Abstract
Invasion des umgebenden normalen Gewebe wird im allgemeinen als ein wichtiger Merkmal der bösartig sein (im Gegensatz zu gutartigen) Tumoren. Bei einigen Krebsarten in bestimmten (zB Hirntumoren, wie Glioblastoma multiforme und Plattenepithelkarzinomen des Kopfes und des Halses -. SCCHN) ist es eine Ursache für schwere Morbidität und kann lebensbedrohlich auch in Abwesenheit von Fernmetastasen können. Außerdem Krebsarten, die einen Rückfall erlitten haben, nach der Behandlung leider häufig vorhanden mit einem aggressiveren Phänotyp. Daher gibt es die Möglichkeit, den Prozess der Invasion Ziel, neue Therapien, die komplementär zu Standard antiproliferative Mittel sein könnten. Bisher wurde diese Strategie durch das Fehlen von robusten und reproduzierbaren Assays für eine detaillierte Analyse der Invasion und zur Wirkstoffdurchmusterung behindert. Hier bieten wir Ihnen eine einfache Mikroplattenverfahren (basierend auf einheitlichen, selbstorganisierende 3D Tumorsphäroide), die ein großes Potenzial für eine solche stu hatstirbt. Wir veranschaulichen die Testplattform unter Verwendung einer menschlichen Glioblastomzelllinie sowie eine SCCHN-Modell, wo die Entwicklung einer Resistenz gegen gezielte epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) Inhibitoren mit verbesserten Matrix invasive Potential verbunden. Wir bieten auch zwei alternative Methoden der halbautomatische Quantifizierung: eines mit einem Zytometers und ein zweites, das einfach erfordert Standard-Mikroskopie und Bildaufnahme mit digitaler Bildanalyse.
Introduction
Klassische Antikrebswirkstoffentwicklung weitgehend konzentrierte sich auf die Verwendung von in vitro zellbasierten Assays zum Screening auf zytotoxische Mittel, die Proliferation von Tumorzellen hemmen und / oder zu fördern den programmierten Zelltod (Apoptose). In jüngerer Zeit wurden Anstrengungen zur zielgerichteten Therapien mit der Entwicklung von Inhibitoren der zugrunde liegenden molekularen Ursachen für maligne Zellproliferation bewegt. Trotz einiger spektakulärer Ergebnisse werden solche Mittel häufig mit der rasanten Entwicklung von Resistenzen assoziiert. Da es sich um die invasive und metastatische Potential von Tumorzellen, die für die Mehrzahl der Krebstodesfälle verantwortlich ist, und dass rezidivierender Krankheit oft ein aggressiver Phänotyp logischen auch überlegen komplementär in vitro Versuchsmodellen 1,2 neuartige identifizieren ist Agenten, die diese zusätzlichen Schlüssel "Markenzeichen" von Krebs hemmen.
Während der malignen Progression, Tumorzellen zu erwerbendie Fähigkeit, das umliegende Gewebe eindringen und / oder zu verbreiten, in entfernte Organe (Metastasierung). Krebszellen durchdringen die Basalmembran durch Bildung invadopodia 3,4. Diese Strukturen werden mit Aktinfilamenten spezifische Adhäsionsproteine und Proteinasen angereichert und sind gemeinsam für Tumorzellbeweglichkeit und Abbau der extrazellulären Matrix (ECM) 5 verantwortlich. Invadopodia in die ECM erstrecken und als wichtig für die Tumorzellinvasion zu sein und auch in das Gefäßkanäle Extravasation, die Erleichterung hämatogene (oder lymphatischen) Verbreitung und Metastasierung.
Aktuelle Standardverfahren, um die Tumorzellinvasion in vitro die folgenden Angaben enthalten zu bewerten. Transwell-basierten oder Boyden-Kammer-Assays, wo 2,6 Einzelzellsuspensionen werden auf einem Filter mit einer dicken Schicht aus ECM-abgeleiteten Proteinen beschichtet ausgesät. Cells dann eindringen und zu bewegen in die untere Kammer in Reaktion auf eine chemo Lockstoff. Häufig verwendete ECMProteine sind Typ I Collagen oder ein Basalmembran-ähnlichen Matrix (BMM zB Matrigel vom EHS Tumor 7 abgeleitet ist), die die natürliche Zusammensetzung der Basalmembranen nachahmt.
Als eine Alternative zu den auf Filterbasis Boydenkammer Typ 8 Assays können Zellen auf der Oberseite eines ECM-Gel (auf die Fibroblasten kann hinzugefügt werden), wo sie eine Monoschicht zu bilden und dann einzeln oder zusammen in das Gel eindringen ausgesät werden. Invasion kann in Bezug auf die Zahl der eindringenden Zellen und / oder Abstand von der Geloberfläche 9 reiste gemessen werden. In der Regel zwischen zwei Schichten aus ECM Gel- ermöglicht den Zellen, aus der Tumormasse in die umgebende Matrix 2,6,10,11 eindringen platziert - Tumorzellen können auch vollständig in einer Matrix entweder als Einzelzellsuspension oder als Kügelchen eingebettet werden.
Die dreidimensionale (3D) Tumor invasion Sphäroid hier beschriebenen Test liefert ein schnelles, automatisierbare Invasion System unter Verwendung eines highly reproduzierbare, standardisierte Methode 12 in einer 96-Well-Plattenformat mit einem Sphäroid pro Vertiefung. BMM direkt zu jeder Vertiefung hinzugefügt, um eine halbfeste Matrix, in die Tumorzellen eindringen vom Sphäroid Körper bereitzustellen. 96 h - das Ausmaß der Tumorzellinvasion in Intervallen über einen Zeitraum von 72 überwacht. Dieses Verfahren bietet die folgenden Vorteile gegenüber den oben erwähnten Strom in vitro Invasionsassays: Die Tumorzellen werden in einer 3D-Struktur nachahmen einen Tumor Mikro-Region oder einer Mikrometastasierung organisiert sind; die Tumorsphäroide sind hoch reproduzierbar in der Größe; die Invasion Assay wird in situ in der gleichen Platte wie Tumor Sphäroid Entwicklung durchgeführt werden, ohne die Notwendigkeit, sie zu Sekundärplatten zu bewegen; die Methode in Kombination mit den neuesten Technologien der automatisierten Bildanalyse, ermöglicht sowohl hohen Gehalt und hohem Durchsatz Analysen von Tumorzellinvasion.
Die Bildanalyse unter Verwendung eines Zytometers, das eine 96-well scannt geführtPlatte innerhalb von 10 min. Durch die Verwendung der Einmündung Anwendung ist das Ausmaß und die Geschwindigkeit der Invasion erreicht entweder durch einzelne Zellen oder Zellcluster Ausbreiten von der Tumorsphäroide und Invasion in die Matrix kann in einer dynamischen Art und Weise gemessen werden. Für geringere Durch wird ein alternatives Verfahren zur Bildanalyse vorgestellt, die auf der Verwendung eines umgekehrten Mikroskops und Standardbildbearbeitungssoftware.
Protocol
1. Erzeugung reproduzierbar Sized Tumorsphäroide
- Waschtumorzellmonoschichten mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; 5 ml für einen 25 cm 2 oder 8 bis 10 ml für einen 75 cm 2 Kolben), fügen Zelldissoziation Enzym (1 ml für einen 25 cm 2 bzw. 2 ml für einen 75 cm 2 Kolben) und inkubieren Zellen bei 37 ° C für 2-5 min.
- Überprüfen Zellablösung unter dem Mikroskop und neutralisieren Zelldissoziation Enzym mit kompletten Wachstumsmedium (5 ml für eine 25 cm 2 oder 8 ml für eine 75 cm 2-Kolben).
- Zentrifuge Zellsuspension bei 500 × g für 5 min.
- Überstand entfernen, tippen Sie auf das Rohr und resuspendieren Zellpellet in 1 ml vollständigem Wachstumsmedium mit einem P1000 Pipette. Dies sollte eine Einzelzellsuspension ohne Zellclustern ergeben.
- Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und verdünnt das Zellsuspension zu erhalten, 0,5 bis 2 x 10 4 Zellen / ml (für jede Zelllinie in o bestimmt werden optimale Zelldichte braucht500 & mgr; m Durchmesser 4 Tage nach der Zellaussaat 12,13) - rder zu Tumorsphäroide von 300 zu erhalten.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in einen sterilen Behälter und, mit einer Mehrkanalpipette 200 ul / Vertiefung in Ultra-Low-Befestigung (ULA) 96-well Rundbodenplatten 12.
- Übertragen die Platten in einen Inkubator (37 ° C, 5% CO 2, 95% Luftfeuchtigkeit). Vier Tage später visuell Tumor Sphäroidbildung bestätigen und mit dem 3D-Invasion Assay.
2. 3D-Tumor Spheroid Invasion Assay
- Auftauen BMM auf Eis.
- Halten Sie einen Satz von Sterilfilter-Tipps für P10, P200 und P1000 Pipetten und sterile Röhrchen (1,5 ml Volumen oder größer, je nach erforderlichen Gesamtvolumen) bei -20 ° C.
- Legen Sie die ULA 96-Well-Platten, die 4 Tage alten Sphäroiden auf Eis.
- Mit Hilfe einer Mehrkanalpipette, entfernen Sie vorsichtig 100 ul / Vertiefung von Wachstumsmedium aus den Sphäroiden Platten. Für diesen Schritt Winkel die Spitzen in Richtung der inside Wand der U-Boden-Vertiefungen, die Vermeidung von Kontakt mit dem Boden des Bohrlochs und die Position der Sphäroide; minimiert Störungen der Sphäroide.
- Verwendung eiskalten Tipps, übertragen BMM zu eiskalten Röhren. Für Zytokin-induzierte Invasion oder für die Arzneimittelevaluationsstudien, fügen Reagenzien (mit 2x die endgültige Konzentration) auf die BMM mit eiskaltem Tipps. Verwenden Sie beispielsweise den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), um die Invasion von CAL CAL S und R-Plattenepithel-Karzinom-Zellen zu stimulieren. Gut mischen durch vorsichtiges Schwenken, die Vermeidung der Bildung von Blasen.
- Gently verzichten 100 ul BMM in die U-Boden gut, mit dem Ziel die Spitze in Richtung der Innenwand des gut. Dieser Schritt ist der kritischste als für eine optimale Bildanalyse muss Sphäroide in der Mitte der Vertiefung 12 verharren.
- Wiederholen Sie Schritt 2.6 für alle erforderlichen Brunnen, so dass 5-6 Wiederholungen / Zustand. Falls erforderlich, ein frisch-gekühlten Spitze.
HINWEIS: Wenn mehr Erfahrung, dispense BMM mit einer Mehrkanalpipette. - Mit einer sterilen Nadel, entfernen Sie Luftblasen, falls vorhanden.
- Mit einem Mikroskop, visuell zu überprüfen, dass Sphäroide sind in einer zentralen Lage. Wenn nicht, Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 × g für 3 min bei 4 ° C. Dadurch wird sichergestellt, dass Sphäroide sind zentral gelegen in jeder gut.
- Übertragen die Platte in einen Inkubator bei 37 ° C und damit der BMM zu verfestigen.
- 1 Stunde später, mit einer Mehrkanalpipette, sanft fügen 100 ul / Vertiefung der vollständigen Wachstumsmedium. Für zytokininduzierte Invasion oder Drogenbewertungsstudien umfassen Zytokine oder Inhibitoren in dem Medium (1x Endkonzentration). Alternativ, wenn Reagenzien wurden nicht auf die BMM in Schritt 2.5 hinzugefügt, fügen Sie sie in das Medium an dieser Stelle (3x die gewünschte Endkonzentration).
3. Automatische Bildaufnahme
- Scan-Platten auf dem Zytometer (für Spezifikationen siehe Tabelle von Ausrüstung und Materialien) in Abständen starting vom Zeitpunkt Null (t0 = Tag der Invasion Assay einzurichten, unmittelbar nach Schritt 2.10 bis zu 72 Stunden oder 96 Stunden für langsamere eindringenden Tumorzelllinien.
- Wählen Sie den "Confluence" Anwendung.
- Überprüfen Sie, ob das Sphäroid im Fokus ist und, falls erforderlich, manuell einstellen und fixieren Sie den "Fokus versetzt.
- Unter "Sampling-Einstellungen" die Option auf eine zentrale Sichtfeld (FOV) zu scannen. Folgende BMM hinaus sollte Tumorsphäroide in einer zentralen Position geblieben sind, so gibt es keine Notwendigkeit, das gesamte Wohl scannen.
- In der Software definieren, die Vertiefungen auf, indem Sie sie auf der Platte Karte gescannt werden. Klicken Sie auf "Suchlauf starten".
HINWEIS: Der Scan wird automatisch gespeichert und können später offline überprüft werden.
4. Automatisierte Bildanalyse
- Wählen Sie "Confluence" Anwendung.
- In der Registerkarte "Analyse", passen application-Einstellungen (zB "Genauigkeit": niedrig, normal, hoch, "Intensitätsschwelle": 1 - 15), um eine genaue Segmentierung auf der Sphäroid, einschließlich Zellprozesse und invadopodia sich in den BMM (siehe Abbildung 1) zu erzeugen. Passen Sie die Einstellungen für die einzelnen Tumorzelllinie und / oder zu verschiedenen Zeitpunkten. Die "Confluence" Anwendungsmaßnahmen der% der Muldenbereich durch die eindringenden Zellen bedeckt, in der ausgewählten FOV.
- Überprüfen Sie, dass die Analyseeinstellungen sind angemessen (dh genaue Segmentierung) für andere Sphäroiden in der Platte, indem Sie auf ein paar verschiedenen Brunnen. Wenn die Segmentierung nicht genau umreißen ein Sphäroid, weiter einzustellen die Anwendungseinstellungen.
- Klicken Sie auf "Start Analyse".
- Auf der Registerkarte "Ergebnisse", überprüfen Sie mehrere Brunnen Analysequalität zu überprüfen. Export "Nun Pegeldaten" in ein Tabellenkalkulationsprogramm.
- Repeat-Analyse für alle Zeitpunkte. Berechnen Sie den Mittelwert% Konfluenz für replizieren Brunnen und Grundstücks Invasion (% Konfluenz) gegen die Zeit in einem Balkendiagramm, mit Wissenschaftliche Visualisierungs- und Statistiksoftware der Wahl.
5. Manuelle Image Acquisition
- Aufnehmen eines Bildes für jeden Tumor Sphäroid in Abständen ausgehend von t = 0 bis zu 72 bis 96 h, je nach Geschwindigkeit der Invasion der Zelllinie in Frage, unter Verwendung eines umgekehrten Mikroskops (bei einer 96-Well-Platte dies dauert ca. 20 - 30 min). Verwenden Sie einen 10X-Objektiv. Verwenden Sie einen 4X Ziel, wenn ein fallenen Bereich zu groß ist, um innerhalb des 10X Sichtfeld vollständig erfasst werden.
- Speichern Sie jede erworbene Einzelbild.
- Zur Kalibrierung nehmen Bilder einer Bühne Raster (1 mm) mit beiden 10X und 4X Ziele (und Speichern von Bildern).
6. Manuelle Bildanalyse
- Öffnen Sie die Bühne Rasterbilder in die Bildanalyse-Software der Wahl.
- Geben Sie den graticule Messungen, die Einheiten (um), die Ziele verwendet (10X oder 4X) und führen Sie die Kalibrierung. Dieser Schritt wird nur einmal benötigt. Für die anschließende Bildanalyse, laden Sie einfach die gewünschten Kalibrierungseinstellungen.
- Öffnen Sie die Invasion Assay Bild, und wählen Sie die Kalibrierungseinstellungen je nach Mikroskopobjektiv (10x oder 4X) verwendet, um die Bilder zu erhalten.
- Alternativ Import von Bildern auf einem Zytometers (Schritt 3) erhalten und manuell zu analysieren, wie Bilder mit Hilfe eines Umkehrmikroskops erhalten beschrieben (siehe in Abbildung 3 und Abbildung 4 dargestellten Ergebnissen).
- Man misst die Fläche von den Sphäroiden bedeckt.
- In dem hier verwendeten für die Repräsentative Ergebnisse (siehe Tabelle für Spezifikationen von Ausrüstung und Materialien) Software, um "Measure" und wählen "Count / Größe". Wählen Sie "Datei" und dann "Einstellungen laden" und wählen vorgegebenen assay-Einstellungen. Dann wählen Sie "Count". Das Sphäroid ist dann genau segmentiert werden.
- Alternativ zu "Bearbeiten" gehen dann "Zeichnen / Merge-Objekte", um das Fenster "Magic Wand / Trace" zu öffnen. Verwenden Sie den Zauberstab Cursor auf dem Sphäroid Bild klicken und erhalten Segmentierung. Wählen Sie "Trace" (im Fenster "Magic Wand") von Hand skizzieren die Sphäroid mit einer Maus.
- Export Messungen verschiedener Parameter (Fläche, Durchmesser, Umfang, etc.) in eine Tabellenkalkulation. Nehmen Sie in der Kalkulationstabelle die relevanten Bildinformationen (zB auch Anzahl, relative Zeitpunkt).
- Zeichnen Sie die mittlere Fläche der Replikation Sphäroiden (Invasion) gegen die Zeit unter Verwendung Wissenschaftliche Visualisierungs- und Statistiksoftware. Alternativ berechnet die Veränderung der Sphäroid Bereich zu jedem Zeitpunkt in Bezug auf den Bereich zum Zeitpunkt t = 0. Dann Stück Invasion (% t0) über die Zeit als eine lineare graph.
Representative Results
3D Tumorinvasion Sphäroid wird mit einem einfachen, reproduzierbaren, automatisierten Verfahren in Figur 1 schematisch dargestellt, beurteilt: reproduzierbar großen Tumorsphäroide durch Plattieren Zellen in ULA 96-well Rundboden Platten erhalten. 4 Tage nach der Einweihung Sphäroiden in BMM eingebettet. Dies stellt eine halbfeste Struktur, in die Tumorzellen eindringen und aus dem Sphäroid verbreiten. 96 Stunden unter Verwendung eines Zytometers - Sphäroide zentral an der Basis der Vertiefungen und Invasion in die BMM liegt leicht in Abständen ausgehend von t = 0 bis 72 überwacht. Dies kann voll automatisiert Bildanalyse bereitzustellen.
Beispiele für verschiedene Arten von Krebszellinvasion in den 2 -. 4 ist die hoch-malignen menschlichen Glioblastoma multiforme (GBM) Zellinie U-87 MG, bildet eine dichte, sphärische 3D-Struktur und wird hier beispielhaft Hirntumoren, bei dem lokale Invasion ist ein wichtiger lebensbedrohlicheFunktion. Einmal in BMM eingebettet, Zellen aus U-87 MG Sphäroiden mit einem typischen "Starburst" Invasion Muster 12 verteilt. Tumorzellen erstrecken sich radial in die Matrix, in der sie eine 3-dimensionale Form beizubehalten. Das Verfahren wird über einen Zeitraum von 72 Stunden, gefolgt wie in Figur 2 für U-87-MG-Sphäroiden gezeigt, wenn das Ausmaß der Tumorzellinvasion, mit Angaben zu den zellulären Prozessen und invadopodia sich in den BMM ist klar ersichtlich. Vollautomatische Bildanalyse unter Verwendung eines Bild Zytometer ermöglicht eine präzise Quantifizierung der Tumorzellinvasion im Laufe der Zeit. Die Quantifizierung in Figur 2 erhalten wird, wie in Figur 1, wobei die automatisierte Analyse erzeugt Segmentierungs um die Zell Vorsprünge, die sich in den BMM vom U-87 MG Sphäroid Körper dargestellt. Man beachte, dass für diese Zellinie, das Tumor Sphäroid Körpers aus der Messung der Eindringzone Bereich ausgeschlossen.
Ein anderes Muster der INVASIon wurde von menschlichen Plattenepithelkarzinomen Kopf-Hals-Krebszelllinien angezeigt. CAL CAL S und R sind isogene aber CAL S ist empfindlich gegenüber, und CAL R resistent gegen EGFR-Tyrosinkinase-Hemmer 14. In Abwesenheit des EGF weder Zelllinie in den BMM (Abbildung 3) aber, wie die Konzentration von EGF erhöht (2,5 ng / ml), die Sphäroide scheinen "Bud" eingedrungen. Bei den höheren Konzentrationen von EGF (40 und 80 ng / ml) den Grad der Invasion war reduziert. Dies steht im Einklang mit der klassischen glockenförmige Dosis-Wirkungs-EGF in Bezug auf die Invasion, die zuvor berichtet worden ist 15. In 20 ng / ml EGF, waren fingerartigen Vorsprünge von dem Hauptkörper des CAL R Sphäroide während CAL S Zellen extrudiert nach 72 h (Figur 3) weniger invasiv. Dieser Differenz Invasion war evident 48 h nach Sphäroide wurden in BMM (enthaltend 20 ng / ml EGF für eine maximale Unterscheidung zwischen Zelllinien platziert) Und größte nach 72 h (Abbildung 4). Diese Bilder wurden rasch mit Hilfe eines Zytometers, wie U-87 MG erworben. (Figuren 3 und 4), jedoch in diesem Fall, ein alternatives Verfahren veranschaulichen, wurde der Grad der Invasion manuell mit eigenständigen Bildanalyse-Software quantifiziert und graphisch dargestellt. Diese Ergebnisse veranschaulichen eine phänotypische Unterschied zwischen Drogenempfindlichen und resistenten Zellen, die verwendet werden könnte, um für Verbindungen, die spezifisch antagonisieren die arzneimittelresistente, invasiven Phänotyp zu screenen.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der 3D-Tumor Sphäroid Invasionstest. Der Arbeitsablauf zeigt die Schritte beinhaltet das Verfahren einschließlich repräsentativer Bilder von U-87-MG Glioblastom Sphäroide direkt nach Einbetten BMM (oberes Feld; T = 0) und nach der Invasion in BMM (unten; t = 72 h) mit und ohne die Segmentierung, die das Gebiet von den eindringenden Zellen bedeckt misst. Bar = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Zeitverlauf der U-87 MG Glioblastom Sphäroid Invasion in BMM. U-87 MG spheroid 3D-Invasion in BMM wurde überwacht und bis zu 72 Stunden mit einem Zytometers quantifiziert. (A) Repräsentative Bilder und (B) Quantifizierung Tumorzellinvasion gezeigt. Bar = 500 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
re 3 "src =" / files / ftp_upload / 52.686 / 52686fig3.jpg "/>
Abbildung 3. CAL R (resistent) und CAL S (Kleinschreibung beachten) Tumor Sphäroid Invasion. (A) Repräsentative Bilder und (B) manuelle Quantifizierung der EGF dosisabhängige CAL CAL R und S Tumorinvasion Sphäroid dargestellt. Bar = 500 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
4. Die Zellen aus CAL R (resistent) Sphäroiden, wenn in B gesetzt sind invasiv als CAL S (Kleinschreibung beachten) TumorsphäroideMM. Bei EGF Stimulation CAL R Tumorsphäroide zeigen eine ausgeprägtere Invasion als CAL S. (A) Repräsentative Bilder und (B) manuelle Quantifizierung der Invasion gezeigt. Bar = 500 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Discussion
Die beiden hier beschriebenen Tumormodellen (Glioblastom und SCCHN) wurden speziell ausgewählt, um unsere 3D-Test veranschaulichen, wie sie sind klinisch relevante lokal invasiven Karzinomen mit einem ungedeckten Bedarf an wirksamen Therapien 12. Nach medikamentöse Behandlung, die Beurteilung der in vitro pharmakodynamische (PD) Biomarker Veränderungen können leicht durch Western-Blot oder Immuntests von Lysaten nach der Anwendung von bestimmten im Handel erhältlichen Reagenzien zur Zellgewinnung von BMM und / oder Immunfluoreszenz-Analyse der Invasion Tumorsphäroide durch ganze Periode durchgeführt werden Mount-Färbung.
Diese Invasionsassay ist eine nützliche Technik für die schnelle und reproduzierbare Beurteilung des Tumorzellinvasion in einem halbfesten Medium, und somit für zukünftige besonders geeignete in vitro Wirkstoff-Screening. Krebszellen dringen in die Matrix in einem 3D-Weise, wie sie aus einer "Mikro-Tumor", durch den Tumor Sphäroid dargestellt verteilt, und erstrecken sich in einer extracellular-Matrix-ähnlichen Umgebung. Der wahre Dreidimensionalität des Assays ist im Zellmorphologie, die sich von dem flachen, adhärenten Zellen Morphologie anzunehmen, wenn das sich auf einem festen Substrat ist offensichtlich. Der Grad der Invasion wird leicht unter Verwendung entweder eines Zytometers, wodurch ein automatisiertes Auslesen oder durch Verwendung eines Standard-Mikroskop in Kombination mit bildgebenden Software quantifiziert. Darüber hinaus ist dieses Verfahren geeignet für Fluoreszenzabbildung 13 (beispielsweise mit Zelllinien, die fluoreszierende Proteine oder vormarkierten mit Fluoreszenzfarbstoffen).
Das Verfahren ist einfach, mit dem nur kritische Schritt der Zugabe des BMM, dargestellt durch, wenn die Gefahr besteht, der die zentrale Position des Sphäroids im stören auch U-förmig. Dies kann zu einer suboptimalen Bildanalyse ergeben, mit Kügelchen in unterschiedlichen Fokusebenen. Es ist daher wichtig, die BMM vorsichtig und langsam in jede Vertiefung hinzufügen. Nach BMM Außerdem ist es ratsam, um die Platte zu überprüfenunter einem Mikroskop, und wenn die Lokalisierung als unannehmbar betrachtet, kann dies durch sanfte Zentrifugation beseitigt. Mit der Erfahrung, das ist selten notwendig. Während diese Methode ist robust und sehr gut reproduzierbar, konnte zwischen experimentelle Variation mit verschiedenen Chargen von BMM auftreten. Um dies zu vermeiden, ist es ratsam, eine ausreichende BMM erhältlich aus einer einzigen Charge, um eine Reihe von Untersuchungen zu beenden.
Eine Beschränkung des Verfahrens (wie für solche Assays) ist die Schwierigkeit beim Unterscheiden zwischen Invasion und Proliferation, die die Tumorzellen, wahrscheinlich während des Testzeitrahmen zu unterziehen. Obwohl die Verdopplungszeit der Zellen berücksichtigt werden oder Zellzyklus-Inhibitoren, wie Cytochalasin D eingeführt wird, ist es nicht leicht zu steuern oder eine eindeutige Unterscheidung zwischen diesen beiden verschiedenen Aspekten der Tumorprogression, speziell für schnell wachsende Tumorzellen und für diejenigen, haben eine "expansive", eher als infiltrative, Invasion Muster. Aus diesem Grundes wird vorgeschlagen, dass eine parallele 3D-Wachstumstest durchgeführt, um spezifische Wirkungen irgend inhibitorisch oder stimulatorisch Mittel zu bewerten. Wenn sorgfältiger Dosis-Wirkungs-Studien durchgeführt werden, kann es möglich sein, Konzentrationen, die Auswirkungen auf die Proliferation zu minimieren auszuwählen. Zum Beispiel haben wir gezeigt, dass die HSP90 Inhibitor 17-AAG hemmt U-87 MG 3D Tumor Sphäroid Invasion schon bei 24 Stunden und bei Konzentrationen unterhalb der Konzentration Hemmung 3D Wachstum um 50% (GI 50) 12.
Andererseits ist die Bedeutung dieser Assay, verglichen mit anderen Standard-Invasionsassays (zB Filter basierten Assays oder Eindringen einzelner Zellen in 3D-Matrices 1) ist, dass die Tumorzellen eindringen in die umgebende Matrix aus dem Sphäroid, das eine ähnlich " Mikro-Tumor "oder eine" Mikrometastasen "und deshalb berücksichtigt wichtige Aspekte der Pathophysiologie einer Tumormasse. Die Methode, die wir präsentieren liefert Informationen über diekollektive Verhalten von Tumorzellen, wenn sie anfangs so dass die Kügelchen, und auch einzeln, als Einzelzellen zu erreichen entfernteren Regionen der BMM. Zusätzlich können Zellen innerhalb Tumorsphäroide Hypoxie und Nährstoffmangel erleben, die durch Veränderungen in der Genexpression, kann Migration und Invasion zu fördern; solche Merkmale sind in 2D-Assays nicht vorhanden. Außerdem sind alle diese ist in einem Hochdurchsatzformat durch den Einsatz von speziellen Platten mit 96 Vertiefungen und die neuesten Bildverarbeitungstechnologie, wodurch eine weitere komplexe 3D-Assay, um leicht in die Zielvalidierung und Arzneimittelforschung verwendet werden.
Die Methode, die wir präsentieren können weitere Anwendungen aufnehmen, um weitere Aspekte der Tumorzellinvasion anzugehen. Insbesondere können zusätzliche Komplexität durch die Zugabe von Wirtszellen, wie Fibroblasten und / oder Endothelzellen in Betracht gezogen werden, in das Sphäroid selbst oder der umgebenden Matrix. Sie kann auch geändert werden, nicht nur in Bezug auf Steifigkeit (durch die Verwendung von verschiedenen concentrations von BMM), sondern auch in Bezug auf die Zusammensetzung (durch die Zugabe von anderen Komponenten abhängig von der spezifischen Gewebe / Organ des angenommenen Tumormodell: zB Tenascin für Hirntumoren 16 und Kollagen für Mammakarzinom 17).
Eine ähnliche Einrichtung (Erzeugung von Sphäroiden und Imaging) kann auch angepasst, um Gewebeinvasion in 3D, wo Tumorsphäroide sind co-kultiviert mit Embryoidkörpern ähnlich einem komplexen Gewebe 12 oder mit anderen zellspezifische Organoide (zB Astrozyten zu beurteilen Gliom 18 oder Krypta Kulturen für Magen-Darm-Krebsarten), aber weitere Arbeiten erforderlich, um automatisierte Bildanalyse zu ermöglichen.
Disclosures
Alle Autoren erklären, keine konkurrierenden Interessenkonflikt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning Matrigel basement membrane matrix |  Corning |
354234 | Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
| Cultrex basement membrane extract, PathClear | Trevigen |
3432-005-01 | Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
| Ultra-low attachment 96-well plate | Corning |
7007 | |
| EGF | Miltenyi Biotec |
130-093-825 | Add 100 μl 1% BSA (w/v) in water to 100 μg EGF. To 25 μl of this, add 4,975 μl RHB-A medium to give a 5 μg/ml working stock. Aliquot and store at -20 °C |
| RHB-A medium | Stem Cells Inc. |
SCS-SF-NB-01 | For diluting EGF |
| DMEM | GIBCO |
31966-021 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | Biosera |
1001/500 | Heat at 56 °C to inactivate complement before use |
| TrypLE | GIBCO |
12605 | Cell dissociation solution |
| Celigo cytometer | Nexcelom Bioscience |
n/a | Specialist equipment for image capture and analysis. Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative |
| IX70 inverted microscope | Olympus |
n/a | Used with camera for manual image capture |
| Retiga Exi Fast 1394 digital camera | Qimaging |
n/a | Attached to microscope for manual image capture |
| Image-Pro Plus 7.0 | Media Cybernetics |
n/a | Software used to control camera and microscope for manual image capture |
| Image-Pro Analyzer 7.0 | Media Cybernetics |
n/a | Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size |
| Excel 2010 | Microsoft |
n/a | Scientific graphing and statistical software |
| Prism 6.0 | GraphPad |
n/a | Scientific graphing and statistical software |
References
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
- Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. Two-Dimensional vs. Three-Dimensional In Vitro Tumor Migration and Invasion Assays. Methods and Protocols. 986, 227-252 (2013).
- Hwang, Y. S., Park, K. K., Chung, W. Y. Invadopodia formation in oral squamous cell carcinoma: the role of epidermal growth factor receptor signalling. Arch. Oral. Biol. 57 (4), 335-343 (2012).
- Wang, S., et al. Study on invadopodia formation for lung carcinoma invasion with a microfluidic 3D culture device. PLoS One. 8 (2), e56448 (2013).
- Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).
- Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Semin. Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Nystrom, M. L., et al. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. The Journal of pathology. 205 (4), 468-475 (2005).
- Deisboeck, T. S., et al. Pattern of self-organization in tumour systems: complex growth dynamics in a novel brain tumour spheroid model. Cell Prolif. 34 (2), 115-134 (2001).
- Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5 (5), e10431 (2010).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol. 10, 29 (2012).
- Vinci, M., Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods and Protocols. , 253-266 (2013).
- Box, C., et al. A novel serum protein signature associated with resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in head and neck squamous cell carcinoma. Eur. J. Cancer. 49 (11), 2512-2521 (2013).
- Khajah, M. A., Al Saleh, S., Mathew, S., M, P., Luqmani, Y. A. Differential effect of growth factors on invasion and proliferation of endocrine resistant breast cancer cells. PLoS One. 7 (7), e41847 (2012).
- Brosicke, N., van Landeghem, F. K., Scheffler, B., Faissner, A. Tenascin-C is expressed by human glioma in vivo and shows a strong association with tumor blood vessels. Cell and tissue research. 354 (2), 409-430 (2013).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Molina, J. R., Hayashi, Y., Stephens, C., Georgescu, M. M. Invasive glioblastoma cells acquire stemness and increased Akt activation. Neoplasia. 12 (6), 453-463 (2010).
