Tredimensionell (3D) Tumör Spheroid invasionsanalys

Abstract

Invasion av omgivande normala vävnader anses allmänt vara en viktig kännetecken för maligna (i motsats till benigna) tumörer. För vissa cancerformer i synnerhet (t.ex. hjärntumörer såsom glioblastoma multiforme och skivepitelcancer i huvud och hals -. SCCHN) är en orsak till allvarlig sjuklighet och kan vara livshotande, även i avsaknad av fjärrmetastaser. Dessutom cancer som fått återfall efter behandling tyvärr ofta närvarande med en mer aggressiv fenotyp. Därför finns det en möjlighet att rikta processen för invasionen att tillhandahålla nya behandlingar som kan vara komplementär till schablon antiproliferativa medel. Hittills har denna strategi hämmats av bristen på robusta, reproducerbara analyser som lämpar sig för en detaljerad analys av invasionen och för drogscreening. Här ger vi en enkel mikro-platta (baserat på en enhetlig, självorganiserande 3D tumör sfäroider) som har en stor potential för en sådan studör. Vi exemplifierar analysplattform med hjälp av en mänsklig glioblastomcellinje och även en SCCHN modell där utvecklingen av resistens mot riktade epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR) -hämmare förknippas med förbättrad matris invasiv potential. Vi erbjuder också två alternativa metoder för halvautomatisk kvantifiering: en med hjälp av en avbildning cytometer och en andra som helt enkelt kräver standard mikroskopi och ta bilder med digital bildanalys.

Introduction

Klassisk cancer läkemedelsutveckling är till stor del inriktad på användningen av in vitro cellbaserade analyser för att screena för cytotoxiska medel som hämmar tumörcelltillväxt och / eller främja programmerad celldöd (apoptos). På senare tid har arbetet gått mot riktade behandlingar med utvecklingen av hämmare av de bakomliggande molekylära orsakerna till malign celltillväxt. Trots några spektakulära resultat, är sådana medel som ofta förknippas med den snabba utvecklingen av läkemedelsresistens. Med tanke på att det är invasiva och metastatisk potential av tumörceller som är ansvarig för de flesta dödsfall i cancer, och att återfall sjukdom uppvisar ofta en mer aggressiv fenotyp, är det logiskt också att överväga kompletterande in vitro experimentella modeller ^1,2 för att identifiera nya medel som kommer att hämma dessa extra viktiga "kännetecken" av cancer.

Under malign progression, tumörceller förvärvaförmågan att invadera omgivande vävnad och / eller spridas till avlägsna organ (metastaser). Cancerceller penetrera basalmembranet genom bildning av invadopodia ^3,4. Dessa strukturer är berikad med aktinfilament, specifika vidhäftningsproteiner och proteinaser och är kollektivt ansvariga för tumör cellmotilitet och nedbrytning av den extracellulära matrisen (ECM) ^5. Invadopodia sträcker sig in i ECM och tros vara viktiga för tumörcellinvasion och även extravasering i kärl kanaler, vilket underlättar hematogen (eller lymfatiska) spridning och metastasering.

Nuvarande standardmetoder för att utvärdera tumörcellinvasion in vitro inkluderar följande. Transwell-baserad eller Boyden kammaranalyser ^2,6 där enkelcellsuspensioner ympas ovanpå ett filter belagt med ett tjockt skikt av ECM-härledda proteiner. Celler invaderar sedan och flytta in i den nedre kammaren som svar på en kemo-attraherande. Vanligen använda ECMproteiner är typ I-kollagen, eller ett basalmembran-liknande matris (BMM, t.ex., Matrigel, som härrör från EHS-tumör ⁷⁾ som härmar den naturliga sammansättningen av basalmembran.

Som ett alternativ till de filterbaserade Boyden-kammare typ analyser ⁸ kan celler ympas ovanpå en ECM-gel (till vilka fibroblaster kan tillsättas), där de bildar ett monoskikt och sedan individuellt eller kollektivt invadera in i gelén. Invasion kan mätas i termer av antalet invaderande celler och / eller avståndet reste från gelytan ^9. Tumörceller kan också vara helt inbäddad i en matris, antingen som en enkelcellsuspension eller som sfäroider - vanligen placerade mellan två skikt av ECM-gel- tillåter celler att invadera ur tumörmassan i den omgivande matrisen ^2,6,10,11.

Det tredimensionella (3D) tumör sfäroid invasionsanalys som beskrivs här ger en snabb, automatiserbar invasionen system med användning av en highly reproducerbar, standardiserad metod ¹² i en 96-brunnar format med en sfäroid per brunn. BMM tillsätts direkt till varje brunn för att ge en halvfast matris, i vilken tumörceller invaderar från sfäroid kropp. Graden av tumörcellinvasion övervakas vid intervall över en period av 72-96 timmar. Denna metod har följande fördelar jämfört med den nuvarande in vitro invasionsanalyser som nämns ovan: Tumörcellerna är organiserade i en 3D-struktur härma en tumör mikro region eller en mikro metastas; tumör sfäroiderna är mycket reproducerbara i storlek; invasionen analysen utförs på plats i samma platta som tumör sfäroid utveckling, utan att behöva flytta dem till sekundära plattor; metoden, i kombination med den senaste tekniken för automatisk bildanalys möjliggör både hög halt och hög kapacitet analyser av tumörcellinvasion.

Den bildanalys utförs med användning av en bildgivande cytometer, som skannar en 96-brunnarsplattan inom 10 minuter. Genom att använda sammanflödet ansökan, omfattningen och hastigheten av invasionen uppnås antingen genom enstaka celler eller genom cellkluster sprider ut från tumör sfäroiderna och invaderande in i matrisen kan mätas på ett dynamiskt sätt. För lägre genomströmning, är en alternativ metod för bildanalys presenteras, baserad på användningen av ett inverterat mikroskop och standard bildprogram.

Protocol

1. Framställning av reproducerbart stora tumör Sfäroider

1. Tvätta tumörcellmonoskikt med fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 5 ml för en 25 cm ² eller 8 - 10 ml för en 75 cm ² kolv), lägga cell dissociation enzym (1 ml för en 25 cm ² eller 2 ml för en 75 cm ² kolv) och inkubera cellerna vid 37 ° C under 2-5 min.
2. Kontrollera cell lossnar under ett mikroskop och neutralisera cell dissociation enzym med komplett odlingsmedium (5 ml för en 25 cm ² eller 8 ml för en 75 cm ² kolv).
3. Centrifugera cellsuspensionen vid 500 xg under 5 minuter.
4. Avlägsna supernatanten, knacka på röret och återsuspendera cellpelleten i 1 ml komplett odlingsmedium med hjälp av en P1000 pipett. Detta bör ge en enkelcellsuspension utan cellkluster.
5. Räkna celler med användning av en hemocytometer och späd cellsuspensionen för att erhålla 0,5-2 x 10 ⁴ celler / ml (optimal celldensitet måste bestämmas för varje cellinje i order för att erhålla tumör sfäroider av 300-500 um diameter 4 dagar efter cell sådd ^12,13).
6. Överför cellsuspensionen till en steril behållare och med hjälp av en flerkanalspipett, dosera 200 l / brunn i ultralåg fäste (ULA) 96 brunnar rundbottnade plattor ^12.
7. Överför plattorna till en inkubator (37 ° C, 5% _CO2, 95% fuktighet). Fyra dagar senare, visuellt bekräfta tumör sfäroid bildning och fortsätt med 3D invasionen analysen.

2. 3D Tumör Spheroid Invasion analys

1. Tina BMM på is.
2. Håll en uppsättning av sterila filterspetsar för P10, P200 och P1000 pipetter och sterila rör (1,5 ml volym eller större beroende på den totala volym som krävs) vid -20 ° C.
3. Placera ULA 96-brunnars plattor innehållande 4-dagar gamla sfäroider på is.
4. Med hjälp av en multikanalpipett, försiktigt bort 100 pl / brunn av tillväxtmedium från sfäroiddiametern plattorna. För detta steg vinkel tipsen mot inside vägg av U-bottnade brunnar och undviker kontakt med botten av brunnen och platsen för sfäroiderna; minimera störningar av sfäroiderna.
5. Använda iskalla tips, överföra BMM till iskalla rör. För cytokininducerad invasion eller utvärderingsstudier läkemedel, lägga reagenser (på 2x slutlig koncentration) till BMM använder iskalla tips. Använd till exempel epidermal tillväxtfaktor (EGF) för att stimulera invasionen av CAL ^S och CAL ^R squamous karcinomceller. Blanda väl genom att snurra försiktigt, undvika bildning av bubblor.
6. Dispensera Försiktigt 100 pl av BMM in i U-bottnad brunn, siktar spetsen mot innerväggen av brunnen. Detta steg är den mest kritiska som, för optimal bildanalys, måste spheroids kvar i centrum av brunnen ^12.
7. Upprepa steg 2,6 för alla nödvändiga brunnar, vilket gör 5-6 replikat / skick. Om det behövs, byta till en nyligen kyld spets.
   OBS: När mer erfaren, dispense BMM med hjälp av en flerkanalspipett.
8. Med hjälp av en steril nål, ta bort bubblor, om sådana finns.
   1. Med hjälp av ett mikroskop, visuellt kontrollera att spheroids är i ett centralt läge. Om inte, centrifugera plattan vid 300 xg under 3 min vid 4 ° C. Detta kommer att säkerställa att sfäroider är centralt belägna i varje brunn.
9. Överför plattan till en inkubator vid 37 ° C och göra det möjligt för BMM stelna.
10. 1 h senare, med hjälp av en flerkanalspipett, försiktigt lägga 100 | il / brunn av komplett odlingsmedium. För cytokininducerade invasion eller utvärderingsstudier, bland annat cytokiner eller inhibitorer på medellång (1x slutlig koncentration). Alternativt, om reagens inte sattes till BMM i steg 2,5, lägga till dem i mediet vid denna tidpunkt (3x önskade slutkoncentrationen).

3. Automatiserad Image Acquisition

1. Scan plattor på cytometern (för specifikationer, se Tabell över utrustning och material) med jämna mellanrum starting från tiden noll (t0 = dag invasionen analysen inrättas omedelbart efter steg 2,10 upp till 72 timmar, eller 96 timmar för långsammare invaderande tumörcellinjer.
2. Välj "Confluence" ansökan.
3. Kontrollera att sfäroid är i fokus och vid behov, manuellt justera och fixera "Fokus off-set".
4. Under "Provtagnings inställningar" väljer att skanna en central synfält (FOV). Efter BMM Dessutom bör tumör sfäroider ha befunnit sig i ett centralt läge, därför finns det ingen anledning att söka igenom hela väl.
5. I programmet, definierar brunnarna som ska skannas genom att markera dem på tallriken kartan. Klicka på "Start scan".
   OBS! Skanningen sparas automatiskt och kan ses senare off-line.

4. Automatiserad bildanalys

1. Välj "Confluence" ansökan.
2. I fliken "Analys", justera application inställningar (t.ex. "precision": låg, normal, hög, "intensitet tröskel": 1 - 15) för att åstadkomma en exakt segmente runt sfäroid, inklusive cellprocesser och invadopodia sträcker sig in i BMM (se figur 1). Justera inställningarna för varje tumör cellinje och / eller vid olika tidpunkter. Den "Confluence" applikations mäter% av brunnen område som omfattas av de invaderande cellerna i det valda FOV.
3. Kontrollera att inställningarna analys är lämpliga (dvs är segmente exakt) för andra spheroids i plattan genom att klicka på ett par olika brunnar. Om segmente inte exakt beskriva en sfäroid, justera programmets inställningar ytterligare.
4. Klicka på "Starta analys".
5. På fliken "Resultat", kontrollera flera brunnar för att kontrollera analyskvalitet. Export "Well nivå uppgifter till ett kalkylprogram.
6. Repeat Analys för alla tidpunkter. Beräkna medelvärdet% sammanflödet för replikatbrunnar och tomt invasion (% sammanflödet) mot tiden i ett stapeldiagram, med hjälp av grafer och statistisk programvara val.

5. Manuell Image Acquisition

1. Spela in en bild för varje tumör sfäroid med intervall utgående från t = 0 upp till 72-96 h, beroende på hastigheten av invasionen av cellinjen ifråga, med användning av ett inverterat mikroskop (för en 96-brunnars platta detta tar ungefär 20 - 30 min). Använd en 10X mål. Använd en 4X mål när en invaderade området är för stor för att vara helt innesluten i 10X synfält.
2. Spara varje enskild bild förvärvas.
3. För kalibrering, ta bilder av en scen graticule (1 mm) med hjälp av både 10X och 4X mål (och spara bilder).

6. Manuell bildanalys

1. Öppna scenen räknefält bilderna i bildanalys programvara val.
2. Ange graticule mätningar enheterna (pm), de mål som används (10X eller 4X) och utför kalibreringen. Detta steg krävs endast en gång. För efterföljande bildanalys, helt enkelt ladda de nödvändiga kalibreringsinställningarna.
3. Öppna invasionen analysbilder och välj kalibreringsinställningarna beroende på mikroskopobjektivet (10X eller 4X) används för att få bilderna.
   1. Alternativt, importera bilder erhålls en avbildning cytometer (steg 3) och analysera manuellt, såsom beskrivits för bilder som erhållits med ett inverterat mikroskop (se resultat som visas i Figur 3 och Figur 4).
4. Mät det område som omfattas av sfäroiderna.
   1. I den programvara som används här för Representativa resultat (för specifikationer, se tabell av utrustning och materiel), gå till "åtgärd" och välj "Räkna / storlek". Välj "File" och sedan "Ladda inställningar" och välj förutbestämd assay inställningar. Välj sedan "Greven". Den sfäroid bör därefter noggrant segmenterad.
   2. Alternativt gå till "Redigera" och sedan "Rita / Merge objekt" för att öppna "Trollstaven / Trace" fönster. Använd staven markören för att klicka på sfäroid bilden och få segmentering. Välj "Trace" (i "Trollstaven" fönster) för att manuellt beskriva sfäroid med hjälp av en mus.
5. Export mätningar av olika parametrar (område, diameter, omkrets etc) till ett kalkylblad. Spela på kalkylbladet relevant bildinformation (t.ex. väl nummer, relativ tidpunkt).
6. Rita den genomsnittliga området upprepade sfäroider (invasion) mot tiden med hjälp av grafer och statistisk programvara. Alternativt beräkna förändringen i sfäroid område vid varje tidpunkt, i förhållande till området vid t = 0. Därefter tomt invasion (% t0) mot tiden som en linjär graph.

Representative Results

3D tumör sfäroid invasionen bedöms med hjälp av en enkel, reproducerbar, automatiserad metod som schematiskt illustreras i figur 1: reproducerbart stora tumör sfäroider erhålles genom utstrykning av celler i ULA 96-brunnars rundbottnade plattor. 4 dagar efter initiering sfäroider är inbäddade i BMM. Detta ger en halvfast struktur in i vilken tumörceller invaderar och sprids ut från sfäroid. Sfäroider finns centralt vid basen av varje brunn och invasion i BMM övervakas lätt vid intervall utgående från t = 0 upp till 72-96 h med användning av en avbildnings cytometer. Detta kan ge helt automatiserad bildanalys.

Exempel på olika typer av cancercellinvasion visas i fig. 2 - 4 Den mycket maligna humana glioblastoma multiforme (GBM) cellinjen U-87 MG, bildar en tät, sfärisk 3D-struktur och används här för att exemplifiera hjärntumörer i vilka lokala invasionen är en nyckellivshotandefunktionen. När inbäddade i BMM, celler från U-87 MG sfäroider sprids med en typisk "starburst" invasion mönstret ^12. Tumörceller radiellt sträcker sig in i matrisen i vilken de upprätthåller en 3-dimensionell form. Processen följs under en period av 72 h såsom visas i fig 2 för U-87 MG sfäroider, när omfattningen av tumörcellinvasion, med uppgifter om de cellulära processerna och invadopodia sträcker sig in i BMM är uppenbar. Helt automatiserad bildanalys med användning av en bild cytometer möjliggör exakt kvantifiering av tumörcellinvasion med tiden. Kvantifieringen i fig 2 erhålles såsom visas i fig 1, där den automatiserade analysen ger segmente runt cell utsprång som sträcker sig in i BMM från U-87 MG-sfäroid kropp. Notera att för denna cellinje, är tumör sfäroid kroppen undantas från mätningen av invaderade området.

Ett annorlunda mönster av invasion visades av mänskliga squamous huvud- och halscancer cellinjer. CAL ^S och CAL ^R är isogen men CAL ^S är känslig för, och CAL ^R resistenta mot EGFR tyrosinkinashämmare ^14. I avsaknad av EGF, varken cellinje invaderade i BMM (Figur 3) men eftersom koncentrationen av EGF ökades (till 2,5 ng / ml), sfäroiderna verkar Bud. Vid de högre koncentrationerna av EGF (40 och 80 ng / ml) graden av invasionen reducerades. Detta överensstämmer med den klassiska klockformade dosrespons på EGF i termer av invasion som har rapporterats tidigare ^15. I 20 ng / ml EGF, fingerliknande utsprång extruderade från huvuddelen av CAL ^R spheroids medan CAL ^S-celler var mindre invasiva efter 72 timmar (Figur 3). Denna differentiella invasionen var tydlig 48 timmar efter sfäroider placerades i BMM (innehållande 20 ng / ml EGF för maximal skillnad mellan cellinjer) Och störst efter 72 timmar (Figur 4). Dessa bilder förvärvades snabbt med hjälp av en avbildning cytometer, som för U-87 MG. Men i detta fall, för att exemplifiera en alternativ metod, bestämdes graden av invasion kvantifieras manuellt med fristående bildanalysmjukvara och presenteras grafiskt (fig 3 och 4). Dessa resultat illustrerar en fenotypisk skillnad mellan läkemedelskänsliga och -resistenta celler som skulle kunna användas för att screena för föreningar som specifikt kommer antagoniserar läkemedelsresistenta, invasiv fenotyp.

Figur 1. Schematisk översikt av 3D tumör sfäroid invasion analys. Arbetsflödet visar stegen metoden innebär bland annat representativa bilder av U-87 MG glioblastom sfäroider strax efter inbäddning i BMM (övre panelen; t = 0) och efter invasionen i BMM (nedre panelen, t = 72 h) med och utan segmentering som mäter det område som omfattas av de invaderande cellerna. Bar = 100 um. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Tids under U-87 MG glioblastom sfäroid invasion i BMM. U-87 MG Spheroid 3D invasion i BMM övervakades och kvantifieras upp till 72 timmar med hjälp av en avbildning cytometer. (A) Representativa bilder och (B) kvantifiering av tumörcellinvasion visas. Bar = 500 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

re 3 "src =" / filer / ftp_upload / 52686 / 52686fig3.jpg "/>
Figur 3. CAL ^R (resistenta) och CAL ^S (känslig) tumör sfäroid invasion. (A) Representativa bilder och (B) manuell kvantifiering av EGF dosberoende CAL ^R och CAL ^S tumör sfäroid invasion visas. Bar = 500 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Celler från CAL ^R (resistenta) sfäroider är mer invasiv än CAL ^S (känsliga) tumör spheroids när de placeras i BMM. När EGF-stimulering CAL ^R tumör spheroids visar en mer uttalad invasion än CAL ^S. (A) Representativa bilder och (B) manuell kvantifiering av invasion visas. Bar = 500 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

De två tumörmodeller som beskrivs här (glioblastom och SCCHN) var speciellt utvalda för att exemplifiera vår 3D-analys eftersom de är kliniskt relevanta lokalt invasiv cancer med ett icke tillgodosett behov av effektiva behandlingar ^12. Efter läkemedelsbehandling, bedömning av in vitro farmakodynamiska (PD) biomarkörer förändringar kan göras enkelt genom western blöt eller immun av lysat efter användning av särskilda kommersiellt tillgängliga reagens för att tillåta cell återhämtning från BMM och / eller immunofluorescerande analys av invaderande tumör sfäroider genom hela mount färgning.

Denna invasion analys är en användbar teknik för snabb och reproducerbar bedömning av tumörcellinvasion i ett halvfast medium och därför särskilt lämplig för framtiden läkemedel vitro screening. Cancerceller invadera matrisen i en 3D sätt som de sprider ut från en "mikro-tumör", företrädd av tumören sfäroid, och sträcker sig in i en extracellular matrisliknande miljö. Den sanna tredimensionalitet av analysen är uppenbar i cellmorfologin, som skiljer sig från den platta, vidhäftande morfologi celler antar när du flyttar på ett fast substrat. Graden av invasionen är lätt kvantifieras med hjälp av antingen en avbildning cytometer, vilket gör att en automatiserad utläsning, eller genom att använda en standardmikroskop i kombination med bildbehandlingsprogram. Dessutom är denna metod lämplig för fluorescerande avbildning ¹³ (till exempel med cellinjer som uttrycker fluorescerande proteiner eller pre-märkta med fluorescerande färgämnen).

Metoden är enkel att utföra med den enda kritiska steget representeras av tillsatsen av BMM, när det finns en risk för att störa den centrala positionen för sfäroid i den U-formade väl. Detta kan resultera i suboptimal bildanalys, med sfäroider i olika fokalplan. Det är därför avgörande att lägga BMM försiktigt och långsamt till varje brunn. Efter BMM Dessutom är det lämpligt att kontrollera plattanunder ett mikroskop och om lokaliseringen anses oacceptabel, kan detta avhjälpas genom försiktig centrifugering. Med erfarenhet, är detta sällan nödvändigt. Även om denna metod är robust och mycket reproducerbar, kan inter experimentell variation uppträda med olika satser av BMM. För att undvika detta, är det lämpligt att köpa tillräckligt BMM från en enda sats för att slutföra en rad studier.

En begränsning av metoden (som för sådana analyser) är svårigheten att skilja mellan invasion och spridning, vilket tumörcellerna genomgår sannolikt under analysen tidsramen. Även kan tas fördubblingstiden för celler hänsyn eller cellcykelinhibitorer såsom cytochalasin D infördes, är det inte lätt att kontrollera eller tydligt skilja mellan dessa två olika aspekter av tumörprogression, särskilt för snabbväxande tumörceller och för dem som har en mer "expansiv", snarare än infiltrativ, invasion mönster. Av denna anledningDet föreslås att en parallell 3D tillväxtanalys genomförs för att utvärdera specifika effekterna av eventuella hämmande eller stimulerande medel. Om noggrann dos-responsstudier har utförts, kan det vara möjligt att välja koncentrationer som minimerar effekterna på proliferation. Till exempel har vi visat att HSP90 hämmare 17-AAG hämmar U-87 MG 3D tumör sfäroid invasionen redan vid 24 timmar och vid koncentrationer under koncentrationen hämma 3D tillväxt med 50% (GI ₅₀₎ ^12.

Å andra sidan, betydelsen av denna analys jämfört med andra standard invasionsanalyser (t.ex. filterbaserade analyser eller invasion av enskilda celler i 3D matriser ^1), är att tumörceller invaderar in i den omgivande matrisen från sfäroid, som liknar en " mikro-tumör "eller en" mikro-metastas ", och därför tar hänsyn till viktiga aspekter av patofysiologin för en tumörmassa. Den metod som vi presenterar ger information omkollektiva beteendet hos tumörceller, när initialt lämnar sfäroiderna, och även individuellt, när enstaka celler nå mer avlägsna regioner i BMM. Dessutom kan celler i tumör sfäroider uppleva hypoxi och närings berövande som, genom förändringar i genuttryck kan främja migration och invasion; dessa aspekter är frånvarande i 2D analyser. Dessutom är allt detta finns i en hög genomströmning format genom användning av särskilda plattor med 96 brunnar och den senaste bildteknik, vilket gör att en mer komplex 3D-analys för att lätt kunna användas i målvalidering och läkemedelsutveckling.

Den metod vi presenterar kan rymma ytterligare ansökningar för att ta itu med ytterligare aspekter av tumörcellinvasion. I synnerhet kan extra komplexitet införas genom tillsats av värdceller, såsom fibroblaster och / eller endotelceller, in i sfäroid själv eller den omgivande matrisen. Detta kan också ändras, inte bara i termer av styvhet (genom användning av olika concentrations av BMM), men också när det gäller komposition (genom tillsats av andra komponenter beroende på den specifika vävnaden / organet i det antagna tumörmodell: t.ex. tenascin för hjärncancer ¹⁶ och kollagen för bröstkarcinom ^17).

En liknande upplägg (generation sfäroider och imaging) kan också anpassas för att bedöma vävnadsinvasion i 3D, där tumör sfäroider är samodlade med embryoidkroppar liknar en komplex vävnad ¹² eller med andra cellspecifika organoids (t.ex. astrocyter för gliom ¹⁸ eller crypt kulturer för gastrointestinal cancer) men det krävs ytterligare arbete för att möjliggöra automatiserad bildanalys.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning Matrigel basement membrane matrix	Corning	354234	Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips
Cultrex basement membrane extract, PathClear	Trevigen	3432-005-01	Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips
Ultra-low attachment 96-well plate	Corning	7007
EGF	Miltenyi Biotec	130-093-825	Add 100 μl 1% BSA (w/v) in water to 100 μg EGF. To 25 μl of this, add 4,975 μl RHB-A medium to give a 5 μg/ml working stock. Aliquot and store at -20 °C
RHB-A medium	Stem Cells Inc.	SCS-SF-NB-01	For diluting EGF
DMEM	GIBCO	31966-021	Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum	Biosera	1001/500	Heat at 56 °C to inactivate complement before use
TrypLE	GIBCO	12605	Cell dissociation solution
Celigo cytometer	Nexcelom Bioscience	n/a	Specialist equipment for image capture and analysis. Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative
IX70 inverted microscope	Olympus	n/a	Used with camera for manual image capture
Retiga Exi Fast 1394 digital camera	Qimaging	n/a	Attached to microscope for manual image capture
Image-Pro Plus 7.0	Media Cybernetics	n/a	Software used to control camera and microscope for manual image capture
Image-Pro Analyzer 7.0	Media Cybernetics	n/a	Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size
Excel 2010	Microsoft	n/a	Scientific graphing and statistical software
Prism 6.0	GraphPad	n/a	Scientific graphing and statistical software