Abstract
종양 (양성 대조적으로) 정상 조직 주변의 내습 일반적 악성의 주요 특징 인 것으로 간주된다. 특히 일부 암 (. 예, 예컨대 아교 모세포종 홍반과 헤드의 편평 상피 세포 암 및 목 등 뇌종양 - SCCHN) 그것은 심각한 이환율의 원인과 생명을 위협하는 원격 전이의 부재 하에서조차 할 수있다. 또한, 재발 한 암은 불행하게도 종종 존재하는보다 적극적인 표현형과 치료를 다음과 같습니다. 따라서, 표준 항 - 증식 제제 상보 수 신규 치료법을 제공하는 침입 과정을 표적으로 할 수있는 기회가있다. 지금까지,이 전략은 침략에 대한 자세한 분석 및 약물 검사에 적합한 강력한 재현 분석의 부족에 의해 방해되었다. 여기에 우리가 간단한 마이크로 플레이트 방법을 제공 (유니폼을 기반으로, 자기 조립 3D 종양 회전 타원체)를 같은 STU에 대한 큰 잠재력을 가지고죽는다. 또한 인간 아교 모세포종 세포주 및 대상 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 억제제에 대해 내성이 강화 매트릭스 개발 침습 전위와 연관된 SCCHN 모델을 이용하여 분석 플랫폼을 예시한다. 사이토 이미지를 사용하여 하나 단순히 디지털 이미지 분석과 표준 현미경 및 이미지 캡처를 요구하는 두 번째 : 우리는 또한 반자동 정량의 두 가지 다른 방법을 제공합니다.
Introduction
고전 항암제 개발은 종양 세포 증식을 억제 및 / 또는 프로그램 된 세포 사멸 (아폽토시스)를 촉진 세포 독성 제에 대한 스크린 시험 관내 세포 - 기반 분석의 사용에 주로 집중된다. 최근의 노력은 악성 세포 증식의 근본적인 원인 분자 억제제의 개발 치료 표적을 향해 이동했다. 일부 극적인 결과에도 불구하고, 이러한 제제는 종종 약물 내성의 급속한 발전과 관련된다. 이 암 사망의 대부분을 담당하는 종양 세포의 침윤과 전이의 가능성이 있으며, 그 재발 질병은 종종 그것이 시험 관내 실험 모델 소설을 식별 1,2 상보 고려하는 것이 논리적이다 공격적인 표현형을 나타낸다 감안할 암의 이러한 추가 키 '특징'을 억제하는 것입니다 요원.
악성 진행하는 동안 종양 세포 취득주변 조직을 침범 및 / 또는 원격 장기 (전이)로 확산 할 수있는 능력. 암세포는 3,4- invadopodia의 형성에 의해 기저막을 뚫고. 이러한 구조는 액틴 필라멘트, 특정 접착 단백질 및 단백질 분해 효소로 통칭하고 농축 종양 세포 운동성 및 세포 외 기질 (ECM) (5)의 저하에 대한 책임이있다. Invadopodia는 ECM 내로 연장하고, 종양 세포의 침윤을위한 중요하고 또한 혈행 (또는 림프계) 보급과 전이를 촉진, 혈관 외 유출 채널로 여겨진다.
현재 표준 방법은 다음과 같다 시험 관내 종양 세포의 침윤을 평가. 트랜스 웰 기반 또는 보이든 챔버 분석법 단일 세포 현탁액은 ECM 유래 단백질의 두꺼운 층으로 코팅 된 필터의 상부에 시딩 2,6-. 세포는 침입 항암 화학 유인 물질에 반응하여 하부 챔버로 이동한다. 일반적으로 사용되는 전자 재료단백질은 내가 콜라겐 타입, 또는 기저막의 자연 성분을 모방 (EHS 종양 (7)에서 파생 된 BMM, 예를 들어, 마트 리겔) 기저막 같은 행렬.
필터 기반 보이 덴 챔버 형 분석법 (8)에 대한 대안으로서, 셀은 겔 내로 침입 개별적으로 또는 집합 적으로 다음 단층과 형성 (섬유 아세포 첨가 수도있는) ECM 겔 위에 시드 할 수있다. 침윤 겔 표면 (9)로부터 침입하는 세포 이동 및 / 또는 거리의 개수로 측정 될 수있다. 일반적으로 세포가 주위 매트릭스 2,6,10,11로 종양 덩어리에서 침입하게 ECM의 겔의 두 층 사이에 위치 - 종양 세포는 완전 매트릭스로 어느 하나의 세포 현탁액 또는 타원체로 내장 될 수있다.
여기에 설명 된 3 차원 (3D) 타원체 종양 침윤 분석은 highl를 사용하여 신속하고 내습 오토메이션 시스템을 제공한다웰 당 하나의 회전 타원체와 96- 웰 플레이트 형식으로 재현 Y, 표준화 된 방법 (12). BMM은 종양 세포가 구형 본체로부터 침입되는 반 고형 매트릭스를 제공하기 위해 각 웰에 직접 첨가된다. 96 시간 - 종양 세포 침윤의 정도는 72 시간에 걸쳐 간격으로 모니터링된다. 이 방법은 상기 언급 한 현재 관내 침윤 분석에 비해 다음과 같은 장점을 제공한다 : 세포를 종양 미세 영역 또는 미세 전이를 흉내 낸 3 차원 구조로 구성되어 종양; 종양의 크기는 회전 타원체 높은 재현성; 침입 분석은 보조 플레이트로 이동할 필요없이 종양 타원체 개발 같은 플레이트에서 반응계에서 수행된다; 자동화 된 이미지 분석의 최신 기술과 결합 방법은, 모두 높은 컨텐츠를 가능하게하고 높은 처리량은 종양 세포 침윤 분석.
이미지 분석은 96 웰 세포 계측기를 스캔 촬상을 이용하여 수행된다10 분 이내 판. 합류 응용 프로그램을 사용하여, 어느 정도의 비율과 내습 단일 세포 또는 세포 클러스터 종양 타원체에서 밖으로 확산 및 동적 방식으로 측정 될 수 매트릭스 내로 침입하거나하여 달성했다. 낮은 처리량 들어, 이미지 분석을위한 다른 방법은 반전 된 현미경 및 이미징 소프트웨어 표준의 사용에 기초하여 제시된다.
Protocol
재현성 크기의 종양 회전 타원체의 1 세대
- 인산염 완충 식염수 세척 종양 세포 단층 (PBS; 25cm 2 8 5 ㎖ - 75cm이 플라스크 10 ㎖) 세포 해리 효소 (ADD 75cm 대 25cm이 1 mL를 2 mL의 5 분 - 2 37 ℃에서 2 플라스크) 및 배양 세포.
- 현미경에서 세포 분리를 확인하고 (75cm 2 플라스크 위해 25cm 2 또는 8 ㎖에 5 ml)에 완전 성장 배지로 세포 분해 효소를 중화.
- 5 분 500 XG에 원심 분리기 세포 현탁액.
- , 뜨는을 제거 튜브를 누르고 P1000 피펫을 사용하여 전체 성장 매체의 1 ml의 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 이것은 셀 클러스터없이 단일 세포 현탁액을 수득한다.
- 혈구를 사용하여 세포를 세어 얻었다 세포 현탁액을 희석 0.5-2 × 104 세포 / ㎖ (최적의 셀 밀도는 O의 각 세포주에 대해 결정해야) 셀은 12, 13를 파종 한 후 500 μm의 직경 4 일 - RDER 300의 종양 회전 타원체을 얻었다.
- 잘 초저 첨부 파일 (ULA) 96 웰 둥근 바닥 판 (12)에 / 멸균 용기에 세포 현탁액을 전송하고, 멀티 채널 피펫을 사용하여, 200 μl를 분배.
- 인큐베이터 (37 ℃, 5 % CO 2, 95 % 습도)에 접시를 전송합니다. 나중에 4 일, 시각적으로 종양 회전 타원체의 형성을 확인하고 3D 침공 분석 진행합니다.
2. 3D 종양 회전 타원체 침공 분석
- 얼음에 BMM을 해동.
- P10에 대한 살균 필터 팁의 집합을 유지 P200 및 P1000 피펫과 멸균 튜브 (1.5 ml의 볼륨에 필요한 총 부피에 따라 이상) -20 ° C에서.
- 얼음에 4 일된 회전 타원체를 포함하는 ULA 96 웰 플레이트를 놓습니다.
- 멀티 채널 피펫을 사용하여 부드럽게 회전 타원체 판에서 성장 배지 100 ㎕ / 웰을 제거합니다. 이 단계 각도에 대한 I 향해 팁웰 타원체의 위치의 바닥과 접촉을 피 U 바닥 웰 nside 벽; 회전 타원체의 교란을 최소화 할 수 있습니다.
- 빙냉 팁을 사용하여, 빙냉 BMM 튜브에 옮긴다. 약물 평가 연구 사이토 카인에 의한 침략 또는를 들어, 얼음처럼 차가운 팁을 사용하여 BMM에 (배 최종 농도) 시약을 추가합니다. 예를 들어, CAL S 및 R CAL 편평 상피 암 세포의 침윤을 촉진하는 표피 성장 인자 (EGF)를 사용한다. 부드럽게 소용돌이 거품의 형성을 회피함으로써 잘 섞는다.
- 부드럽게 잘의 내부 벽쪽으로 팁을 목표로, U-바닥 우물에 BMM 100 μl를 분배. 최적 화상 분석을 위해, 구 상체는 웰 (12)의 중심에 남아 있어야으로서이 단계는 가장 중요하다.
- 6 복제 / 조건 - 5 수 있도록 필요한 모든 우물, 단계를 반복 2.6. 필요한 경우, 갓 냉각 팁을 변경합니다.
참고 : 경험, dispen멀티 채널 피펫을 사용하여 자체 BMM. - 존재하는 경우 멸균 바늘을 사용하여, 거품을 제거합니다.
- 현미경을 사용하여 시각적으로 회전 타원체는 중앙 위치에 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 4 ℃에서 3 분 동안 300 XG에서 접시를 원심 분리기. 이 회전 타원체가 중앙은 물론 각에 위치되어 있는지 확인합니다.
- 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 전송하고 BMM이 응고 할 수 있습니다.
- 1 시간 후, 멀티 채널 피펫을 사용하여 부드럽게 100 μL / 전체 성장 매체의 잘을 추가합니다. 사이토킨 - 유도 침윤 또는 약물 평가 연구를 위해, 배지 또는 사이토킨 억제제 (최종 농도를 1 배)를 포함한다. 시약이 단계 2.5 BMM에 첨가되지 않은 경우 또는, (원하는 최종 농도의 3 배)이 시점에서 매체에 추가.
3. 자동 이미지 인식
- 사이토에 스캔 판 간격 역에서 (사양은 장비 및 재료의 표 참조)즉시 72 시간, 또는 느린 침입 종양 세포 라인을위한 96 시간까지의 단계 2.10 이후 제로 (T0 = 설정 침공 분석의 날, 시간에서 rting.
- '합류'응용 프로그램을 선택합니다.
- 회전 타원체에 초점이 있음을 확인하고, 필요한 경우, 수동으로 조정하고 '설정 오프 포커스'를 수정.
- 뷰 (FOV)의 중앙 필드를 스캔 선택 '샘플링 설정'에서. BMM을 첨가 한 다음, 종양 타원체 따라서 전체 웰을 검사 할 필요가없고, 중앙 위치에 남아있을 것이다.
- 소프트웨어에서 우물을 판지도를 강조 표시하여 스캔 할 정의합니다. '검사 시작'을 클릭합니다.
참고 : 스캔이 자동으로 저장되고 나중에 오프라인 검토 할 수 있습니다.
4. 자동 이미지 분석
- '합류'응용 프로그램을 선택합니다.
- '분석'탭에서 APPLIC를 조정ATION 설정 (예를 들어, "정확도"낮은, 보통 높은; "강도 임계치": 1 - 15) BMM (도 1 참조)으로 연장되는 세포 프로세스 및 invadopodia 포함 타원체 주위 정확한 분할을 생성한다. 각 종양 세포주 및 / 또는 다양한 시점에서의 설정을 조정한다. '합류'응용 대책 선택된 FOV에서 세포 침입에 의해 덮여 웰 영역의 %.
- 분석 설정이 몇 가지 다른 우물을 클릭하여 접시에 다른 타원체에 대한 (즉, 세그먼트가 정확) 적절한 지 확인합니다. 분할 정확하게 회전 타원체를 개설하지 않는 경우, 추가 응용 프로그램 설정을 조정합니다.
- '분석 시작'을 클릭합니다.
- '결과'탭에서, 분석의 품질을 확인하기 위해 여러 우물을 확인합니다. 스프레드 시트 프로그램에 내보내기 '음 레벨 데이터'.
- Repea모든 시점 t에 대한 분석. 과학 그래프 선택의 통계 소프트웨어를 사용하여 복제 우물과 막대 차트에서 시간에 대한 플롯 침공 (% 합류)에 대한 평균 %의 합류를 계산합니다.
5. 수동 이미지 획득
- t 행 = 0 최대 72 시동 간격마다 종양 타원체 용 화상을 기록 - 96 시간이 약 20 소요 96- 웰 플레이트 반전 현미경 (하여 해당 세포주의 침윤의 속도에 따라 - 30 분). 10X 목표를 사용합니다. 침범 영역이 완전히 뷰 10X 필드 내에서 포착되기에 너무 큰 경우 4X 목표를 사용한다.
- 획득 한 각각의 이미지를 저장합니다.
- 교정의 경우, 모두 10 배와 4 배 목표를 사용하여 스테이지 계수 (1mm)의 이미지를 가지고 (및 이미지를 저장).
6. 수동 이미지 분석
- 원하는 이미지 분석 소프트웨어로 스테이지 눈금 이미지를 연다.
- 한 위대한를 입력icule 측정, (μm) 단위, 목적 사용 (10 배 또는 4 배)와 교정을 수행합니다. 이 단계는 한 번만 필요합니다. 후속 이미지 분석을 위해, 단지 필요한 캘리브레이션 설정을 재로드.
- 침공 분석 이미지를 열고 현미경 목표 (10 배 또는 4 배)에 따라 보정 설정을 선택하여 이미지를 얻기 위해 사용.
- 도립 현미경을 사용하여 얻어진 이미지에 대하여 기술 된 바와 같이 (도 3 및도 4에 도시 된 결과를 참조), 혹은, 수입 이미지 (단계 3) 사이토 촬상하여 얻어진 수동 분석.
- 회전 타원체의 적용 영역을 측정합니다.
- (사양 장비 및 재료의 표를 참조하십시오) 대표 결과 여기에 사용되는 소프트웨어, '측정'에 가서 선택에서 '/ 크기를 계산합니다'. '파일'다음 '로드 설정'을 선택하고 미리 정해진 ASSA을 선택Y 설정. 그런 다음 '백작'을 선택합니다. 회전 타원체는 정확하게 분할해야합니다.
- 또한 '마술 지팡이 / 추적'창을 엽니 다 '개체를 병합 / 그리기'다음 '편집'로 이동합니다. 회전 타원체 이미지를 클릭하고 분할을 얻기 위해 지팡이 커서를 사용합니다. 수동으로 마우스를 사용하여 회전 타원체의 윤곽을 ( '자동 선택'창에서) '추적'을 선택합니다.
- 스프레드 시트에 다른 매개 변수 (지역, 직경, 경계 등)의 수출 측정. 스프레드 시트에 기록 관련 이미지 정보 (예를 들어, 잘 수, 상대 시점).
- 과학 및 통계 그래프 소프트웨어를 사용하여 시간에 대한 복제 스페 로이드 (침입)의 평균 면적을 그린다. 대안 적으로, t의 영역에 상대적으로 각 시점에서의 구형 영역의 변화를 계산 = 0이어서 플롯 침윤 (%의 T0) 선형 GRA 같은 대 시간산도.
Representative Results
3D 종양 침윤 타원체가도 1에 개략적으로 도시 된 단순하고 재현성, 자동화 된 방법을 사용하여 평가한다 : 재현성 크기의 종양 타원체 ULA은 96 웰 둥근 바닥 플레이트에 세포를 플레이 팅함으로써 얻어진다. 사일 후 개시 회전 타원체는 BMM에 포함된다. 이는 종양 세포가 침입 및 회전 타원체의 밖으로 확산되는 반고체 구조를 제공한다. 사이토 영상을 사용하여 96 시간 - 회전 타원체가 BMM에 잘 각각의베이스와 침략에 중앙 위치를 쉽게 T = 0 최대 72부터 간격으로 모니터링합니다. 이는 완전히 자동화 된 이미지 분석을 제공 할 수있다.
암세포 침윤의 다른 타입의 예는도 2에 도시되어있다 -. 4 높은 악성 인간 아교 모세포종 홍반 (GBM) 세포주 U-87 MG가 꽉 구면 3 차원 구조를 형성하고, 뇌종양을 예시하기 위해 여기에서 사용되는 로컬되는 침공 키 생명을 위협이다기능. 일단 BMM에 포함 된, 전형적인 "스타 버스트"침략 패턴 (12)과 확산 U-87 MG의 회전 타원체의 세포. 종양 세포는 방사상들은 3 차원 형상을 유지하고있는 매트릭스로 연장된다. BMM 내로 연장 세포 과정의 세부 invadopodia와 종양 세포 침윤의 정도가 불확실한 경우, U-87 MG의 회전 타원체를 위해도 2에 도시 된 바와 같이 공정이 72 시간의 기간에 걸쳐 이어진다. 어느 정도의 시간에 따른 종양 세포 침윤의 정확한 정량을 가능 사이토 이미지를 사용하여 이미지 분석을 자동화. 자동 분석이 U-87 MG 회전 타원체 본체로부터 BMM 내로 연장 돌출부 주위 세포 분할을 생성하는도 1에 도시 된 바와 같이,도 2의 정량화가 얻어진다. 이 세포주, 종양 구형 체 침범 영역의 측정으로부터 제외됩니다.
invas의 다른 패턴이온은 인간 편평 경부암 세포주에 의해 표시되었다. CAL S와 CAL R은 동종하지만 CAL S는 민감하고, EGFR 티로신 키나제 억제제 (14)에 대한 내성 CAL R. EGF의 부재에서, 어느 세포주 BMM (도 3) EGF의 농도는 증가하지만, (2.5 NG / ㎖로), 타원체는 '뇌'에 나타나는 내로 침입. EGF (40 및 80 NG / ㎖)의 침입 정도의 높은 농도에서 감소 하였다. 이것은 이전에 15을보고되었다 내습 환산 EGF에 고전 종형 용량 반응과 일치한다. 20 NG에서 / ml의 EGF, CAL S 셀 동안 CAL R의 회전 타원체의 본체로부터 압출 손가락 모양의 돌기가 72 시간 (그림 3) 후 덜 침습적했다. 구 상체는 세포주 사이의 최대 구별 20 NG / ㎖ EGF를 함유 BMM (넣었다 후에이 차분 내습 48 시간 분명했다) 및 72 시간 후 최대 (그림 4). 이러한 이미지는 U-87 MG에 관해서는, 사이토 이미지를 사용하여 신속하게 획득했다. 그러나,이 경우, 다른 방법을 예시하기 위해, 침입도가 독립형 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 정량하고, 수동으로 그래픽으로 표시된다 (도 3 및도 4). 이러한 결과는 특히 약제 내성 침습적 표현형을 길항하는 것 화합물을 선별하는 데에 이용 될 수있는 약물에 민감한 셀들 사이에 내성 표현형의 차이를 나타낸다.
3D 종양 회전 타원체 침공 분석의 도식 개요를 그림. 워크 플로는 BMM에 삽입 한 후이 방법은 U-87 MG 아교 모세포종의 회전 타원체의 대표 이미지를 포함하여 포함하는 단계를 보여줍니다 (상단 패널을, T = 0)과 침공 후 BMM에;와 침입 세포에 의해 커버되는 영역을 측정하는 분할하지 않고 (하단 패널 T는 72 시간을 =). 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
의 BMM. U-87 MG에 U-87 MG 아교 모세포종의 회전 타원체 침공의 그림 2 시간 코스가 BMM에 3D 침입 감시 및 사이토 영상을 사용하여 72 시간까지 정량 하였다 회전 타원체. (A) 대표 이미지와 (B)의 정량화 종양 세포의 침윤이 도시되어있다. 바 = 500 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3 다시 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 52686 / 52686fig3.jpg "/>
(저항) 그림 3. CAL R 및 CAL S (구분) 종양 회전 타원체 침공. (A) 대표 이미지와 (B)의 EGF의 농도 의존적 CAL R과 CAL S 종양 회전 타원체 침공의 수동 정량이 표시됩니다. 바 = 500 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
(B)에 배치 할 때 그림 4. CAL 연구에서 세포 (방지) 스페 로이드는 CAL S (구분) 종양 회전 타원체보다 더 침습적 있습니다EGF 자극 CAL R 종양 회전 타원체는 CAL S보다 더 두드러 침공. (A) 대표 이미지와 (B)의 침략을 수동으로 정량을 표시하면 MM. 표시됩니다. 바 = 500 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기에 설명 된 두 종양 모델 (아교 모세포종과 SCCHN)을 구체적으로 그들이 임상 적으로 효과적인 치료 (12)에 대한 충족되지 않은 요구와 관련 로컬 침습적 암이기 때문에 우리의 3D 분석을 예시하기 위해 선택되었다. 약물 치료 시험 관내 약물 역학 (PD) 바이오 마커의 변화 평가 BMM 및 / 또는 전체가 종양 타원체 침입의 면역 분석에서 세포의 회복을 허용하기 위해 특정 시판되는 시약을 사용 다음 웨스턴 블롯 또는 용 해물의 면역 분석에 의해 용이하게 행할 수 이어 마운트 염색.
이 침공 분석은 유용한 반고체 매체에 종양 세포 침공의 신속하고 재현성 평가를위한 기술 및 생체 외 약물 검사에서 미래에 대한 때문에 특히 적합하다. 암 세포들은 종양 타원체로 표시되는 "미세 종양"에서 확산로 3D 방식으로 매트릭스에 침입하고 extracellul 내로 연장AR 매트릭스 같은 환경. 분석의 진정한 입체감이 고체 기판에 세포가 이동할 때 가정 평평한 부착 형태와 다른 세포 형태에 분명하다. 침윤 정도를 쉽게 또는 이미징 소프트웨어와 조합 표준 현미경을 사용하여 자동 판독을 허용 사이토 이미징을 사용하여 정량된다. 또한,이 방법은 적합 형광 이미징 13 (형광 단백질이나 발현 세포주와 예를 들어, 형광 염료로 미리 라벨링).
에서 회전 타원체의 중심 위치 교란의 위험이있는 경우에있어서 BMM의 첨가에 의해 표시되는 경우에만 중요 단계를 수행하는 간단 웰 U 자형. 이것은 서로 다른 초점면에 회전 타원체로, 최적 이미지 분석 될 수 있습니다. 그것은 각 웰에 조심스럽게 천천히 BMM을 추가하는 것이 중요하다. BMM 추가 후에는 판을 확인하는 것이 좋습니다현지화가 받아 들일 수없는 것으로 간주되는 경우 현미경과,이는 부드러운 원심 분리에 의해 해결 될 수 있습니다. 경험을 바탕으로,이 거의 필요하다. 이 방법은 강력하고 매우 재현하는 동안, 간 실험적인 변화는 BMM의 다른 배치로 발생할 수 있습니다. 이를 방지하기 위해, 일련의 연구를 수행하는 하나의 배치에서 충분한 BMM을 구입하는 것이 바람직하다.
방법의 제한은 (이러한 분석 용 등)의 종양 세포 가능성 분석 기간 동안 겪게 침윤 및 증식을 구별하는 어려움이다. 세포의 배가 시간이 고려, 또는 사이토 칼라 신 D와 같은 세포주기 억제제가 도입 될 수 있지만, 제어하거나 명확 특히 빠르게 성장하는 종양 세포에 대한 이들에 대해, 종양 진행의 두 가지 측면을 구별하기 쉽지 않다 더 "광대"보다는 침윤성, 침입 패턴을 가지고있다. 이 때문에그것은 평행 차원 성장 분석은 어떤 자극 또는 억제 제제의 특정 효과를 평가하기 위해 수행되는 것을 제안한다. 주의 투여 량 반응 연구를 수행한다면, 그 증식에 미치는 영향을 최소화 농도를 선택하는 것이 가능할 수있다. 예를 들어 우리는 HSP90 17-AAG가 50 % (GI 50) (12)에 의해 3D 성장을 억제 24 시간에서와 농도 이하 농도에서 이미 U-87 MG 3D 종양 회전 타원체의 침략을 억제하는 억제제 것으로 나타났습니다.
한편, 상기 분석의 중요성은 다른 표준 침윤 분석 (예를 들어, 필터 기반 분석법 또는 3D 매트릭스 (1)에 단일 세포 침윤)에 비해 종양 세포가 유사한 것을 타원체로부터 주변 매트릭스 내로 침입한다는 것이다 " 따라서 마이크로 종양 "또는"미세 전이 ", 및 종양 덩어리의 병태 생리의 계정 중요한 측면을 고려합니다. 우리가 제시하는 방법은에 대한 정보를 제공합니다처음 타원체를 떠나, 또한 개별적으로, 하나의 셀에 BMM 더 먼 영역에 도달하면 종양 세포의 집단 행동. 또한, 종양 회전 타원체 내 세포는 저산소증과 영양 부족을 경험할 수있는, 유전자 발현의 변화를 통해, 마이그레이션 및 침략을 홍보 할 수 있습니다; 이러한 기능은 2D 분석에 존재하지 않는다. 또한,이 모두는보다 복잡한 3 차원 분석을 용이하게 목표 검증 및 약물 개발에 사용될 수 있도록, 특정 96- 웰 플레이트의 사용을 통해 높은 처리량 형식과 최신 촬영 기술에 사용 가능하다.
우리가 제시 방법은 종양 세포의 침윤 추가적인 양태를 해결하는 또 다른 애플리케이션을 수용 할 수있다. 특히, 여분의 복잡성은 회전 타원체 자체 또는 주변 행렬로, 이러한 섬유 아세포 및 / 또는 내피 세포와 같은 숙주 세포의 첨가에 의해 예상 될 수있다. 이것은 또한 강성의 관점에서 (다른 공동의 사용에 의해서도 수정 될 수있다BMM의 ncentrations)뿐만 아니라, 조성물의 관점에서 (채택 종양 모델의 특정 조직 / 기관에 의존하는 다른 구성 요소의 추가에 의해 : 유방 암종 17)에 대한 뇌 암 (16) 및 콜라겐 등, 테네 스틴.
(회전 타원체 및 이미징의 세대)와 유사한 셋업은 종양 회전 타원체가 다른 세포 특이 organoids (예 :, 성상 세포와 복잡한 조직 (12)를 닮은 배아 체와 공동 배양 차원에서 조직 침공을 평가하기 위해 적용 할 수 있습니다 신경 교종 18 토굴 위장 암에 대한 문화)하지만 추가 작업은 자동화 된 이미지 분석을 사용하는 데 필요합니다.
Disclosures
모든 저자는 이익에 대한 경쟁 충돌을 선언합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning Matrigel basement membrane matrix |  Corning |
354234 | Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
| Cultrex basement membrane extract, PathClear | Trevigen |
3432-005-01 | Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
| Ultra-low attachment 96-well plate | Corning |
7007 | |
| EGF | Miltenyi Biotec |
130-093-825 | Add 100 μl 1% BSA (w/v) in water to 100 μg EGF. To 25 μl of this, add 4,975 μl RHB-A medium to give a 5 μg/ml working stock. Aliquot and store at -20 °C |
| RHB-A medium | Stem Cells Inc. |
SCS-SF-NB-01 | For diluting EGF |
| DMEM | GIBCO |
31966-021 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | Biosera |
1001/500 | Heat at 56 °C to inactivate complement before use |
| TrypLE | GIBCO |
12605 | Cell dissociation solution |
| Celigo cytometer | Nexcelom Bioscience |
n/a | Specialist equipment for image capture and analysis. Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative |
| IX70 inverted microscope | Olympus |
n/a | Used with camera for manual image capture |
| Retiga Exi Fast 1394 digital camera | Qimaging |
n/a | Attached to microscope for manual image capture |
| Image-Pro Plus 7.0 | Media Cybernetics |
n/a | Software used to control camera and microscope for manual image capture |
| Image-Pro Analyzer 7.0 | Media Cybernetics |
n/a | Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size |
| Excel 2010 | Microsoft |
n/a | Scientific graphing and statistical software |
| Prism 6.0 | GraphPad |
n/a | Scientific graphing and statistical software |
References
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
- Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. Two-Dimensional vs. Three-Dimensional In Vitro Tumor Migration and Invasion Assays. Methods and Protocols. 986, 227-252 (2013).
- Hwang, Y. S., Park, K. K., Chung, W. Y. Invadopodia formation in oral squamous cell carcinoma: the role of epidermal growth factor receptor signalling. Arch. Oral. Biol. 57 (4), 335-343 (2012).
- Wang, S., et al. Study on invadopodia formation for lung carcinoma invasion with a microfluidic 3D culture device. PLoS One. 8 (2), e56448 (2013).
- Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).
- Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Semin. Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Nystrom, M. L., et al. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. The Journal of pathology. 205 (4), 468-475 (2005).
- Deisboeck, T. S., et al. Pattern of self-organization in tumour systems: complex growth dynamics in a novel brain tumour spheroid model. Cell Prolif. 34 (2), 115-134 (2001).
- Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5 (5), e10431 (2010).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol. 10, 29 (2012).
- Vinci, M., Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods and Protocols. , 253-266 (2013).
- Box, C., et al. A novel serum protein signature associated with resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in head and neck squamous cell carcinoma. Eur. J. Cancer. 49 (11), 2512-2521 (2013).
- Khajah, M. A., Al Saleh, S., Mathew, S., M, P., Luqmani, Y. A. Differential effect of growth factors on invasion and proliferation of endocrine resistant breast cancer cells. PLoS One. 7 (7), e41847 (2012).
- Brosicke, N., van Landeghem, F. K., Scheffler, B., Faissner, A. Tenascin-C is expressed by human glioma in vivo and shows a strong association with tumor blood vessels. Cell and tissue research. 354 (2), 409-430 (2013).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Molina, J. R., Hayashi, Y., Stephens, C., Georgescu, M. M. Invasive glioblastoma cells acquire stemness and increased Akt activation. Neoplasia. 12 (6), 453-463 (2010).
