Protocol
1. Vand Indsamling og Filtration
- Saml ferskvands prøver fra forskellige steder (Figur 1). Pass prøver gennem en række filtre: 1 um filter, 0,2 um filter, og 30 kDa cutoff tangential flow filter systematisk separat eukaryot, bakterielle og virale mellemstore partikler hhv.
Bemærk: Kun rensning og analyse af materialet genvindes på 0,2 um filtre (fritlevende bakterier) er beskrevet i denne rapport, men lignende fremgangsmåder kan anvendes til de andre partikler udvundet fra filtrene.
2. bakteriekoncentration DNA ekstraktion og oprensning
- Fjern 0,2 um membranfilter (e) fra vandfiltreringssystem (skematisk diagram, figur 2). Fold 0,2 um disc filter i halve og læg det i en 50 ml rør med den åbne side opad. Tilsæt 5 ml 1X phosphatpufret opløsning (PBS) og 0,01% Tween, pH 7,4 irøret. Hvis mere end en filter bruges under processen ansætte en anden slange pr filter. Store rør (r) med filter ved 4 ° C, indtil den forarbejdes. Ellers gå videre til trin 2.2.
- Fjern 0,2 um membranfilter fra 50 ml rør med steril pincet den. Place filter (s) på en petriskål (forlade PBS-buffer i røret).
- Med sterile pincetter og sterile sakse, skæres filteret i små strimler (1 cm x 1 cm). Desinficer pincet og saks ved opblødning i 70% isopropanol, aftørring med en DNA-overflade dekontaminant og skylning med ultrarent vand af type 1 mellem forskellige prøver.
- Filtret skåret i strimler tilbage i samme 50 ml rør. Der tilsættes 10 ml 1x PBS og 0,01% Tween, pH 7,4 til filteret, så der er i alt 15 ml af buffer i 50 ml rør.
- Tilføj 6 rene wolfram perler (3 mm i diameter) til hvert 50 ml rør, dække røret med parafilm, og vortex kraftigt i 20 minutter (brug 50 ml rør vortex adapter). Hvis multiple filtre behandles fra en prøve, overførsel og pool alle homogenatet i en ren 50 ml rør. Centrifuger rørene ved 3.300 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
- Pellet resuspenderes og alikvote bakterieceller (~ 1 ml prøver) i 1,7 ml mikrocentrifugerør. Bemærk, at der vil være 5 mikrocentrifugerør pr prøve.
- Spin ned mikrocentrifugerør ved 10.000 xg i 10 min, og fjerne det meste af supernatanten ned til ~ 200 pi mærket.
- Opbevare prøverne ved -80 ° C, eller gå videre til at udtrække bakterielt DNA ved anvendelse af et kommercielt tilgængeligt DNA isolation kit i henhold til fabrikantens anvisninger. Under bakteriel DNA-ekstraktion brug enten PBS eller vand som en negativ ekstraktionskontrol, og E. coli som en positiv ekstraktion kontrol.
- Fordi DNA fra flere rør bliver ekstraheret, pool parallelle sub-portioner fra den samme prøve i en 2 ml rør. Derefter foretage en O / N udfældning ved anvendelse af en opløsning bestående af 0,1volumener af 3 M natriumacetat, 2 volumener 100% ethanol og 5 pi af 5 pg / pl lineær acrylamid. Bland godt og opbevares prøver ved -80 ° C.
- Centrifugeres ved maksimal hastighed (17.000 x g) i 30 minutter ved 4 ° C. Vask pellet med 1 ml iskold 70% ethanol, lufttørre i en biosikkerhed kabinet til ikke mere end 5 minutter, og resuspender DNA-pelleten i 34 pi 10 mM Tris-CI, pH 8,5.
Bemærk: Lineær acrylamid vil bidrage til at visualisere DNA-pelleten efter O / N udfældning. - Bestem DNA mængde og kvalitet ved hjælp af en høj følsomhed fluorescerende nukleinsyre kvantificering assay og en microvolume spektrofotometer henholdsvis efter producentens anvisninger (se tabel Materialer).
Bemærk: Hvis flere prøver er forberedt på det tidspunkt, kan en ultrasensitiv fluorescerende nukleinsyre assay til kvantificering dsDNA og plade-baserede fluorometer / spektrofotometer bruges i stedet.
3. DNA-bibliotek Fremstilling
- Enzymatisk fragment én nanogram af bakterielt DNA ved anvendelse af en transposon-baseret metode (tagmentation). Tilføj adapter og indeksere sekvenser på fragmenteret DNA i overensstemmelse med producentens anvisninger. Emne tagmented prøver til 12 cykler af PCR, som angivet i fabrikantens anvisninger, på hvilket tidspunkt sekventering indekser er inkorporeret.
4. Automatiseret Gel Size Selection
- Spring standard post-PCR oprydning trin beskrevet i producentens anvisninger (se tabel Materialer). Størrelse udvalgte post-PCR prøver direkte anvendelse af en automatiseret gelbaseret udvælgelse størrelse platform.
- Tilføj til 3,5 pi ladningsbuffer til hver prøve.
- Efter fabrikantens protokol, indlæse prøverne på elektroforese arbejdsstation, angive en størrelse udvælgelse mål på 500-800 bp, i en 300 pi ekstraktion volumen ved hjælp af en præfabrikeret 1,5% agarose kassette.
- Koncentrer det rå output materiale (300 ul) ned til 25 pi via ethanol nedbør.
Bemærk: Du kan også bruge elektroforese arbejdsstation til at automatisere koncentration for et større antal prøver via filter plade og vakuum manifold.- Udfælde rå elueringsvolumen anvendelse af 0,1 volumener af 3 M natriumacetat, 2 volumener 100% ethanol og 5 pi af 5 pg / pl lineær acrylamid. Bland godt, sted prøver ved -80 ° CO / N. Centrifugér prøver ved 17.000 xg i 30 minutter.
- Kassér supernatanter og fortsæt til vaske DNA pellet med 1 ml iskold 70% ethanol.
- Centrifugér prøver igen ved 17.000 xg i 30 min, kasseres supernatanter, lufttørre, og endelig resuspender DNA pellet i 25 pi 10 mM Tris-CI, pH 8,5.
- (Valgfrit) Brug 1 pi DNA-biblioteker størrelse vælges med den automatiserede valg gel størrelse platform at lave en femfold fortynding ved Tris-EDTA-buffer, pH 8,0. Analyser biblioteker ved hjælp af en chip-baserede kapillarelektroforese instrument til at analysere dsDNA kvalitet i henhold til producentens anvisninger.
5. Bibliotek Normalisering og sekventering
- Fortsæt til normalisere prøver under anvendelse bibliotek normalisering perler (inkluderet i transposon-baserede præparat bibliotek kit) som beskrevet i producentens forberedelse guide.
- Alternativt måle dsDNA biblioteker ved anvendelse af en høj følsomhed fluorescerende nukleinsyre kvantificeringsassayet, efterfulgt af pooling ved ækvimolære forhold for at nå en endelig dsDNA koncentration på 2 nM. Fortsæt at denaturere biblioteker ved anvendelse 10 pi puljede biblioteker og 10 pi 0,2 N NaOH, inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur. Fortyndet denatureret biblioteker ved anvendelse hybridiseringsbuffer (inkluderet med transposon-baseret præparat kit) til et slutvolumen på 1 ml og koncentration på 11:05.
- Load prøves på en næste generation sekventering platform ved at følge producentens standard sekventering protokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DNA-koncentration, og Quality Assessment
Bakteriel DNA-koncentrationer varierede fra 0,01 til 0,11 ng / ml pr vandprøven af de forskellige skelsættende sites (tabel 1). DNA isoleret fra bakteriel fraktion havde A 260/280 og A 260/230 forhold på 1,4 til 1,8 og fra 0,3 til 1,6 hhv. Mens nogle af de A 260/230 forhold var relativt lavt, blev ingen tilsyneladende inhibering observeret i den forberedte bibliotek og andre efterfølgende anvendelser. Disse programmer omfattede PCR og qPCR-test målretning 16S rRNA og CPN 60, og efterfølgende amplicon sekventering (data ikke vist).
Ranger Technology
DNA-biblioteker fremstillet med et transposon-baseret fremgangsmåde og gel størrelse udvælges med high-throughput automatiseret platform gav et snævert interval af DNA-fragmenter mellem 500-800 bp (figur 3). Denne alternative protocol gav koncentrationer i området fra 0,3 til 3,4 ng / pi (tabel 1). Brug af et gennemsnit på 650 bp af DNA-fragment størrelse, gennemsnitlig koncentration for dette bibliotek var 3,81 nM råmateriale. Biblioteker blev konsekvent størrelse valgt i alle DNA-biblioteker fremstillet fra flere skelsættende steder.
DNA Sequencing QC Parametre
DNA-sekventering af dette bibliotek på Illumina MiSeq genererede en klynge densitet på 1.198 K / mm2. Procentdelen af klynge passerer filtre var 84,2% med en anslået udbytte på 9,2 Gb. Desuden 7,4 Gb eller 82,8% af den læser havde en kvalitet score ≥30. Udnyttelse af en automatiseret gel markering størrelse platform konsekvent ført passende udbytter og minimeret gruppering af uønskede fragmenter under 200 bp.
<br /> Figur 1. Vandprøver blev indsamlet fra byområder (A) og landbrugsmæssigt (B) påvirket vandskel.
Figur 2. Skematisk fremstilling af metoder, der anvendes til at generere transposon-baserede DNA-biblioteker fra ferskvands prøver. Klik her for at se en større udgave af figuren.
Figur 3. elektroferogrammer af DNA-biblioteker genereret fra ferskvands prøver: (A) Post-PCR DNA-biblioteker før størrelse udvælgelse og (B) DNA-biblioteker størrelse valgt ved hjælp af automatiseredegel størrelse udvælgelse platform (målområde: 500-800 bp). Alle prøver blev fortyndet fem gange med TE-buffer.
| Miljøprøve | Bakteriel DNA-koncentration (Ng / ml) * | A 260/280 | A 260/230 | DNA-koncentration (ng / pl) før valget størrelse, volumen: 25 pi | DNA-koncentration (ng / pl) efter valg størrelse, volumen: 25 pi |
| 1 | 0,11 (0,16) | 1.8 | 1.4 | 27 | 1.2 |
| 2 | 0,11 (0,20) | 1.8 | 1.3 | 27.4 | 3.3 |
| 3 | 0,10 (0,37) | 1.8 | 1.6 | 19.5 | 3.4 |
| 4 | <td> 0,04 (0,04)1.5 | 0,5 | 24.4 | 1.6 | |
| 5 | 0,11 (0,13) | 1.7 | 1,0 | 26.1 | 1.1 |
| 6 | 0,05 (0,03) | 1.5 | 0.7 | 15.2 | 0.4 |
| 7 | 0,01 (0,01) | 1.4 | 0,3 | 15.1 | 0,3 |
| 8 | 0,03 (0,05) | 1.6 | 0.7 | 17 | 0,9 |
| * værdier indikerer dsDNA koncentration på en høj følsomhed fluorescerende nukleinsyre kvantificering assay. Tallet i parentes repræsenterer koncentration på en microvolume spektrofotometer. | |||||
Tabel 1. Kvalitet og kvantitet vurdering af DNA ekstraheret fra ferskvands prøver miljømæssige og transposon-baserede biblioteker før og efterautomatiseret gel størrelse markering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tilstedeværelsen af adapter dimerer og klynger af små skærstørrelser fortrinsvis blive sekventeret i nuværende platforme udgør et fald i brugbare udbytter og underudnyttelse af udstyrets kapacitet 15. Anvendelsen af perle beating metoder kombineret med et transposon-baseret fremgangsmåde til fremstilling af biblioteker kan resultere i mere DNA klipning i forhold til andre metoder til udvinding 4,5. Ikke desto mindre er alle metoder til udvinding og bibliotek forberedelse potentielt introducere bias til fordelingen af sekventering læser 8,16. Eksperimentelle observationer anvendelse af en automatiseret nukleinsyre udvinding platform, kombineret med en ligering-baserede metode, ikke synes at fjerne overskuddet af adaptordimerer fra shotgun biblioteker (data ikke vist). Denne undersøgelse ansat en modificeret protokol til at forberede biblioteker fra miljøprøver efter størrelse Valg DNA-fragmenter inden for et meget specifikt område, hvilket minimerer overførsel af adapter dimerer eller lilleDNA-fragmenter. Anvendelsen af en automatiseret gel størrelse udvælgelse platform genereret reproducerbare spor af DNA-biblioteker i et bestemt interval af 500-800 bp (figur 3). Mens et større antal rå læser (~ 1,5 millioner) blev opnået ved anvendelse af standard behandling (paramagnetiske perler på 0,5x ratio) i forhold til andre oprydninger (dvs. 2 gange på 0,5x ratio) og modificeret protokol beskrevet her, kun 55% af de læser per prøve var større end 225 bp. Procentdelen af læser per prøve under anvendelse af den modificerede protokol genereres mindst 75% af læser større end 225 bp. I standard behandling, det store antal læser angivet en overrepræsentation af kort læser i biblioteket. Fragmentstørrelser udvalgt med paramagnetiske perler (standardbehandling) er blevet rapporteret at være variabel i forhold til valg af gel størrelse nærmer 17. Denne modificerede protokol genereret mere informativ læser end paramagnetiske perler. Anvendelsen af udvælgelse gel at bygge biblioteker har enLSO indikerede en reduktion i forekomsten af kimærer fra ~ 5% til 0,02% 9.
Kritiske trin i denne protokol omfatter overvejelser for normalisering af input DNA, mængden af DNA i bibliotekerne, og kemi af PCR Master mix. Afhængigt af start input DNA-koncentration, kan det være tidskrævende at måle og fortynde DNA ned til et beløb på 1 ng kræves af transposon-baserede metode her og dermed hurtigere kan automatiseres perle tilgange anvendes til at normalisere input DNA kan også overvejes i den indledende forberedelse prøve 18. Efter tagmentation og inkorporering af indekser, prøver direkte størrelse valgt ved hjælp af elektroforese arbejdsstation er beskrevet i denne undersøgelse. Et kritisk trin i denne procedure er mængden af DNA indlæses i systemet. Den minimale DNA-koncentration prøve til optisk detektering afhænger af arten af prøven (amplicon versus shotgun-sekventering). Intrinsic nyttiggørelse udbytter har væretvist sig at holde op med lav-input prøver og nyttiggørelse effektivitet> 75%. Den laveste DNA beløb, der kan påvises ved den automatiserede gel størrelse udvælgelse her beskrevne system er 1,5 ng total DNA (Nesbitt, M. og Slodoban, J. 2014, upublicerede data). Ikke desto mindre er optisk detektering af prøven ikke forpligtet til at foretage valg størrelse, som dobbelt farvestof markører bruges til at afgøre, hvor at størrelsen vælg bestemt mål. Før biblioteker fremstillet fra miljøprøver blev fyldt i platformen, blev DNA-koncentrationen kvantificeres ved anvendelse af et fluorometer. En relativt snævert interval af DNA-koncentrationer blev påvist i post-PCR-prøver (tabel 1). Selv om disse prøver indeholdt en blanding af salte, dimerer, DNA-polymerase, amplificeret miljømæssige DNA og skjulte reagenser 19, disse koncentrationer repræsenteret på mindst 252 gange højere end den rapporterede laveste mængde DNA påvises ved elektroforese arbejdsstation. Normalt størrelse udvælgelse af DNA fragmenter ville blive udført i en pufferopløsning i stedet for PCR Master Mix. Selvom oplysninger om PCR Master mix i denne protokol var frigivet fra producenten, blev indledende test udført for at spore migration af dobbelt farvestof markører i mix (data ikke vist). En puffer med høj ionstyrke i PCR Master mix vil ændre den elektroforetiske mobilitet af prøven, og dermed denne variabel skal imødekommes for. Den automatiserede valg gel platform er beskrevet i denne undersøgelse udsætter en mulighed for at angive, om en prøve er i høj ionstyrke. Når denne mulighed benyttes, så ændres elektroforetisk mobilitet kurver og forsinkede band sporingsparametre ansat. Derfor er det muligt, at kemien i PCR-blandingen vil have en indvirkning på loadingpufferen og markører, og påvirker migration af DNA-fragmenter i gelen.
Der er et par systemer kommercielt tilgængelige til automatiseret eller semi-automatiske udvælgelse gel størrelse. Disseinstrumenter også separation, genvinding og dokumentation på mindre end 1 time. Alligevel er der begrænsninger, når det kommer til antallet af prøver, at disse systemer kan håndtere, og de omkostninger, der er forbundet med forbrugsvarer 17,20. I denne sammenhæng den her beskrevne teknik håndterer aspekter af både agarosegel størrelse udvælgelse og analyser. Op til 96 prøver kan være størrelse valgt i en enkelt kørsel, mens op til 192 prøver kan karakteriseres med høj opløsning elektroforese. Endvidere kan instrumentet også udfylde de generiske opgaver flydende håndtering brugere forventer af en automatiseret arbejdsstation.
Rå elueringsvolumen på denne protokol spænder fra 100 til 400 pi, afhængig af målområdet (25 bp til 40 kb). Mens dette aspekt af instrumentet kan opfattes som en begrænsning, skal det bemærkes, at DNA-biblioteker elueret med et volumen på 300 pi vil have en gennemsnitlig koncentration på 301 pM (data ikke vist). Denne resulterende værdi repræterer en 26 gange højere end den krævede slutkoncentration til sekventering i en MiSeq platform (~ 11:05). I den foreliggende undersøgelse, ethanolpræcipitering udgjorde et yderligere skridt i form af tid ansat i biblioteket forberedelse. I øjeblikket kan elueringsvolumenet reduceres yderligere ved hjælp af et vakuum filtrering skridt på dæk, der bruger en kommerciel filter plade og et vakuum manifold, der passer på dækket (opgradering). Ved hjælp af denne opsætning, er det rå elueringsvolumen overført til filterpladen, koncentreret og derefter resuspenderet i 25 pi (Slodoban, J., 2014, personlig kommunikation). Til denne undersøgelse blev DNA præcipitation udført for at holde arbejdsgangen i overensstemmelse med input volumen nødvendig for normalisering prøve trin som beskrevet i transposon-baserede kit.
Denne modificerede teknik kan anvendes til DNA eller cDNA biblioteker fremstillet fra andre miljøprøver såsom havvand, rensningsanlæg, sediment, jord, eller mikrobielle måtter. Den automatiskeparret gel udvælgelse størrelse platform rapporteret her kan anvendes med minimum ændringer ikke kun Illumina sekventering platforme, men også til andre næste generation sekventering platforme, herunder Roche 454, Life Technologies, og Stillehavet BioSciences. Særlige overvejelser at tilpasse denne teknologi til andre platforme omfatter lastning godt kapacitet (op til 51 pi), dimensionering referencer eller markører, og procentdelen af agarose gel kassette (afhængig af fraktion mål). Denne high-throughput automatiseret gel udvælgelse størrelse teknik er en diskriminerende form for rensning og er passende for billige elektroforetiske karakteriseringer. Andre applikationer, der kan drage fordel af denne teknologi omfatter RNA-Seq projekter, lange fragment sekventering (herunder funktionelle metagenomics), gensyntese, mate par bibliotek konstruktion, de novo og komplekse genomsekventering, begrænsning fordøje analyse og genotypning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Jared R. Slobodan og Matthew J. Nesbitt både ejer aktier i Coastal Genomics, en privatejet British Columbia corporation tilbyder Ranger Technology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic pump Masterflex P/S 1400 Series | Thermo Scientific | 1400-1620 | |
| 0.2 µm Supor Membrane | VWR | CA28143-969 | Pall Corporation, Ann Harbor, MI |
| Tungsten carbide beads 3 mm (200) | Qiagen | 69997 | |
| Isopropyl alcohol 70% | Jedmon Products | 825751 | Healthcare Plus |
| DNA away | VWR | 7010 | Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA |
| Milli-Q water purification system | Fisher Scientific | ZMQS6VF0Y | Merck Millipore. This system has been discontinued. |
| 20x PBS pH 7.5 | VWR | E703-1L | Amresco, Inc., Solon, OH |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | Fisher chemicals |
| Vortex adapter for 2 (50 ml) tubes | VWR | 13000-V1-50 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Vortex-Genie 2, 120 V (Model G560) | VWR | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. |
| Beckman Centrifuge | Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd | Model J-6B | |
| PowerLyzer Powersoil DNA isolation kit | VWR | 12855-100 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Vortex adapter for 24 (1.5-2 ml) tubes | VWR | 13000-V1-24 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Microfuge 18 centrifuge | Beckman Coulter | 367160 | |
| Nimbus Select workstation with Ranger Technology | Hamilton Robotics | 92720-01 | Includes the liquid handling workstation and integrated Ranger Tech (electrophoresis hardware) |
| Ranger reagent kit | Coastal Genomics | CG-10600-150-12-21 | Includes loading buffer and cassettes |
| Ethyl alcohol (anhydrous) | Commercial Alcohols | P016EAAN | Greenfield Ethanol |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250G | |
| Linear acrylamide (5 mg/ml) | Life Technologies | AM9520 | Ambion |
| Eppendorf refrigerated centrifuge | Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd. | 5417R | |
| Buffer EB (250 ml) | Qiagen | 19086 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Qubit fluorometer | Life Technologies | Q32857 | Invitrogen. This product has been discontinued. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Life Technologies | Q32854 | Invitrogen |
| High sensitivity DNA reagent | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| High sensitivity DNA chips | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent 2011 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938B | |
| Nextera XT DNA sample preparation kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT index kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| MiSeq reagent kit v2 (500-cycles) | Illumina | MS-102-2003 | |
| Miseq system | Illumina | SY-410-1003 |
References
- Siuda, W., Chrost, R. J. Concentration and susceptibility of dissolved DNA for enzyme degradation in lake water - some methodological remarks. Aquatic Microbial Ecology. 21, 195-201 (2000).
- Butler, J. M., Hill, C. R. Scientific Issues with Analysis of Low Amounts of DNA. , Available from: http://www.promega.ca/resources/profiles-in-dna/2010/scientific-issues-with-analysis-of-low-amounts-of-dna (2010).
- Ficetola, G. F., Miaud, C., Pompanon, F., Taberlet, P. Species detection using environmental DNA from water samples. Biology letters. 4, 423-425 (2008).
- Liles, M. R., et al. Recovery, purification, and cloning of high-molecular-weight DNA from soil microorganisms. Applied and environmental microbiology. 74, 3302-3305 (2008).
- Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats. BioTechniques. 49, 631-640 (2010).
- Tebbe, C. C., Vahjen, W. Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast. Applied and environmental microbiology. 59, 2657-2665 (1993).
- Solonenko, S. A., et al. Sequencing platform and library preparation choices impact viral metagenomes. BMC genomics. 14, 320 (2013).
- Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome biology. 12, R18 (2011).
- Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J., et al. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines .. [et al.]. 18, 18 (2009).
- Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56, 61-64, 66, 68 (2014).
- Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental cell research. 322, 12-20 (2014).
- Grunenwald, H., Baas, B., Caruccio, N., Syed, F. Rapid, high-throughput library preparation for next-generation sequencing. Nature Methods. 7, (2010).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning : a laboratory manual. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2001).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of visualized experiments. , (2012).
- Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nature methods. 5, 1005-1010 (2008).
- Marine, R., et al. Evaluation of a transposase protocol for rapid generation of shotgun high-throughput sequencing libraries from nanogram quantities of DNA. Applied and environmental microbiology. 77, 8071-8079 (2011).
- Rohland, N., Reich, D. Cost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome research. 22, 939-946 (2012).
- Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based nextera system. Bmc Biotechnology. 13, (2013).
- Picelli, S., et al. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects. Genome research. , (2014).
- Rhodes, J., Beale, M. A., Fisher, M. C. Illuminating Choices for Library Prep: A Comparison of Library Preparation Methods for Whole Genome Sequencing of Cryptococcus neoformans Using Illumina HiSeq. PloS One. 9, e113501 (2014).
