Summary
בפרוטוקול הבא, אנו מתארים דרך פשוטה מאוד לבודד את מלכודות נויטרופילים תאיות (רשתות) מכל דם אנושי באמצעות ריאגנטים זמינים. לאחר מכן, אנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש ברשתות המבודדות בassay הידבקות במבחנה עם תאים סרטניים.
Abstract
מלכודות נויטרופילים התאיות (רשתות) זוהו לאחרונה כחלק מארסנל מיקרוביאלית של נויטרופילים. מלבד תפקידם במלחמה בזיהומים, מחקר שנעשה לאחרונה הראה כי הם עשויים להיות מעורבים בתהליכים רבים מחלה אחרות, ובכלל זה התקדמות הסרטן. בידוד רשתות מטוהרים הוא אלמנט חיוני כדי לאפשר המחקר של פונקציות אלה.
בסרטון הזה, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה של בידוד NET תא מתוך כל דם אנושי באמצעות ריאגנטים זמינים. רשתות מבודדות לאחר מכן ניתן להשתמש עבור מכתים immunofluorescence, סופג או מבחני תפקודיים שונים. זה מאפשר הערכה של הנכסים הביולוגיים שלהם בהעדר תופעות של בלבול הפוטנציאליות של נויטרופילים עצמם.
טכניקת הפרדת שיפוע צפיפות מועסקת לבודד נויטרופילים מכל דם תורם בריא. אז נויטרופילים מבודדים מומרצים ע"י phorbol 12 myr13-אצטט istate (PMA) כדי לגרום לNETosis. אז נויטרופילים הופעל מבוטלים, ומניית NET-תא ללא מתקבלת.
לאחר מכן, אנו מדגימים כיצד מבודדים רשתות ניתן להשתמש בassay הידבקות עם תאי סרטן הריאות אנושיים A549. מניית NET משמשת למעייל הבארות של 96 O צלחת תרבית תאים היטב / תאי A549 N, ולאחר הבטחת היווצרות monolayer NET נאותה בחלק התחתון של הבארות, שכותרתו CFSE מתווספות. תאים חסיד הם לכמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי Nikon TE300. בחלק מהבארות, 1000U DNAse1 מתווסף 10 דקות לפני הספירה להשפיל רשתות
Introduction
מלכודות תאי נויטרופילים (רשתות) הם שהתגלו לאחרונה אלמנטים הנגזרים נויטרופילים מורכבים מגדילי הדנ"א תאי מעוצבים על ידי מאות חלבונים וההיסטונים. הם מופרשים על ידי נויטרופילים בהקשר של זיהום ודלקת בעקבות גירויים מסוימים והם הוכרו בתחילה להיות חלק ממנגנוני ההגנה של נויטרופילים מפני זיהומים. הם הוצגו לראשונה לקידום לכידה של פולשים חיידקים שונים, כוללים חיידקים, וירוסים ופטריות 1-3. לכידתו של החיידק היה אז להוביל להרס שלו הן באופן ישיר על ידי החלבונים הקשורים NET 3,4 ובעקיפין באמצעות גיוס המקומי של תאי phagocytic 5,6. התפקיד של רשתות עם זאת נראה שלא יהיה מוגבל לארח הגנה. לאחרונה, הם הוכחו לשחק תפקיד חשוב במחלות אוטואימוניות 7,8, פקקת 9, הפרעות הקשורות להריון 10 ואפילו התקדמות הסרטן11,12. בהתאם לכך, נראה כי רשתות לשחק תפקיד חשוב במספר רב של תהליכים פיסיולוגיים שונים. עם זאת, בהתחשב באופי החדשני של מחקר כזה, הרבה עדיין לא הובהר לגבי המנגנונים שבאמצעותם רשתות להפעיל את השפעתם. במסמך זה, אנו מציגים שיטה פשוטה לבידוד של רשתות בהעדר של נויטרופילים.
בסרטון הבא, אנחנו מדגימים טכניקה פשוטה וקלה לבודד את רשתות מכל דם אנושי. רשתות תא ללא לאחר מכן ניתן להשתמש במספר הניסויים במבחנה הכולל צביעה, imuunofluorescence, סופגות, כמו גם מספר מבחני כגון הידבקות, הפצה והגירה. פרוטוקולים אחרים קיימים 13, 19, אולם הם בדרך כלל ארוכים, מורכבים, יקרים, ולעתים קרובות, תשואה נמוכה 13. פרוטוקול זה משתמש בחומרים כימיים פשוט בסיסיים ומפחית את מספר הצעדים הנדרשים כדי לבודד נויטרופילים, ולכן צמצום האורך של proceduמחדש תוך מיקסום תשואה.
השיטה הבאה משלבת טכניקות שונות לבידוד נויטרופילים שתוארו קודם לכן בספרות להשיג פרוטוקול פשוט מניב מדגם טהור מאוד של נויטרופילים חיים. כפי שהוצע בספרות, דם ורידים נאסף בצינורות EDTA בשימוש בתוך 10 דקות, כדי למנוע הפעלת נויטרופילים 14. אנו משתמשים בצנטריפוגה מדיה הפרדת השיפוע (LSM) צפיפות ימפוציטים לבודד גרנולוציטים ותאי דם אדומים מהדם כל heparinized, שיטה המותאמת מטכניקת צנטריפוגה צפיפות Ficoll תחילה שתוארה על ידי Boyum et al 15. LSM הוא שינוי של ניסוח Boyum שמחליף diatrizoate נתרן לmetrizoate נתרן ושמש בהצלחה במחקרים רבים לבודד נויטרופילים 16-18.
בעקבות צנטריפוגה צפיפות ההפרש, מונוציטים ולימפוציטים מבוטלים; לאחר מכן תאי דם אדומים משקעיםבאמצעות 6% פתרון Dextran 14 וRBCs הנותרים lysed להשיג אוכלוסייה של נויטרופילים הטהורים, אשר מאומת עם Trypan כחול וכתמי כחולים מתילן.
סוכנים רבים שנעשו שימוש כדי לגרום NETosis הן במבחנה in vivo, כוללים lipopolysaccharide (LPS), ותצטט myristate phorbol (PMA) וinterleukins (IL-8) 3,5,6. בפרוטוקול הבא, נויטרופילים המבודדים מומרצים עם 500 ננומטר PMA במשך 4 שעות, אשר הוכח להיות ריכוז נאות כדי לאפשר היווצרות NET עקבית ואמינה ללא קידום אפופטוזיס 19,20.
לאחר בידוד, אנו מדגימים כיצד רשתות תא ללא שהתקבלו מפרוטוקול זה יכול לשמש בassay הידבקות. DNAse1 משמש לעיכול ולבזות רשתות כפי שתואר לעיל ובכך משמש כשליטה 2,3,11. אפשרויות אחרות כוללות את השימוש במעכבי elastase נויטרופילים (ניי) לעכב formati NETב, אשר מהווה חלופה מקובלת כאשר המטרה היא לעכב את היווצרות NET ולא תשפיע שפלתם 11. למרות שניי יש מספר הפונקציות מגוונות, זה כבר הראה בעבר כי בתצהיר NET יכול להיות מעוכב על ידי ניי באמצעות חסימה של decondensation הכרומטין, degranulation הגרעיני ומות נויטרופילים 12
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות אתיות מוסדיות מקומיות.
ציור 1. דם
- דרך venipucture antecubital, לאסוף 14 צינורות דם ממתנדב בריאה לראש ירוק צינורות (heparinized) ולהפוך כל צינור לפני שהתיישב על קרח. איסוף דם בתוך 10 - 15 דקות של ניסוי כדי להבטיח תשואת נויטרופילים אופטימלית.
2. בידוד נויטרופילים מדם מלא
- לשטוף כל צינור עליון ירוק של דם עם 5 מיליליטר של PBS ללא Ca וMg כדי לדלל את הדם. בכל אחד מצינורות חרוטי 4 x 50 מיליליטר, להוסיף 15 מיליליטר של מדיה הפרדת ימפוציטים (LSM) בשעה RT. באמצעות מחט 18 G רכובה על מזרק 60 מיליליטר, שכבת הדם המדולל על LSM בזהירות, יצירת ממשק LSM-דם חד.
הערה: יש להימנע מערבוב של השכבות ככל האפשר. - צנטריפוגה ב 800 XG למשך 30 דקות ב 21 ° C, ללא הפסקה.
הפסקות פתאומיות יכול: הערהלגרום לערבוב של השכבות השונות. - שים לב למשקעי אריתרוציטים ונויטרופילים בתחתית. לשאוב ולזרוק 2 שכבות העליונה (פלזמה וLSM) והקפד להיפטר מהממשק בין שכבות אלה המכילות לימפוציטים ותאי mononuclear, עוזב את השכבה האדומה התחתונה בלבד.
- על צינור אחד, להוסיף 20 מיליליטר של פוספט הצפת מלוח (PBS) ופתרון Dextran 20 מיליליטר של 6%. בעדינות להפוך כל צינור לערבב עם השכבה של אריתרוציטים ונויטרופילים ולאפשר לשבת בRT למשך 30 דקות.
הערה: זה יאפשר תאי דם אדומים (RBCs) משקע בתחתית. - לאחר 30 דקות, להעביר את supernatant העשיר נויטרופילים לתוך צינורות טריים וזורקים את כדורי RBC. supernatants צנטריפוגות ב 450 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר צנטריפוגה, להשליך supernatant. גלולה תכיל בעיקר נויטרופילים וכמה RBCs.
- הכן פתרון lysing ידי הוספת 0.5 מיליליטר של חיץ lysing 4.5 מיליליטר של מים סטריליים. Lyse נותר RBC עם tהוא הכין 5 מיליליטר של lysing פתרון, להעביר את כל כדורים המושעים לצינור אחד. לאפשר תמוגה ב RT בחושך במשך 10 דקות.
- צנטריפוגה ב 450 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. בטל supernatant ולשטוף גלולה עם 5 מיליליטר PBS ללא Ca וMg ו צנטריפוגות שוב ב 450 XG ב 4 ° C כדי להיפטר מכל פתרון lysing שנותר. גלולה המתקבלת בשלב זה מכילה נויטרופילים. Resuspend גלולה ב 30 מיליליטר של 3% הקרים RPMI ולשים על קרח.
הערה: 3% RPMI נעשית על ידי השלמת תקשורת RPMI עם 3% שור עוברי סרום (FBS) - ודא טוהר המדגם באמצעות מכתים מתילן כחול. > 95% של תאים צריכים להיות גרנולוציטים עם גרעינים רב-אוֹנִי. השתמש בכתמי כחולי Trypan לאמת> כדאיות 95% מתאים ולספור את תשואת נויטרופילים הסופית. לדלל נויטרופילים בקרח קר 3% RPMI להשיג ריכוז סופי של 5 x 10 6 מיליליטר / נויטרופילים.
3. רשתות דור
- לעורר נויטרופילים עם 500 nM של PMA (לכל 30 מיליליטר של תמיסת נויטרופילים) ודגירה על צלחת 150 x 25mm רקמה שטוחה תרבות עם רשת 20 מ"מ ל4 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. זה יאפשר NETosis.
- לאחר 4 שעות של גירוי, לשאוב בעדינות וזורקים את התקשורת, עוזב את השכבה של רשתות ונויטרופילים דבקו בתחתית. לא לשבש שכבה זו.
- שימוש בסכום כולל של 15 מיליליטר של PBS הקר בלי Ca וMg לכל צלחת, לשטוף את התחתית של כל מנה על ידי pipetting 15 מיליליטר של PBS על החלק התחתון של המנה, כדי להרים את כל החומר חסיד מהתחתית.
- לאסוף פתרון המתקבל משטיפה כל מנה (שלב 3.3) בצינור חרוטי 15 מיליליטר ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 450 XG ב 4 ° C. נויטרופילים וכל תאים הנותרים גלולה בתחתית, עוזבים supernatant NET-עשיר מחוץ לתא.
- supernatant Divide לתוך צינורות 1.5 מיליליטר מיקרו צנטריפוגות וספין במשך 10 דקות ב 18,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. זה יאפשר לכל DNA לגלולה.
הערה: צנטריפוגה בtu הגדולBES הוא זמן קל יותר ופחות רב אם מהירויות גבוהות כאלה הן ברי-השגה בצנטריפוגה הרגילה, אחרת יצטרך לחלק supernatants בצינורות קטנים יותר על מנת להשתמש במהירות גבוהה מיקרו צנטריפוגות. - בטל supernatant ו resuspend כל כדורים שהושגו יחד בקרח הקר PBS לריכוז המתאים 2 x 10 7 נויטרופילים לשל PBS 100 μl. זו תניב מניית NET-התא ללא שיכול לשמש לניסויים הבאים.
- למדוד ריכוז ה- DNA במדגם שהושג באמצעות spectrophotometry או כלי כימות DNA חלופי. ריכוז נאות במדגם צריך לנוע בין 140-180 ng / μl.
4. תא NET-סרטן סטטי הידבקות Assay
- הוספה של מניית NET שהושג בעבר לכל גם 100 μl בצלחת תחתונה גם שטוחה 96 ולאפשר לבארות מעיל O / N ב 4 ° C בחושך.
- בין 12 ל 20 שעות מאוחר יותר, לוודא היווצרות monolayer אחיד של תארשתות חופשיות בחלק התחתון של הבארות מתחת למיקרוסקופ (איור 1). בשלב זה, לשאוב בעדינות את כל החומר שאינו חסיד מתוך הבארות, כדי לוודא שלא לשבש את monolayer NET בתחתית.
- הוספה של 1% בסרום שור אלבומין פתרון (BSA) חוסם 100 μl היטב כל אחד ולצאת לh 1 ב RT.
- ניתוק תאי סרטן A549 מבקבוק T-75 של שימוש 2 מיליליטר של 0.25% פתרון טריפסין. ברגע שמנותק, להוסיף 10 מיליליטר של תקשורת A549 לתאים ו צנטריפוגות trypsinized ב 450 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. בטל תאי supernatant וגלולים בתקשורת כדי להשיג ריכוז של 2 x10 4 תאי סרטן לכל 100 מדיה μl.
הערה: תאי A549 גדלו בנפרד. בקצרה, תאים בתרבית ומתוחזק בתקשורת F12 DMEM המכיל 10% FBS ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין וטופחו על C 5% CO 2 37 מעלות. ברגע 70 - הושג 80% מפגש תא, הם היו מנותקים באמצעות 0.25% טריפסין- EDTA וresuspended באותה התקשורתשתואר לעיל. - תאי סרטן הכתם באמצעות CFSE על ידי הוספת 1 μl של CFSE לכל מיליליטר של תקשורת ולהשאיר כתם על RT במשך 10 דקות. לאחר הצביעה, צנטריפוגות מטה ב 450 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ואז להשליך תאי supernatant וגלולים בנפח ראשוני של תקשורת כדי להשיג ריכוז של 2 x10 4 תאי סרטן לכל 100 מדיה μl.
- אחרי שעה 1 של רשתות חסימה, בעדינות לשאוב פתרון חסימה ולהוסיף 2 x10 4 תאים סרטניים בתקשורת, שהוא שווה ערך ל -100 μl, לכל גם על monolayer NET ולאפשר לדבוק במשך 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לשאוב בעדינות את התאים ולהוסיף של PBS 100 μl היטב כל אחד לשטוף את כל תאים שאינם חסיד.
- בחלק מהבארות, להוסיף 1000U של DNAse1 לכל גם במשך 10 דקות לפני הכביסה כדי לבזות רשתות. זה ישמש שליטה שלילית. בבארות אחרות, להוסיף מים סטריליים לכל גם 100 μl במשך 10 דקות, שישמשו כשליטה ברכב (VC).
הערה: 3 משכפל לcondition מבוצע בדרך כלל כדי להגדיל את גודל מדגם. - לשאוב ולזרוק את כל הפתרון בבארות ומשאירות רק את רשתות ותאים סרטניים חסיד בתחתית. הוספה של 4% תמיסת פורמלדהיד לכל גם 100 μl לתקן תאי סרטן חסיד לרשתות ולקרוא assay תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1). עלילה ולנתח את התוצאות (איור 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הישג מוצלח של assay הידבקות סטטית עם רשתות דורש ציפוי נאות של הבארות עם monolayer של רשתות לפני התוספת של תאים סרטניים (איור 1). כל הצעדים הבאים חייבים להיעשות בזהירות שלא לפגוע בשכבה ש. כאשר שכבה נאותה של רשתות נוצר, הוא צפוי לראות הידבקות תאים סרטניים משמעותית לרשתות כפי שניתן לראות באיור 2 א ו2C. השפעה זו בוטלה על ידי התוספת של DNAse1, אשר מדרדרת רשתות כפי שניתן לראות ב2B דמויות ו2D. לעומת זאת, לא צריך להיות שום ירידה משמעותית בהידבקות A549 לרשתות בנוכחות השליטה ברכב (איור 3). כדי לקבל הערכה טובה של הידבקות תא הסרטן ממוצעת לשדה מתח גבוה (hpf), מומלץ לספור לפחות 4 HPFS אקראי בכל טוב. שדות שלא מצופים היטב ברשתות בשל בעיות טכניות לא צריכים להילקח בחשבון לcounטינג כיוון שהן עלולים לזייף תוצאות.
איור 1. NET חד שכבתי. תמונות במיקרוסקופ אור של בארות צלחת 96 בארות מצופים ברשתות מראים () monolayer האחיד של רשתות בכל רחבי גם בניגוד לציפוי בינוני (B) של היטב עם שכבה מופרעת של רשתות. ברים סולם מייצגים 40 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. הדבקה A549 תאי סרטן לרשתות במבחנה. תאים () סרטן A549 (חיצים) לדבוק monolayer של רשתות במבחנה. (ב) additiעל של DNAse1 מקטין באופן משמעותי את רמת הידבקות תאים סרטניים; (C) מראה תמונה מייצגת של הידבקות תא סרטן ברשתות תחת אור הניאון תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (Nikon TE300) לפני (C) ולאחר תוספת (D) של DNAse1. ברים סולם מייצגים 40 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. תוצאות עבור תוכנה במבחנת הידבקות Assay. GraphPad שימשו לתכנן ולנתח את תוצאות מassay הידבקות תא סרטן A549 לרשתות. בנוכחות DNAse, הידבקות הייתה 13.90% בהשוואה לרשתות שלא טופלו. בנוכחותו של שליטה ברכב (VC), הידבקות הייתה 77.26% בהשוואה לרשתות שלא טופלו. הנתונים מוצגים כממוצע +/-SEM. משמעות נקבעה באמצעות בדיקת Kruskall אליס עם ** p <0.001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול בידוד מלכודת נויטרופילים התאי הפגין בסרטון זה משלב טכניקות שונות המשמשות בספרות לבידוד נויטרופילים והיווצרות NET. זה מפשט את תהליך מורכב למדי ומשתנה ומציע דרך אמינה מאוד ושכפול לבודד את רשתות תא ללא מטוהרים עם פחות שלבים מאשר פרוטוקולים אחרים. יתר על כן, חומרים כימיים זמינים מועסקים הוספה לפשטות הפרוטוקולים והפחתת עלותו באופן משמעותי. היישום של רשתות כלפי assay הידבקות סטטית משמש כדי להדגים את הגמישות המוענקת על ידי טכניקת הבידוד הזה, כמו ריכוז NET יכול בקלות לטפל כדי שיתאים למטרה מסוימת (17). בהתאם לכך, רשתות מבודדות על ידי הטכניקה הפגינה יכולות לשמש לסוגים שונים של מבחני כוללים מבחני הידבקות דינמית, מבחני הגירה, מבחני immunofluorescence התפשטות והדמיה confocal, מיקרוסקופ אלקטרונים, cytometry זרימה כמו גם מערבי סופג מסורתי. ישנם מספר צעדים בפרוטוקול זה כי הם קריטיים להצלחתו. ראשית, נויטרופילים עשויים להיות מופעלים בטעות במהלך התהליך של בידוד מוביל לאפופטוזיס. לכן חשוב לבצע את כל שלבי הבידוד בתנאים סטריליים מתחת למכסת מנוע קטר, להימנע מערבוב אגרסיווי של צינורות, לשמור את כל הדגימות על קרח אחרי צעד תמוגה RBC, ולהימנע מזמני ההמתנה ארוכים בין שלבים. שנית, אם המטרה של assay היא בארות מעיל לצורך הערכת הידבקות, חשוב לכבד את ריכוז NET הציע לכל טוב, כמו גם את ריכוז ה- DNA הסופי המוצע ב" מניית NET "כמו זה יבטיח גם וmonolayer העקבי של רשתות. ריכוז נמוך יותר עשוי לייצר ציפוי רק בלתי סדיר של הבאר ותוצאות ולכן פחות אמינות. לבסוף, חשוב גם לטפל בmonolayer NET מאוד בזהירות בעת ביצוע assay למניעת שיבושיה. זה ניתן להקל על ידי התאמהעוצמת היניקה וpipetting בצד הבארות.
מגבלות של טכניקה זו כוללות את העובדה שזה עדיין דורש כמות משמעותית של זמן כדי לייצר רשתות, נגרמות בעיקר על ידי צעד גירוי PMA 4 שעות. בנוסף, כמות משמעותית של דם נדרשת לבודד מספר מספיק של נויטרופילים הנדרשים לניסוי אחד. יש בהחלט הפסד של כמות משמעותית של רשתות בצעד צנטריפוגה הראשונה (שלב 3.4.) כאשר השלכת נויטרופילים. שינויים כדי להקטין את איבוד NET בשלב זה יכול להגדיל את התשואה נטו הסופית באופן משמעותי. כמו כן, רשתות מבודדות יש להשתמש בתוך 12-24 שעות של הבידוד שלהם, שדורש תכנון ניסוי זהיר וניהול זמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לי המחברים אין לחשוף
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Wisent | 311-425-CL | |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent | 305-010-CL | |
| Dextran hydrochloride (powder) | Spectrum | DE130 | 6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | 3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum |
| BD Pharm Lyse Lysing buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Alrdrich | P8139 | |
| DNAse1 | Roche | 11284932001 | |
| F12 DMEM | Wisent | 319-075-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Integrid tissue culture dish with 20 mm grid (150 x 25 mm) | Falcon | 353025 |
References
- Saitoh, T., et al. Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1. Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).
- Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin RodA. PLoS Pathog. 6 (4), e1000873 (2010).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Papayannopoulos, V., Zychlinsky, A. NETs: a new strategy for using old weapons. Trends Immunol. 30 (11), 513-521 (2009).
- McDonald, B., Urrutia, R., Yipp, B. G., Jenne, C. N., Kubes, P. Intravascular neutrophil extracellular traps capture bacteria from the bloodstream during sepsis. Cell Host Microbe. 12 (3), 324-333 (2012).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. J Immunol. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).
- Khandpur, R., et al. NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis. Sci Transl Med. 5 (178), 178ra140 (2013).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Hahn, S., Giaglis, S., Hoesli, I., Hasler, P. Neutrophil NETs in reproduction: from infertility to preeclampsia and the possibility of fetal loss. Front Immunol. 3, 362 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. J Clin Invest. , (2013).
- Cools-Lartigue, J., Spicer, J., Najmeh, S., Ferri, L. Neutrophil extracellular traps in cancer progression. Cell Mol Life Sci. , (2014).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. J Vis Exp. (36), (2010).
- Maqbool, M., Vidyadaran, S., George, E., Ramasamy, R. Optimisation of laboratory procedures for isolating human peripheral blood derived neutrophils. Med J Malaysia. 66 (4), 296-299 (2011).
- Boyum, A. Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand J Immunol. Suppl. 5, 9-15 (1976).
- Calado, R. T., et al. Sex hormones, acting on the TERT gene, increase telomerase activity in human primary hematopoietic cells. Blood. 114 (11), 2236-2243 (2009).
- Zhong, C., Qu, X., Tan, M., Meng, Y. G., Ferrara, N. Characterization and regulation of bv8 in human blood cells. Clin Cancer Res. 15 (8), 2675-2684 (2009).
- Wu, Y. J., et al. In vivo leukocyte labeling with intravenous ferumoxides/protamine sulfate complex and in vitro characterization for cellular magnetic resonance imaging. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (5), C1698-C1708 (2007).
- Saffarzadeh, M., et al. Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones. PLoS One. 7 (2), e32366 (2012).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
