Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Tredimensjonale (3D) Tumor Spheroid invasjonen analysen

doi: 10.3791/52686 Published: May 1, 2015

Abstract

Invasjon av omliggende normalt vev er generelt ansett å være en viktig kjennetegn på ondartet (i motsetning til godartet) svulster. For noen kreftformer i særdeleshet (f.eks hjernesvulster som glioblastoma multiforme og plateepitelkarsinom i hode og hals -. SCCHN) det er en årsak til alvorlig sykdom og kan være livstruende, selv i fravær av fjernmetastaser. I tillegg kreft som har fått tilbakefall etter behandling dessverre ofte har en mer aggressiv fenotype. Derfor er det en mulighet for å målrette prosessen med invasjon for å tilveiebringe nye behandlingsformer som kan være komplementært til vanlige anti-proliferative midler. Til nå har denne strategien vært hemmet av mangel på robuste, reproduserbare analyser egnet for en detaljert analyse av invasjonen og for narkotika screening. Her gir vi en enkel mikroplate metoden (basert på uniform, selvsammen 3D tumor kuler) som har stort potensial for en slik studør. Vi eksemplifisere analysen plattformen ved hjelp av en human glioblastoma cellelinje, og også en SCCHN modell der utvikling av resistens mot målrettet epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) er assosiert med øket matriks-invasiv potensial. Vi tilbyr også to alternative metoder for semi-automatisert kvantifisering: en bruker bilde cytometer og andre som rett og slett krever standard mikroskopi og bildeopptak med digital bildeanalyse.

Introduction

Klassiske anticancerlegemiddelutvikling i stor grad fokusert på anvendelse av in vitro celle-baserte analyser for å skjerm for cytotoksiske midler som hemmer tumorcelle-proliferasjon og / eller fremmer programmert celledød (apoptose). I den senere tid har forsøk beveget seg mot målrettet terapi med utvikling av inhibitorer av den underliggende molekylære årsakene til ondartet celleproliferasjon. Til tross for noen bemerkelsesverdige resultater, er slike midler ofte forbundet med den raske utviklingen av medikamentresistens. Gitt at det er invasiv og metastatisk potensial av kreftceller som er ansvarlig for de fleste kreftdødsfall, og at residiverende sykdom som presenterer ofte en mer aggressiv fenotype, er det logisk også å vurdere utfyllende in vitro eksperimentelle modeller 1,2 til å identifisere roman agenter som vil hemme disse ekstra taste 'kjennetegn' kreft.

Under ondartet progresjon, tumorceller erverveevnen til å invadere omkringliggende vev og / eller spre seg til fjerne organer (metastase). Kreftceller trenge gjennom basalmembranen ved dannelsen av invadopodia 3,4. Disse strukturene er beriket med aktin filamenter, spesifikke adhesjonsproteiner og proteinases og samlet er ansvarlig for svulst cellemotilitet og nedbrytning av ekstracellulær matrix (ECM) 5. Invadopodia strekker seg inn i ECM og antas å være viktig for tumorcelle invasjon og også bloduttredelse i vaskulære kanaler, tilrettelegging hematogenous (eller lymfesystemet) formidling og metastasering.

Dagens standard metoder for å vurdere svulst celle invasjon in vitro inkluderer følgende. Transwell-baserte eller Boyden kammer assays 2,6 hvor enkeltcellesuspensjoner blir sådd på toppen av et filter belagt med et tykt lag av ECM-avledede proteiner. Celler deretter invadere og bevege seg inn i det nedre kammer som reaksjon på en chemo-lokkemiddel. Vanligvis brukes ECMproteiner er type I kollagen, eller en basalmembran-lignende matrise (BMM, f.eks Matrigel, avledet fra EHS tumor 7) som etterligner den naturlige sammensetning av basalmembraner.

Som et alternativ til filterbaserte Boyden kammertypen assays 8, kan celler sådd på toppen av en ECM-gel (som fibroblaster kan tilsettes), hvor de danner et monolag, og deretter individuelt eller kollektivt invadere inn i gelen. Invasjon kan måles i form av antall invaderende celler og / eller avstand reist fra geloverflaten 9. Tumorceller kan også være helt innleiret i en matrise, enten som en enkelt cellesuspensjon eller som kuler - vanligvis er plassert mellom to lag av gel-ECM tillater celler å invadere ut av tumormasse inn i den omgivende matrise 2,6,10,11.

Den tre-dimensjonale (3D) tumorcelleklump invasjon analysen beskrevet her tilveiebringer en hurtig, automatiserbar invasjon system ved hjelp av en highly reproduserbar og standardisert metode 12 i et 96-brønners plateformat med en sfæroide per brønn. BMM tilsettes direkte til hver brønn for å gi et semi-fast matriks til hvilken tumorceller å invadere fra den sfæroide kroppen. Omfanget av tumorcelle-invasjon overvåkes i intervaller over en periode på 72-96 timer. Denne metoden gir følgende fordeler i forhold til de nåværende in vitro-invasjons assays som er nevnt ovenfor: tumorcellene er organisert i en 3D-struktur etterligne en tumor mikro-region eller en mikro-metastase; tumor kuler er svært reproduserbare i størrelse; invasjonen Analysen utføres in situ i den samme plate som tumorcelleklump utvikling, uten behov for å flytte dem til sekundære plater; metoden, kombinert med den nyeste teknologien for automatisk bildeanalyse, muliggjør både høyt innhold og høy gjennomstrømming analyser av tumorcelle invasjon.

Den bildeanalyse blir utført ved hjelp av en avbildnings cytometer, som skanner en 96-brønnersplate i 10 min. Ved bruk av samløpet søknad, graden og hastigheten av invasjon oppnådd enten ved enkle celler eller cellegrupper spres ut fra tumor sfæroidene og invaderende i matriksen kan måles på en dynamisk måte. For lavere gjennomstrømning, er en alternativ metode for bildeanalyse presenteres, basert på bruk av et invertert mikroskop og standard bildebehandling.

Protocol

1. generasjon reproduserbart Sized Tumor Spheroids

  1. Vask tumorcellemonolagene med fosfatbuffret saltvann (PBS, 5 ml for en 25 cm 2 eller 8 - 10 ml for en 75 cm2 kolbe), tilsett celledissosiasjon enzym (1 ml av en 25 cm to eller 2 ml for en 75 cm 2 kolbe) og inkuberes cellene ved 37 ° C i 2 - 5 min.
  2. Kontroller celle løsgjøring under et mikroskop og nøytralisere celledissosiasjon enzym med komplett vekstmedium (5 ml i en 25 cm 2 eller 8 ml av en 75 cm2 kolbe).
  3. Sentrifuger cellesuspensjon ved 500 xg i 5 min.
  4. Fjern supernatant, trykk på tube og re-suspendere cellepelleten i 1 ml komplett vekstmedium med en P1000 pipette. Dette bør gi en enkeltcelle-suspensjon uten cellegrupper.
  5. Cellene telles ved hjelp av et hemocytometer og fortynnet cellesuspensjon for å oppnå 0,5 til 2 x 10 4 celler / ml (optimal celletetthet må bestemmes for hver cellelinje i order å oppnå tumor kuler til 300 - 500 pm diameter 4 dager etter såing av cellen 12,13).
  6. Overfør cellesuspensjonen til et sterilt reservoar og, ved hjelp av en multikanal pipette, dispensere 200 ul / brønn inn i ultra-low festet (ULA) 96-brønners rundbunnede plater 12.
  7. Overfør platene i en inkubator (37 ° C, 5% CO2, 95% luftfuktighet). Fire dager senere, visuelt bekrefte svulst spheroid formasjon og fortsette med 3D invasjonen analysen.

2. 3D Tumor Spheroid invasjonen analysen

  1. Tine BMM på is.
  2. Hold et sett av sterile filter tips for P10, P200 og P1000 pipetter og sterile rør (1,5 ml volum eller større avhengig av totalvolumet påkrevd) ved -20 ° C.
  3. Plasser Ula 96-brønners plater som inneholder fire dager gamle kuler på is.
  4. Ved hjelp av en multikanal pipette, fjern forsiktig 100 ul / brønn av vekstmedium fra den sfæroide platene. For dette trinnet vinkel tipsene mot inside vegg av den U-bunn brønner, unngå kontakt med bunnen av brønnen, og plassering av kulene; minimalisere forstyrrelser av sfæroidene.
  5. Bruke iskalde tips, overføre BMM til iskalde rør. For cytokin-indusert invasjon eller for narkotikaundersøkelser, legger reagenser (på 2x sluttkonsentrasjonen) til BMM av iskalde tips. For eksempel bruke epidermal vekstfaktor (EGF) for å stimulere invasjonen av CAL S og CAL R plateepitel karsinom celler. Bland godt ved å svinge forsiktig, unngå dannelse av bobler.
  6. Forsiktig dispensere 100 ul av BMM inn i U-bunnen godt, sikter spissen mot innerveggen av brønnen. Dette trinnet er den mest kritiske som for optimal bildeanalyse, sfæroider forbli i midten av brønnen 12.
  7. Gjenta trinn 2.6 for alle de nødvendige brønner, slik at 5-6 replikater / tilstand. Om nødvendig, endre til en fersk kjølt tips.
    MERK: Når mer erfarne, dispense BMM bruker en multikanalspipette.
  8. Ved hjelp av en steril nål, fjerne bobler, hvis det finnes.
    1. Ved hjelp av et mikroskop, visuelt sjekke at kulene er i en sentral posisjon. Hvis ikke, sentrifuger plate på 300 x g i 3 min ved 4 ° C. Dette vil sikre at kuler er sentralt plassert i hver brønn.
  9. Overføre platen til en inkubator ved 37 ° C og lar BMM å stivne.
  10. 1 time senere, ved hjelp av en multikanal pipette, tilsett 100 ul / brønn komplett vekstmedium. For cytokin-indusert invasjon eller narkotika evalueringsstudier, omfatter cytokiner eller hemmere i mediet (1x endelig konsentrasjon). Alternativt, hvis reagensene ikke ble tilsatt til BMM i trinn 2.5, legge dem til mediet på dette punktet (3 x den ønskede sluttkonsentrasjon).

3. Automated Image Acquisition

  1. Scan plater på cytometeret (for spesifikasjoner, se tabell utstyr og materialer) i intervaller starting fra tid null (t0 = dag for invasjonen assay satt opp, umiddelbart etter trinn 2,10 opp til 72 timer eller 96 timer for langsommere invaderer tumorcellelinjer.
  2. Velg "Confluence 'søknad.
  3. Sjekk at spheroid er i fokus, og om nødvendig justere manuelt og fikse 'Focus off-set ".
  4. Under 'Prøvetaking innstillinger ", velg å skanne ett sentralt synsfelt (FOV). Etter BMM tillegg bør kreft kulene ha forblitt i en sentral posisjon, og dermed er det ikke behov for å skanne hele godt.
  5. I programvaren definerer brønnene som skal skannes ved å markere dem på kartet plate. Klikk på "Start skann".
    MERK: Skanningen lagres automatisk og kan bli vurdert senere off-line.

4. Automated Image Analysis

  1. Velg "Confluence 'søknad.
  2. I fanen Analysis ", justere applicasjon innstillinger (for eksempel "presisjon": lav, normal, høy, «intensitet terskel": 1 - 15) for å frembringe en nøyaktig segmentering rundt den sfæroide, inkludert celleprosesser og invadopodia som strekker seg inn i BMM (se figur 1). Juster innstillingene for hver tumor cellelinje og / eller på ulike tidspunkter. The 'Confluence' søknad måler% av brønnen området som dekkes av de invaderende cellene, i den valgte FOV.
  3. Sjekk at analyseinnstillingene er riktige (dvs. er nøyaktig segmentering) for andre kuler i platen ved å klikke på et par forskjellige brønner. Dersom segmentering ikke nøyaktig skissere en spheroid, justere programinnstillingene ytterligere.
  4. Klikk på "Begynn analyse".
  5. 'Resultater' kategorien, sjekke flere brønner for å verifisere analyse kvalitet. Eksport "Vel nivå data" til et regnearkprogram.
  6. Repeat-analyse for alle tidspunkter. Beregn middelverdien% samløpet for replikere brønner og tomten invasjon (% samløpet) mot tiden i et stolpediagram, ved hjelp av vitenskapelige grafer og statistisk programvare av valget.

5. Manuell Image Acquisition

  1. Ta et bilde for hver tumor celleklump i intervaller med start fra t = 0 og opp til 72-96 timer, avhengig av hastigheten av invasjonen av cellelinjen i spørsmålet, ved hjelp av et invertert mikroskop (for en 96-brønns plate Dette tar omtrent 20 - 30 min). Bruk en 10X objektiv. Bruk en 4X objektiv når en invaderte området er for stor til å bli helt fanget innenfor 10X synsfelt.
  2. Lagre hvert enkelt bilde ervervet.
  3. For kalibrering, ta bilder av en scene graticule (1 mm) med begge 10X og 4X mål (og lagre bilder).

6. Manuell bildeanalyse

  1. Åpne scenen graticule bilder til bildeanalyse programvare av valget.
  2. Skriv inn graticule målinger enhetene (um), de mål som brukes (10X eller 4X), og utføre kalibreringen. Dette trinnet er kun nødvendig én gang. For påfølgende bildeanalyse, bare laste de nødvendige innstillingene kalibrering.
  3. Åpne invasjonsanalysebilder, og velge innstillingene kalibrerings avhengig av mikroskopobjektiv (10X eller 4 X) som brukes til å oppnå de bildene.
    1. Alternativt importere bildene oppnådd på en avbildnings cytometer (trinn 3), og analysere manuelt, som beskrevet for bilder oppnådd ved anvendelse av et invertert mikroskop (se resultatene vist i figur 3 og figur 4).
  4. Mål området som dekkes av kulene.
    1. I programvaren som brukes her for Representant Resultater (for spesifikasjoner, se tabell utstyr og materialer), gå til "Mål" og velg "Count / størrelse '. Velg "Fil" og deretter "Last inn innstillinger 'og velg forhåndsbestemt assay innstillinger. Deretter velger du "Count". Den sfæroide bør da være nøyaktig segmenteres.
    2. Alternativt gå til "Edit" og deretter "Tegn / Merge Objects" for å åpne "Magic Wand / Trace 'vinduet. Bruk wand markøren til å klikke på spheroid bildet og få segmentering. Velg "Trace" (i "Magic Wand" vindu) å skissere spheroid manuelt ved hjelp av en mus.
  5. Eksport målinger av ulike parametere (område, diameter, omkrets etc.) til et regneark. Spill på regnearket relevant informasjon image (f.eks brønn nummer, relative tidspunkt).
  6. Plott gjennomsnittlig areal av replikere kuler (invasjon) versus tid ved hjelp av vitenskapelige grafer og statistisk programvare. Alternativt kan beregne endringen i sfæroide området ved hvert tidspunkt, i forhold til området ved t = 0. Da plottet invasjon (% t0) som funksjon av tid som en lineær graph.

Representative Results

3D tumor invasjon sfæroid blir vurdert ved hjelp av en enkel, reproduserbar, automatisert metode som skjematisk illustrert i figur 1: reproduserbar størrelse tumor sfæroider blir oppnådd ved utsåing av cellene i ULA 96-brønners rundbunnede plater. 4 dager etter innvielses kuler er innebygd i BMM. Dette gir en halvfast struktur i hvilken tumorceller å invadere og spres ut av den sfæroide. Sfæroidene er plassert sentralt i bunnen av hver brønn, og invasjon i det BMM lett overvåkes ved intervaller med start fra t = 0 og opp til 72-96 timer ved bruk av en avbildnings cytometer. Dette kan gi fullt ut automatisert bildeanalyse.

Eksempler på ulike typer av kreftcelle invasjon er illustrert i figurene 2 -. 4. Det svært maligne human glioblastoma multiforme (GBM) cellelinje U-87 MG, danner en tett, sfærisk 3D-struktur og brukes her for å eksemplifisere hjernesvulster som lokal invasjonen er en viktig livstruendefunksjonen. Når innebygd i BMM, celler fra U-87 MG kuler spredt med en typisk "starburst" invasjon mønster 12. Tumorceller radielt strekker seg inn i matriksen i hvilken de opprettholder en tre-dimensjonal form. Prosessen blir fulgt over en periode på 72 timer, som vist i figur 2 for U-87 mg sfæroider, når graden av tumorcelle invasjon, med detaljer av cellulære prosesser og invadopodia som strekker seg inn i BMM er tydelig. Helautomatisk bildeanalyse ved hjelp av et bilde cytometer muliggjør nøyaktig kvantifisering av tumorcelle invasjon over tid. Kvantifiseringen i figur 2 er oppnådd som vist på figur 1, hvor den automatiserte analyse resulterer segmentering rundt cellen fremspring som strekker seg inn i BMM fra U-87 MG sfæroide legeme. Legg merke til at denne cellelinje, er svulsten sfæroide kroppen unntatt fra målingen av den invaderte området.

Et annet mønster av invasion ble vist av menneskelige plateepitelkreft i hode- og nakkekreft cellelinjer. CAL S og CAL R er isogen men CAL S er følsom for, og CAL R motstandsdyktig mot EGFR tyrosinkinasehemmere 14. I fravær av EGF, hverken cellelinjen inn i den invaderte BMM (figur 3) men, som konsentrasjonen av EGF ble økt (til 2,5 ng / ml), sfæroidene synes å "knopp". Ved de høyere konsentrasjoner av EGF (40 og 80 ng / ml) graden av invasjonen ble redusert. Dette er konsistent med den klassiske klokkeformet doserespons til EGF i form av invasjon som tidligere er rapportert 15. I 20 ng / ml EGF, fingerlignende utvekster ekstrudert fra hoveddelen av CAL R kuler mens CAL S-celler var mindre invasiv etter 72 timer (figur 3). Denne differensielle invasjon var tydelig etter 48 timer sfæroider ble anbragt i BMM (inneholdende 20 ng / ml EGF for maksimal forskjell mellom cellelinjer) Og beste etter 72 timer (figur 4). Disse bildene ble kjøpt opp raskt ved hjelp av en bilde cytometer, som for U-87 MG. Men i dette tilfellet, for å eksemplifisere en alternativ metode, ble graden av invasjonen kvantifisert manuelt ved hjelp av frittstående bildeanalyse-programvare og er presentert grafisk (figur 3 og 4). Disse resultater illustrerer en fenotypisk forskjell mellom medikamentsensitive og -resistente celler som kan brukes til å screene for forbindelser som vil spesifikt motvirker legemiddelresistente, invasive fenotype.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk oversikt over 3D tumor invasjon sfæroide assay. Arbeidsflyten viser trinnene i metoden innebærer inkludert representative bilder av U-87 MG glioblastom kuler like etter innstøping i BMM (øvre panel; t = 0) og etter invasjon inn BMM (nederst panel; t = 72 timer) med og uten segmentering som måler området som dekkes av de invaderende cellene. Bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Tids løpet av U-87 MG glioblastoma celleklump invasjonen i BMM. U-87 MG sfæroide 3D ​​invasjonen i BMM ble målt og kvantifisert opp til 72 timer ved hjelp av en bilde cytometer. (A) Representative bilder og (B) kvantifisering av tumorcelle-invasjon er vist. Bar = 500 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

re 3 "src =" / files / ftp_upload / 52686 / 52686fig3.jpg "/>
Figur 3. CAL R (resistent) og CAL S (sensitiv) svulst spheroid invasjon. (A) Representative bilder og (B) manuell kvantifisering av EGF doseavhengig CAL R og CAL S svulst spheroid invasjon vises. Bar = 500 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4 Celler fra CAL R. (Resistente) kuler er mer invasive enn CAL S (sensitive) svulst kuler når den plasseres i BMM. Ved EGF stimulering CAL R kreft kuler viser en mer markant invasjon enn CAL S. (A) Representative bilder og (B) manuell kvantifisering av invasjonen vises. Bar = 500 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

De to tumormodeller som er beskrevet her (glioblastom og SCCHN) ble spesielt utvalgt for å eksemplifisere vår 3D-analysen som de er klinisk relevante lokalt invasive kreftformer med et udekket behov for effektive behandlingsformer 12. Etter behandling, vurdering av in vitro farmakodynamiske (PD) biomarkør endringer kan utføres enkelt ved western blot eller immunologiske analyser av lysater etter bruk av spesifikke kommersielt tilgjengelige reagenser for å tillate celle utvinning fra BMM og / eller analyse av immunofluorescent invaderer tumor sfæroider av hele mount farging.

Denne invasjonen-analysen er en nyttig teknikk for rask og reproduserbar vurdering av tumorcelle invasjon i en halvfast medium og derfor spesielt egnet for fremtidig in vitro legemiddel-screening. Kreftceller invadere matrisen i et 3D måte som de spres ut fra en "micro-tumor", representert ved tumor sfæroide, og strekker seg inn i en extracellular matrise-lignende miljø. Den sanne tredimensjonalitet til analysen er tydelig i cellemorfologi, som er forskjellig fra den flate, tilhenger morfologi cellene anta når det beveger seg på et fast substrat. Graden av invasjonen enkelt kvantifiseres ved hjelp av enten en bilde cytometer, slik at en automatisert lese-out, eller ved å bruke en standard mikroskop i kombinasjon med bildebehandlingsprogrammer. Dessuten er denne fremgangsmåten egnet for fluoriserende bilde 13 (for eksempel med cellelinjer som uttrykker fluorescerende proteiner eller pre-merket med fluorescerende fargestoffer).

Fremgangsmåten er enkel å utføre med den eneste kritiske trinn er representert ved tilsetning av BMM, når det er en risiko for å forstyrre den sentrale posisjonen av den sfæroide i den U-formede brønnen. Dette kan resultere i suboptimal bildeanalyse, med kuler i forskjellige fokalplanene. Det er derfor avgjørende å tilsette BMM forsiktig og langsomt til hver brønn. Etter BMM tillegg er det lurt å sjekke platenunder et mikroskop, og hvis lokalisering anses uakseptabelt, dette kan avhjelpes ved forsiktig sentrifugering. Med erfaring, er dette sjelden nødvendig. Mens denne fremgangsmåte er robust og meget reproduserbar, kan inter eksperimentelle variasjoner forekomme med forskjellige satser av BMM. For å unngå dette, er det lurt å kjøpe tilstrekkelig BMM fra et enkelt parti å fullføre en rekke studier.

En begrensning av fremgangsmåten (som for slike analyser) er vanskeligheten med å skille mellom invasjon og proliferasjon, som tumorcellene sannsynlig gjennomgå under analysen tidsramme. Selv om doblingstiden av celler kan bli tatt hensyn til, eller cellesyklus inhibitorer så som cytokalasin D innført, er det ikke lett å kontrollere eller klart skille mellom disse to ulike aspekter av tumorprogresjon, spesielt for hurtig voksende tumorceller, og for de som ha en mer "ekspansiv", heller enn infiltrerende, invasjon mønster. Av denne grunner det foreslått at en parallell 3D-vekstanalyse er utført for å evaluere virkningene av eventuelle spesifikke hemmende eller stimulerende midler. Hvis imidlertid doseresponsstudier utføres, kan det være mulig å velge konsentrasjoner som minimerer effekter på proliferasjon. For eksempel har vi vist at den HSP90-inhibitor som inhiberer 17-AAG U-87 MG 3D tumor invasjon sfæroide allerede ved 24 timer og ved konsentrasjoner under konsentrasjonen som inhiberer 3D-vekst ved 50% (GI 50) 12.

På den annen side er betydningen av denne analysen sammenlignet med andre standard invasjon assays (f.eks, filterbaserte analyser eller invasjon av enkeltceller til 3D-matriser 1), er at tumorceller invadere i den omgivende grunnmasse fra den sfæroide, som ligner en " mikro-tumor "eller" micro-metastasering ", og dermed tar hensyn til viktige sider ved patofysiologien til en tumormasse. Metoden vi presenterer gir informasjon omkollektive oppførsel av tumorceller, når utgangspunktet forlater kulene, og også individuelt, hvis enkeltceller nå mer fjerntliggende områder i BMM. I tillegg kan cellene i tumor sfæroidene oppleve hypoksi og næringsmangel som, gjennom endringer i genekspresjon, kan fremme migrering og invasjon; slike funksjoner er fraværende i 2D analyser. Dessuten er alt dette tilgjengelig i en high-throughput format gjennom bruk av bestemte 96-brønners plater og den nyeste bildeteknologi, slik at en mer kompleks 3D-analyse for å enkelt brukes i mål validering og medisiner.

Metoden vi presenterer kan huse ytterligere programmer for å håndtere flere aspekter av tumorcelle invasjon. Spesielt kan ekstra kompleksitet tenkes ved tilsetning av vertsceller, så som fibroblaster og / eller endotelceller, i den sfæroide selv eller den omgivende matrise. Dette kan også endres, ikke bare i form av stivhet (ved bruk av ulike concentrations av BMM), men også i form av sammensetning (ved tilsetting av andre komponenter avhengig av den spesifikke vev / organ i vedtatt tumor modell: f.eks tenascin for hjernekreft 16 og kollagen for brystkreft 17).

Et tilsvarende opplegg (dannelse av sfæroider og imaging) kan også være innrettet til å vurdere vevsinvasjon i 3D, hvor tumor sfæroider er ko-dyrket med embryoide legemer som likner en kompleks vev 12 eller sammen med andre cellespesifikke organoids (f.eks astrocytter for glioma 18 eller krypten kulturer for gastrointestinal kreft), men ytterligere arbeid er nødvendig for å muliggjøre automatisert bildeanalyse.

Disclosures

Alle forfattere erklærer ingen konkurrerende interessekonflikt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Corning Matrigel basement membrane matrix Corning 354234 Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips
Cultrex basement membrane extract, PathClear Trevigen 3432-005-01 Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips
Ultra-low attachment 96-well plate Corning 7007
EGF Miltenyi Biotec 130-093-825 Add 100 μl 1% BSA (w/v) in water to 100 μg EGF. To 25 μl of this, add 4,975 μl RHB-A medium to give a 5 μg/ml working stock. Aliquot and store at -20 °C
RHB-A medium Stem Cells Inc. SCS-SF-NB-01 For diluting EGF
DMEM GIBCO 31966-021 Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum Biosera 1001/500 Heat at 56 °C to inactivate complement before use
TrypLE GIBCO 12605 Cell dissociation solution
Celigo cytometer Nexcelom Bioscience n/a Specialist equipment for image capture and analysis. Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative
IX70 inverted microscope Olympus n/a Used with camera for manual image capture
Retiga Exi Fast 1394 digital camera Qimaging n/a Attached to microscope for manual image capture
Image-Pro Plus 7.0 Media Cybernetics n/a Software used to control camera and microscope for manual image capture
Image-Pro Analyzer 7.0 Media Cybernetics n/a Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size
Excel 2010 Microsoft n/a Scientific graphing and statistical software
Prism 6.0 GraphPad n/a Scientific graphing and statistical software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & therapeutics. 134, (1), 82-106 (2012).
  2. Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. Two-Dimensional vs. Three-Dimensional In Vitro Tumor Migration and Invasion Assays. Methods and Protocols. 986, 227-252 (2013).
  3. Hwang, Y. S., Park, K. K., Chung, W. Y. Invadopodia formation in oral squamous cell carcinoma: the role of epidermal growth factor receptor signalling. Arch. Oral. Biol. 57, (4), 335-343 (2012).
  4. Wang, S., et al. Study on invadopodia formation for lung carcinoma invasion with a microfluidic 3D culture device. PLoS One. 8, (2), e56448 (2013).
  5. Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147, (5), 992-1009 (2011).
  6. Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
  7. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Semin. Cancer Biol. 15, (5), 378-386 (2005).
  8. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  9. Nystrom, M. L., et al. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. The Journal of pathology. 205, (4), 468-475 (2005).
  10. Deisboeck, T. S., et al. Pattern of self-organization in tumour systems: complex growth dynamics in a novel brain tumour spheroid model. Cell Prolif. 34, (2), 115-134 (2001).
  11. Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5, (5), e10431 (2010).
  12. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol. 10, 29 (2012).
  13. Vinci, M., Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods and Protocols. 253-266 (2013).
  14. Box, C., et al. A novel serum protein signature associated with resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in head and neck squamous cell carcinoma. Eur. J. Cancer. 49, (11), 2512-2521 (2013).
  15. Khajah, M. A., Al Saleh, S., Mathew, S., M, P., Luqmani, Y. A. Differential effect of growth factors on invasion and proliferation of endocrine resistant breast cancer cells. PLoS One. 7, (7), e41847 (2012).
  16. Brosicke, N., van Landeghem, F. K., Scheffler, B., Faissner, A. Tenascin-C is expressed by human glioma in vivo and shows a strong association with tumor blood vessels. Cell and tissue research. 354, (2), 409-430 (2013).
  17. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155, (7), 1639-1651 (2013).
  18. Molina, J. R., Hayashi, Y., Stephens, C., Georgescu, M. M. Invasive glioblastoma cells acquire stemness and increased Akt activation. Neoplasia. 12, (6), 453-463 (2010).
Tredimensjonale (3D) Tumor Spheroid invasjonen analysen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay. J. Vis. Exp. (99), e52686, doi:10.3791/52686 (2015).More

Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay. J. Vis. Exp. (99), e52686, doi:10.3791/52686 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter