Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

doi: 10.3791/52686 Published: May 1, 2015

Abstract

פלישה של רקמות הסובבות נורמליות נחשבת בדרך כלל להיות סימן היכר מרכזי של ממאיר (בניגוד לשפיר) גידולים. לסוגים מסוימים של סרטן בפרט (לדוגמא, גידולים במוח כגון multiforme גליובלסטומה וקרצינומה של תאי קשקש של הראש וצוואר -. SCCHN) הוא סיבה לתחלואה קשה ויכולים להיות גם בהיעדרו של גרורות מרוחקות סכנת חיים. בנוסף, סרטן שההישנות לאחר טיפול למרבה הצער לעתים קרובות נוכחי עם פנוטיפ אגרסיווי יותר. לכן, יש הזדמנות למקד את התהליך של פלישה לספק טיפולים חדשניים שיכול להיות משלימים לסוכנים אנטי-שגשוג סטנדרטיים. עד עכשיו, אסטרטגיה זו כבר הקשתה על ידי חוסר מבחני חזקים, שחזור מתאימים לניתוח מפורט של פלישה ולהקרנת סמים. כאן אנו מספקים שיטת מיקרו-צלחת פשוטה (המבוסס על מדים, spheroids גידול 3D להרכבה עצמית) שיש לו פוטנציאל גדול לסטו כגוןמת. אנחנו מדגימים את פלטפורמת assay באמצעות קו אנושי תא גליובלסטומה וגם מודל SCCHN בי הפיתוח של התנגדות נגד הקולטן לגורם צמיחת אפידרמיס ממוקד מעכבים (EGFR) קשור עם פוטנציאל מטריצה ​​פולשנית משופר. כמו כן אנו מספקים שתי שיטות חלופיות של כימות חצי אוטומטי: אחת באמצעות הדמיה cytometer ושני שפשוט דורש ללכוד מיקרוסקופיה ותמונה רגילה עם ניתוח תמונה דיגיטלי.

Introduction

פיתוח תרופות נגד הסרטן קלאסי הוא ממוקד במידה רבה על השימוש במבחני חוץ גופייה מבוסס תאים למסך לחומרים ציטוטוקסיים המעכבים התפשטות תאים סרטנית ו / או לקדם מוות מתוכנת של תאים (אפופטוזיס). לאחרונה, מאמצים עברו לטיפולים ממוקדים בפיתוח מעכבי הגורמים המולקולריים שבבסיס של התפשטות תאים ממארת. למרות כמה תוצאות מרהיבות, סוכנים כאלה הקשורים לעתים קרובות עם ההתפתחות המהירה של עמידות לתרופות. בהתחשב בכך שזה הפוטנציאל פולשני וגרורתי של תאים סרטניים שאחראית למרבית מקרי מוות מסרטן, וכי מחלת הישנות לעתים קרובות מציגה פנוטיפ אגרסיווי יותר, זה הגיוני גם לשקול משלים במודלים ניסיוניים מבחנה 1,2 לזהות רומן סוכנים שימנעו "סימני ההיכר" אלה נוספים מפתח של הסרטן.

במהלך התקדמות ממארת, תאי גידול לרכושהיכולת לפלוש לרקמות שמסביב ו / או להפיץ לאיברים מרוחקים (גרורות). תאים סרטניים לחדור את הקרום במרתף על ידי ההיווצרות של invadopodia 3,4. מבנים אלה מועשרים בסיבים אקטין, חלבוני הדבקה ספציפיים וproteinases וקולקטיביים אחראים לתנועתיות של תאי גידול והשפלה של מטריקס (ECM) 5. Invadopodia להאריך לתוך ECM והם האמינו להיות חשובים לפלישת תאים סרטניים וגם extravasation לערוצי כלי דם, להקל hematogenous הפצה (או הלימפה) וגרורות.

שיטות מקובלות כיום להעריך פלישת תאים סרטניים במבחנה כוללת את הבאים. מבוסס transwell או מבחני קאמריים בוידן 2,6 בי השעיות תא בודדות הם זורעים על גבי מסנן מצופה בשכבה עבה של חלבונים המופק מECM. תאים אז לפלוש ולעבור לתא התחתון בתגובה לכימותרפיה-attractant. ECM הנפוץחלבונים הם סוג אני קולגן, או מטריצת מרתף כמו קרום (BMM, למשל, Matrigel, הנגזרת מהגידול EHS 7) המחקה את ההרכב הטבעי של ממברנות מרתף.

כחלופה למבחני סוג תא וידן מבוססת מסנן 8, יכולים להיות שנזרעו תאים על גבי ג'ל ECM (שניתן להוסיף fibroblasts) שבו הם יוצרים monolayer ולאחר מכן בנפרד או ביחד לפלוש לתוך הג'ל. פלישה ניתן למדוד במונחים של מספר התאים פולשים ו / או מרחק שעובר ממשטח ג'ל 9. תאים סרטניים יכולים גם להיות מוטבעים לחלוטין לתוך מטריצה ​​או כהשעית תא בודדת או כspheroids - בדרך כלל ממוקם בין שתי שכבות של ג'ל ECM מאפשרות לתאים לפלוש מחוץ למסת הגידול לתוך המטריצה ​​מקיפה 2,6,10,11.

Assay תלת ממדי (3D) אליפטית גידול הפלישה המתוארת כאן מספק מערכת מהירה, automatable פלישה באמצעות highlשיטת y לשחזור, סטנדרטית 12 בפורמט צלחת 96-היטב עם אליפטית אחד בכל טוב. BMM מתווסף כל גם ישירות לספק מטריצת חצי מוצקה שאליו תאים סרטניים לפלוש מהגוף אליפטית. של פלישת תאים סרטני המידה מנוטרת במרווחים על פני תקופה של 72-96 שעות. שיטה זו מספקת את היתרונות הבאים על מבחני פלישה הנוכחיים במבחנה שהוזכרו לעיל: גידול תאים מאורגנים במבנה 3D מחקה מייקר אזור גידול או מיקרו-גרורות; spheroids הגידול הוא מאוד לשחזור בגודל; assay הפלישה מתבצע באתר באותה הצלחת כמו פיתוח אליפטית גידול, ללא הצורך להעביר אותם לצלחות המשניות; השיטה, בשילוב עם הטכנולוגיות החדישות ביותר של ניתוח תמונה אוטומטי, מאפשרת הן תכולה גבוהה ותפוקה גבוהה מנתח של פלישת תאים סרטניים.

ניתוח התמונה מתבצע באמצעות הדמיה cytometer, אשר סורק 96-היטבצלחת בתוך 10 דקות. על ידי שימוש ביישום המפגש, השיעור של פלישת המידה ולהשיג גם על ידי תאים בודדים או על ידי צבירי תאים מתפשטים החוצה מspheroids הגידול ופולש לתוך המטריצה ​​ניתן למדוד באופן דינמי. לתפוקה נמוכה יותר, שיטה חלופית לניתוח תמונה מוצגת, המבוססת על השימוש במיקרוסקופ הפוכה ותוכנת הדמיה סטנדרטית.

Protocol

1. דור של Spheroids גידול בגודל reproducibly

  1. monolayers לשטוף תאים סרטניים עם מי מלח שנאגרו פוספט (PBS; 5 מיליליטר ל25 סנטימטר 2 או 8 - 10 מיליליטר לבקבוק 2 75 סנטימטרים), להוסיף אנזים תא דיסוציאציה (1 מיליליטר ל25 סנטימטר 2 או 2 מיליליטר ל75 סנטימטר 2 בקבוק) ותאי דגירה בC ° 37 2 - 5 דקות.
  2. בדקו ניתוק תא תחת מיקרוסקופ ולנטרל אנזים ניתוק תא עם מדיום גידול שלם (5 מיליליטר לסנטימטר 25 2 או 8 מיליליטר לבקבוק 2 75 סנטימטרים).
  3. השעיה תא צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות.
  4. הסר supernatant, לחץ על הצינור מחדש להשעות תא גלולה ב 1 מיליליטר של מדיום גידול להשלים בעזרת פיפטה P1000. זה אמור להניב השעיה תא בודדת ללא צבירי תאים.
  5. ספירת תאים באמצעות hemocytometer ולדלל את ההשעיה התא להשיג 0.5-2 x 10 4 תאים / מיליליטר (צפיפות תאים אופטימלית צריכה להיקבע לשורה תאים כל אחד בoבצו להשיג spheroids גידול של 300-500 קוטר מיקרומטר 4 ימים לאחר זריעת תאי 12,13).
  6. מעבירים את ההשעיה התא למאגר סטרילי ו, בעזרת פיפטה רבה, לוותר 200 μl / גם לתוך קובץ מצורף נמוך במיוחד (אולא) 96-גם צלחות תחתית עגולות 12.
  7. מעבירים את הצלחות לאינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לחות 95%). ארבעה ימים לאחר מכן, באופן חזותי לאשר היווצרות אליפטית גידול ולהמשיך עם assay פלישת 3D.

2. גידול 3D Assay ספרואיד הפלישה

  1. להפשיר BMM על קרח.
  2. לשמור על ערכה של טיפים סינון סטרילי לP10, P200 וטפטפות P1000 וצינורות סטרילי (1.5 מיליליטר נפח גדול יותר או בהתאם לנפח כולל הנדרשים) ב -20 ° C.
  3. מקם את צלחות 96-היטב אולא מכילות ישן spheroids 4 ימים על קרח.
  4. בעזרת פיפטה רבה, להסיר בעדינות 100 μl / טוב של מדיום גידול מהצלחות אליפטית. לזווית שלב זה הטיפים לקראתיקיר nside של בארות U-התחתונה, הימנעות ממגע עם תחתית הבאר ואת המיקום של spheroids; למזער הפרעה של spheroids.
  5. בעזרת טיפים קרים כקרח, להעביר BMM לצינורות קר כקרח. לפלישה מושרה ציטוקינים או למחקרי הערכת תרופה, להוסיף חומרים כימיים (ב2x הריכוז הסופי) לBMM באמצעות טיפים קרים כקרח. לדוגמא, השתמש גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) כדי לעורר את הפלישה של קרצינומה של תאי קשקש CAL S וCAL R. מערבבים היטב על ידי מתערבל בעדינות, הימנעות היווצרותן של בועות.
  6. בעדינות לוותר על BMM 100 μl לתוך הבאר U-התחתונה, מכוון את הקצה לכיוון הקיר הפנימי של הבאר. צעד זה הוא קריטי ביותר כ, לניתוח תמונה אופטימלי, spheroids חייב להישאר במרכז גם 12.
  7. חזור על שלב 2.6 עבור כל הבארות הנדרשות, המאפשרות 5-6 חזרות / מצב. במידת צורך, לשנות לקצה טרי מצונן.
    הערה: כאשר מנוסה יותר, dispense BMM בעזרת פיפטה רבה.
  8. באמצעות מחט סטרילית, להסיר בועות, אם קיימים.
    1. באמצעות מיקרוסקופ, מבחינה ויזואלית לבדוק שspheroids נמצא במיקום מרכזי. אם לא, צנטריפוגות הצלחת ב XG 300 דקות 3 על 4 מעלות צלזיוס. זה יבטיח כי spheroids נמצאים במיקום מרכזי בכל טוב.
  9. העבר את הצלחת לחממה על 37 מעלות צלזיוס ולאפשר BMM כדי לחזק.
  10. 1 שעה מאוחר יותר, בעזרת פיפטה רבה, בעדינות להוסיף 100 μl / טוב של מדיום גידול שלם. ללימודי פלישה או הערכת תרופה מושרה ציטוקינים, כוללים ציטוקינים או מעכבים במדיום (1X ריכוז סופי). לחלופין, אם ריאגנטים לא התווספו לBMM בשלב 2.5, להוסיף אותם למדיום בשלב זה (3x הריכוז הסופי הרצוי).

תמונה אוטומטית 3. רכישה

  1. צלחות סריקה בcytometer (למפרטים ראו טבלה של ציוד וחומרים) בSTA מרווחיםrting מהזמן אפס (t0 = יום של assay הפלישה הקים, מייד לאחר שלב 2.10 עד 72 שעות, או 96 שעות לשורות תאי גידול פולשים איטיות יותר.
  2. בחר את היישום 'Confluence'.
  3. בדוק שאליפטית היא בפוקוס ו, במידת הצורך, להתאים באופן ידני ולתקן את "הפוקוס יצא-'.
  4. תחת 'הגדרות דגימה', בחרו לסרוק שדה מרכזי אחד של תצוגה (FOV). בעקבות בנוסף BMM, spheroids גידול צריך נותר בעמדה מרכזית, ובכך אין צורך לסרוק את כולו גם.
  5. בתוכנה, להגדיר את הבארות לסריקה על ידי הדגשה אותם על מפת הצלחת. לחץ על "התחל סריקה".
    הערה: הסריקה תישמר באופן אוטומטי וניתן לסקור מאוחר יותר off-line.

4. ניתוח תמונה אוטומטית

  1. בחר יישום 'Confluence'.
  2. בכרטיסייה 'ניתוח', להתאים ישימיםהגדרות ני (למשל, "דיוק": נמוך, רגיל, גבוה; "סף עוצמה": 1 - 15) כדי לייצר פילוח מדויק סביב אליפטית, כוללים תהליכים בתא וinvadopodia הארכה לBMM (ראה איור 1). התאם את ההגדרות עבור כל שורת תאים סרטניים ו / או בנקודות זמן שונות. אמצעי 'Confluence' יישום% מהשטח גם מכוסה על ידי התאים הפולשים, בFOV נבחר.
  3. ודא שהגדרות הניתוח מתאימות (כלומר, הפילוח מדויק) לspheroids האחר בצלחת על ידי לחיצה על כמה בארות שונות. אם הפילוח לא מדויק להתוות אליפטית, להתאים את הגדרות יישום נוסף.
  4. לחץ על "התחל ניתוח".
  5. בכרטיסייה 'התוצאות', לבדוק בארות מרובות כדי לוודא את איכות ניתוח. "הנתונים ובכן רמה 'יצוא לתוכנת גיליונות אלקטרוניים.
  6. Repeaניתוח לא לכל נקודות הזמן. חשב את מפגש% הממוצע לבארות לשכפל ופלישת עלילה (מפגש%) נגד זמן בתרשים בר, באמצעות גרפים מדעיים ותוכנות סטטיסטיות של בחירה.

5. תמונה ידנית רכישה

  1. להקליט תמונה לכל אליפטית גידול במרווחים החל מt = 0 עד 72-96 שעות, בהתאם למהירות של פלישה של הקו הסלולרי בשאלה, באמצעות מיקרוסקופ הפוכה (לצלחת 96-היטב זה לוקח בערך 20 - 30 דק '). השתמש אובייקטיבי 10X. השתמש אובייקטיבי 4X כאשר האזור פלש גדול מדי כדי לנפול בפח לחלוטין בתחום 10X מבט.
  2. להציל את כל תמונה בנפרד רכשה.
  3. לכיול, לקחת תמונות של רשת הגאוגרפית שלב (1 מ"מ) בשתי מטרות 10X ו4X (ולשמור את התמונות).

6. ניתוח תמונה ידני

  1. פתח את תמונות רשת הגאוגרפית שלב לתוך תוכנת ניתוח תמונה של בחירה.
  2. הזן את gratמדידות icule, היחידות (מיקרומטר), מטרות שימוש (10X או 4X) ולבצע את הכיול. צעד זה נדרש רק פעם אחת. לניתוח תמונה שלאחר מכן, פשוט לטעון מחדש את הגדרות כיול הנדרשות.
  3. פתח את תמונות assay פלישה ובחר את הגדרות הכיול בהתאם למטרת מיקרוסקופ (10X או 4X) משמש כדי לקבל את התמונות.
    1. לחלופין, לייבא תמונות שהתקבלו בהדמית cytometer (שלב 3) ולנתח באופן ידני, כפי שתוארו עבור תמונות המתקבלות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה (ראה תוצאות מוצגות באיור 3 ואיור 4).
  4. למדוד את השטח המכוסה על ידי spheroids.
    1. בתוכנה המשמשת כאן לנציגי התוצאות (למפרטים ראו טבלה של ציוד וחומרים), ללכת ל'מדוד 'ובחר' רוזן / גודל ". בחרת 'קובץ' ולאחר מכן 'הגדרות טען' ובחר אסא-שנקבע מראשהגדרות y. לאחר מכן בחר 'רוזן'. אליפטית אמורה להיות מפולח בצורה מדויקת.
    2. לחלופין ללכת ל'ערוך 'ולאחר מכן' צייר / מיזוג אובייקטים "לפתוח חלון" שרביט קסמים / עקבות '. השתמש בסמן השרביט ללחץ על תמונת אליפטית ולקבל פילוח. בחירה 'עקבות' (בחלון 'שרביט הקסמים') מתאר באופן ידני אליפטית באמצעות עכבר.
  5. מדידות יצוא של פרמטרים שונים (אזור, קוטר, היקף וכו ') לגיליון אלקטרוני. שיא בגיליון האלקטרוני המידע על תמונה הרלוונטית (למשל, גם מספר, נקודת זמן היחסית).
  6. עלילה האזור הממוצע של spheroids לשכפל (פלישה) לעומת זמן באמצעות גרפים מדעיים ותוכנה סטטיסטית. לחלופין, לחשב את השינוי בשטח אליפטית בכל נקודת זמן, יחסית לאזור בזמן t = 0. ואז פלישת עלילה (t0%) לעומת זמן כמו הגר"א ליניאריph.

Representative Results

פלישת אליפטית גידול 3D נבחנת באמצעות שיטה פשוטה, לשחזור, אוטומטית מאוירת באופן סכמטי באיור 1: spheroids גידול reproducibly בגודל מתקבל על ידי תאי ציפוי לאולא 96-גם צלחות תחתית עגולות. spheroids הודעה הייזום-4 ימים מוטמע בBMM. זה מספק מבנה מוצק למחצה לתוכו תאים סרטניים לפלוש ופרושים של אליפטית. Spheroids נמצא במיקום מרכזי בבסיס של כל טוב והפלישה לBMM מנוטר בקלות במרווחים החל מt = 0 עד 72-96 שעות באמצעות הדמיה cytometer. זה יכול לספק ניתוח תמונה אוטומטי לחלוטין.

דוגמאות לסוגים שונים של פלישת תאים הסרטניים של מומחשות באיורים 2 -. 4 multiforme גליובלסטומה אדם הקו הממאיר ביותר (GBM) התא U-87 MG, יוצר מבנה 3D הדוק, כדורי ומשמש כאן כדי להדגים גידולים במוח שבו מקומי פלישה היא סכנת חיים מפתחתכונה. משובץ ברגע בBMM, ​​תאים מspheroids U-87 MG התפשט עם דפוס פלישה טיפוסי "מספרים" 12. תאי גידול להאריך רדיאלית לתוך המטריצה ​​שבה הם שומרים על צורה 3 ממדים. התהליך אחרי על פני תקופה של 72 שעות, כפי שמוצג באיור 2 לU-87 spheroids MG, כאשר היקף פלישת תאים סרטניים, עם פרטים של התהליכים התאיים וinvadopodia הארכה לBMM הוא ברור מאליו. באופן מלא אוטומטי ניתוח תמונה באמצעות תמונה cytometer מאפשר כימות מדויק של פלישת התאים הסרטניים לאורך זמן. הכימות באיור 2 מתקבל כפי שמודגם באיור 1, שבו הניתוח האוטומטי מייצר פילוח סביב בליטות תא הארכה לBMM מ- 87 U MG גוף אליפטית. שים לב שעבור קו תא זה, גוף אליפטית הגידול נכלל במדידה של האזור פלש.

דפוס של invas שונההיון הוצג על ידי שורות תאי הסרטן אנושיות קשקש של ראש וצוואר. CAL S וCAL R הוא isogenic אבל CAL S הוא רגיש ל, וCAL R עמיד למעכבי טירוזין קינאז EGFR 14. בהעדר EGF, שורת תאים לא פלשה לBMM (איור 3) עם זאת, כריכוז של EGF הוגדל (2.5 ng / ml), spheroids נראה 'ניצן'. בריכוזים גבוהים יותר של EGF (מיליליטר / 40 ו- 80 ng) את מידת הפלישה הופחת. זה עולה בקנה אחד עם התגובה הקלסית דמוי פעמון המינון לEGF במונחים של פלישה שכבר דווחה בעבר 15. ב 20 ng / ml EGF, בליטות כמו אצבע-נמתחים מהגוף העיקרי של spheroids CAL R תוך תאי CAL S היו פחות פולשני לאחר 72 שעות (איור 3). פלישת ההפרש הזה הייתה ברורה 48 שעות לאחר spheroids הונח לBMM (המכיל 20 ng / ml EGF להבחנה המרבית בין שורות תאים) והגדול ביותר אחרי 72 שעות (איור 4). תמונות אלה נרכשו במהירות באמצעות הדמיה cytometer, כלU-87 MG. עם זאת, במקרה זה, כדי להדגים שיטה חלופית, את מידת הפלישה הייתה לכמת באופן ידני באמצעות תוכנת ניתוח תמונה עצמאית ומוצגת באופן גרפי (איורים 3 ו -4). תוצאות אלו ממחישות את הבדל בין תאי פנוטיפי תרופה רגישים ו-resistant שיכול להיות מנוצל כדי להקרין לתרכובות שדווקא שנאה מצד פנוטיפ עמיד, פולשני הסמים.

איור 1
איור 1. סקירה סכמטי של assay פלישת אליפטית גידול 3D. העבודה מציגה את שלבי השיטה כרוכה כולל תמונות נציג של spheroids U-87 MG גליובלסטומה רק לאחר ההטבעה לתוך BMM (פנל עליון; t = 0) ולאחר פלישה לBMM (פנל תחתון; t = 72 שעות) עם ובלי הפילוח המודד את האזור המכוסה על ידי התאים הפולשים. בר = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
כימות איור 2. זמן-במהלך פלישת U-87 MG אליפטית גליובלסטומה לBMM. U-87 MG אליפטית פלישת 3D לBMM הייתה פיקוח ולכמת עד 72 שעות באמצעות הדמיה cytometer. () תמונות ונציג (ב) פלישת תאים סרטניים מוצגת. בר = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מחדש 3 "src =" / קבצים / ftp_upload / 52,686 / 52686fig3.jpg "/>
איור 3. CAL R (עמיד) וCAL S פלישה (רגישה) אליפטית גידול. (א) נציג תמונות וכימות ידני של R EGF תלוי מינון CAL ופלישת אליפטית גידול CAL S (B) מוצגים. בר = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. תאים מCAL R spheroids (עמיד) הם יותר חודרני מאשר S spheroids גידול CAL (רגיש) כאשר הניחו BMM. עם spheroids גידול גירוי EGF CAL R להראות פלישה בולטת יותר מאשר כאל S. (א) נציג תמונות וכימות ידני של פלישה (B) מוצג. בר = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

שני דגמי הגידול מתוארים כאן (גליובלסטומה וSCCHN) נבחרו במיוחד כדי להדגים assay 3D שלנו כפי שהם קליניים סרטן פולשני המקומי רלוונטי עם צורך מסופק לטיפולים יעילים 12. בעקבות טיפול תרופתי, הערכה במבחנה שינויי pharmacodynamic סמן ביולוגי (PD) יכול להתבצע בקלות על ידי כתם או immunoassays של lysates המערביים בעקבות השימוש בחומרים כימי זמינים מסחרי ספציפיים כדי לאפשר התאוששות תא מBMM ו / או ניתוח immunofluorescent של פלישת spheroids גידול על ידי כל צביעת הר.

assay הפלישה זוהי טכניקה שימושית להערכה מהירה ושחזור של פלישת תאים סרטניים למדיום מוצק למחצה, ולכן מתאימה במיוחד לעתיד בהקרנת סמים מבחנה. תאים סרטניים לפלוש המטריצה ​​באופן 3D כפי שהם פרושים מ" מיקרו-גידול ", מיוצג על ידי אליפטית הגידול, ולהרחיב לextracellulסביבה כמו מטריקס-AR. תלת-ממדית האמיתית של assay ניכר במורפולוגיה התא, שהוא שונה מהמורפולוגיה השטוחה, תאים חסיד להניח בעת מעבר על מצע מוצק. התואר של פלישה הוא לכמת בקלות תוך שימוש בהדמיה cytometer, המאפשר אוטומטי לקריאה החוצה, או על ידי שימוש במיקרוסקופ רגיל בשילוב עם תוכנת הדמיה. יתר על כן, שיטה זו מתאימה להדמיה ניאון 13 (לדוגמא עם שורות תאים לבטא חלבונים או ניאון מראש שכותרתו עם צבעי ניאון).

השיטה היא פשוטה לביצוע עם השלב הקריטי רק מיוצג על ידי התוספת של BMM, כאשר קיים סיכון של הפרעה לעמדה של אליפטית במרכז בצורה U-היטב. זה יכול לגרום לניתוח תמונה הכי מוצלח, עם spheroids במטוסי מוקד שונים. לכן זה קריטי כדי להוסיף BMM בזהירות ולאט לאט זה טוב. לאחר תוספת BMM רצוי כדי לבדוק את הצלחתתחת מיקרוסקופ ואם הלוקליזציה נחשבת מקובלת, זה ניתן לתיקון על ידי צנטריפוגה העדינה. עם ניסיון, זה רק לעתים נדירות יש צורך. בעוד ששיטה זו היא חזקה ומאוד לשחזור, וריאציה בין-ניסיונית עלולה להתרחש עם קבוצות שונות של BMM. כדי להימנע מכך, מומלץ לרכוש BMM מספיק מתצווה אחת כדי להשלים סדרה של מחקרים.

מגבלה של השיטה (כמו לכל מבחני כאלה) היא הקושי בהבחנה בין הפלישה והתפשטות, שתאי הגידול צפויים לעבור במהלך מסגרת זמן assay. למרות זמן ההכפלה של תאים יכול להילקח בחשבון, או מעכבי מחזור התא כגון cytochalasin D הציגו, זה לא קל לשלוט או בבירור להבחין בין שני היבטים שונים אלה של התקדמות גידול, במיוחד לתאי גידול גדלו במהירות ועבור אלה ש יש דפוס יותר "רחב", ולא הסתנן, פלישה. מהסיבה הזוהוא הציע שassay צמיחת 3D מקביל מתבצע כדי לבדוק את ההשפעות ספציפיות של כל סוכנים מעכבים או גירוי. אם מחקרי תגובת מינון זהיר מבוצעים, זה עשוי להיות אפשרי כדי לבחור ריכוזים שלמזער את ההשפעות על התפשטות. לדוגמא שהראינו כי Hsp90 מעכב 17-AAG מעכב U-87 פלישת אליפטית גידול MG 3D כבר בשעה 24 ובריכוזים נמוכים ריכוז עיכוב צמיחת 3D ב -50% (GI 50) 12.

מצד השני, את המשמעות של assay זה בהשוואה למבחני פלישה סטנדרטית אחרים (למשל, מבחני סינון מבוסס או פלישה של תאים בודדים למטריצות 1 3D), הוא שתאים סרטניים לפלוש לתוך המטריצה ​​מקיפה מאליפטית, שדומה " מיקרו-גידול "או" מיקרו-גרורות ", ולכן לוקח בחשבון היבטים חשובים של הפתופיזיולוגיה של מסת גידול. אנו מציגים השיטה מספקת מידע עלהתנהגות קולקטיבית של תאים סרטניים, כאשר בתחילה לעזוב את spheroids, וגם באופן אישי, כאשר תאים בודדים להגיע אזורים מרוחקים יותר בBMM. בנוסף, תאים בתוך הגידול spheroids עלולים לחוות מחסור היפוקסיה ומזין אשר, דרך שינויים בביטוי גנים, יכול לקדם את ההגירה ופלישה; תכונות כגון נעדרות במבחני 2D. יתר על כן, כל זה הוא זמין בפורמט תפוקה גבוהה באמצעות השימוש בלוחות 96-גם ספציפיים וטכנולוגיית ההדמיה האחרונה, מאפשר assay 3D מורכב יותר לשמש בקלות ביעד אימות וגילוי תרופות.

אנו מציגים שיטה יכולה להכיל יישומים נוספים כדי לטפל בהיבטים נוספים של פלישת תאים סרטניים. בפרט, מורכבות נוספת ניתן בחזון על ידי התוספת של תאי מארח, כגון fibroblasts ו / או בתאי האנדותל, לעצמו או אליפטית המטריצה ​​שמסביב. זה גם יכול להיות שונה, לא רק במונחים של נוקשות (על ידי השימוש בשיתוף שונהncentrations של BMM), אלא גם במונחים של הרכב (על ידי התוספת של רכיבים אחרים תלויים ברקמה / איבר המסוים של המודל שאומץ על הגידול: למשל, tenascin לסרטן המוח 16 וקולגן לסרטן השד 17).

הגדרה דומה (דור של spheroids והדמיה) יכולה גם להיות מותאם כדי להעריך פלישת רקמה ב3D, שבו spheroids גידול הוא שיתוף תרבותי עם גופי embryoid הדומים רקמה מורכבת 12 או עם organoids תא ספציפי אחר (למשל, האסטרוציטים ל תרבויות גליומה 18 או קריפטה לסרטן במערכת העיכול), אבל עבודה נוספת נדרשת על מנת לאפשר ניתוח תמונה אוטומטי.

Disclosures

כל המחברים מצהירים שום ניגוד מתחרה של עניין.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Corning Matrigel basement membrane matrix Corning 354234 Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips
Cultrex basement membrane extract, PathClear Trevigen 3432-005-01 Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips
Ultra-low attachment 96-well plate Corning 7007
EGF Miltenyi Biotec 130-093-825 Add 100 μl 1% BSA (w/v) in water to 100 μg EGF. To 25 μl of this, add 4,975 μl RHB-A medium to give a 5 μg/ml working stock. Aliquot and store at -20 °C
RHB-A medium Stem Cells Inc. SCS-SF-NB-01 For diluting EGF
DMEM GIBCO 31966-021 Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum Biosera 1001/500 Heat at 56 °C to inactivate complement before use
TrypLE GIBCO 12605 Cell dissociation solution
Celigo cytometer Nexcelom Bioscience n/a Specialist equipment for image capture and analysis. Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative
IX70 inverted microscope Olympus n/a Used with camera for manual image capture
Retiga Exi Fast 1394 digital camera Qimaging n/a Attached to microscope for manual image capture
Image-Pro Plus 7.0 Media Cybernetics n/a Software used to control camera and microscope for manual image capture
Image-Pro Analyzer 7.0 Media Cybernetics n/a Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size
Excel 2010 Microsoft n/a Scientific graphing and statistical software
Prism 6.0 GraphPad n/a Scientific graphing and statistical software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & therapeutics. 134, (1), 82-106 (2012).
  2. Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. Two-Dimensional vs. Three-Dimensional In Vitro Tumor Migration and Invasion Assays. Methods and Protocols. 986, 227-252 (2013).
  3. Hwang, Y. S., Park, K. K., Chung, W. Y. Invadopodia formation in oral squamous cell carcinoma: the role of epidermal growth factor receptor signalling. Arch. Oral. Biol. 57, (4), 335-343 (2012).
  4. Wang, S., et al. Study on invadopodia formation for lung carcinoma invasion with a microfluidic 3D culture device. PLoS One. 8, (2), e56448 (2013).
  5. Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147, (5), 992-1009 (2011).
  6. Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
  7. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Semin. Cancer Biol. 15, (5), 378-386 (2005).
  8. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  9. Nystrom, M. L., et al. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. The Journal of pathology. 205, (4), 468-475 (2005).
  10. Deisboeck, T. S., et al. Pattern of self-organization in tumour systems: complex growth dynamics in a novel brain tumour spheroid model. Cell Prolif. 34, (2), 115-134 (2001).
  11. Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5, (5), e10431 (2010).
  12. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol. 10, 29 (2012).
  13. Vinci, M., Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods and Protocols. 253-266 (2013).
  14. Box, C., et al. A novel serum protein signature associated with resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in head and neck squamous cell carcinoma. Eur. J. Cancer. 49, (11), 2512-2521 (2013).
  15. Khajah, M. A., Al Saleh, S., Mathew, S., M, P., Luqmani, Y. A. Differential effect of growth factors on invasion and proliferation of endocrine resistant breast cancer cells. PLoS One. 7, (7), e41847 (2012).
  16. Brosicke, N., van Landeghem, F. K., Scheffler, B., Faissner, A. Tenascin-C is expressed by human glioma in vivo and shows a strong association with tumor blood vessels. Cell and tissue research. 354, (2), 409-430 (2013).
  17. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155, (7), 1639-1651 (2013).
  18. Molina, J. R., Hayashi, Y., Stephens, C., Georgescu, M. M. Invasive glioblastoma cells acquire stemness and increased Akt activation. Neoplasia. 12, (6), 453-463 (2010).
Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay. J. Vis. Exp. (99), e52686, doi:10.3791/52686 (2015).More

Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay. J. Vis. Exp. (99), e52686, doi:10.3791/52686 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter