Summary
다음 프로토콜에서 우리는 쉽게 사용할 시약을 사용하여 인간의 전체 혈액에서 호중구 세포 외 트랩 (그물을) 분리하는 아주 간단한 방법을 설명합니다. 우리는 그 다음 절연 그물 암세포 밀착성 시험 관내 분석에서 사용하는 방법을 보여준다.
Abstract
호중구 세포 외 트랩 (그물)이 최근 호중구의 항균 필수품 전반의 한 부분으로 확인되었다. 그렇다 감염 싸움에서 자신의 역할에서, 최근의 연구는 암의 진행을 포함하여 많은 다른 질병 과정에 관여 될 수 있음을 보여 주었다. 정제 그물을 분리하는 것은 이러한 기능에 대한 연구를 허용하는 중요한 요소이다.
이 비디오에서는, 우리는 쉽게 사용할 시약을 사용하여 인간의 전체 혈액에서 세포 무료 NET 분리의 단순화 된 방법을 보여줍니다. 고립 된 그물은 면역 형광 염색법, 모래 바닥 또는 다양한 기능 분석에 사용할 수 있습니다. 이는 호중구 자신의 전위 교란 효과의 부재에서의 생물학적 특성의 평가를 가능하게한다.
밀도 구배 분리 기술은 건강한 기증자로부터 전혈 호중구를 분리하는데 사용된다. 고립 된 호중구는 포르 12 MYR에 의해 자극istate 13 아세테이트 (PMA)는 NETosis을 유도합니다. 활성화 된 호중구는 폐기되고, 무 세포 NET 콘텐츠가 얻어진다.
그런 다음 A549 인간 폐암 세포와 접착 분석에서 사용할 수있는 방법을 보여 격리 그물. NET 스톡 코트에 첨가되는 96 웰 세포 배양 플레이트 O / N, 그리고 웰의 저부에 적절한 NET 단층 형성을 확인한 후 CFSE 개 A549 세포의 웰을 사용한다. 부착 세포는 니콘 TE300 형광 현미경을 사용하여 정량한다. 일부 우물에서, 1000U DNAse1는 그물을 저하 계산하기 전에 10 분 추가
Introduction
호중구 세포 외 트랩 (그물) 새로 단백질과 히스톤의 수백에 의해 장식 된 세포 외 DNA의 가닥으로 구성 호중구 파생 요소를 발견한다. 이들은 특정 자극에 따라 감염 및 염증의 맥락에서 호중구에 의해 분비되며, 이들은 초기 감염에 대한 호중구의 방어 메커니즘의 일부로 인식 하였다. 그들은 처음 박테리아, 바이러스, 곰팡이 1-3 등 다양한 미생물 침략자의 트래핑을 촉진 것으로 나타났다. 미생물의 트래핑 후 그 파괴에 직접적으로 NET 관련 단백질 3,4에 의해 간접적으로 식세포 5,6의 현지 채용을 통해 이어질 것입니다. 그물의 역할은 그러나 방어를 호스트하기 위해 제한 될 것 같지 않습니다. 보다 최근에, 그들은, 9 혈전증,자가 면역 질환 7,8에서 중요한 역할을하는 임신 관련 질환 (10) 및 심지어 암의 진행을 도시 한(11, 12). 따라서, 그물 다양한 생리 현상 큰 숫자에서 중요한 역할을하는 것으로 보인다. 그러나, 이러한 연구의 신규 한 특성으로 인해, 많은 그물 그 효과를 발휘하는 기전과 관련하여 설명 될 남아. 여기서, 호중구의 부재 그물 분리를 위해 단순화 된 방법을 제시한다.
다음 비디오는, 인간 전혈로부터 분리 그물을 간단하고 쉬운 방법을 보여준다. 무 세포 그물은 접착 성, 증식 및 이주 등의 분석법 번호뿐만 아니라 블로 팅 염색 imuunofluorescence 비롯한 시험 관내 실험에 사용될 수있다. 다른 프로토콜 그러나 그들은 일반적으로, 긴 복잡하고 비싼, 자주, 낮은 수율 13 아르, 13, 19 존재한다. 이 단순화 된 프로토콜 따라서 procedu의 길이를 최소화 염기성 시약을 사용하여 호중구를 분리하는 데 필요한 단계의 수를 감소수율을 극대화하면서 다시.
다음의 방법은 호중구 격리를위한 다양한 기술들이 앞서 라이브 호중구 매우 순수한 샘플을 수득 간단한 프로토콜을 수득 문헌에 기재된 결합한다. 문헌에서 제안 된 바와 같이, 정맥 혈액을 EDTA 튜브에 수집하고, 호중구 활성화 (14)을 방지하기 위해 10 분 이내에 사용된다. 우리는 헤파린 처리 전혈 초기 Boyum 등 15에 의해 설명 피콜 밀도 원심 분리 기법에서 적응 방법에서 과립구 및 적혈구를 분리 림프구 분리 매체 (LSM) 밀도 구배 원심 분리를 사용한다. LSM은 나트륨 metrizoate 나트륨 diatrizoate 대입 16-18 호중구를 분리 많은 연구에서 성공적으로 사용되어왔다 Boyum 제형의 변형 예이다.
차동 밀도 원심 분리, 단핵구와 림프구가 삭제됩니다 다음; 적혈구는 침강6 % 덱스 트란 용액 (14)을 사용하고, 나머지 적혈구는 트리 판 블루와 메틸렌 블루 염색 확인 순수한 호중구의 인구를 얻기 위해 용해된다.
에이전트는 다수의 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 및 포르 볼 미리 스테이트 아세테이트 (PMA) 및 인터루킨 (IL-8) -3,5,6- 비롯한 시험 관내 및 생체 내 NETosis을 유도하기 위해 사용되어왔다. 다음 프로토콜에 고립 된 호중구 세포 자멸사 (19, 20)을 홍보하지 않고 일관성과 신뢰성을 NET 형성을 허용하는 적절한 농도로 표시되었습니다 4 시간, 500 nM의 PMA로 자극한다.
분리 후, 우리는이 프로토콜에서 얻은 무 세포 그물 부착 분석에서 사용할 수있는 방법을 보여준다. DNAse1 소화 및 전술 한 바와 같이 그물을 분해하는 데 사용하므로 제어 2,3,11 역할을한다. 다른 옵션 NET formati을 억제 호중구 엘라 스타 제 억제제 (NEI)의 사용을 포함목표는 NET 형성을 억제하기보다는 저하 (11)에 영향을하는 것입니다 허용 대안 인에. 네이는 다양한 기능을 가지고 있지만, 이전에 증착 NET 염색질 decondensation, 탈과립 핵 호중구 사멸 (12)의 막힘을 통해 네이 의해 억제 될 수 있음을 보여왔다
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Protocol
참고 : 모든 실험이 지역의 기관 윤리 지침에 따라 실시 하였다.
1. 혈액 그리기
- 전주 venipucture을 통해 녹색 위쪽 (헤파린) 튜브에 건강한 지원자에서 혈액의 14 튜브를 수집하고 얼음에 정착하기 전에 각 튜브를 반전. 최적의 호중구 수율을 보장하기 위해 실험 15 분 - (10) 내의 혈액을 수집합니다.
전혈 2. 호중구 격리
- 혈액을 희석하기 위해 칼슘과 마그네슘이없는 PBS의 5 ml의 혈액의 각 녹색 위쪽 튜브를 씻으십시오. 4 × 50 ML 원뿔 튜브의 각에서, RT에서 림프구 분리 매체 (LSM) 15ml를 추가합니다. 날카로운 LSM-혈액 인터페이스를 생성, 조심스럽게 LSM 위에 희석 된 혈액을 층, 60 ML의 주사기에 장착 된 18 G 바늘을 사용.
주 : 최대한 층의 혼합 피한다. - 휴식없이 21 ° C에서 30 분 동안 800 XG에 원심 분리기.
참고 : 갑자기 중단 할 수 있습니다다른 레이어의 혼합을 야기한다. - 맨 아래에있는 적혈구와 호중구 침전물을 준수하십시오. 기음과는 하단 붉은 레이어를 떠나, 림프구 및 단핵구 세포를 포함 이러한 층 사이의 인터페이스를 제거해야합니다 상위 2 층 (플라즈마 및 LSM) 만들기를 폐기합니다.
- 각각의 튜브에, 인산 버퍼 식염수 (PBS) 20 ml의 6 % 덱스 트란 용액 20 ml를 추가합니다. 부드럽게 적혈구 및 호중구의 층과 혼합하고 실온에서 30 분 동안 방치시키고 각 튜브를 반전.
주 :이 적혈구 (적혈구) 아래쪽에 침강 것을 허용 할 것이다. - 30 분 후, 신선한 튜브에 호중구 풍부한 뜨는을 전송하고 RBC 펠렛을 폐기합니다. 5 분 동안 4 ° C에서 450 XG에 원심 분리기 상층 액. 원심 분리 후, 상층 액을 버린다. 펠렛은 주로 호중구 몇 적혈구가 포함됩니다.
- 멸균 수에 4.5 ㎖의 용균 완충액을 0.5 ㎖의 첨가에 의해 용해하는 용액을 준비한다. 로 용해은 t으로 RBC 남아그는 하나의 튜브에 모든 재 부유 알약을 전송, 솔루션을 용해하는 5 mL를 준비했다. 10 분 동안 어둠 속에서 실온에서 용해를 허용합니다.
- 5 분 동안 4 ° C에서 450 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버리고 남아있는 용해하는 용액을 제거하기 위해 4 ° C에서 450 XG에서 다시 칼슘과 마그네슘 원심 분리기없이 5 ml의 PBS로 펠렛을 씻는다. 이 시점에서 얻어진 펠렛은 호중구가 포함되어 있습니다. 감기 3 % RPMI의 30 ml의 펠렛을 재현 탁과 얼음에 넣어.
주 : 3 %가 RPMI로 RPMI 매체를 보충함으로써 이루어진다 3 % 소 태아 혈청 (FBS) - 메틸렌 블루 염색을 사용하여 샘플의 순도를 확인합니다. > 세포의 95 %는 다 엽성 핵와 과립구해야합니다. > 확인 세포의 95 % 생존 최종 호중구 수율을 계산하는 트리 판 블루 염색을 사용합니다. 5 × 106 호중구 / ml의 최종 농도를 얻기 위해 빙냉 3 % RPMI 호중구를 희석.
3. 그물 세대
- 500 N과 호중구를 자극PMA의 M (호중구 용액 30ml를 당), 37 ° C, 5 % CO 2에서 4 시간 동안 20mm 그리드와 150 X 25mm 평면 조직 배양 접시에 배양한다. 이 NETosis을 수 있습니다.
- 자극의 4 시간 후, 부드럽게 하단에 부착 된 그물과 호중구의 레이어를 떠나, 기음과 미디어를 폐기합니다. 이 계층을 중단하지 마십시오.
- 접시 당 칼슘과 마그네슘이없는 차가운 PBS 15 ml의 총을 사용하여, 아래에서 모든 접착 재료를 리프트 오프하기 위해 접시의 저면에 PBS 15 ㎖를 피펫 팅하여 각 접시의 저면을 씻는다.
- 4 ° C에서 450 XG에서 10 분 동안 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기의 각 접시 (단계 3.3) 세척에서 얻은 솔루션을 수집합니다. 호중구 나머지 세포는 무 세포 상청액 NET 풍부한 떠나는 하단 펠렛 것이다.
- 나누기 1.5 ml의 마이크로 원심 분리기 튜브에 뜨는 4 ℃에서 18,000 XG에 10 분 동안 스핀. 이것은 모든 DNA가 펠렛 할 수 있습니다.
참고 : 큰 TU에서 원심 분리BES 달리 고속 마이크로 원심 분리기를 사용하기 위해 더 작은 튜브에 상청을 분할해야한다, 이러한 높은 속도는 일반 원심 분리기에 도달 할 경우 소모 쉽고 적은 시간이다. - PBS 100 ㎕ 당 2 × 10 7 호중구에 해당하는 농도로 얼음 차가운 PBS에서 함께 얻은 모든 알약을 뜨는을 취소하고 재현 탁. 이 후속 실험에 사용할 수있는 무 세포 NET 스톡을 산출 할 것이다.
- 측정법 또는 다른 DNA 정량 도구를 사용하여 수득 된 샘플에서 DNA 농도를 측정한다. 180 NG / μL - 샘플에서 적절한 농도는 140 사이의 범위해야합니다.
4. NET-암 세포 정적 접착 분석
- 어둠 속에서 4 ° C에서 코트 우물 O / N로 96 웰 평평한 바닥 플레이트에 잘 당 이전에 취득한 NET 주식의 100 μl를 추가 할 수 있습니다.
- 이후 12 시간 내지 20 세포의 균일 한 단일 층의 형성을 확인할현미경으로 우물의 바닥에서 무료로 그물 (그림 1). 이 시점에서, 부드럽게 하단에있는 NET 단층을 방해 확실하지 만드는 우물에서 모든 비 접착 물질을 대기음.
- 각 웰에 1 % 소 혈청 알부민 (BSA) 차단 용액 100 μl를 추가하고 실온에서 1 시간 동안 둡니다.
- 0.25 % 트립신 용액 2 ㎖를 사용하여 T-75 플라스크에서 A549 폐암 세포를 분리. 일단, 분리 된 5 분 동안 4 ° C에서 450 XG에 트립신 세포와 원심 분리기에 A549 미디어 10 ㎖를 추가합니다. 100 μL 용지 당 4 X10 암세포의 농도를 얻기 위해 용지에 재현 탁하고 세포 상등액을 폐기.
주 : A549 세포 별도로 성장시켰다. 간략하게, 세포를 배양하고, 10 % FBS, 1 % 페니실린 스트렙토 마이신 및 37 ° C에서 5 % CO 2에서 배양 함유 된 DMEM F12 배지에서 유지 하였다. 일단 70 - 80 %의 세포가 합류점에 도달 한, 그들은 0.25 % 트립신 EDTA를 이용하여 분리하고 동일한 배지에서 재현 탁위의 설명. - 미디어 CFSE 1 ㎖ 당 1 μl를 첨가하고 실온에서 10 분 동안 염색을 남겨 CFSE 사용 얼룩 암세포. 5 분 동안 4 ° C에서 450 XG에 염색, 원심 분리기 다운 후 다음 100 μL 미디어 당이 10 배 4 암 세포의 농도를 얻기 위해 미디어의 초기 볼륨에 뜨는에 resuspend 세포를 폐기합니다.
- 부드럽게 흡인 솔루션을 차단하고 당 잘 NET 단일 층 이상, 100 μL에 해당 미디어에이 10 배 4 암 세포를 추가하고 37 ° C 5 % CO 2에서 90 분 동안 부착 할 수 있도록, 차단 그물 1 시간 후. 조심스럽게 세포를 흡인 및 비 부착 세포를 씻어 각 웰에 PBS 100 ㎕를 추가합니다.
- 일부 우물에서 그물을 저하 세척하기 전에 10 분 동안 잘 당 DNAse1의 1000U를 추가합니다. 이것은 부정적인 제어를 제공합니다. 다른 우물에서, 차량 제어 (VC)이 될 것입니다 10 분, 잘 당 멸균 물 100 μl를 추가합니다.
참고 : 3 공조 당 복제n은 일반적으로 표본의 크기를 증가시키기 위해 수행된다. - 기음은 우물 바닥에 만 그물과 부착 암 세포를 떠나 모든 솔루션을 버리고. (도 1)에 부착 NETS 암세포를 수정하고 형광 현미경 분석을 읽을 웰당 4 % 포름 알데히드 용액 100 ㎕를 추가한다. 플롯 및 결과를 분석 (도 3).
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Representative Results
그물 정적 유착 검정 성공적인 획득은 암세포의 첨가 이전 그물 단층 (도 1)과의 웰 적절한 코팅을 필요로한다. 이후의 모든 단계는 층을 방해하지 않도록주의하여 수행해야합니다. 그물의 적절한 층을 형성 할 때, 그것은도 2A 및 2C에 도시 된 바와 같이 그물 상당한 암 세포의 부착을 볼 것으로 예상된다. 이 효과는도 2B 및 2D에 도시 된 바와 같이 그물 저하 DNAse1의 첨가에 의해 폐지된다. 반대로, 차량 제어 (도 3)의 존재에 그물 A549 밀착성 현저한 감소가 없어야한다. 고전력 장 (HPF) 당 평균 암 세포 유착의 양호한 추정을 획득하기 위해서는 웰 당 적어도 4 개의 랜덤 HPFS 카운트 것을 권장한다. 물론 기술적 인 문제로 인해 그물에 코팅되지 않은 필드 coun에 대한 고려해서는 안이들과 같은 팅 결과를 위조 수 있습니다.
그림 1. NET 단일 플라이. 그물 그물의 (A) 균일 한 단일 층을 보여주는 전반에 걸쳐 잘 그물의 중단 층으로 잘 (B) 불충분 코팅 대조적으로 코팅 된 96 웰 플레이트 웰의 광학 현미경 이미지. 스케일 바는 40 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
시험 관내 그물에도 2 A549 종양 세포 유착. (A) A549 폐암 세포 (화살표)는 시험관 내에서의 그물 단층 부착. (B) AdditiDNAse1 크게 암 세포 유착의 레벨에서의 감소; (C)는 (C) 전에 DNAse1의 (D) 첨가 한 후 형광 현미경 (니콘 TE300)에서 형광등 아래 그물에 암 세포 유착의 대표 화상을 도시한다. 스케일 바는 40 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
접착 시험 관내 어 세이. 그래프 패드 소프트웨어에 대한 결과도 3에 그물 A549 폐암 세포 부착 분석 결과를 플롯하고 분석하는데 사용 하였다. DNase의 존재에서, 밀착성이 미처리 그물에 비해 13.90 %이었다. 비히클 대조군 (VC)의 존재 하에서 밀착성 미처리 그물에 비해 77.26 %이었다. 데이터는 평균으로 제공됩니다 +/-SEM. 의의 ** P <0.001로 채택 Kruskall 월리스 테스트를 사용하여 측정 하였다.
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Discussion
이 비디오에서 보여 호중구 세포 외 트랩 격리 프로토콜은 호중구 격리 및 NET 형성을위한 문헌에 사용 된 다른 기술을 결합한다. 그것은 매우 복잡하고 변화하는 프로세스를 간소화하고 다른 프로토콜보다 적은 단계를 정제 무 세포 그물을 분리하는 매우 안정적이고 복제 방법을 제공합니다. 또한, 쉽게 사용할 시약은 프로토콜의 단순성에 추가 채용 크게 비용을 줄일 수있다. 정적 접착 분석 향해 그물 애플리케이션 NET 농도는 쉽게 특정 목표 (17)에 적합하도록 조작 될 수있는 한,이 분리 기술에 의해 제공되는 융통성을 증명하는 역할을한다. 따라서, 격리 기술에 의해 증명 그물 유동 세포 계측법뿐만 아니라 전통적인 웨스턴 블롯 분석법 동적 밀착성, 이주 분석법, 증식 분석법 및 면역 형광 공 초점 영상, 전자 현미경 분석법을 포함하여 다양한 유형에 사용될 수있다. 그것의 성공에 중요이 프로토콜의 단계들이있다. 먼저, 실수 호중구 아폽토시스 선도의 분리 과정에서 활성화 될 수있다. 이 단계 사이에 긴 대기 시간, 흄 후드에서 무균 조건 하에서 모든 격리 단계를 수행 관의 적극적인 혼합을 방지, RBC 용해 단계 후 얼음에 모든 샘플을 유지하고 방지하는 것이 중요하다. 상기 분석의 목적은 접착 성을 평가하기위한 목적 코트 웰에 제공한다면, 이것이 심지어 보장하므로 "NET 스톡"에서 제안 된 최종 DNA 농도뿐만 아니라 웰당 제안 NET 농도를 존중하는 것이 중요 그물의 일관성 단층. 낮은 농도는 잘 만 누덕 누덕 기운 코팅 때문에 신뢰성이 떨어지는 결과가 발생할 수 있습니다. 마지막으로, 그 붕괴를 방지하기 위해 분석을 수행하는 동안 매우 조심스럽게 NET 단층을 처리하는 것이 중요하다. 이 조정에 의해 촉진 될 수있다웰의 측면에 흡인 피펫의 강도.
이 기술의 제한은 여전히 주로 4 시간 PMA 자극 공정에 의한 그물을 생성하기 위해 상당한 시간을 필요로한다는 사실을 포함한다. 또한, 혈액의 상당량 한 실험에 필요한 충분한 호중구 수를 분리 할 필요가있다. 확실히 제 원심 분리 단계에서 그물 상당량의 손실이 (단계 3.4). 호중구를 폐기 할 때는. 수정은 크게 최종 NET 수율을 증가시킬 수이 시점에서 NET 손실을 최소화합니다. 주의 실험 계획 및 시간 관리를 필요로 자신의 분리, 24 시간 - 또한, 고립 된 그물 (12) 내에서 사용되어야합니다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Wisent | 311-425-CL | |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent | 305-010-CL | |
| Dextran hydrochloride (powder) | Spectrum | DE130 | 6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | 3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum |
| BD Pharm Lyse Lysing buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Alrdrich | P8139 | |
| DNAse1 | Roche | 11284932001 | |
| F12 DMEM | Wisent | 319-075-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Integrid tissue culture dish with 20 mm grid (150 x 25 mm) | Falcon | 353025 |
References
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