Protocol
1. Recolección de Agua y Filtración
- Recoger muestras de agua dulce de varios sitios (Figura 1). Pase muestras a través de una serie de filtros: 1 micras filtro, filtro de 0,2 micras, y 30 kDa de corte del filtro de flujo tangencial a sistemáticamente eucariota separado, partículas de tamaño bacterianas y virales, respectivamente.
Nota: Sólo la purificación y análisis del material recuperado en las 0,2 micras filtros (bacterias de vida libre) se describe en este informe, pero enfoques similares se puede utilizar para las otras partículas recuperadas de los filtros.
2. Concentración bacteriana, ADN Extracción y Purificación
- Retire el filtro de membrana de 0,2 micras (s) del sistema de filtración de agua (diagrama esquemático, figura 2). Doble el filtro de 0,2 micras disco en medio y lo coloca en un tubo de 50 ml con el lado abierto hacia arriba. Añadir 5 ml de solución tamponada con fosfato (PBS 1x) y 0,01% de Tween, pH 7,4 enel tubo. Si se utiliza más de un filtro durante el proceso de emplear un tubo diferente por filtro. Tubo (s) tienda con filtro a 4 ° C hasta su transformación. De lo contrario, continúe con el paso 2.2.
- Retire el filtro de 0,2 micras membrana desde el tubo de 50 ml con una pinza estéril. Place filtro (s) en una placa de Petri (dejar el tampón PBS en el tubo).
- Con pinzas estériles y tijeras estériles, cortar el filtro en tiras pequeñas (1 cm x 1 cm). Desinfectar pinzas y tijeras por inmersión en el 70% de isopropanol, limpiando con un descontaminante superficie ADN y enjuagar con agua ultrapura de tipo 1 entre las diferentes muestras.
- Coloque el filtro de corte en tiras de nuevo en el mismo tubo de 50 ml. Añadir 10 ml de 1x PBS y 0,01% de Tween, pH 7,4 para el filtro por lo que hay un total de 15 ml de tampón en el tubo de 50 ml.
- Añadir 6 perlas de tungsteno limpias (3 mm de diámetro) a cada tubo 50 ml, cubrir el tubo con Parafilm, y agitar vigorosamente durante 20 min (50 ml adaptador de utilizar tubos de vórtice). Si multIPLE filtros se procesan de una muestra, la transferencia y la piscina todo el homogeneizado en un tubo de 50 ml limpio. Centrifugar los tubos a 3300 xg durante 15 min a 4 ° C.
- Resuspender las células bacterianas de pellets y alícuotas (~ 1 ml alícuotas) en 1,7 ml tubos de microcentrífuga. Tenga en cuenta que habrá 5 tubos de microcentrífuga por muestra.
- Centrifugar los tubos de microcentrífuga a 10.000 xg durante 10 min, y eliminar la mayor parte del sobrenadante hasta ~ 200 marca l.
- Almacenar las muestras a -80 ° C, o proceder a extraer el ADN bacteriano mediante el uso de un kit de aislamiento de ADN disponibles comercialmente según las instrucciones del fabricante. Durante el uso de extracción de ADN bacteriano o bien PBS o agua como control negativo de extracción, y E. coli como un control positivo de extracción.
- Debido a que el ADN de múltiples tubos se extraen, piscina sub-paralelas alícuotas de la misma muestra en un tubo de 2 ml. A continuación, llevar a cabo una / N precipitación O mediante el uso de una solución compuesta de 0,1volúmenes de acetato de sodio 3 M, 2 volúmenes de etanol 100%, y 5 l de 5 mg / l de acrilamida lineal. Mezclar bien y guarde las muestras a -80 ° C.
- Centrifugar a velocidad máxima (17.000 xg) durante 30 min a 4 ° C. Lavar la pella con 1 ml de etanol al 70% enfriado con hielo, secar al aire en una cabina de bioseguridad por no más de 5 min y resuspender el pellet de ADN en 34 l de 10 mM Tris-Cl, pH 8,5.
Nota: acrilamida lineal ayudará a visualizar sedimento de ADN después de la O / N precipitación. - Determinar la cantidad de ADN y la calidad utilizando una alta sensibilidad del ensayo de cuantificación de ácidos nucleicos fluorescente y un espectrofotómetro microvolumen, respectivamente, siguiendo las instrucciones del fabricante (Ver Tabla de Materiales).
Nota: Si múltiples muestras se preparan en el momento, un ensayo ultrasensible de ácido nucleico fluorescente para la cuantificación de ADN de doble cadena y con base de placa fluorómetro / espectrofotómetro se puede utilizar en su lugar.
3. Preparación de ADN Biblioteca
- Enzimáticamente fragmento de un nanogramo de ADN bacteriano utilizando un método basado en transposón (tagmentation). Añadir adaptadores e índice secuencias en el ADN fragmentado siguiendo las instrucciones del fabricante. Asunto tagmented muestras a 12 ciclos de PCR como se indica en las instrucciones del fabricante, momento en el que se incorporan los índices de secuenciación.
4. Gel Automatizado Tamaño Selección
- Saltar paso estándar de limpieza post-PCR se describe en las instrucciones del fabricante (Ver Tabla de Materiales). Tamaño selectas muestras post-PCR directamente utilizando una plataforma de selección de tamaño a base de gel automatizado.
- Añadir 3,5 l de tampón de carga a cada muestra.
- Siguiendo el protocolo del fabricante, cargar las muestras en la estación de trabajo de la electroforesis, especificando un objetivo de selección de tamaño de 500-800 pb, en un extracto de 300 lvolumen de iones, usando un casete de agarosa prefabricado 1,5%.
- Se concentra el material de salida en bruto (300 l) a 25 l mediante precipitación con etanol.
Nota: También puede utilizar la estación de trabajo de electroforesis para automatizar la concentración de un mayor número de muestras a través de la placa de filtro y colector de vacío.- Precipitar el volumen de elución en bruto utilizando 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M, 2 volúmenes de etanol 100% y 5 l de 5 mg / l de acrilamida lineal. Mezclar bien, colocar las muestras a -80 ° CO / N. Centrifugar las muestras a 17.000 xg durante 30 min.
- Desechar los sobrenadantes y proceder a lavar sedimento de ADN con 1 ml de etanol al 70% enfriado con hielo.
- Centrifugar las muestras de nuevo a 17.000 xg durante 30 min, descartar los sobrenadantes, secar al aire, y finalmente se resuspenden sedimento de ADN en 25 l de 10 mM Tris-Cl, pH 8,5.
- (Opcional) Utilice 1 l de tamaño bibliotecas de ADN seleccionado con la plataforma de selección del tamaño de gel automatizado para hacer un cincodilución -fold utilizando solución tampón Tris-EDTA, pH 8,0. Analizar las bibliotecas utilizando un instrumento de electroforesis capilar a base de chip para analizar la calidad de dsDNA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
5. Biblioteca Normalización y secuenciación
- Proceda a normalizar las muestras usando perlas de normalización de la biblioteca (incluidas en el kit de preparación de biblioteca basado en transposón) como se describe en la guía de preparación del fabricante.
- Alternativamente, las bibliotecas dsDNA medir usando un ensayo de cuantificación fluorescente de ácido nucleico de alta sensibilidad, seguido por la puesta en común en relaciones equimolares para llegar a una concentración final de 2 nM dsDNA. Proceder para desnaturalizar las bibliotecas utilizando 10 l de bibliotecas agrupadas y 10 l de 0,2 N NaOH, incubar durante 5 min a TA. Diluir bibliotecas desnaturalizados utilizando tampón de hibridación (incluido con el kit de preparación basado en transposón) a un volumen final de 1 ml y la concentración de 23:05.
- Cargue la muestras en una plataforma de secuenciación de próxima generación siguiendo protocolos de secuenciación estándar del fabricante.
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Representative Results
Concentración de ADN, y la Evaluación de la Calidad
Las concentraciones de ADN bacteriano oscilaron 0,01 a 0,11 ng / ml por muestra de agua de los diferentes sitios de la cuenca (Tabla 1). ADN aislado de la fracción bacteriana tenía A 260/280 y 260/230 A proporciones de 01/04 a 01/08 y de 0,3 a 1,6, respectivamente. Aunque algunos de los A 260/230 proporciones eran relativamente bajos, ninguna inhibición aparente se observó en la biblioteca preparada y otras aplicaciones posteriores. Estas aplicaciones incluyen PCR y qPCR pruebas dirigidas 16S rRNA y cpn 60, y la secuencia de amplificación subsiguiente (datos no mostrados).
Guardabosques Tecnología
Bibliotecas de ADN preparadas con un método y un gel de tamaño basado en transposón seleccionada con una plataforma de alto rendimiento automatizado produjeron un rango estrecho de fragmentos de ADN entre 500-800 pb (Figura 3). Esta pr alternativaotocol produjo concentraciones que van desde 0,3 hasta 3,4 ng / l (Tabla 1). Utilizando un promedio de 650 pb de tamaño de los fragmentos de ADN, la concentración media de esta biblioteca fue 3,81 nM de material de entrada. Las bibliotecas fueron consistentemente tamaño seleccionado en todas las bibliotecas de ADN preparados a partir de múltiples lugares de la cuenca.
Parámetros de Secuenciación de DNA de control de calidad
La secuenciación de ADN de esta biblioteca en la Illumina MiSeq genera una densidad racimo de 1198 K / mm 2. El porcentaje de los filtros de paso de racimo fue del 84,2%, con un rendimiento estimado de 9,2 Gb. Por otra parte, 7,4 Gb o 82,8% de las lecturas tuvieron una puntuación de calidad ≥30. La utilización de una plataforma de selección del tamaño de gel automatizado resultó consistentemente en los rendimientos adecuados y minimiza la agrupación de fragmentos no deseados debajo de 200 pb.
<br /> Figura 1. Las muestras de agua se recogieron de las zonas urbanas (A) y la agricultura (B) cuencas influido.
Figura 2. Representación esquemática de los métodos utilizados para generar bibliotecas de ADN basado en transposón de las muestras de agua dulce. Haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.
Figura 3. Electroferogramas de las bibliotecas de ADN generados a partir de muestras de agua dulce: (A) las bibliotecas de Post-PCR ADN antes de la selección del tamaño y las dimensiones (B) bibliotecas de ADN seleccionadas usando la automatizadatamaño de gel (rango objetivo: 500-800 pb) plataforma de selección. Todas las muestras se diluyeron cinco veces con tampón TE.
| Muestra Ambiental | Concentración de ADN bacteriano (Ng / ml) * | A 260/280 | A 260/230 | Concentración de ADN (ng / l) antes de la selección de tamaño, volumen: 25 l | Concentración de ADN (ng / l) después de la selección de tamaño, volumen: 25 l |
| 1 | 0,11 (0,16) | 1.8 | 1.4 | 27 | 1.2 |
| 2 | 0,11 (0,20) | 1.8 | 1.3 | 27.4 | 3.3 |
| 3 | 0,10 (0,37) | 1.8 | 1.6 | 19.5 | 3.4 |
| 4 | <td> 0,04 (0,04)1.5 | 0.5 | 24.4 | 1.6 | |
| 5 | 0,11 (0,13) | 1.7 | 1.0 | 26.1 | 1.1 |
| 6 | 0,05 (0,03) | 1.5 | 0.7 | 15.2 | 0.4 |
| 7 | 0,01 (0,01) | 1.4 | 0.3 | 15.1 | 0.3 |
| 8 | 0,03 (0,05) | 1.6 | 0.7 | 17 | 0.9 |
| * Los valores indican la concentración de ADN de doble cadena usando un ensayo fluorescente cuantificación de ácidos nucleicos de alta sensibilidad. El número entre paréntesis representa la concentración usando un espectrofotómetro microvolumen. | |||||
Tabla 1. Calidad y la evaluación de la cantidad de ADN extraído de muestras de agua dulce ambientales, y bibliotecas basadas en transposón antes y despuésselección del tamaño de gel automatizado.
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Discussion
La presencia de dímeros de adaptador y la agrupación de pequeños tamaños de inserción preferentemente ser secuenciados en las plataformas actuales representan una disminución en los rendimientos utilizables y subutilización de la capacidad del equipo 15. El uso de métodos de batido de talón combinado con un enfoque basado en transposón para preparar bibliotecas puede resultar en más de cizallamiento ADN en comparación con otros métodos de extracción de 4,5. Sin embargo, todos los métodos de extracción y preparación de la biblioteca potencialmente introducir sesgos a la distribución de secuenciación lee 8,16. Las observaciones experimentales utilizando una plataforma de extracción de ácidos nucleicos automatizada, combinado con un método basado en la ligadura, no parecían para eliminar el exceso de dímeros de adaptador de bibliotecas de escopeta (datos no mostrados). Este estudio empleó un protocolo modificado para preparar bibliotecas de muestras ambientales por fragmentos de ADN Selección del tamaño dentro de un intervalo muy específico, minimizando de este modo el arrastre de dímeros de adaptador o pequeñaFragmentos de ADN. El uso de una plataforma de selección de tamaño de gel automatizado genera trazas reproducibles de bibliotecas de ADN dentro de un rango específico de 500-800 pb (Figura 3). Mientras que un mayor número de prima lee (~ 1,5 millones) se obtuvieron utilizando tratamiento estándar (perlas paramagnéticas en 0.5x ratio) en comparación con otras limpiezas (es decir, 2 veces en relación 0.5x) y el protocolo modificado aquí descritos, sólo el 55% de las lecturas por muestra fueron superiores a 225 pb. El porcentaje de lecturas por muestra utilizando el protocolo modificado generado al menos el 75% de lecturas mayor que 225 pb. En el tratamiento estándar, el gran número de lecturas indica una sobre representación de corto lee en la biblioteca. Tamaños de los fragmentos seleccionados con perlas paramagnéticas (tratamiento estándar) se han notificado a ser variable en comparación con la selección de tamaño de gel enfoques 17. Este protocolo modificado genera más informativo lee de perlas paramagnéticas. El uso de la selección gel para construir bibliotecas tiene unalso indicó una reducción en la incidencia de quimeras de ~ 5% a 0,02% 9.
Los pasos críticos en el presente protocolo incluyen consideraciones para la normalización de ADN de entrada, cantidad de ADN en las bibliotecas, y la química de la mezcla maestra de PCR. Dependiendo de la concentración de ADN de entrada de partida, puede llevar mucho tiempo para medir y diluir el ADN hasta una cantidad de 1 ng requerido por el método basado en transposón utilizada aquí y los enfoques basados en perlas por lo tanto más rápido automatizables para normalizar entrada de ADN puede también tenerse en cuenta en la preparación de la muestra inicial de 18. Tras tagmentation y la incorporación de índices, las muestras fueron directamente tamaño seleccionado utilizando la estación de trabajo de electroforesis descrito en este estudio. Un paso crítico en este procedimiento es la cantidad de ADN cargado en el sistema. La concentración de ADN mínimo de la muestra para la detección óptica depende de la naturaleza de la muestra (amplicón frente secuenciación shotgun). Rendimientos de recuperación intrínsecas han sidose muestra para sostener con muestras de bajos insumos y la eficiencia de recuperación> 75%. La cantidad de ADN más bajo que puede ser detectado por el sistema de selección del tamaño de gel automatizado descrito aquí es de 1,5 ng de ADN total (Nesbitt, M. y Slodoban, J., 2014, datos no publicados). Sin embargo, la detección óptica de la muestra no se requiere para llevar a cabo la selección de tamaño, como marcadores de tinte duales se utilizan para determinar dónde tamaño seleccionar un objetivo específico. Antes de bibliotecas preparadas a partir de muestras ambientales fueron cargados en la plataforma, la concentración de ADN se cuantificó usando un fluorómetro. Se detectó un rango relativamente estrecho de concentraciones de ADN en muestras de enviar-PCR (Tabla 1). Aunque estas muestras contenían una mezcla de sales, dímeros, ADN polimerasa, el ADN amplificado del medio ambiente, y los reactivos no revelados 19, estas concentraciones representados al menos 252 veces mayor que la cantidad más baja reportada de ADN detectable por la estación de trabajo electroforesis. Normalmente, la selección de tamaño de fragmentos de ADNmentos se llevarían a cabo en una solución tampón en lugar de la mezcla maestra de PCR. A pesar de información con respecto a mezcla maestra de PCR utilizado en este protocolo fue revelada desde el fabricante, se llevaron a cabo pruebas preliminares para realizar un seguimiento de la migración de los marcadores de colorante doble en la mezcla (datos no mostrados). Un tampón de alta fuerza iónica en la mezcla maestra de PCR se altera la movilidad electroforética de la muestra, y por lo tanto esta variable necesita ser acomodado para. La plataforma de selección gel automatizado descrito en este estudio expone una opción para indicar si una muestra está en alta fuerza iónica. Cuando se utiliza esta opción, se emplean curvas de movilidad electroforética entonces alterados y parámetros de seguimiento banda retardadas. Por lo tanto, es posible que la química de la mezcla de PCR tendrá un impacto en el tampón de carga y los marcadores, y afecta a la migración de fragmentos de ADN en el gel.
Hay unos pocos sistemas disponibles comercialmente para la selección automatizado o semi-automatizado tamaño de gel. Estosinstrumentos también proporcionan la separación, recuperación y documentación en menos de 1 hora. Sin embargo, hay limitaciones cuando se trata de número de muestras que estos sistemas pueden manejar, y los costos asociados con consumibles 17,20. En este contexto, la técnica descrita aquí se ocupa de aspectos tanto de selección de tamaño en gel de agarosa y análisis. Hasta 96 muestras pueden ser de tamaño seleccionado en una sola carrera, mientras que hasta 192 muestras pueden caracterizarse con alta resolución electroforesis. Además, el instrumento también puede realizar las tareas de manejo de líquidos genéricos usuarios esperan de una estación de trabajo automatizado.
Volumen de elución Raw de este protocolo varía de 100 a 400 l, dependiendo del rango meta (25 pb a 40 kb). Si bien este aspecto del instrumento puede ser percibido como una limitación, se debe señalar que las bibliotecas de ADN se eluyó con un volumen de 300 l tendrían una concentración media de 301 pM (datos no mostrados). Esto repre valor resultantesenta un 26 veces mayor que la concentración final requerida para la secuenciación en una plataforma MiSeq (~ 23:05). En el presente estudio, la precipitación con etanol representa un paso adicional en términos de tiempo empleado en la preparación de la biblioteca. En la actualidad, el volumen de elución puede reducirse aún más mediante el uso de una etapa de filtración en-cubierta de vacío que utiliza una placa de filtro comercial y un colector de vacío que se ajusta en la cubierta (actualización). Utilizando esta configuración, el volumen de elución prima se transfiere a la placa de filtro, se concentró y luego volvió a suspender en 25 l (Slodoban, J., 2014, comunicación personal). Para este estudio, la precipitación de ADN se llevó a cabo para mantener el flujo de trabajo consistente con el volumen de entrada necesaria para el paso de la muestra de normalización como se describe en el kit basado en transposón.
Esta técnica modificada puede ser aplicable a ADN o ADNc bibliotecas preparadas a partir de otras muestras ambientales tales como el agua de mar, planta de tratamiento de aguas residuales, los sedimentos, el suelo, o esteras microbianas. El autogel acoplado plataforma de selección de tamaño reportado aquí se puede aplicar con modificaciones mínimas, no sólo a las plataformas de secuenciación de Illumina, sino también a otras plataformas de secuenciación de próxima generación, incluyendo Roche 454, Life Technologies y Pacific Biosciences. Consideraciones especiales para adaptar esta tecnología a otras plataformas incluyen capacidad de carga bien (hasta 51 l), las referencias o los marcadores de tamaño, y el porcentaje de casete en gel de agarosa (dependiendo de la fracción objetivo). Este gel automatizado técnica de selección del tamaño de alto rendimiento es una forma de discriminación de la purificación y es adecuada para la caracterización electroforética de bajo coste. Otras aplicaciones que pueden beneficiarse de esta tecnología incluyen proyectos de RNA-Seq, secuenciación fragmento largo (incluyendo la metagenómica funcional), la síntesis de genes, par compañero de construcción de la biblioteca, de novo y compleja la secuenciación del genoma, análisis de restricción enzimática y genotipado.
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Disclosures
Jared R. Slobodan y Matthew J. Nesbitt tanto tienen acciones de Coastal Genomics, una corporación British Columbia privada que ofrece la tecnología de Ranger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic pump Masterflex P/S 1400 Series | Thermo Scientific | 1400-1620 | |
| 0.2 µm Supor Membrane | VWR | CA28143-969 | Pall Corporation, Ann Harbor, MI |
| Tungsten carbide beads 3 mm (200) | Qiagen | 69997 | |
| Isopropyl alcohol 70% | Jedmon Products | 825751 | Healthcare Plus |
| DNA away | VWR | 7010 | Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA |
| Milli-Q water purification system | Fisher Scientific | ZMQS6VF0Y | Merck Millipore. This system has been discontinued. |
| 20x PBS pH 7.5 | VWR | E703-1L | Amresco, Inc., Solon, OH |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | Fisher chemicals |
| Vortex adapter for 2 (50 ml) tubes | VWR | 13000-V1-50 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Vortex-Genie 2, 120 V (Model G560) | VWR | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. |
| Beckman Centrifuge | Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd | Model J-6B | |
| PowerLyzer Powersoil DNA isolation kit | VWR | 12855-100 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Vortex adapter for 24 (1.5-2 ml) tubes | VWR | 13000-V1-24 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Microfuge 18 centrifuge | Beckman Coulter | 367160 | |
| Nimbus Select workstation with Ranger Technology | Hamilton Robotics | 92720-01 | Includes the liquid handling workstation and integrated Ranger Tech (electrophoresis hardware) |
| Ranger reagent kit | Coastal Genomics | CG-10600-150-12-21 | Includes loading buffer and cassettes |
| Ethyl alcohol (anhydrous) | Commercial Alcohols | P016EAAN | Greenfield Ethanol |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250G | |
| Linear acrylamide (5 mg/ml) | Life Technologies | AM9520 | Ambion |
| Eppendorf refrigerated centrifuge | Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd. | 5417R | |
| Buffer EB (250 ml) | Qiagen | 19086 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Qubit fluorometer | Life Technologies | Q32857 | Invitrogen. This product has been discontinued. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Life Technologies | Q32854 | Invitrogen |
| High sensitivity DNA reagent | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| High sensitivity DNA chips | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent 2011 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938B | |
| Nextera XT DNA sample preparation kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT index kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| MiSeq reagent kit v2 (500-cycles) | Illumina | MS-102-2003 | |
| Miseq system | Illumina | SY-410-1003 |
References
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