Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Driedimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

doi: 10.3791/52686 Published: May 1, 2015

Abstract

Invasie van omringende normale weefsels wordt algemeen beschouwd als een essentieel kenmerk van kwaadaardig (in tegenstelling tot goedaardige) tumoren. Voor bepaalde kankers in het bijzonder (bijvoorbeeld hersentumoren zoals glioblastoom multiforme en plaveiselcelcarcinoom van het hoofd en de nek -. SCCHN) is een oorzaak van ernstige morbiditeit en kan levensbedreigend zelfs bij afwezigheid van metastasen op afstand zijn. Bovendien kankers die een recidief na behandeling nog vaak aanwezig met een agressiever fenotype. Daarom is er een mogelijkheid om het proces van invasie richten op nieuwe therapieën die complementair zijn aan standaard anti-proliferatieve middelen zouden kunnen zijn. Tot nu toe is deze strategie werd gehinderd door het ontbreken van een robuuste, reproduceerbare assays die geschikt zijn voor een gedetailleerde analyse van de invasie en voor drug discovery. Hier bieden we een eenvoudige micro-plaat methode (op basis van uniforme, zelfassemblerende 3D bolvormige tumoren), die een groot potentieel voor een dergelijke stu heeftoverlijdt. We illustreren de assay platform met een humane glioblastoma cellijn en ook SCCHN model waarbij de ontwikkeling van resistentie tegen gerichte epidermale groeifactor receptor (EGFR) remmers gepaard met verhoogde matrix-invasief potentieel. We bieden ook twee alternatieve methoden van semi-automatische kwantificatie: de ene met een imaging cytometer en een tweede die gewoon nodig standaard microscopie en beeld vast te leggen met een digitale beeldanalyse.

Introduction

Klassieke ontwikkeling antikankergeneesmiddel is grotendeels gericht op het gebruik van in vitro op cellen gebaseerde assays voor het screenen op cytotoxische middelen die proliferatie van tumorcellen remmen en / of bevorderen geprogrammeerde celdood (apoptose). Recenter zijn pogingen bewogen naar gerichte therapieën bij de ontwikkeling van remmers van de onderliggende moleculaire oorzaak van kwaadaardige celproliferatie. Ondanks de spectaculaire resultaten zijn dergelijke middelen vaak geassocieerd met de snelle ontwikkeling van resistentie. Aangezien het invasieve en metastatische vermogen van tumorcellen die verantwoordelijk is voor de meerderheid van sterfgevallen door kanker, en recidief ziekte presenteert vaak agressiever fenotype, is het logisch ook complementair in vitro experimentele modellen 1,2 tot nieuwe identificatie te overwegen middelen die deze extra key 'kenmerken' van kanker zal remmen.

Tijdens kwaadaardige progressie, tumorcellen verwervende mogelijkheid om het omringende weefsel binnen te dringen en / of verspreid in afgelegen organen (metastase). Kankercellen doordringen in de basaal membraan door de vorming van invadopodia 3,4. Deze structuren zijn verrijkt met actine filamenten specifieke adhesie-eiwitten en proteasen en gezamenlijk verantwoordelijk voor tumor celbeweeglijkheid en afbraak van de extracellulaire matrix (ECM) 5. Invadopodia uit te breiden naar de ECM en worden verondersteld belangrijk voor tumorcel invasie te zijn en ook de extravasatie in vasculaire kanalen, hematogene (of lymfatische) verspreiding en metastase te vergemakkelijken.

Voor standaardmethoden tumorcel invasie in vitro omvatten het volgende te evalueren. Transwell-gebaseerde of Boyden-kamer assays 2,6 waarin enkelvoudige celsuspensies worden geënt op een filter bekleed met een dikke laag ECM-afgeleide eiwitten. Cellen dringen en vervolgens verplaatsen naar de onderste kamer in reactie op een chemo-attractant. Veel gebruikte ECMeiwitten zijn type I collageen, of basaal membraan-achtige matrix (BMM bijvoorbeeld Matrigel, afgeleid van de EHS tumor 7) de natuurlijke samenstelling van basismembranen nabootst.

Als alternatief voor de filter gebaseerde Type Boyden kamer 8 assays, kunnen cellen worden geënt bovenop een ECM gel (waarnaar fibroblasten kunnen worden toegevoegd) wanneer zij een monolaag en vormen dan individueel of collectief dringen in de gel. Invasion kan worden gemeten in termen van het aantal binnenvallende cellen en / of de afgelegde afstand van het gel oppervlak 9. Tumorcellen kunnen ook volledig worden ingebed in een matrix hetzij als celsuspensie of sferoïden - meestal geplaatst tussen twee lagen van ECM gel- waardoor cellen binnendringen van de tumormassa in de omgevende matrix 2,6,10,11.

De driedimensionale (3D) tumor sferoïde invasie assay hier beschreven is, een snelle, automatiseerbare invasie systeem door een highly reproduceerbare gestandaardiseerde werkwijze 12 in een 96-well plaat formaat met een sferoïde per putje. BMM wordt direct toegevoegd aan elk putje van een halfvaste matrix waarin tumorcellen binnendringen van het bolvormige lichaam. De omvang van tumorcel invasie gecontroleerd met tussenpozen gedurende 72-96 uur. Deze werkwijze heeft de volgende voordelen ten opzichte van huidige in vitro invasie bovenstaande assays: de tumorcellen zijn georganiseerd in een 3D-structuur nabootsen van een tumor micro-omgeving of een micro-metastase; de bolvormige tumoren zijn zeer reproduceerbaar in grootte; de invasie assay wordt uitgevoerd in situ in dezelfde plaat als tumor sferoïde ontwikkeling zonder de noodzaak om deze secundaire platen bewegen; de werkwijze, gecombineerd met de nieuwste technologie van geautomatiseerde beeldanalyse, zodat zowel hoog gehalte en high throughput analyse van tumorcel invasie.

De beeldanalyse wordt uitgevoerd met een beeldvormend cytometer, die een 96-well scansplaat binnen 10 min. Via de samenvloeiing toepassing de mate en snelheid van de invasie bereikt door enkele cellen of celgroepen uitspreiden van de bolvormige tumoren en invasie in de matrix kan worden gemeten in een dynamische wijze. Voor lagere throughput wordt een alternatieve methode voor het gepresenteerde analyse, gebaseerd op het gebruik van een omgekeerde microscoop en standaard beeldverwerkingssoftware.

Protocol

1. Generatie van reproduceerbaar Sized Tumor Sferoïden

  1. Wash tumorcel monolagen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 5 ml van een 25 cm 2 of 8-10 ml voor een 75 cm2 kolf), voeg celdissociatie enzyme (1 ml voor een 25 cm 2 of 2 ml van een 75 cm 2 kolf) en incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 2-5 min.
  2. Controleer cel onthechting onder een microscoop en neutraliseren celdissociatie enzym met compleet groeimedium (5 ml voor een 25 cm 2 of 8 ml voor een 75 cm2 kolf).
  3. Centrifugeer celsuspensie bij 500 xg gedurende 5 minuten.
  4. Verwijder supernatant, tik op de buis en resuspendeer celpellet in 1 ml compleet groeimedium met een P1000 pipet. Dit zou een enkele celsuspensie verkregen zonder celgroepen.
  5. Tellen cellen met een hemocytometer en verdun de celsuspensie te verkrijgen 0,5-2 x 10 4 cellen / ml (optimale celdichtheid moet worden bepaald voor elke cellijn order om bolvormige tumoren van 300 te verkrijgen - 500 pm diameter 4 dagen na cel zaaien 12,13).
  6. Breng de celsuspensie om een steriele reservoir en, met behulp van een multichannel pipet, afzien van 200 ul / putje in ultra-low attachment (ULA) 96-well round bodemplaten 12.
  7. Breng de platen een incubator (37 ° C, 5% CO2, 95% vochtigheid). Vier dagen later, visueel bevestigen tumor sferoïde formatie en ga verder met de 3D-invasie assay.

2. 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

  1. Dooi BMM op ijs.
  2. Houd een set van steriele filter tips voor P10, P200 en P1000 pipetten en steriele buizen (1,5 ml volume of meer, afhankelijk van het totale volume nodig) bij -20 ° C.
  3. Plaats de ULA 96-well platen bevattende 4 dagen oude sferoïden op ijs.
  4. Met behulp van een multichannel pipet, verwijder voorzichtig 100 ul / putje van groeimedium uit de bolvormige platen. Hiervoor staphoek de tips naar het inside wand van het U-bodem wells, het vermijden van contact met de bodem van de put en de locatie van de sferoïden; minimaliseren van verstoring van de sferoïden.
  5. Met behulp van ijskoude tips, transfer BMM om ijskoude buizen. Voor cytokine-geïnduceerde invasie of voor drug evaluatiestudies, voeg reagentia (bij 2x de uiteindelijke concentratie) naar de BMM met ijskoude tips. Gebruik bijvoorbeeld epidermale groeifactor (EGF) aan de invasie van CAL CAL S en R squameuze carcinoomcellen stimuleren. Meng goed door voorzichtig te zwenken, het vermijden van de vorming van bellen.
  6. Voorzichtig afzien 100 ul van BMM in de U-bodem vormt, de punt gericht naar de binnenwand van de put. Deze stap is de meest kritische als voor optimale beeldanalyse moet sferoïden in het midden van de put 12 blijven.
  7. Herhaal stap 2.6 voor alle vereiste putten, waardoor 5-6 herhalingen / conditie. Indien nodig, te wijzigen om een ​​vers-gekoelde tip.
    OPMERKING: Wanneer meer ervaren, dispense BMM met behulp van een multichannel pipet.
  8. Met behulp van een steriele naald, verwijder luchtbellen, indien aanwezig.
    1. Met behulp van een microscoop, visueel te controleren of sferoïden zijn in een centrale positie. Zo niet, gecentrifugeerd plaat bij 300 xg gedurende 3 min bij 4 ° C. Dit garandeert dat sferoïden centraal gelegen zijn in elk putje.
  9. Breng de plaat een incubator bij 37 ° C en laat de BMM stollen.
  10. 1 uur later, met een multichannel pipet zachtjes voeg 100 ul / putje volledig groeimedium. Voor cytokine-geïnduceerde invasie of drug evaluatie studies, onder meer cytokines of remmers in het medium (1x uiteindelijke concentratie). Als alternatief, als reagens niet werd toegevoegd aan de BMM in stap 2,5, toevoegen aan het medium op dit punt (3x de gewenste eindconcentratie).

3. Automated Image Acquisition

  1. Scan platen op de cytometer (voor specificaties zie tabel van Equipment and Materials) met tussenpozen starting van tijd nul (t0 = dag van de invasie assay ingesteld, onmiddellijk na stap 2.10 tot 72 uur of 96 uur voor langzamere invasie tumorcellijnen.
  2. Selecteer de 'Confluence' applicatie.
  3. Controleer of de bolvormige is scherpgesteld en, indien nodig, handmatig aanpassen en bevestig de 'Focus off-set'.
  4. Onder 'Sampling instellingen', selecteert u om een centrale gezichtsveld (FOV) te scannen. Na BMM Bovendien moeten bolvormige tumoren bleven in een centrale positie, is derhalve niet nodig de hele scan ook.
  5. In de software bepalen de putten worden gescand door ze te markeren op het bord kaart. Klik op 'Start scan'.
    LET OP: De scan wordt automatisch opgeslagen en kan later off-line te worden beoordeeld.

4. Automated Image Analysis

  1. Selecteer de toepassing 'Confluence'.
  2. In het tabblad 'Analysis', passen applictie-instellingen (bijvoorbeeld "precisie": laag, normaal, hoog, "intensiteitsdrempel": 1 - 15) om een precieze verdeling rond de sferoïde inbegrip celprocessen en invadopodia zich in de BMM (zie figuur 1) te produceren. Pas de instellingen voor elke tumor cellijn en / of op verschillende tijdstippen. De 'Confluence' toepassing van de maatregelen% van de put gebied dat onder de binnenvallende cellen, in de geselecteerde FOV.
  3. Controleer dat de analyse instellingen geschikt zijn (dat wil zeggen, segmentatie accuraat is) voor andere sferoïden in de plaat door te klikken op een paar verschillende putten. Als de segmentatie niet nauwkeurig schetsen een sferoïde, verder aan te passen aan de applicatie-instellingen.
  4. Klik op 'Start analyse'.
  5. Op het tabblad 'Results', check meerdere putten analyse kwaliteit te controleren. Export 'Nou level data' naar een spreadsheet programma.
  6. REPEAt-analyse van alle tijdspunten. Bereken het gemiddelde% samenvloeiing voor repliceren putten en plot invasie (% samenvloeiing) tegen de tijd in een staafdiagram, met behulp van wetenschappelijke grafieken en statistische software keuze.

5. Manual Image Acquisition

  1. Opnemen van een beeld voor elke tumor sferoïde met tussenpozen vanaf t = 0 tot 72-96 uur, afhankelijk van de snelheid van inval van de cellijn in kwestie met behulp van een omgekeerde microscoop (bij een 96-putjesplaat dit duurt ongeveer 20 - 30 min). Gebruik een 10X objectief. Gebruik een 4x objectief wanneer een binnengedrongen gebied te groot is om volledig te worden meegenomen in het gebied 10X gezien.
  2. Sla elke individuele afbeelding verworven.
  3. Voor de kalibratie, neem foto's van een podium raster (1 mm) met behulp van zowel 10X en 4X doelstellingen (en afbeeldingen opslaan).

6. Manual Image Analysis

  1. Open het podium raster afbeeldingen in de beeldanalyse software van keuze.
  2. Voer de graticule metingen, de eenheden (micrometer), de doelstellingen gebruikt (10X of 4X) en voer de kalibratie. Deze stap is slechts eenmaal vereist. Voor de daaropvolgende beeldanalyse, gewoon opnieuw de vereiste kalibratie-instellingen.
  3. Open de invasie assay beelden en selecteer de kalibratie-instellingen, afhankelijk van de microscoop doelstelling (10X of 4X) gebruikt om de beelden te verkrijgen.
    1. Alternatief invoer verkregen beelden op een beeldvormend cytometer (stap 3) en handmatig analyseren, zoals beschreven voor afbeeldingen verkregen onder toepassing van een omgekeerde microscoop (zie figuur 3 en figuur 4 de resultaten).
  4. Meet het gebied dat door de bolletjes.
    1. In de software wordt gebruikt voor de Representatieve resultaten (voor specificaties zie tabel van Equipment and Materials), ga naar 'Measure' en selecteer 'Count / size'. Koos voor 'Bestand' dan 'Load settings' en selecteer vooraf vastgestelde ASSAy instellingen. Vervolgens kiest u 'Count'. De sferoïde moet dan nauwkeurig worden gesegmenteerd.
    2. Als alternatief ga naar 'Bewerken' dan 'Teken / Objects Merge' om het venster 'Magic Wand / Trace' te openen. Gebruik de staf cursor te klikken op het bolvormige en het verkrijgen van segmentatie. Selecteer 'Trace' (in het venster 'Magic Wand') naar de bolvormige handmatig schetsen met behulp van een muis.
  5. Metingen van verschillende parameters (oppervlakte, diameter, omtrek etc.) naar een spreadsheet exporteren. Record op de spreadsheet de relevante beeldinformatie (bijvoorbeeld, goed nummer, relatieve tijdstip).
  6. Plot van de gemiddelde oppervlakte van repliceren sferoïden (inval) versus tijd met behulp van wetenschappelijke grafieken en statistische software. Alternatief Bereken de verandering in bolvormige gebied op elk tijdstip ten opzichte van het gebied op t = 0. Vervolgens plot invasie (t0%) versus tijd als een lineaire graph.

Representative Results

3D tumor sferoïde invasie wordt beoordeeld met behulp van een eenvoudige, reproduceerbare, geautomatiseerde werkwijze schematisch geïllustreerd in Figuur 1: reproduceerbaar sized bolvormige tumoren worden verkregen door platen ULA cellen in 96-well platen met ronde bodem. 4 dagen na de initiatie sferoïden worden ingebed in BMM. Dit zorgt voor een semi-vaste structuur waarin tumorcellen binnendringen en verspreiden van de sferoïde. Sferoïden zijn centraal gelegen aan de basis van elk putje en invasie in de BMM wordt gemakkelijk gevolgd met intervallen vanaf t = 0 tot 72-96 uur via een beeldvormend cytometer. Dit kan volledig geautomatiseerde beeldanalyse bieden.

Voorbeelden van verschillende soorten kankercel invasie zijn geïllustreerd in figuren 2 -. 4 de zeer kwaadaardige humane glioblastoma multiforme (GBM) cellijn U-87 MG, vormt een dichte, bolvormige 3D structuur en wordt hier gebruikt om hersentumoren illustreren waarbij de lokale invasie is een belangrijke levensbedreigendefunctie. Eenmaal ingebed in BMM, cellen van U-87 MG bolletjes verspreid met een typische "starburst" invasie patroon 12. Tumorcellen radiaal in de matrix waarin ze handhaven van een 3-dimensionale vorm. Het proces wordt gevolgd gedurende een periode van 72 uur zoals getoond in figuur 2 voor U-87 MG sferoïden, wanneer de mate van tumorcel invasie, met vermelding van de cellulaire processen en invadopodia vergroten wanneer BMM is duidelijk zichtbaar. Volledig geautomatiseerde beeldanalyse met behulp van een afbeelding cytometer maakt een nauwkeurige kwantificering van de tumorcel invasie in de tijd. De kwantificering in figuur 2 wordt verkregen zoals weergegeven in figuur 1, waarbij de geautomatiseerde analyse produceert segmentatie rond de cel uitsteeksels uitstrekken in de BMM van de U-87 MG sferoïde lichaam. Merk op dat voor deze cellijn wordt de tumor sferoïde lichaam betrokken in de bepaling van de binnengedrongen zone.

Een ander patroon van invasion werd getoond door menselijke squameuze hoofd en nek kanker cellijnen. CAL CAL S en R zijn isogene maar CAL S is gevoelig voor en CAL R resistent tegen EGFR tyrosine kinase inhibitors 14. Bij afwezigheid van EGF noch cellijn binnengedrongen in de BMM (figuur 3) Aangezien de concentratie van EGF verhoogd (tot 2,5 ng / ml), kunnen de sferoïden lijken "bud". Bij de hogere concentraties van EGF (40 en 80 ng / ml) de mate van invasie verminderde. Dit strookt met de klassieke klokvormige dosisrespons op EGF in termen van invasie die eerder gerapporteerd 15. In 20 ng / ml EGF, vinger-achtige uitsteeksels geëxtrudeerd uit het hoofdgedeelte van CAL R sferoïden terwijl CAL S cellen waren minder invasieve na 72 uur (figuur 3). Dit verschil invasie bleek 48 uur na sferoïden in BMM (bevattende 20 ng / ml EGF voor maximale verschil tussen cellijnen werden geplaatst) En hoogste na 72 uur (Figuur 4). Deze beelden werden snel verkregen middels een beeldvormend cytometer, als U-87 MG. Echter, in dit geval een alternatieve methode illustreren, werd de mate van invasie manueel gekwantificeerd middels stand-alone beeldanalyse software en grafisch weergegeven (figuren 3 en 4). Deze resultaten illustreren een fenotypisch verschil tussen de geneesmiddel-gevoelige en resistente cellen die kunnen worden gebruikt om te screenen op verbindingen die specifiek zullen antagoniseren de drug resistant, invasief fenotype.

Figuur 1
Figuur 1. Schematische weergave van 3D-tumor sferoïde invasie assay. De workflow toont de stappen van de methode houdt in, waaronder representatieve beelden van de U-87 MG glioblastoom spheroids net na het integreren BMM (bovenste paneel; t = 0) en na de invasie in BMM (onderste paneel; t = 72 uur) met en zonder de segmentatie dat het gebied dat door de binnenvallende cellen meet. Bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Tijdsverloop van U-87 MG glioblastoom sferoïde invasie in BMM. U-87 MG 3D sferoïde invasie in BMM werd gevolgd en gekwantificeerd tot 72 uur met behulp van een beeldvormende cytometer. (A) Representatieve beelden en (B) kwantificering van tumorcelinvasie getoond. Bar = 500 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

re 3 "src =" / files / ftp_upload / 52686 / 52686fig3.jpg "/>
Figuur 3. CAL R (resistent) en CAL S (gevoelige) tumor sferoïde invasie. (A) Vertegenwoordiger beelden en (B) handmatig kwantificering van EGF dosisafhankelijke CAL R en CAL S tumor sferoïde invasie worden getoond. Bar = 500 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Cellen uit CAL R (resistent) sferoïden zijn meer invasief dan CAL S (gevoelige) bolvormige tumoren wanneer geplaatst in BMM. Bij EGF stimulatie CAL R bolvormige tumoren vertonen een meer uitgesproken invasie dan CAL S. (A) Representatieve beelden en (B) handmatig kwantificering van invasie getoond. Bar = 500 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De beide tumormodellen beschreven (glioblastoma en SCCHN) werden specifiek geselecteerd om onze assay 3D illustreren zoals ze klinisch relevant lokaal invasieve kankers met een onvervulde behoefte aan effectieve therapieën 12. Na behandeling met geneesmiddelen, evaluatie van in vitro farmacodynamische (PD) biomarker veranderingen kunnen eenvoudig worden uitgevoerd door Western blot of immunoassays van lysaten na het gebruik van specifieke in de handel verkrijgbare reagentia naar cel herstel van BMM en / of immunofluorescente analyse van invasie bolvormige tumoren in hele toestaan mount vlekken.

Dit invasie assay is een nuttige techniek voor snelle en reproduceerbare beoordeling van tumorcel invasie in een halfvast medium en daarom bijzonder geschikt voor latere in vitro screenen van geneesmiddelen. Kankercellen binnenvallen matrix in een 3D manier als ze verspreid een "micro-tumor", vertegenwoordigd door de tumor sferoïde, en strekken zich in een extracellular matrix-achtige omgeving. De ware driedimensionaliteit van de assay is zichtbaar in de celmorfologie, die verschilt van de vlakke, hechtende cellen morfologie aannemen tijdens het verplaatsen op een vast substraat. De mate van invasie gemakkelijk gekwantificeerd met behulp van een beeldvormende cytometer, waardoor een automatische uitlezing, of met een gewone microscoop in combinatie met beeldverwerkingssoftware. Bovendien is deze methode geschikt voor het fluorescent imaging 13 (bijvoorbeeld bij cellijnen die fluorescerende eiwitten of vooraf gemerkt met fluorescente kleurstoffen).

De werkwijze is eenvoudig uit te voeren met het enige kritische stap voorgesteld door de toevoeging van de BMM, wanneer er een risico van verstoring van de middenstand van de sferoïde in de put U-vormig. Dit kan leiden tot suboptimale beeldanalyse met bolletjes in verschillende beeldvlakken. Het is derhalve kritisch voor de BMM voorzichtig en langzaam goed aan elke. Na BMM Daarnaast is het raadzaam om de plaat te controlerenonder een microscoop en als de lokalisatie onacceptabel wordt beschouwd, kan dit worden verholpen door zacht centrifugeren. Met ervaring is dit zelden nodig. Hoewel deze werkwijze is robuust en zeer reproduceerbaar, kunnen inter-experimentele variatie optreden met verschillende batches van BMM. Om dit te vermijden, is het raadzaam om voldoende BMM kopen van een enkele partij aan een reeks studies voltooien.

Een beperking van de werkwijze (zoals voor dergelijke assays) is het moeilijk om onderscheid te maken tussen invasie en proliferatie, waarbij de tumorcellen waarschijnlijke ondergaan gedurende de test periode. Hoewel de verdubbelingstijd van de cellen in aanmerking kan worden genomen of celcyclus remmers zoals cytochalasine D ingevoerd, is het niet gemakkelijk te controleren of een duidelijk onderscheid tussen deze twee aspecten van tumorprogressie, in het bijzonder voor snel groeiende tumorcellen en voor die die een meer "uitgebreide" dan infiltratieve, invasie patroon. Om deze redenwordt voorgesteld dat een parallelle 3D growth assay wordt uitgevoerd om specifieke effecten van remmende of stimulerende middelen te evalueren. Bij zorgvuldige dosis respons studies worden uitgevoerd, kan het mogelijk zijn om concentraties die gevolgen proliferatie minimaliseren selecteren. Zo hebben we aangetoond dat het HSP90 remmer 17-AAG remt U-87 MG 3D tumor sferoïde invasie al op 24 uur en bij concentraties beneden de concentratie die 3D-groei met 50% (GI 50) 12.

Anderzijds, de betekenis van deze assay in vergelijking met andere standaard invasie assays (bijv filter gebaseerde bepalingen of invasie van enkele cellen in 3D-matrices 1), dat tumorcellen binnendringen in het omgevende matrix in het sferoïde, dat lijkt op een " micro-tumor "of" micro-metastase ", waardoor rekening gehouden met belangrijke aspecten van de pathofysiologie van een tumormassa. De methode die we presenteren geeft informatie over decollectief gedrag van tumorcellen, bij eerste verlaten van de sferoïden, alsmede afzonderlijk, als enkele cellen bereiken meer afgelegen gebieden van de BMM. Bovendien kunnen cellen in bolvormige tumoren hypoxie en voedingsstoffen ontbering ervaren die door veranderingen in genexpressie, kan bevorderen migratie en invasie; dergelijke functies ontbreken in 2D assays. Bovendien, dit alles in een high-throughput-formaat door het gebruik van specifieke 96-putjesplaten en de nieuwste beeldvormingstechnologie, waardoor een complexe 3D assay gemakkelijk gebruik in targetvalidatie en drug discovery.

De werkwijze die we voorstellen is geschikt voor verdere verzoeken om aanvullende aspecten van tumorcel invasie pakken. In het bijzonder kunnen extra complexiteit door toevoeging van gastheercellen, zoals fibroblasten en / of endotheelcellen worden overwogen, in het bolvormige zelf of de omringende matrix. Dit kan ook worden gemodificeerd, niet alleen wat betreft de stijfheid (door het gebruik van verschillende concentrations van BMM), maar ook qua samenstelling (door toevoeging van andere componenten afhankelijk van de specifiek weefsel / orgaan van de vastgestelde tumormodel: bijvoorbeeld tenascine voor hersenkanker 16 en collageen voor borstcarcinoom 17).

Een vergelijkbare opstelling (vorming van sferoïden en imaging) kunnen ook worden aangepast om weefsel invasie beoordelen 3D, waarbij bolvormige tumoren worden samen gekweekt met embryoid organen lijkt op een complex weefsel 12 of andere celspecifieke organoids (bijvoorbeeld astrocyten voor glioma 18 of crypte culturen voor gastro-intestinale kankers), maar verder werk is nodig om automatische beeldanalyse in te schakelen.

Disclosures

Alle auteurs verklaren geen concurrerende belangenverstrengeling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Corning Matrigel basement membrane matrix Corning 354234 Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips
Cultrex basement membrane extract, PathClear Trevigen 3432-005-01 Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips
Ultra-low attachment 96-well plate Corning 7007
EGF Miltenyi Biotec 130-093-825 Add 100 μl 1% BSA (w/v) in water to 100 μg EGF. To 25 μl of this, add 4,975 μl RHB-A medium to give a 5 μg/ml working stock. Aliquot and store at -20 °C
RHB-A medium Stem Cells Inc. SCS-SF-NB-01 For diluting EGF
DMEM GIBCO 31966-021 Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum Biosera 1001/500 Heat at 56 °C to inactivate complement before use
TrypLE GIBCO 12605 Cell dissociation solution
Celigo cytometer Nexcelom Bioscience n/a Specialist equipment for image capture and analysis. Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative
IX70 inverted microscope Olympus n/a Used with camera for manual image capture
Retiga Exi Fast 1394 digital camera Qimaging n/a Attached to microscope for manual image capture
Image-Pro Plus 7.0 Media Cybernetics n/a Software used to control camera and microscope for manual image capture
Image-Pro Analyzer 7.0 Media Cybernetics n/a Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size
Excel 2010 Microsoft n/a Scientific graphing and statistical software
Prism 6.0 GraphPad n/a Scientific graphing and statistical software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & therapeutics. 134, (1), 82-106 (2012).
  2. Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. Two-Dimensional vs. Three-Dimensional In Vitro Tumor Migration and Invasion Assays. Methods and Protocols. 986, 227-252 (2013).
  3. Hwang, Y. S., Park, K. K., Chung, W. Y. Invadopodia formation in oral squamous cell carcinoma: the role of epidermal growth factor receptor signalling. Arch. Oral. Biol. 57, (4), 335-343 (2012).
  4. Wang, S., et al. Study on invadopodia formation for lung carcinoma invasion with a microfluidic 3D culture device. PLoS One. 8, (2), e56448 (2013).
  5. Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147, (5), 992-1009 (2011).
  6. Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
  7. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Semin. Cancer Biol. 15, (5), 378-386 (2005).
  8. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  9. Nystrom, M. L., et al. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. The Journal of pathology. 205, (4), 468-475 (2005).
  10. Deisboeck, T. S., et al. Pattern of self-organization in tumour systems: complex growth dynamics in a novel brain tumour spheroid model. Cell Prolif. 34, (2), 115-134 (2001).
  11. Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5, (5), e10431 (2010).
  12. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol. 10, 29 (2012).
  13. Vinci, M., Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods and Protocols. 253-266 (2013).
  14. Box, C., et al. A novel serum protein signature associated with resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in head and neck squamous cell carcinoma. Eur. J. Cancer. 49, (11), 2512-2521 (2013).
  15. Khajah, M. A., Al Saleh, S., Mathew, S., M, P., Luqmani, Y. A. Differential effect of growth factors on invasion and proliferation of endocrine resistant breast cancer cells. PLoS One. 7, (7), e41847 (2012).
  16. Brosicke, N., van Landeghem, F. K., Scheffler, B., Faissner, A. Tenascin-C is expressed by human glioma in vivo and shows a strong association with tumor blood vessels. Cell and tissue research. 354, (2), 409-430 (2013).
  17. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155, (7), 1639-1651 (2013).
  18. Molina, J. R., Hayashi, Y., Stephens, C., Georgescu, M. M. Invasive glioblastoma cells acquire stemness and increased Akt activation. Neoplasia. 12, (6), 453-463 (2010).
Driedimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay. J. Vis. Exp. (99), e52686, doi:10.3791/52686 (2015).More

Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay. J. Vis. Exp. (99), e52686, doi:10.3791/52686 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter