerente con il volume di ingresso necessaria per passo normalizzazione dei campioni come descritto nel kit base trasposone-.
Questa tecnica modificata può essere applicabile a librerie di DNA o cDNA preparati da altri campioni ambientali come l'acqua di mare, impianto di trattamento delle acque reflue, sedimenti, suolo, o stuoie microbiche. L'autogel accoppiate piattaforma di selezione del formato riportato qui può essere applicato con modifiche minime, non solo per le piattaforme di sequenziamento Illumina, ma anche ad altre piattaforme di sequenziamento di prossima generazione, tra cui Roche 454, Life Technologies, e BioSciences Pacifico. Considerazioni speciali per adattare questa tecnologia ad altre piattaforme includono la capacità di carico e (fino a 51 ml), i riferimenti dimensionamento o marcatori, e la percentuale di cassette gel (dipende dalla frazione di destinazione). Questo high-throughput gel automatizzato tecnica di selezione del formato è una forma di discriminazione di purificazione ed è adeguata per il basso costo caratterizzazioni elettroforetiche. Altre applicazioni che possono beneficiare di questa tecnologia includono progetti di RNA-Seq, lunga sequenza frammento (compresi metagenomica funzionali), sintesi del gene, coppia compagno costruzione biblioteca, de novo e complessi sequenziamento del genoma, restrizione digerire analisi, e genotipizzazione.
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Disclosures
Jared R. Slobodan e Matthew J. Nesbitt entrambi titolari di azioni di Coastal Genomics, una società di proprietà privata British Columbia offre la tecnologia Ranger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic pump Masterflex P/S 1400 Series | Thermo Scientific | 1400-1620 | |
| 0.2 µm Supor Membrane | VWR | CA28143-969 | Pall Corporation, Ann Harbor, MI |
| Tungsten carbide beads 3 mm (200) | Qiagen | 69997 | |
| Isopropyl alcohol 70% | Jedmon Products | 825751 | Healthcare Plus |
| DNA away | VWR | 7010 | Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA |
| Milli-Q water purification system | Fisher Scientific | ZMQS6VF0Y | Merck Millipore. This system has been discontinued. |
| 20x PBS pH 7.5 | VWR | E703-1L | Amresco, Inc., Solon, OH |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | Fisher chemicals |
| Vortex adapter for 2 (50 ml) tubes | VWR | 13000-V1-50 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Vortex-Genie 2, 120 V (Model G560) | VWR | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. |
| Beckman Centrifuge | Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd | Model J-6B | |
| PowerLyzer Powersoil DNA isolation kit | VWR | 12855-100 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Vortex adapter for 24 (1.5-2 ml) tubes | VWR | 13000-V1-24 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Microfuge 18 centrifuge | Beckman Coulter | 367160 | |
| Nimbus Select workstation with Ranger Technology | Hamilton Robotics | 92720-01 | Includes the liquid handling workstation and integrated Ranger Tech (electrophoresis hardware) |
| Ranger reagent kit | Coastal Genomics | CG-10600-150-12-21 | Includes loading buffer and cassettes |
| Ethyl alcohol (anhydrous) | Commercial Alcohols | P016EAAN | Greenfield Ethanol |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250G | |
| Linear acrylamide (5 mg/ml) | Life Technologies | AM9520 | Ambion |
| Eppendorf refrigerated centrifuge | Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd. | 5417R | |
| Buffer EB (250 ml) | Qiagen | 19086 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Qubit fluorometer | Life Technologies | Q32857 | Invitrogen. This product has been discontinued. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Life Technologies | Q32854 | Invitrogen |
| High sensitivity DNA reagent | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| High sensitivity DNA chips | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent 2011 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938B | |
| Nextera XT DNA sample preparation kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT index kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| MiSeq reagent kit v2 (500-cycles) | Illumina | MS-102-2003 | |
| Miseq system | Illumina | SY-410-1003 |
References
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