Protocol
1. Collecte de l'eau et de filtration
- Prélever des échantillons d'eau douce provenant de divers sites (figure 1). Faire passer les échantillons à travers une série de filtres: 1 um filtre, filtre de 0,2 um, et le filtre à écoulement tangentiel 30 kDa de coupure systématiquement eucaryote séparé, des particules virales et bactériennes de taille, respectivement.
Note: Seule la purification et l'analyse des matériaux récupérés sur les 0,2 um filtres (bactéries vivant en liberté) est décrite dans le présent rapport, mais des approches similaires peut être utilisé pour les autres particules récupérées sur les filtres.
2. Concentration bactérienne, extraction et purification de l'ADN
- Retirer le filtre de 0,2 um à membrane (s) à partir du système de filtration de l'eau (schéma, figure 2). Pliez le filtre de 0,2 um de disque en deux et placez-le dans un tube de 50 ml avec le côté ouvert vers le haut. Ajouter 5 ml de solution tamponnée au phosphate (PBS 1x) et 0,01% de Tween, pH 7,4 dansle tube. Si plus d'un filtre est utilisé pendant le processus employer un autre tube par filtre. tube (s) de magasin avec filtre à 4 ° C jusqu'à leur transformation. Sinon, passez à l'étape 2.2.
- Retirer le filtre à membrane de 0,2 um à partir du tube de 50 ml avec des pinces stériles. Placer le filtre (s) sur une boîte de Pétri (quitter le tampon PBS dans le tube).
- Avec des pinces stériles et ciseaux stériles, couper le filtre en petites lanières (1 cm x 1 cm). Désinfecter pinces et ciseaux par trempage dans 70% d'isopropanol, essuyant avec une surface décontaminant d'ADN et de rinçage avec de l'eau ultra-pure de type 1 entre les différents échantillons.
- Placez le filtre coupé en lanières de nouveau dans le même tube de 50 ml. Ajouter 10 ml de 1 x PBS et 0,01% de Tween, pH 7,4 pour le filtre de sorte qu'il ya un total de 15 ml de tampon dans le tube de 50 ml.
- Ajouter six perles de tungstène propres (de 3 mm de diamètre) à chaque tube de 50 ml, couvrir le tube avec du Parafilm, et le vortex vigoureusement pendant 20 min (50 ml utiliser tubes vortex adaptateur). Si multIPLE filtres sont traitées d'un échantillon, le transfert et piscine toute l'homogénat dans un tube de 50 ml propre. Centrifuger les tubes à 3300 g pendant 15 min à 4 ° C.
- Reprendre le culot et aliquotes cellules bactériennes (~ 1 ml de Aliquots) dans 1,7 ml microtubes. Notez qu'il y aura cinq microtubes par échantillon.
- Isoler les microtubes à 10 000 g pendant 10 min, et éliminer la plupart du surnageant jusqu'à ~ 200 pi marque.
- Conserver les échantillons à -80 ° C, ou de procéder à l'extraction d'ADN bactérien en utilisant un kit d'isolement d'ADN disponible dans le commerce selon les instructions du fabricant. Au cours de l'utilisation de bactéries d'extraction d'ADN, soit du PBS ou de l'eau en tant que témoin négatif de l'extraction, et E. coli comme contrôle positif d'extraction.
- Parce que l'ADN de plusieurs tubes de l'extraction, en commun sous-parallèles aliquotes du même échantillon dans un tube de 2 ml. Ensuite procéder à une O / N précipitation en utilisant une solution constituée de 0,1volumes d'acétate de sodium 3 M, 2 volumes d'éthanol à 100%, et 5 pl de 5 pg / pl acrylamide linéaire. Bien mélanger et conserver les échantillons à -80 ° C.
- Centrifuger à vitesse maximale (17 000 xg) pendant 30 min à 4 ° C. Laver culot avec 1 ml d'éthanol à 70% de glace-froid, l'air sec dans une enceinte de biosécurité pour pas plus de 5 min et remettre en suspension culot d'ADN dans 34 ul de 10 mM Tris-Cl, pH 8,5.
Remarque: acrylamide linéaire permettra de visualiser l'ADN culot après l'O / N précipitations. - Déterminer la quantité et la qualité de l'ADN en utilisant une haute sensibilité de l'essai de quantification de l'acide nucléique fluorescent et un spectrophotomètre microvolume, respectivement, en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
Remarque: Si plusieurs échantillons sont préparés à l'époque, un dosage de l'acide nucléique fluorescente ultrasensible pour quantifier l'ADN double brin et fluoromètre / spectrophotomètre à base de plaque peut être utilisé à la place.
3. Préparation de l'ADN Bibliothèque
- Fragment enzymatiquement une nanogramme d'ADN bactérien en utilisant un procédé à base de transposons (tagmentation). Ajouter adaptateur et d'index des séquences sur l'ADN fragmenté en suivant les instructions du fabricant. Sous réserve tagmented échantillons à 12 cycles de PCR comme indiqué dans les instructions du fabricant, à quel point les indices de séquençage sont incorporés.
Sélection de la taille 4. Gel automatisé
- Sautez l'étape de nettoyage post-PCR standard décrit dans les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Échantillons post-PCR Sélectionnez la taille directement en utilisant une plate-forme de sélection du format à base de gel-automatisé.
- Ajouter 3,5 pi de tampon de chargement à chaque échantillon.
- En suivant le protocole du fabricant, charger les échantillons sur le poste de travail d'électrophorèse, en spécifiant une cible de 500 à 800 pb taille-sélection, dans un extrait de 300 ulle volume d'ions, en utilisant une cassette agarose préfabriqué 1,5%.
- Concentrer le matériau de sortie brute (300 pi) jusqu'à 25 pi par précipitation à l'éthanol.
Remarque: Vous pouvez également utiliser le poste de travail d'électrophorèse pour automatiser la concentration pour un plus grand nombre d'échantillons par plaque de filtre et le collecteur à vide.- Précipiter le volume d'élution brut en utilisant 0,1 volumes de 3 M d'acétate de sodium, 2 volumes d'éthanol à 100% et 5 pl de 5 pg / pl acrylamide linéaire. Mélangez bien, placer les échantillons à -80 ° CO / N. Centrifuger les échantillons à 17 000 g pendant 30 min.
- Jeter surnageants et passez à laver culot d'ADN avec 1 ml de glace-froid à 70% d'éthanol.
- Centrifuger les échantillons à nouveau à 17 000 xg pendant 30 minutes, éliminer les surnageants, l'air sec, et finalement remises en suspension le culot dans l'ADN 25 ul de 10 mM de Tris-Cl, pH 8,5.
- (Facultatif) Utilisez 1 pl de banques d'ADN taille sélectionnée avec la plate-forme de sélection de la taille de gel automatisé pour faire un cinq-fois la dilution avec une solution de tampon Tris-EDTA, pH 8,0. Analyser les bibliothèques aide d'un instrument d'électrophorèse capillaire sur puce pour analyser la qualité ADNdb selon les instructions du fabricant.
5. Bibliothèque Normalisation et séquençage
- Passez à normaliser les échantillons en utilisant des billes de normalisation bibliothèque (inclus dans le kit de préparation de la bibliothèque à base de transposons) comme décrit dans le guide de préparation du fabricant.
- Sinon, mesurez bibliothèques ADNdb utilisant une lampe fluorescente de sensibilité du dosage de l'acide nucléique de la sensibilité élevée, suivie par la mise en commun à des rapports équimolaires pour atteindre une concentration finale de 2 nM ADN double brin. Passez à dénaturer les bibliothèques utilisant 10 pi de bibliothèques en gestion commune et 10 pi de NaOH 0,2 N, incuber pendant 5 min à température ambiante. Diluer bibliothèques dénaturés en utilisant un tampon d'hybridation (fourni avec le kit de préparation à base de transposons) jusqu'à un volume final de 1 ml et la concentration de 23:05.
- échantillon de charges dans une plate-forme de séquençage de nouvelle génération en suivant des protocoles classiques de séquençage du fabricant.
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Representative Results
Concentration d'ADN, et de l'évaluation de la qualité
Les concentrations d'ADN bactériens ont varié de 0,01 à 0,11 ng / ml pour l'échantillon d'eau des différents sites de partage des eaux (tableau 1). ADN isolé de la fraction bactérienne avait un 260/280 et 260/230 A ratios de 01.04 à 01.08 et de 0,3 à 1,6, respectivement. Bien que certains des rapports A 260/230 ont été relativement faible, aucune inhibition apparente n'a été observée dans la bibliothèque préparée et d'autres applications en aval. Ces applications incluses PCR et qPCR tests ciblant l'ARNr 16S et cpn 60 et le séquençage de l'amplicon subséquente (données non présentées).
Ranger Technologie
des banques d'ADN préparées avec un procédé et un gel à base de transposons taille sélectionnée avec une plate-forme à haut débit automatisée ont donné une fourchette étroite de fragments d'ADN entre 500 à 800 pb (figure 3). Cette solution protocole a abouti à des concentrations allant de 0,3 à 3,4 ng / ul (tableau 1). En utilisant une moyenne de 650 pb de taille des fragments d'ADN, la concentration moyenne de cette bibliothèque était de 3,81 nM de matériau d'entrée. Bibliothèques ont été systématiquement format sélectionné dans toutes les bibliothèques d'ADN préparés à partir de plusieurs endroits du bassin versant.
Séquençage de l'ADN QC Paramètres
Le séquençage d'ADN de cette bibliothèque sur la Illumina MiSeq généré une densité de faisceau de 1 198 K / mm 2. Le pourcentage de filtres de passage de munitions était de 84,2% avec un rendement estimé de 9,2 Gb. En outre, 7,4 Go ou 82,8% de la lectures avaient un score de qualité ≥30. Utilisation d'un gel plate-forme de sélection de la taille automatisé toujours entraîné des rendements appropriés et minimisé le regroupement des fragments indésirables moins de 200 pb.
<br /> Figure 1. Des échantillons d'eau ont été prélevés en milieu urbain (A) et l'agriculture (B) bassins versants influencés.
Figure 2. Représentation schématique des méthodes utilisées pour générer des bibliothèques d'ADN à base de transposons à partir d'échantillons d'eau douce. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de la figure.
Figure 3. Electrophérogrammes des banques d'ADN générées à partir d'échantillons d'eau douce: (A) bibliothèques ADN post-PCR avant la sélection de la taille et (B) des banques d'ADN en utilisant la taille choisie automatisétaille de gel (fourchette cible: 500-800 pb) plate-forme de sélection. Tous les échantillons ont été dilués cinq fois avec du tampon TE.
| Échantillon environnemental | Concentration de l'ADN bactérien (Ng / ml) * | A 260/280 | A 260/230 | concentration d'ADN (ng / ul) avant la sélection de taille, de volume: 25 pi | concentration d'ADN (ng / ul) après la sélection de taille, de volume: 25 pi |
| 1 | 0,11 (0,16) | 1,8 | 1.4 | 27 | 1.2 |
| 2 | 0,11 (0,20) | 1,8 | 1.3 | 27,4 | 3.3 |
| 3 | 0,10 (0,37) | 1,8 | 1.6 | 19,5 | 3.4 |
| 4 | <td> 0,04 (0,04)1,5 | 0,5 | 24,4 | 1.6 | |
| 5 | 0,11 (0,13) | 1,7 | 1.0 | 26,1 | 1.1 |
| 6 | 0,05 (0,03) | 1,5 | 0,7 | 15,2 | 0,4 |
| 7 | 0,01 (0,01) | 1.4 | 0,3 | 15,1 | 0,3 |
| 8 | 0,03 (0,05) | 1.6 | 0,7 | 17 | 0,9 |
| * Les valeurs indiquent la concentration ADNdb utilisant une lampe fluorescente de sensibilité du dosage de l'acide nucléique à haute sensibilité. Nombre entre parenthèses représente la concentration en utilisant un spectrophotomètre microvolume. | |||||
Tableau 1. La qualité et l'évaluation de la quantité d'ADN extrait à partir d'échantillons environnementaux d'eau douce, et les bibliothèques à base de transposons avant et aprèsautomatisée sélection de la taille de gel.
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Discussion
La présence de dimères de l'adaptateur et le regroupement des petites tailles d'insert étant préférentiellement séquencés dans les plateformes actuelles représentent une diminution des rendements et utilisables sous-utilisation de la capacité de l'équipement 15. L'utilisation de méthodes de battage de perles combinées avec une approche à base de transposons pour préparer bibliothèques peut entraîner plus d'ADN cisaillement par rapport à d'autres méthodes d'extraction 4,5. Néanmoins, toutes les méthodes d'extraction et de préparation bibliothèque introduisent des biais potentiellement à la distribution de séquençage lit 8,16. Les observations expérimentales en utilisant une plate-forme d'extraction d'acide nucléique automatisé, associé à une méthode basée sur la ligature, ne semblent pas d'éliminer l'excès de dimères d'adaptateur à partir de bibliothèques de fusil de chasse (données non présentées). Cette étude a utilisé un protocole modifié pour préparer bibliothèques à partir d'échantillons environnementaux par des fragments d'ADN de sélection de la taille dans une gamme très spécifique, minimisant ainsi le report des dimères de l'adaptateur ou petiteLes fragments d'ADN. L'utilisation d'un gel plate-forme de sélection de taille automatisée généré traces reproductibles de banques d'ADN dans une plage spécifique de 500 à 800 pb (figure 3). Bien qu'un plus grand nombre de lectures brutes (~ 1,5 millions) ont été obtenus en utilisant un traitement standard (à billes paramagnétiques rapport 0.5x) par rapport à d'autres nettoyages (soit 2 fois au rapport 0,5x) et le protocole modifié décrits ici, seulement 55% des les lectures par échantillon étaient supérieure à 225 pb. Le pourcentage de lectures par échantillon en utilisant le protocole modifié généré au moins 75% du lit supérieure à 225 pb. Dans le traitement classique, le grand nombre de lectures indiqué sur un court lit de représentation dans la bibliothèque. Les tailles des fragments sélectionnés avec des perles paramagnétiques (traitement standard) ont été signalés à être variable par rapport à la sélection de la taille de gel approches 17. Ce protocole modifié a généré plus informative lit de billes paramagnétiques. L'utilisation de la sélection de gel pour construire des bibliothèques a unLSO a indiqué une réduction de l'incidence des chimères de ~ 5% à 0,02% 9.
Les étapes critiques dans le présent protocole incluent des considérations pour la normalisation de l'ADN d'entrée, quantité d'ADN dans les bibliothèques, et la chimie du mélange maître PCR. En fonction de la concentration d'ADN d'entrée de départ, il peut prendre beaucoup de temps pour mesurer et diluer l'ADN jusqu'à une quantité de 1 ng requis par le procédé à base de transposons utilisée ici et les approches à base de billes donc automatisables plus rapide pour normaliser ADN d'entrée peut également être pris en compte dans la préparation de l'échantillon initial 18. Après tagmentation et l'incorporation des indices, des échantillons ont été directement taille sélectionnée en utilisant le poste de travail d'électrophorèse décrit dans cette étude. Une étape critique dans ce procédé est la quantité d'ADN chargé dans le système. La concentration minimale de l'échantillon d'ADN pour la détection optique dépend de la nature de l'échantillon (par rapport à l'amplicon de séquençage en aveugle). Rendements de récupération intrinsèques ont étémontré à tenir avec des échantillons faibles intrants et rendements de récupération> 75%. Le montant le plus bas d'ADN qui peut être détecté par le système de sélection de la taille de gel automatisé décrit ici est de 1,5 ng de l'ADN total (Nesbitt, M. et Slodoban, J., 2014, données non publiées). Néanmoins, la détection optique de l'échantillon ne est pas nécessaire de procéder à la sélection de la taille, comme marqueurs de colorants doubles sont utilisés pour déterminer où la taille de sélectionner une cible spécifique. Avant de banques préparées à partir d'échantillons environnementaux ont été chargés dans la plate-forme, la concentration d'ADN a été quantifiée en utilisant un fluorimètre. Une fourchette relativement étroite de concentrations d'ADN a été détecté dans des échantillons post-PCR (Tableau 1). Bien que ces échantillons contenaient un mélange de sels, des dimères, l'ADN polymérase, l'ADN amplifié de l'environnement, et les réactifs non divulgués 19, ces concentrations ont représenté au moins 252 fois plus élevé que le montant le plus bas rapporté de l'ADN détectable par le poste de travail d'électrophorèse. Normalement, la sélection de la taille de l'ADN fragments seront effectuées dans une solution tampon à la place du mélange maître PCR. Même si des informations concernant PCR Master Mix utilisé dans ce protocole n'a pas été divulgué par le fabricant, des essais préliminaires ont été menées pour suivre la migration des marqueurs double de colorant dans le mélange (données non présentées). Un tampon de force ionique élevée dans le mélange maître de PCR va modifier la mobilité électrophorétique de l'échantillon, et donc cette variable qui doit être logé à. La plate-forme de sélection de gel automatisé décrit dans cette étude expose une option pour indiquer si un échantillon est en forte force ionique. Lorsque cette option est utilisée, les courbes de mobilité électrophorétique ensuite modifié et les paramètres de suivi de bande retardés sont employées. Par conséquent, il est possible que la composition chimique du mélange de PCR aura une incidence sur le tampon de charge et des marqueurs, et affecte la migration de fragments d'ADN dans le gel.
Il existe quelques systèmes disponibles dans le commerce pour la sélection de la taille du gel automatisé ou semi-automatisé. Cesinstruments permettent également une séparation, la récupération et la documentation en moins d'une heure. Néanmoins, il ya des limites quand il se agit de nombre d'échantillons que ces systèmes peuvent gérer, et les coûts associés aux consommables 17,20. Dans ce contexte, la technique décrite ici gère à la fois les aspects de gel sélection et d'analyse de la taille d'agarose. Jusqu'à 96 échantillons peuvent être taille sélectionnée en une seule fois, alors que jusqu'à 192 échantillons peuvent être caractérisés par électrophorèse haute résolution. En outre, l'instrument peut également effectuer les tâches de manipulation de liquides génériques utilisateurs attendent d'un poste de travail automatisé.
Volume d'élution Raw de ce protocole varie de 100 à 400 pi, en fonction de la fourchette cible (25 bp à 40 kb). Bien que cet aspect de l'instrument peut être perçue comme une limitation, il faut noter que des banques d'ADN éluées avec un volume de 300 ul auraient une concentration moyenne de 301 pM (données non présentées). Ce repré de valeur résultantesente de 26 fois supérieure à la concentration requise finale pour le séquençage en une plate-forme MiSeq (~ 11,5 pm). Dans la présente étude, précipitation à l'éthanol représentait une étape supplémentaire en termes de temps employé à la préparation bibliothèque. Actuellement, le volume d'élution peut être encore réduite en utilisant une étape de filtration sous vide sur le pont qui utilise une plaque filtrante commercial et un distributeur de vide qui se adapte sur le pont (mise à niveau). Grâce à cette configuration, le volume d'élution brut est transféré dans la plaque de filtration, concentré puis remis en suspension dans 25 pi (Slodoban, J., 2014, communication personnelle). Pour cette étude, la précipitation d'ADN a été réalisée pour maintenir le flux de production compatibles avec le volume d'entrée nécessaire pour l'étape de normalisation de l'échantillon tel que décrit dans le kit à base de transposons.
Cette technique peut être modifiée applicable aux banques d'ADN ou d'ADNc préparés à partir d'autres échantillons environnementaux tels que l'eau de mer, station d'épuration, les sédiments, le sol ou tapis microbiens. L'autogel accouplée plate-forme de sélection de la taille rapportée ici peut être appliqué avec un minimum de modifications, non seulement pour les plates-formes de séquençage Illumina, mais aussi à d'autres plates-formes de séquençage de nouvelle génération, y compris Roche 454, Life Technologies, et BioSciences Pacifique. Considérations particulières pour adapter cette technologie à d'autres plates-formes comprennent la capacité de chargement de puits (jusqu'à 51 pi), des références ou des marqueurs de calibrage, et le pourcentage de la cassette de gel d'agarose (en fonction de la fraction cible). Ce gel automatisé technique de sélection de la taille à haut débit est une forme de discrimination de purification et est adéquate pour caractérisations électrophorétiques low cost. D'autres applications qui peuvent bénéficier de cette technologie comprennent des projets d'ARN-Seq, à long séquençage des fragments (y compris la métagénomique fonctionnels), la synthèse de gènes, construction de la banque partenaire de la paire, de novo et le séquençage du génome complexe, digestion de restriction, l'analyse et le génotypage.
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Disclosures
Jared R. Slobodan et Matthew J. Nesbitt deux détiennent des actions de Coastal Genomics, une société privée Colombie-Britannique offrant la technologie Ranger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic pump Masterflex P/S 1400 Series | Thermo Scientific | 1400-1620 | |
| 0.2 µm Supor Membrane | VWR | CA28143-969 | Pall Corporation, Ann Harbor, MI |
| Tungsten carbide beads 3 mm (200) | Qiagen | 69997 | |
| Isopropyl alcohol 70% | Jedmon Products | 825751 | Healthcare Plus |
| DNA away | VWR | 7010 | Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA |
| Milli-Q water purification system | Fisher Scientific | ZMQS6VF0Y | Merck Millipore. This system has been discontinued. |
| 20x PBS pH 7.5 | VWR | E703-1L | Amresco, Inc., Solon, OH |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | Fisher chemicals |
| Vortex adapter for 2 (50 ml) tubes | VWR | 13000-V1-50 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Vortex-Genie 2, 120 V (Model G560) | VWR | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. |
| Beckman Centrifuge | Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd | Model J-6B | |
| PowerLyzer Powersoil DNA isolation kit | VWR | 12855-100 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Vortex adapter for 24 (1.5-2 ml) tubes | VWR | 13000-V1-24 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Microfuge 18 centrifuge | Beckman Coulter | 367160 | |
| Nimbus Select workstation with Ranger Technology | Hamilton Robotics | 92720-01 | Includes the liquid handling workstation and integrated Ranger Tech (electrophoresis hardware) |
| Ranger reagent kit | Coastal Genomics | CG-10600-150-12-21 | Includes loading buffer and cassettes |
| Ethyl alcohol (anhydrous) | Commercial Alcohols | P016EAAN | Greenfield Ethanol |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250G | |
| Linear acrylamide (5 mg/ml) | Life Technologies | AM9520 | Ambion |
| Eppendorf refrigerated centrifuge | Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd. | 5417R | |
| Buffer EB (250 ml) | Qiagen | 19086 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Qubit fluorometer | Life Technologies | Q32857 | Invitrogen. This product has been discontinued. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Life Technologies | Q32854 | Invitrogen |
| High sensitivity DNA reagent | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| High sensitivity DNA chips | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent 2011 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938B | |
| Nextera XT DNA sample preparation kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT index kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| MiSeq reagent kit v2 (500-cycles) | Illumina | MS-102-2003 | |
| Miseq system | Illumina | SY-410-1003 |
References
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