Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

ثلاثي الأبعاد (3D) ورم الجسم الشبه الكروي الغزو الفحص

doi: 10.3791/52686 Published: May 1, 2015

Abstract

يعتبر غزو الأنسجة المحيطة العادية عموما أن تكون السمة المميزة الرئيسية للالخبيث (في مقابل حميدة) الأورام. بالنسبة لبعض أنواع السرطان على وجه الخصوص (على سبيل المثال، وأورام الدماغ مثل الأشكال ورم أرومي وسرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة - SCCHN) هو سبب اعتلال شديد ويمكن أن يكون حتى في حالة عدم وجود نقائل بعيدة مهددة للحياة. وبالإضافة إلى ذلك، والسرطانات التي انتكس بعد العلاج للأسف موجودة في كثير من الأحيان مع النمط الظاهري أكثر عدوانية. ولذلك، هناك فرصة لاستهداف عملية غزو لتوفير علاجات جديدة يمكن أن تكون مكملة لمضادات التكاثري القياسية. حتى الآن، وقد أعاق هذه الاستراتيجية من خلال عدم وجود قوية، المقايسات استنساخه مناسبة لإجراء تحليل مفصل للغزو وفحص المخدرات. نحن هنا نقدم طريقة لوحة صغيرة بسيطة (على أساس موحد، الكروية الورم 3D الذاتي تجميع) التي لديها إمكانات كبيرة لمثل هذا ستويموت. نحن مثالا على منصة الفحص باستخدام خط خلية ورم أرومي البشري وأيضا نموذجا SCCHN حيث يرتبط تطور المقاومة ضد تستهدف عامل نمو البشرة مستقبلات (EGFR) مثبطات مع تعزيز مصفوفة الغازية المحتملة. كما نقدم طريقتين بديلة للالكمي شبه الآلي: واحد باستخدام التصوير الكريات والثانية التي يتطلب ببساطة القياسية المجهري والتقاط الصور مع تحليل الصور الرقمية.

Introduction

الكلاسيكية تنمية المضادة للسرطان المخدرات هي مركزة بشكل كبير على استخدام فحوصات في المختبر خلية القاعدة للكشف عن العوامل السامة للخلايا التي تمنع انتشار الخلايا السرطانية و / أو تعزيز موت الخلايا المبرمج (موت الخلايا المبرمج). وفي الآونة الأخيرة، تحركت الجهود الرامية إلى العلاجات المستهدفة مع تطوير مثبطات لأسباب الجزيئية الكامنة وراء انتشار الخلايا الخبيثة. على الرغم من بعض النتائج مذهلة، وغالبا ما ترتبط هذه العوامل مع التطور السريع للمقاومة الجراثيم للأدوية. نظرا لأنه هو احتمال الغازية والمتنقل من الخلايا السرطانية هي المسؤولة عن معظم الوفيات الناجمة عن السرطان، وهذا المرض غالبا ما انتكس يمثل النمط الظاهري أكثر عدوانية، فمن المنطقي أيضا أن تنظر مكملة في المختبر نماذج تجريبية 1،2 لتحديد رواية العوامل التي سوف تمنع هذه 'بصمات' مفتاح إضافية من السرطان.

خلال تطور خبيث، تكتسب الخلايا السرطانيةالقدرة على غزو الأنسجة المحيطة و / أو تنتشر في أعضاء بعيدة (الانبثاث). الخلايا السرطانية تخترق الغشاء القاعدي عن طريق تشكيل لinvadopodia 3،4. وأثرت هذه الهياكل مع خيوط الأكتين والبروتينات التصاق محددة وproteinases وهي مجتمعة مسؤولة عن الحركة الخلايا السرطانية وتدهور المصفوفة خارج الخلية (ECM) 5. Invadopodia تمتد إلى ECM، ويعتقد أنها مهمة لغزو الخلايا السرطانية وكذلك تسرب إلى قنوات الأوعية الدموية، مما يسهل دموي المنشأ (أو اللمفاوية) نشر والانبثاث.

طرق القياسية الحالية لتقييم غزو الخلايا السرطانية في المختبر تشمل ما يلي. المستندة إلى Transwell أو بويدن المقايسات غرفة 2،6 حيث المصنف تعليق خلية واحدة على رأس مرشح مغلفة بطبقة سميكة من البروتينات المشتقة من ECM. خلايا ثم تغزو وتنتقل إلى مجلس النواب ردا على الكيماوي جاذبة. وشاع استخدام ECMالبروتينات هي من النوع الأول الكولاجين، أو قبو يشبه غشاء المصفوفة (BMM، على سبيل المثال، Matrigel، والمستمدة من الورم EHS 7) الذي يحاكي التكوين الطبيعي للأغشية الطابق السفلي.

كبديل لبويدن نوع الغرفة المقايسات القائم على تصفية 8 خلايا يمكن المصنف على رأس هلام ECM (التي الليفية يمكن إضافة) حيث أنها تشكل أحادي الطبقة ومن ثم فرديا أو جماعيا غزو في هلام. ويمكن قياس الغزو من حيث عدد الخلايا الغازية و / أو المسافة المقطوعة من سطح هلام 9. ويمكن أيضا أن الخلايا السرطانية تكون جزءا لا يتجزأ تماما في مصفوفة إما تعليق خلية واحدة أو كما الكروية - عادة ما توضع بين طبقتين من ECM gel- مما يتيح لخلايا لغزو من كتلة الورم في مصفوفة المحيطة 2،6،10،11.

وثلاثي الأبعاد (3D) ورم كروي مقايسة الغزو الموصوفة هنا يوفر نظام غزو automatable السريع باستخدام HIGHLذ استنساخه، طريقة موحدة 12 في شكل لوحة 96-جيدا مع كروي واحد لكل بئر. يضاف BMM مباشرة إلى كل بئر لتوفير مصفوفة شبه صلبة في الخلايا السرطانية التي تغزو من الجسم كروي. ويتم رصد مدى غزو الخلايا السرطانية على فترات على مدى فترة من 72-96 ساعة. يوفر هذا الأسلوب الميزات التالية على المقايسات الحالية في المختبر الغزو المذكورة أعلاه: الورم ويتم تنظيم الخلايا في هيكل 3D محاكاة ورم الصغرى المنطقة أو ورم خبيث الصغير؛ الأجسام الشبه الكروية الورم هي تكرار للغاية في حجم؛ يتم تنفيذ فحص الغزو في الموقع بنفس لوحة عن تطوير ورم كروي، من دون الحاجة إلى نقلها إلى لوحات الثانوية؛ طريقة، جنبا إلى جنب مع أحدث التقنيات لتحليل الصور الآلي، وتمكن كل من المحتوى العالي وتحليل إنتاجية عالية من غزو الخلايا السرطانية.

يتم تنفيذ تحليل الصور باستخدام التصوير الكريات، والذي يقوم بمسح جيدا 96لوحة في غضون 10 دقيقة. باستخدام تطبيق التقاء، ومدى ومعدل الغزو يتحقق إما عن طريق خلايا مفردة أو مجموعات الخلايا تمتد من الأجسام الشبه الكروية الورم والغازية في مصفوفة يمكن قياسها بطريقة ديناميكية. لانخفاض الإنتاجية، وتقدم طريقة بديلة لتحليل الصور، استنادا إلى استخدام مجهر مقلوب وبرامج التصوير القياسية.

Protocol

1. توليد بتكاثر الأجسام الشبه الكروية ورم الحجم

  1. غسل الطبقات الوحيدة الخلية السرطانية مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، 5 مل ل25 سم 2 أو 8-10 مل ل75 سم 2 قارورة)، إضافة انزيم تفارق الخلية (1 مل ​​25 سم 2 أو 2 مل 75 سم 2 قارورة)، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 2-5 دقيقة.
  2. تحقق انفصال الخلايا تحت المجهر وتحييد انزيم تفارق الخلية مع كامل متوسطة النمو (5 مل ل25 سم 2 أو 8 مل ل75 سم 2 قارورة).
  3. تعليق خلية الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق.
  4. إزالة طاف، والاستفادة من الأنبوب وإعادة تعليق بيليه خلية في 1 مل من متوسط ​​النمو باستخدام ماصة P1000. وهذا ينبغي أن تسفر عن تعليق خلية واحدة دون كتل الخلية.
  5. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وتمييع تعليق خلية للحصول على 0،5-2 × 10 4 خلية / مل (تحتاج كثافة الخلية المثلى ليتم تحديدها لكل خط الخلية في سrder للحصول الكروية الورم من 300-500 ميكرون قطرها 4 أيام بعد خلية البذر 12،13).
  6. نقل تعليق خلية إلى خزان معقم و، وذلك باستخدام ماصة الأقنية، الاستغناء عن 200 ميكرولتر / جيد في المرفق منخفضة للغاية (ULA) 96-جيدا لوحات أسفل الجولة 12.
  7. نقل لوحات لحاضنة (37 ° C، 5٪ CO 95٪ الرطوبة). بعد أربعة أيام، تأكيد بصريا تشكيل كروي الورم والمضي قدما في غزو مقايسة 3D.

2. 3D ورم الجسم الشبه الكروي الغزو الفحص

  1. ذوبان الجليد BMM على الجليد.
  2. الحفاظ على مجموعة من النصائح مرشح العقيمة لP10، P200 والماصات P1000 وأنابيب معقمة (1.5 مل حجم أو أكبر اعتمادا على الحجم الكلي مطلوب) عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  3. وضع ULA لوحات 96-جيدا تحتوي الكروية القديمة 4 أيام على الجليد.
  4. باستخدام ماصة الأقنية، وإزالة بلطف 100 ميكرولتر / جيد للنمو المتوسطة من لوحات كروي. لهذه الخطوة زاوية النصائح نحو طجدار nside من الآبار U-القاع، وتجنب الاتصال مع الجزء السفلي من البئر وموقع الكروية. تقليل اضطراب الكروية.
  5. استخدام النصائح المثلج، ونقل BMM لأنابيب الجليد الباردة. للغزو التي يسببها خلوى أو دراسات تقييم المخدرات، إضافة الكواشف (في 2X تركيز النهائي) إلى BMM باستخدام نصائح الجليد الباردة. على سبيل المثال، استخدم عامل نمو البشرة (EGF) لتحفيز غزو CAL S وCAL R الخلايا الحرشفية سرطان. مزيج جيد من قبل يحوم بلطف، وتجنب تشكيل فقاعات.
  6. الاستغناء بلطف 100 ميكرولتر من BMM في البئر U-القاع، وتهدف غيض نحو الجدار داخل البئر. هذه الخطوة هي الأكثر أهمية كما، على تحليل الصور الأمثل، يجب أن تظل الكروية في وسط البئر 12.
  7. كرر الخطوة 2.6 لجميع الآبار المطلوبة، مما يسمح 5-6 مكررات / حالة. إذا لزم الأمر، تغيير إلى طرف الطازجة المبردة.
    ملاحظة: عندما أكثر خبرة، dispenحد ذاته BMM باستخدام ماصة الأقنية.
  8. باستخدام إبرة معقمة، إزالة الفقاعات، إذا كان موجودا.
    1. باستخدام المجهر، والتحقق بصريا أن الكروية هي في موقع مركزي. إن لم يكن، أجهزة الطرد المركزي لوحة في 300 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. وسوف يضمن هذا الكروية تقع مركزيا في كل بئر.
  9. نقل لوحة لحاضنة عند 37 درجة مئوية، والسماح للBMM لترسيخ.
  10. في وقت لاحق 1 ساعة، وذلك باستخدام ماصة الأقنية، إضافة بلطف 100 ميكرولتر / بئر الكامل متوسطة النمو. للغزو أو تقييم المخدرات الدراسات التي يسببها خلوى، وتشمل السيتوكينات أو مثبطات على المدى المتوسط ​​(1X التركيز النهائي). بدلا من ذلك، إذا لم يتم إضافة الكواشف إلى BMM في الخطوة 2.5، وإضافتها إلى وسيلة في هذه المرحلة (3X التركيز النهائي المطلوب).

3. الآلي الحصول على الصور

  1. لوحات المسح على الكريات (للمواصفات انظر الجدول من المعدات والمواد) على فترات ستاrting من وقت صفر (T0 = يوم للمقايسة غزو إعداد، مباشرة بعد خطوة 2.10 تصل إلى 72 ساعة أو 96 ساعة للأبطأ غزو خطوط الخلايا السرطانية.
  2. حدد التطبيق "التقاء".
  3. تأكد من أن كروي هو في التركيز، وإذا لزم الأمر، وضبط يدويا وإصلاح "التركيز المقاصة.
  4. تحت "ضبط أخذ العينات"، حدد لمسح حقل مركزي واحد من عرض (فوف). بعد BMM بالإضافة إلى ذلك، يجب أن ظلت الكروية الورم في موقع مركزي، وبالتالي ليست هناك حاجة لفحص البئر كله.
  5. في البرنامج، وتحديد الآبار التي يتم مسحها ضوئيا من خلال تسليط الضوء على الخريطة لوحة. انقر على 'بدء المسح الضوئي.
    ملاحظة: يتم حفظ المسح الضوئي تلقائيا، ويمكن إعادة النظر فيها في وقت لاحق خارج الخط.

4. الآلي تحليل الصور

  1. حدد التطبيق 'ملتقى'.
  2. في علامة التبويب "تحليل"، وضبط تطبيق صحيفةضبط أوجه (على سبيل المثال، "الدقة": منخفضة، عادية، عالية؛ "عتبة كثافة": 1-15) لإنتاج تجزئة دقيقة حول كروي، بما في ذلك عمليات الخلية وinvadopodia تمتد إلى BMM (انظر الشكل 1). ضبط الإعدادات لكل خط الخلية السرطانية و / أو عند نقاط زمنية مختلفة. تدابير تطبيق "التقاء" ل٪ من المساحة بشكل جيد من قبل الخلايا الغازية المشمولة في مجال الرؤية المحددة.
  3. تأكد من أن إعدادات تحليل مناسبة (أي تجزئة دقيقة) لالكروية الأخرى في لوحة من خلال النقر على عدد قليل من الآبار المختلفة. إذا لم تجزئة الخطوط العريضة بدقة كروي، وضبط إعدادات التطبيق أيضا.
  4. انقر على "ابدأ التحليل.
  5. على علامة التبويب "نتائج"، والتحقق من الآبار متعددة للتحقق من نوعية التحليل. "البيانات على مستوى حسنا" التصدير إلى برنامج جدول بيانات.
  6. Repeaتحليل ر لجميع نقاط الوقت. حساب متوسط٪ التقاء للآبار تكرار والغزو مؤامرة (٪ التقاء) مع الزمن في الرسم البياني شريط، وذلك باستخدام الرسوم البيانية العلمية والبرامج الإحصائية في الاختيار.

5. دليل الحصول على الصور

  1. تسجيل صورة لكل كروي الورم على فترات بدءا من ر = 0 ما يصل الى 72-96 ساعة، وهذا يتوقف على سرعة اجتياح خط الخلية في السؤال، وذلك باستخدام مجهر مقلوب (لوحة 96-جيدا هذا يستغرق حوالي 20 - 30 دقيقة). استخدام هدفا 10X. استخدام الهدف 4X عندما غزت منطقة كبيرة جدا ليتم القبض تماما في مجال 10X نظر.
  2. حفظ كل صورة الفردية المكتسبة.
  3. للمعايرة، التقاط صور من مرحلة graticule (1 مم) باستخدام كل أهداف 10X و4X (وحفظ الصور).

6. كتيب تحليل الصور

  1. فتح الصور المرحلة graticule في برنامج تحليل الصور في الاختيار.
  2. أدخل غراتقياسات icule، الوحدات (ميكرون)، والأهداف المستخدمة (10X أو 4X) وأداء المعايرة. مطلوب هذه الخطوة مرة واحدة فقط. لتحليل الصور لاحقا، وذلك ببساطة إعادة ضبط المعايرة المطلوبة.
  3. فتح الصور مقايسة الغزو واختر إعدادات المعايرة اعتمادا على الهدف المجهر (10X أو 4X) المستخدمة للحصول على الصور.
    1. بدلا من ذلك، الصور التي تم الحصول عليها استيراد على التصوير الكريات (الخطوة 3) وتحليل يدويا، كما هو موضح في الصور التي تم الحصول عليها باستخدام مجهر مقلوب (انظر النتائج هو موضح في الشكل 3 والشكل 4).
  4. قياس المنطقة التي تغطيها الكروية.
    1. في البرمجيات المستخدمة هنا لممثل النتائج (للمواصفات انظر الجدول من المعدات والمواد)، انتقل إلى "قياس" وحدد "عدد / حجم. اختار 'ملف' ثم 'تحميل الإعدادات' وحدد قبل تحديد أساضبط ص. ثم اختر 'عدد'. ثم ينبغي أن تكون مجزأة بدقة كروي.
    2. تذهب بدلا من ذلك إلى 'تعديل' ثم 'رسم / كائنات دمج "لفتح نافذة" العصا السحرية / تتبع. استخدام المؤشر عصا لانقر على الصورة كروي والحصول على تجزئة. اختر 'تتبع' (في نافذة "العصا السحرية") لتوضيح كروي يدويا باستخدام الماوس.
  5. قياسات تصدير معلمات مختلفة (منطقة، قطر، محيط الخ) إلى جدول بيانات. سجل في جدول البيانات والمعلومات ذات الصلة الصورة (على سبيل المثال، وأيضا العدد، نقطة زمنية نسبية).
  6. رسم المنطقة متوسط ​​الكروية تكرار (الغزو) مقابل الوقت باستخدام الرسوم البيانية العلمية والبرامج الإحصائية. بدلا من ذلك، حساب التغير في منطقة كروي في كل نقطة زمنية، نسبة إلى المنطقة في ر = 0. ثم غزو مؤامرة (٪ T0) مقابل الوقت باعتباره جرا الخطيةالرقم الهيدروجيني.

Representative Results

ويتم تقييم 3D غزو الورم كروي باستخدام، قابلة للتكرار، طريقة بسيطة الآلي موضح تخطيطي في الشكل 1: يتم الحصول عليها الكروية الورم الحجم بتكاثر بواسطة طلاء الخلايا في ULA 96-جيدا لوحات أسفل مستديرة. هي جزء لا يتجزأ 4 أيام بعد بدء-الكروية في BMM. وهذا يوفر بنية شبه صلبة في الخلايا السرطانية التي تغزو وتنتشر كروي. وتقع الكروية مركزيا في قاعدة كل بئر والغزو في BMM يتم رصدها بسهولة على فترات بدءا من ر = 0 تصل إلى 72-96 ساعة باستخدام التصوير الكريات. هذا يمكن أن توفر تحليل الصور مؤتمتة بالكامل.

ويوضح أمثلة لأنواع مختلفة من غزو الخلايا السرطانية في أرقام 2 - 4 خبيث للغاية الأشكال ورم أرومي الإنسان (GBM) خط الخلية U-87 MG، يشكل ضيق، كروية هيكل 3D، ويستخدم هنا مثالا أورام المخ التي محلية الغزو هو مهددة للحياة على الرئيسيةالميزة. مرة واحدة جزءا لا يتجزأ من BMM، الخلايا من الكروية U-87 MG تنتشر مع "النجمي" نمط الغزو نموذجي 12. الخلايا السرطانية تمديد شعاعيا في مصفوفة التي تحافظ على شكل 3-الأبعاد. ويتبع عملية على مدى 72 ساعة كما هو مبين في الشكل رقم 2 لU-87 MG الكروية، عندما مدى غزو الخلايا السرطانية، مع تفاصيل العمليات الخلوية وinvadopodia تمتد إلى BMM هو واضح بشكل واضح. مؤتمتة بالكامل تحليل الصور باستخدام صورة الكريات تمكن الكميات الدقيقة للغزو الخلايا السرطانية مع مرور الوقت. يتم الحصول على القياس الكمي في الشكل 2 كما هو موضح في الشكل رقم 1، حيث ينتج عن التحليل الآلي تجزئة حول نتوءات خلية تمتد إلى BMM من U-87 MG جسم كروي. لاحظ أن لهذا الخط خلية، يتم استبعاد لهيئة كروي الورم من قياس مجال غزو.

وهناك نمط مختلف من invasتم عرض أيون الحرشفية في الرأس والرقبة خطوط الخلايا السرطانية البشرية. CAL S وCAL R هي إسوي لكن CAL S حساس ل، وCAL R مقاومة للEGFR التيروزين كيناز مثبطات 14. في غياب EGF، لا خط الخلية غزا في BMM (الشكل 3) ومع ذلك، كما تم زيادة تركيز EGF (2.5 نانوغرام / مل)، تظهر الكروية إلى "برعم". في تركيزات أعلى من EGF (40 و 80 نانوغرام / مل) درجة الغزو تم تخفيض. وهذا يتفق مع الكلاسيكية على شكل جرس الاستجابة للجرعة لEGF من حيث الغزو التي ذكرت سابقا 15. في 20 نانوغرام / مل EGF، كانت نتوءات تشبه الاصبع مقذوف من الجسم الرئيسي للالكروية CAL R بينما الخلايا CAL S أقل الغازية بعد 72 ساعة (الشكل 3). وكان هذا الغزو الفرق واضح 48 ساعة بعد وضعت الكروية في BMM (تحتوي على 20 نانوغرام / مل EGF للتميز القصوى بين خطوط الخلايا) وأعظم بعد 72 ساعة (الشكل 4). تم الحصول عليها هذه الصور بسرعة باستخدام التصوير الكريات، أما بالنسبة U-87 MG. ومع ذلك، في هذه الحالة، لتجسد أسلوب بديل، وكان كميا درجة غزو يدويا باستخدام برمجيات تحليل الصور قائمة بذاتها ويتم عرضها بيانيا (الشكلان 3 و 4). وتوضح هذه النتائج فرق المظهري بين الخلايا الحساسة للعقاقير ومقاوم يمكن استخدامها للكشف عن المركبات التي سوف يثير عداء على وجه التحديد مقاومة، النمط الظاهري الغازية المخدرات.

الشكل 1
الشكل 1. نظرة عامة تخطيطي 3D الورم كروي الغزو الفحص. ويوضح سير العمل الخطوات ينطوي على طريقة بما في ذلك الصور ممثل الكروية U-87 MG ورم أرومي بعد التضمين في BMM (اللوحة العلوية؛ ر = 0) وبعد الغزو في BMM (اللوحة السفلية؛ ر = 72 ساعة) مع وبدون تجزئة الذي يقيس المنطقة من قبل الخلايا الغازية تغطيتها. بار = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. الوقت بالطبع من الغزو U-87 MG ورم أرومي كروي في BMM. U-87 MG كروي تم رصد الغزو 3D في BMM وكميا تصل إلى 72 ساعة باستخدام التصوير الكريات. (A) صور الممثل و (B) الكمي ل وترد غزو الخلايا السرطانية. بار = 500 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

إعادة 3 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 52686 / 52686fig3.jpg "/>
ويبين الشكل 3. CAL R (مقاومة) وCAL S (حساسة) غزو الورم كروي. (A) صور الممثل و (B) الكمي اليدوي للEGF تعتمد على الجرعة CAL R وCAL S غزو الورم كروي. بار = 500 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. خلايا من CAL R (المقاومة) الكروية هي أكثر الغازية من CAL S (الحساسة) الكروية الورم عند وضعه في BMM. وعند تبين التحفيز EGF CAL R الكروية ورم غزو أكثر وضوحا من CAL S. (A) صور الممثل و (B) الكمي اليدوي للغزو ترد. بار = 500 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

نماذج ورم المذكورين هنا (ورم أرومي وSCCHN) وقد تم اختيار خصيصا لتجسد لنا مقايسة 3D كما هي سريريا السرطانات الغازية محليا ذات الصلة مع الحاجة غير الملباة لعلاجات فعالة 12. بعد العلاج من تعاطي المخدرات، وتقييم التغييرات في المختبر الدوائية (PD) العلامات البيولوجية لا يمكن أن يؤديها بسهولة عن طريق طخة غربية أو المناعية لللست] بعد استخدام الكواشف محددة متاحة تجاريا للسماح الانتعاش خلية من BMM و / أو تحليل مناعي غزو الأجسام الشبه الكروية الورم عن طريق كله جبل تلطيخ.

هذا الاختبار الغزو هو تقنية مفيدة للتقييم السريع واستنساخه من غزو الخلايا السرطانية في المتوسط ​​نصف صلب وبالتالي مناسبة خاصة بالنسبة للمستقبل في المختبر فحص المخدرات. الخلايا السرطانية تغزو المصفوفة بطريقة 3D لأنها انتشرت من "الورم الصغير"، ممثلة كروي الورم، وتمتد إلى extracellulAR-مثل مصفوفة البيئة. الحقيقي ثلاثة أبعاد للفحص هو واضح في شكل الخلية، والذي يختلف من شقة، مورفولوجيا الخلايا الملتصقة تفترض عندما تتحرك على ركيزة صلبة. يمكن تقدير درجة الغزو بسهولة باستخدام إما التصوير الكريات، مما يسمح للالآلي للقراءة بها، أو عن طريق استخدام المجهر القياسي في تركيبة مع برامج التصوير. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة مناسبة للتصوير الفلورسنت 13 (على سبيل المثال مع خطوط الخلايا معربا عن البروتينات الفلورية أو المسمى مسبقا مع الأصباغ الفلورية).

طريقة بسيطة لأداء بالخطوة الحاسمة الوحيدة التي يمثلها إضافة BMM، عندما يكون هناك خطر إزعاج المركز الأساسي للكروي في شكل U جيدا. هذا يمكن أن يؤدي إلى تحليل الصور دون المستوى الأمثل، مع الكروية في طائرات التنسيق المختلفة. ولذلك فمن الأهمية بمكان إضافة BMM بعناية وببطء إلى كل بئر. بعد BMM بالإضافة إلى ذلك فإنه من المستحسن للتحقق من لوحةتحت المجهر وإذا اعتبر توطين غير مقبول، وهذا يمكن تداركه عن طريق الطرد المركزي لطيف. من ذوي الخبرة، وهذا نادرا ما يكون ضروريا. ومع أن هذا الأسلوب هو قوية وقابلة للتكرار للغاية، يمكن أن الاختلاف بين التجريبية تحدث مع دفعات مختلفة من BMM. لتجنب هذا، فإنه من المستحسن لشراء ما يكفي من BMM من دفعة واحدة لاستكمال سلسلة من الدراسات.

وجود قيود على طريقة (كما عن أي من هذه المقايسات) هو صعوبة في التمييز بين الغزو والانتشار، والتي الخلايا السرطانية المحتمل الخضوع خلال الإطار الزمني الفحص. على الرغم من أن الوقت مضاعفة الخلايا يمكن أن تؤخذ بعين الاعتبار، أو مثبطات دورة الخلية مثل مثبط حركة الخلايا D قدم، فإنه ليس من السهل السيطرة عليها أو التمييز بين هذين الجوانب المختلفة لتطور الورم، وخاصة بالنسبة للخلايا السرطانية السريعة النمو وبالنسبة لأولئك بوضوح أن لديها أكثر "توسعية"، بدلا من الارتشاحي، ونمط الغزو. لهذا السببيقترح أن مواز فحص النمو 3D يتم تنفيذ لتقييم آثار محددة من أية عوامل المثبطة أو تنشيطية. إذا تم إجراء دراسات متأنية الاستجابة للجرعة، قد يكون من الممكن لتحديد تركيزات التي تقلل من الآثار المترتبة على انتشار الأسلحة النووية. على سبيل المثال لقد أظهرنا أن HSP90 المانع 17-AAG يمنع U-87 MG 3D غزو الورم كروي بالفعل في 24 ساعة وبتركيزات أقل من تركيز تثبيط نمو بنسبة 50٪ 3D (GI 50) (12).

من ناحية أخرى، فإن أهمية هذا الاختبار بالمقارنة مع غيرها من المقايسات الغزو القياسية (على سبيل المثال، مرشح القائمة على فحوصات أو غزو الخلايا واحد في 3D المصفوفات 1)، هو أن الخلايا السرطانية تغزو في مصفوفة المحيطة بها من كروي، التي تمثل " الورم الصغير "أو" ورم خبيث-الصغير "، وبالتالي يأخذ بعين الاعتبار جوانب هامة من الفيزيولوجيا المرضية لكتلة الورم. طريقة نقدم يوفر معلومات عنالسلوك الجماعي من الخلايا السرطانية، عند الخروج في البداية الكروية، وأيضا بشكل فردي، عندما تصل خلايا مفردة المناطق الأكثر بعدا في BMM. بالإضافة إلى ذلك، الخلايا داخل الكروية الورم قد تواجه نقص الأكسجين والمغذيات الحرمان التي، من خلال التغيرات في التعبير الجيني، يمكن أن تعزز الهجرة والغزو. هذه الميزات هي غائبة في المقايسات 2D. وعلاوة على ذلك، كل هذا هو متاح في شكل عالية الإنتاجية من خلال استخدام لوحات محددة 96-جيدا وأحدث تقنيات التصوير، والسماح لفحص 3D أكثر تعقيدا ليتم استخدامها بسهولة في التحقق من صحة الهدف واكتشاف المخدرات.

طريقة نقدم يمكن أن تستوعب المزيد من التطبيقات لمعالجة جوانب إضافية من غزو الخلايا السرطانية. على وجه الخصوص، تعقيد إضافي يمكن تصور بإضافة خلايا العائل، مثل الخلايا الليفية و / أو الخلايا البطانية، إلى كروي نفسه أو المصفوفة المحيطة بها. هذا ويمكن أيضا أن يتم تعديل، ليس فقط من حيث صلابة (عن طريق استخدام شارك مختلفةncentrations من BMM)، ولكن أيضا من حيث التكوين (عن طريق إضافة مكونات أخرى تعتمد على محدد الأنسجة / جهاز من النموذج المعتمد الورم: على سبيل المثال، tenascin لسرطان الدماغ 16 و الكولاجين لسرطان الثدي 17).

ويمكن أيضا مماثل مجموعة المتابعة (الجيل من الكروية والتصوير) أن تتكيف مع تقييم غزو الأنسجة في 3D، حيث الكروية الورم وشارك في تربيتها مع الهيئات مضغي تشبه الأنسجة المعقدة 12 أو مع organoids خلية محددة أخرى (على سبيل المثال، الخلايا النجمية ل مطلوب بالورم 18 أو سرداب الثقافات لسرطانات الجهاز الهضمي)، ولكن بمزيد من العمل لتمكين تحليل الصور آليا.

Disclosures

كل الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح المتنافسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Corning Matrigel basement membrane matrix Corning 354234 Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips
Cultrex basement membrane extract, PathClear Trevigen 3432-005-01 Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips
Ultra-low attachment 96-well plate Corning 7007
EGF Miltenyi Biotec 130-093-825 Add 100 μl 1% BSA (w/v) in water to 100 μg EGF. To 25 μl of this, add 4,975 μl RHB-A medium to give a 5 μg/ml working stock. Aliquot and store at -20 °C
RHB-A medium Stem Cells Inc. SCS-SF-NB-01 For diluting EGF
DMEM GIBCO 31966-021 Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum Biosera 1001/500 Heat at 56 °C to inactivate complement before use
TrypLE GIBCO 12605 Cell dissociation solution
Celigo cytometer Nexcelom Bioscience n/a Specialist equipment for image capture and analysis. Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative
IX70 inverted microscope Olympus n/a Used with camera for manual image capture
Retiga Exi Fast 1394 digital camera Qimaging n/a Attached to microscope for manual image capture
Image-Pro Plus 7.0 Media Cybernetics n/a Software used to control camera and microscope for manual image capture
Image-Pro Analyzer 7.0 Media Cybernetics n/a Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size
Excel 2010 Microsoft n/a Scientific graphing and statistical software
Prism 6.0 GraphPad n/a Scientific graphing and statistical software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & therapeutics. 134, (1), 82-106 (2012).
  2. Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. Two-Dimensional vs. Three-Dimensional In Vitro Tumor Migration and Invasion Assays. Methods and Protocols. 986, 227-252 (2013).
  3. Hwang, Y. S., Park, K. K., Chung, W. Y. Invadopodia formation in oral squamous cell carcinoma: the role of epidermal growth factor receptor signalling. Arch. Oral. Biol. 57, (4), 335-343 (2012).
  4. Wang, S., et al. Study on invadopodia formation for lung carcinoma invasion with a microfluidic 3D culture device. PLoS One. 8, (2), e56448 (2013).
  5. Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147, (5), 992-1009 (2011).
  6. Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
  7. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Semin. Cancer Biol. 15, (5), 378-386 (2005).
  8. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  9. Nystrom, M. L., et al. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. The Journal of pathology. 205, (4), 468-475 (2005).
  10. Deisboeck, T. S., et al. Pattern of self-organization in tumour systems: complex growth dynamics in a novel brain tumour spheroid model. Cell Prolif. 34, (2), 115-134 (2001).
  11. Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5, (5), e10431 (2010).
  12. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol. 10, 29 (2012).
  13. Vinci, M., Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods and Protocols. 253-266 (2013).
  14. Box, C., et al. A novel serum protein signature associated with resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in head and neck squamous cell carcinoma. Eur. J. Cancer. 49, (11), 2512-2521 (2013).
  15. Khajah, M. A., Al Saleh, S., Mathew, S., M, P., Luqmani, Y. A. Differential effect of growth factors on invasion and proliferation of endocrine resistant breast cancer cells. PLoS One. 7, (7), e41847 (2012).
  16. Brosicke, N., van Landeghem, F. K., Scheffler, B., Faissner, A. Tenascin-C is expressed by human glioma in vivo and shows a strong association with tumor blood vessels. Cell and tissue research. 354, (2), 409-430 (2013).
  17. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155, (7), 1639-1651 (2013).
  18. Molina, J. R., Hayashi, Y., Stephens, C., Georgescu, M. M. Invasive glioblastoma cells acquire stemness and increased Akt activation. Neoplasia. 12, (6), 453-463 (2010).
ثلاثي الأبعاد (3D) ورم الجسم الشبه الكروي الغزو الفحص
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay. J. Vis. Exp. (99), e52686, doi:10.3791/52686 (2015).More

Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay. J. Vis. Exp. (99), e52686, doi:10.3791/52686 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter