Protocol
אוסף מים 1. וסינון
- לאסוף דגימות מים מתוקים מאתרים שונים (איור 1). לעבור דגימות באמצעות סדרה של מסננים: מסנן 1 מיקרומטר, 0.2 מיקרומטר מסנן, וזרימה משיקה מסנן 30 הפסקת kDa לשיטתי אוקריוטים נפרד, חלקיקים בגודל חיידקי וירוסים, בהתאמה.
שים לב: רק הטיהור והניתוח של החומר התאושש על 0.2 מיקרומטר המסננים (חיידקי חיים-חינם) מתואר בדוח זה, אבל גישות דומות יכולות לשמש לחלקיקים האחרים התאוששו מהמסננים.
2. ריכוז חיידקים, הפקת DNA וטיהור
- הסר את מסנן 0.2 מיקרומטר הקרום (ים) ממערכת סינון מים (תרשים סכמטי, איור 2). מקפלים את מסנן 0.2 מיקרומטר הדיסק במחצית ולמקם אותו לתוך צינור 50 מיליליטר עם הצד עד הפתוח. הוסף 5 מיליליטר של תמיסת פוספט שנאגרו 1x (PBS) ו0.01% Tween, pH 7.4 להצינור. אם מסנן אחד או יותר המשמש בתהליך להעסיק צינור שונה למסנן. צינור חנות (s) עם מסנן על 4 מעלות צלזיוס עד מעובד. אחרת, המשך לשלב 2.2.
- הסר את מסנן 0.2 מיקרומטר קרום מצינור 50 מיליליטר עם מלקחיים סטרילית. מסנן מקום (ים) על צלחת פטרי (לעזוב את חיץ PBS בצינור).
- עם מלקחיים סטרילית ומספריים סטרילי, לחתוך את המסנן לרצועות קטנות (1 סנטימטר x 1 סנטימטר). לחטא מלקחיים ומספריים על ידי השרייה בisopropanol 70%, מנגב עם decontaminant משטח DNA ושטיפה במי ultrapure מסוג 1 בין מדגמים שונים.
- הנח את המסנן חתוך לרצועות האחוריות לתוך צינור 50 מיליליטר. הוסף 10 מיליליטר של 1x PBS ו0.01% Tween, pH 7.4 למסנן ולכן יש בסך הכל 15 מיליליטר של חיץ בשפופרת 50 מיליליטר.
- הוסף 6 חרוזים נקיים טונגסטן (3 מ"מ קוטר) על צינור אחד 50 מיליליטר, לכסות את הצינור עם Parafilm, ומערבולת במרץ במשך 20 דקות (50 מיליליטר להשתמש מתאם מערבולת צינורות). אם multiple מסננים מעובדים ממדגם אחד, העברה והבריכה כל homogenate לתוך צינור 50 מיליליטר נקי. בצנטריפוגה הצינורות ב 3300 XG במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- Resuspend גלולה וaliquot תאי החיידקים (~ 1 מיליליטר aliquots) ל1.7 מיליליטר צינורות microcentrifuge. שים לב שלא יהיו 5 צינורות microcentrifuge לדגימה.
- ספין למטה צינורות microcentrifuge ב10,000 XG במשך 10 דקות, ולהסיר את רוב supernatant עד ~ 200 סימן μl.
- אחסן את הדגימות ב -80 ° C, או להמשיך כדי לחלץ DNA חיידקים באמצעות ערכת בידוד DNA זמינה מסחרי בהתאם להוראות היצרן. במהלך שימוש בקטריאלי מיצוי DNA או PBS או מים כביקורת שלילית חילוץ, וא coli כביקורת חיובית חילוץ.
- בגלל DNA מצינורות מרובים חילוץ, בריכה תת-aliquots המקביל מהמדגם זהה לצינור 2 מיליליטר אחד. לאחר מכן לערוך O / N ממטרים באמצעות פתרון מורכב מ0.1כרכים של 3 אצטט M נתרן, 2 כרכים של 100% אתנול, ו -5 μl של 5 מיקרוגרם / acrylamide יניארי μl. מערבבים היטב ודגימות חנות ב -80 מעלות צלזיוס.
- צנטריפוגה במהירות המרבית (17,000 XG) במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף גלולה עם 1 מיליליטר של אתנול קר כקרח 70%, אוויר יבש בארון בטיחות ביולוגי לשום גלולה DNA דקות יותר מ 5 וגלול בμl 34 של 10 מ"מ טריס-Cl, pH 8.5.
הערה: acrylamide ינארית תעזור לדמיין גלולה DNA לאחר O / הממטרים N. - לקבוע כמות ה- DNA ואיכות באמצעות רגישות גבוהה assay quantitation חומצות גרעין הניאון וספקטרופוטומטר microvolume, בהתאמה, בעקבות הוראות היצרנים (ראה טבלה של חומרים).
הערה: אם דוגמאות רבות מוכנות בזמן, assay הרגיש ביותר ניאון חומצות גרעין לכימות dsDNA וfluorometer / ספקטרופוטומטר פלייט מבוסס ניתן להשתמש במקום.
3. DNA ספריית הכנה
- ננוגרם אנזימי בר אחד של DNA חיידקים באמצעות שיטה המבוססת על transposon (tagmentation). להוסיף רצפי מתאם ומדד על DNA מקוטע הבאים הוראות היצרן. נושא tagmented דגימות עד 12 מחזורים של PCR כפי שצוין בהוראות היצרן, ובשלב זה מדדי הרצף משולבים.
בחירת גודל 4. האוטומטי ג'ל
- דלג על שלב ניקוי סטנדרטי פוסט-PCR המתואר בהוראות היצרן (ראה טבלה של חומרים). דגימות שלאחר PCR בחרו גודל ישירות באמצעות פלטפורמת בחירת גודל מבוסס ג'ל אוטומטי.
- להוסיף 3.5 μl של חיץ טעינה לכל דגימה.
- בעקבות הפרוטוקול של היצרן, לטעון את הדגימות על תחנת העבודה אלקטרופורזה, המפרט יעד גודל בחירה של 500-800 נקודות בסיס, בתמצית 300 μlיון נפח, באמצעות 1.5% קלטת agarose יצוקים מראש.
- לרכז את חומר גלם הפלט (300 μl) עד 25 μl באמצעות משקעים אתנול.
הערה: לחלופין, להשתמש בתחנת העבודה אלקטרופורזה כדי להפוך ריכוז למספרים גדולים יותר של דגימות באמצעות צלחת מסנן וסעפת ואקום.- לזרז גלם באמצעות 0.1 כרכים של 3 אצטט M נתרן, 2 כרכים של 100% אתנול ו 5 μl של 5 מיקרוגרם / acrylamide יניארי μl נפח elution. מערבבים היטב, דגימות מקום ב -80 CO ° / N. צנטריפוגה דגימות 17,000 XG למשך 30 דקות.
- בטל supernatants ולהמשיך לשטוף גלולה DNA עם 1 מיליליטר של אתנול 70% קרים כקרח.
- צנטריפוגה דגימות שוב ב17,000 XG למשך 30 דקות, להשליך supernatants, אוויר יבש, ולבסוף resuspend גלולה DNA ב -25 μl של 10 מ"מ טריס-Cl, pH 8.5.
- (אופציונאלי) μl 1 של ספריות DNA גודל שנבחר עם פלטפורמת בחירת גודל ג'ל האוטומטית השתמש לעשות חמשדילול -fold באמצעות פתרון חיץ טריס-EDTA, pH 8.0. לנתח ספריות באמצעות מכשיר אלקטרופורזה נימים מבוסס שבב לנתח איכות dsDNA על פי הוראות יצרן.
5. ספריית נורמליזציה ורצף
- המשך לנרמל דגימות באמצעות חרוזים ספריית נורמליזציה (כלולים בערכת הכנת ספרייה מבוססת transposon) כפי שמתואר במדריך להכנה של היצרן.
- לחלופין, למדוד ספריות dsDNA באמצעות assay רגישות גבוהה ניאון גרעין quantitation החומצה, ואחרי איגום ביחסי equimolar להגיע ריכוז dsDNA סופי של 2 ננומטר. המשך לפגל ספריות באמצעות 10 μl של ספריות ונקוו ו -10 μl של 0.2 N NaOH, דגירה של 5 דקות על RT. לדלל ספריות מפוגלים באמצעות מאגר הכלאה (כלול בערכת ההכנה מבוססת transposon) לנפח סופי של 1 מיליליטר וריכוז של 11.5 בערב.
- טען מדגםים בפלטפורמת רצף של הדור הבא על ידי ביצוע פרוטוקולי הרצף הסטנדרטי של היצרן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ריכוז ה- DNA, והערכת איכות
ריכוזי DNA חיידקים נעו 0.01-0.11 ng / ml לדגימה מים של אתרי פרשת מים השונים (טבלה 1). DNA מבודד מחלק חיידקים היה 260/280 ו260/230 יחסים של 1.4-1.8 ו0.3-1.6, בהתאמה. בעוד שחלק מ260/230 היחסים היו נמוך יחסית, אין עיכוב ניכר נצפה בספרייה מוכנה ויישומים במורד הזרם אחרים. יישומים אלה כללו PCR וqPCR בדיקות מיקוד rRNA 16S וCPN 60, ורצף amplicon שלאחר מכן (מידע לא מוצג).
Ranger טכנולוגיה
ספריות DNA מוכנות עם גודל שיטה וג'ל מבוסס transposon נבחר עם פלטפורמת תפוקה גבוהה אוטומטית הניבו מגוון הדוק של שברי DNA בין 500-800 נקודות בסיס (איור 3). יחסי ציבור חלופה זוotocol הניב ריכוזים הנעים 0.3-3.4 ng / μl (טבלת 1). שימוש ממוצע של 650 נ"ב בגודל קטע DNA, ריכוז ממוצע לספרייה זו היה 3.81 ננומטר של חומר הזנה. ספריות היו באופן עקבי גודל שנבחרו בכל ספריות ה- DNA שהוכנו ממקומות פרשת מים מרובים.
פרמטרי DNA רצף QC
רצפי DNA של ספרייה זו על MiSeq Illumina נוצרו צפיפות מקבץ של 1,198 K / 2 מ"מ. אחוז מסנני פטירת אשכול היה 84.2% עם תשואה משוערת של 9.2 Gb. יתר על כן, 7.4 GB או 82.8% מהכניסות היו ציון איכות ≥30. הניצול של פלטפורמת בחירת גודל ג'ל אוטומטית הביא באופן עקבי בתשואות מתאימות ולמזער האשכולות של שברים לא רצויים תחת 200 נ"ב.
<br /> איור 1. דגימות מים נאספו מעירוני () וחקלאי פרשות מים (B) השפיעו.
איור 2. ייצוג סכמטי של שיטות המשמשות ליצירת ספריות DNA מבוסס transposon מדגימות מים מתוקים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.
איור 3. Electropherograms של ספריות ה- DNA שנוצרו מדגימות מים מתוקים: (א) ספריות Post-PCR DNA לפני בחירת גודל וגודל ספריות (B) DNA שנבחרו באמצעות אוטומטי(יעד: 500-800 נקודות בסיס) גודל ג'ל פלטפורמת בחירה. כל הדגימות היו מדוללים פי חמישה עם חיץ TE.
| מדגם סביבתי | ריכוז ה- DNA חיידקים (Ng / ml) * | 260/280 | 260/230 | ריכוז ה- DNA (ng / μl) לפני בחירת גודל, נפח: 25 μl | ריכוז ה- DNA (ng / μl) לאחר בחירת גודל, נפח: 25 μl |
| 1 | 0.11 (0.16) | 1.8 | 1.4 | 27 | 1.2 |
| 2 | 0.11 (0.20) | 1.8 | 1.3 | 27.4 | 3.3 |
| 3 | 0.10 (0.37) | 1.8 | 1.6 | 19.5 | 3.4 |
| 4 | <td> 0.04 (0.04)1.5 | 0.5 | 24.4 | 1.6 | |
| 5 | 0.11 (0.13) | 1.7 | 1.0 | 26.1 | 1.1 |
| 6 | 0.05 (0.03) | 1.5 | 0.7 | 15.2 | 0.4 |
| 7 | 0.01 (0.01) | 1.4 | 0.3 | 15.1 | 0.3 |
| 8 | 0.03 (0.05) | 1.6 | 0.7 | 17 | 0.9 |
| * ערכים מצביעים על ריכוז dsDNA באמצעות assay גרעין ניאון רגישות גבוהה quantitation החומצה. מספר בסוגריים מייצג ריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר microvolume. | |||||
טבלת 1. איכות והערכת כמות ה- DNA שחולץ מן דגימות מים מתוקים סביבתיות, וספריות מבוססות transposon לפני ואחריבחירת גודל ג'ל אוטומטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הנוכחות של הדימרים מתאם ואשכולות של גדלים להכניס קטנים מעדיפים להיות רצף בפלטפורמות הנוכחיות מייצגת ירידה בתשואות שמישים ותת-ביצוע ביכולתו של הציוד 15. השימוש בשיטות מכות חרוז בשילוב עם גישה מבוססת transposon להכין ספריות עלול לגרום ליותר גז DNA בהשוואה לשיטות אחרות של 4,5 חילוץ. עם זאת, כל השיטות של הכנת מיצוי וספריית פוטנציאל להציג את ההטיות לחלוקת הרצף קוראת 8,16. תצפיות ניסיוניות באמצעות פלטפורמה אוטומטית גרעין חילוץ חומצה, בשילוב עם שיטה המבוססת על קשירה, לא נראות לי להסיר את העודפים של הדימרים מתאם מספריות רובה (מידע לא מוצג). מחקר זה השתמש בפרוטוקול שונה כדי להכין את הספריות מדגימות סביבתיות על ידי שברי DNA בחירת גודל בטווח מאוד ספציפי, ובכך לצמצם שריד של הדימרים מתאם או קטניםשברי DNA. השימוש בפלטפורמת בחירת גודל ג'ל אוטומטי שנוצרה עקבות לשחזור של ספריות DNA בתוך טווח מסוים של 500-800 נקודות בסיס (איור 3). בעוד שמספר גדול של גלם קורא (~ 1.5 מ') התקבלו באמצעות טיפול סטנדרטי (חרוזים פאראמגנטיים ב0.5x יחס) בהשוואה לניקוי אחר (כלומר, פי 2 ב0.5x יחס) והפרוטוקול שונה שתוארו כאן, 55% בלבד מ אלה קוראים לדגימה היו גדולים יותר מאשר 225 נ"ב. אחוז קורא לדגימה באמצעות הפרוטוקול שונה שנוצר לפחות 75% מקורא יותר מ 225 נ"ב. בטיפול הסטנדרטי, המספר הגדול של קורא הצביע על ייצוג של קצר קורא בספרייה. גדלי בר נבחרים עם חרוזים פאראמגנטיים (טיפול סטנדרטי) כבר דיווחו להיות משתנה בהשוואה לבחירת גודל ג'ל גישות 17. פרוטוקול שונה זו נוצר יותר אינפורמטיבי קורא מחרוזי פאראמגנטיים. השימוש בג'ל לבחירה לבנות ספריות ישסימפוני דווח על ירידה בשכיחות של מפלצות מ~ 5% עד 0.02% 9.
צעדים קריטיים בפרוטוקול הנוכחי כוללים שיקולים לנורמליזציה של DNA קלט, כמות ה- DNA בספריות, וכימיה של מיקס מאסטר PCR. בהתאם לריכוז ה- DNA הקלט מתחיל, זה יכול להיות למדידה ולדלל את ה- DNA עד לסכום של 1 ננוגרם הנדרש על ידי השיטה המבוססת על transposon משמשת כאן וגישות המבוסס על חרוז כך מהר automatable לנרמל DNA קלט יכול גם גוזל זמן ייחשב בהכנת המדגם הראשונית 18. בעקבות tagmentation ושילוב של מדדים, דגימות היו ישירות גודל שנבחר באמצעות תחנת העבודה אלקטרופורזה המתוארת במחקר זה. שלב קריטי בהליך זה הוא כמות ה- DNA הטעון במערכת. מדגם ריכוז ה- DNA המינימאלי לזיהוי אופטי תלוי באופי של המדגם (amplicon הרצף לעומת רובה ציד). תשואות התאוששות מהותיות היומוצג להחזיק עם דגימות נמוך קלט ויעילות התאוששות> 75%. כמות ה- DNA הנמוכה ביותר שיכול להיות מזוהות על ידי מערכת בחירת גודל האוטומטית ג'ל המתואר כאן היא 1.5 ננוגרם של DNA הכולל (נסביט, מ 'וSlodoban, J., 2014, נתונים שלא פורסמו). עם זאת, זיהוי אופטי של המדגם אינו נדרש לבצע בחירת גודל, כסמני צבע כפולים משמשים כדי לקבוע היכן גודל לבחור יעד ספציפי. לפני ספריות הוכנו מדגימות סביבתיות הועמסו לתוך הפלטפורמה, ריכוז ה- DNA היה לכמת באמצעות fluorometer. טווח צר יחסי של ריכוזי DNA התגלה בדגימות שלאחר PCR (טבלת 1). למרות שהדגימות אלה הכילו תערובת של מלחים, הדימרים, DNA פולימרז, DNA הסביבתי מוגבר, וריאגנטים שלא פורסמו 19, ריכוזים אלה מייצגים לפחות 252-לקפל גבוהים מהסכום הנמוך ביותר שדווח של DNA לזיהוי על ידי תחנת העבודה אלקטרופורזה. בדרך כלל, בחירת גודל frag DNAמפעלים היו להתבצע בפתרון חיץ במקום תערובת אמן PCR. למרות שתערובת אמן PCR מידע לגבי שימוש בפרוטוקול זה הייתה שלא פורסם מהיצרן, בדיקות ראשוניות שנערכו כדי לעקוב אחר נדידה של סמני צבע כפולים בתמהיל (מידע לא מוצג). מאגר כוח יוני גבוה בתמהיל אב PCR ישנה את ניידות electrophoretic של המדגם, ובכך משתנה זה צריך להיות לאכלס ל. פלטפורמת בחירת ג'ל האוטומטית מתוארת במחקר זה חושפת אפשרות כדי לציין אם מדגם הוא בכוח יוני גבוה. כאשר אפשרות זו משמשת, עקומות ניידות electrophoretic אז שינו ופרמטרי מעקב הלהקה מתעכבים מועסקים. לכן, ייתכן שהכימיה של PCR התערובת תהיה השפעה על מאגר הטעינה וסמנים, ומשפיעה על הגירה של שברי DNA בג'ל.
יש כמה מערכות זמינות מסחרי לבחירה אוטומטית או אוטומטי למחצה גודל ג'ל. אלהמכשירים מספקים גם הפרדה, התאוששות, ותיעוד בשעה פחות מ 1. עם זאת, יש מגבלות כשמדובר במספר הדגימות שמערכות אלה יכולים להתמודד, ואת העלויות כרוכות במתכלה 17,20. בהקשר זה, הטכניקה שתוארה כאן מטפלת בהיבטים של שתי בחירת agarose ג'ל גודל וניתוח. עד 96 דגימות יכולות להיות גודל שנבחר בטווח אחת, בעוד שניתן לאפיין עד 192 דגימות עם אלקטרופורזה ברזולוציה גבוהה. יתר על כן, המכשיר יכול גם להשלים את משימות הטיפול נוזלי הגנרית משתמשים מצפים מתחנת עבודה אוטומטית.
Raw elution נפח של פרוטוקול זה נע 100-400 μl, בהתאם לטווח היעד (25 נ"ב 40 kb). בעוד היבט זה של המכשיר עשוי להיתפס כהגבלה, יש לציין כי ספריות DNA eluted בהיקף של 300 μl תהיה ריכוז ממוצע של 301 בערב (מידע לא מוצג). repre ערך כתוצאה זהsents לקפל 26-גבוהים מהריכוז הנדרש הסופי עבור סידור בפלטפורמת MiSeq (~ 11:05). במחקר הנוכחי, משקעים אתנול ייצגו צעד נוסף במונחים של זמן שהועסק בהכנת ספרייה. נכון לעכשיו, elution הנפח ניתן להפחית עוד יותר על ידי שימוש בצעד סינון ואקום על סיפון המשתמש בצלחת מסנן מסחרית וסעפת ואקום שמתאימה על הסיפון (שדרוג). באמצעות התקנה זו, גלם elution הנפח מועבר לתוך צלחת המסנן, מרוכז ולאחר מכן resuspended ב -25 μl (Slodoban, J., 2014, תקשורת אישית). במחקר זה, משקעים DNA נערכו כדי לשמור על זרימת העבודה עולה בקנה אחד עם הקלט דרוש לצעד מדגם נורמליזציה כפי שתואר בערכה מבוססת transposon הנפח.
טכניקה זו שונה יכולה להיות רלוונטית לספריות DNA או cDNA שהוכנו מדגימות סביבתיות אחרות כגון מי ים, מתקן לטיפול בשפכים, משקעים, אדמה, או מחצלות חיידקים. האוטומטיפלטפורמת בחירת גודל ג'ל הזדווגו דיווחה כאן יכולה להיות מיושמת עם שינויים מינימליים לא רק לפלטפורמות רצף Illumina, אלא גם לפלטפורמות רצף של הדור הבא אחרות כוללים 454 רוש, Life Technologies, וBioSciences האוקיינוס השקט. שיקולים מיוחדים כדי להתאים את הטכנולוגיה הזאת לפלטפורמות אחרות כוללות יכולת טעינה גם (עד 51 μl), אזכור או סמנים לשינוי גודל, ואחוז קלטת agarose ג'ל (תלוי בשבריר היעד). טכניקת בחירת גודל זה תפוקה גבוהה ג'ל האוטומטי היא צורה מפלה של טיהור ומתאימה לאפיוני electrophoretic עלות נמוכה. יישומים אחרים שיכולים להפיק תועלת מטכנולוגיה זו כוללים פרויקטי RNA-Seq, רצף בר ארוך (כולל metagenomics הפונקציונלי), סינתזת גן, בניית ספריית זוג זוג, דה נובו ורצף הגנום מורכב, הגבלה לעכל ניתוח, וgenotyping.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ג'ארד ר 'סלובודן ומתיו ג' נסביט הן להחזיק במניות של החוף Genomics, תאגיד קולומביה הבריטית בבעלות פרטית המציע את הטכנולוגיה Ranger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic pump Masterflex P/S 1400 Series | Thermo Scientific | 1400-1620 | |
| 0.2 µm Supor Membrane | VWR | CA28143-969 | Pall Corporation, Ann Harbor, MI |
| Tungsten carbide beads 3 mm (200) | Qiagen | 69997 | |
| Isopropyl alcohol 70% | Jedmon Products | 825751 | Healthcare Plus |
| DNA away | VWR | 7010 | Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA |
| Milli-Q water purification system | Fisher Scientific | ZMQS6VF0Y | Merck Millipore. This system has been discontinued. |
| 20x PBS pH 7.5 | VWR | E703-1L | Amresco, Inc., Solon, OH |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | Fisher chemicals |
| Vortex adapter for 2 (50 ml) tubes | VWR | 13000-V1-50 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Vortex-Genie 2, 120 V (Model G560) | VWR | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. |
| Beckman Centrifuge | Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd | Model J-6B | |
| PowerLyzer Powersoil DNA isolation kit | VWR | 12855-100 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Vortex adapter for 24 (1.5-2 ml) tubes | VWR | 13000-V1-24 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Microfuge 18 centrifuge | Beckman Coulter | 367160 | |
| Nimbus Select workstation with Ranger Technology | Hamilton Robotics | 92720-01 | Includes the liquid handling workstation and integrated Ranger Tech (electrophoresis hardware) |
| Ranger reagent kit | Coastal Genomics | CG-10600-150-12-21 | Includes loading buffer and cassettes |
| Ethyl alcohol (anhydrous) | Commercial Alcohols | P016EAAN | Greenfield Ethanol |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250G | |
| Linear acrylamide (5 mg/ml) | Life Technologies | AM9520 | Ambion |
| Eppendorf refrigerated centrifuge | Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd. | 5417R | |
| Buffer EB (250 ml) | Qiagen | 19086 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Qubit fluorometer | Life Technologies | Q32857 | Invitrogen. This product has been discontinued. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Life Technologies | Q32854 | Invitrogen |
| High sensitivity DNA reagent | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| High sensitivity DNA chips | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent 2011 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938B | |
| Nextera XT DNA sample preparation kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT index kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| MiSeq reagent kit v2 (500-cycles) | Illumina | MS-102-2003 | |
| Miseq system | Illumina | SY-410-1003 |
References
- Siuda, W., Chrost, R. J. Concentration and susceptibility of dissolved DNA for enzyme degradation in lake water - some methodological remarks. Aquatic Microbial Ecology. 21, 195-201 (2000).
- Butler, J. M., Hill, C. R. Scientific Issues with Analysis of Low Amounts of DNA. , Available from: http://www.promega.ca/resources/profiles-in-dna/2010/scientific-issues-with-analysis-of-low-amounts-of-dna (2010).
- Ficetola, G. F., Miaud, C., Pompanon, F., Taberlet, P. Species detection using environmental DNA from water samples. Biology letters. 4, 423-425 (2008).
- Liles, M. R., et al. Recovery, purification, and cloning of high-molecular-weight DNA from soil microorganisms. Applied and environmental microbiology. 74, 3302-3305 (2008).
- Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats. BioTechniques. 49, 631-640 (2010).
- Tebbe, C. C., Vahjen, W. Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast. Applied and environmental microbiology. 59, 2657-2665 (1993).
- Solonenko, S. A., et al. Sequencing platform and library preparation choices impact viral metagenomes. BMC genomics. 14, 320 (2013).
- Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome biology. 12, R18 (2011).
- Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J., et al. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines .. [et al.]. 18, 18 (2009).
- Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56, 61-64, 66, 68 (2014).
- Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental cell research. 322, 12-20 (2014).
- Grunenwald, H., Baas, B., Caruccio, N., Syed, F. Rapid, high-throughput library preparation for next-generation sequencing. Nature Methods. 7, (2010).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning : a laboratory manual. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2001).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of visualized experiments. , (2012).
- Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nature methods. 5, 1005-1010 (2008).
- Marine, R., et al. Evaluation of a transposase protocol for rapid generation of shotgun high-throughput sequencing libraries from nanogram quantities of DNA. Applied and environmental microbiology. 77, 8071-8079 (2011).
- Rohland, N., Reich, D. Cost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome research. 22, 939-946 (2012).
- Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based nextera system. Bmc Biotechnology. 13, (2013).
- Picelli, S., et al. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects. Genome research. , (2014).
- Rhodes, J., Beale, M. A., Fisher, M. C. Illuminating Choices for Library Prep: A Comparison of Library Preparation Methods for Whole Genome Sequencing of Cryptococcus neoformans Using Illumina HiSeq. PloS One. 9, e113501 (2014).
