Summary
В следующем протоколе, мы описать очень простой способ, чтобы изолировать нейтрофилов внеклеточной ловушки (сетки) из цельной крови человека, используя легко доступные реагенты. Затем показано, как изолированные сети могут быть использованы в лабораторной адгезии анализа с раковыми клетками.
Abstract
Нейтрофилов внеклеточных ловушек (НРТ) были недавно определены как часть антимикробной арсенал нейтрофилов в. Помимо их роли в борьбе с инфекциями, недавнее исследование показало, что они могут быть вовлечены во многих других болезненных процессов, в том числе прогрессирования рака. Изоляция очищенные сеток важным элементом, чтобы изучение этих функций.
В этом видео, мы демонстрируем упрощенный метод свободного разделительная сетка клеток из цельной крови человека, используя легко доступные реагенты. Изолированные НРТ может быть использован для иммунофлуоресцентного окрашивани, промокательной или различных функциональных анализов. Это позволяет оценить их биологических свойств в отсутствие потенциальных вмешивающихся эффектов самих нейтрофилов.
Методика градиента плотности разделения используется для выделения нейтрофилов у здоровых доноров цельной крови. Изолированные Затем нейтрофилы стимулировали форболовым 12-млн летistate 13-ацетата (РМА), чтобы вызвать NETosis. Активированные нейтрофилы, затем отбрасываются, а NET акции без клеток получается.
Затем показано, как изолированные сети могут быть использованы в анализе адгезии с клетками рака легкого А549 человека. NET акции используется для покрытия лунок 96-луночного культуры клеток пластина O / N, и после обеспечения адекватной системы образования монослоя на дне лунок, CFSE меченых клеток А549 будут добавлены. Прикрепленные клетки количественно с помощью флуоресцентного микроскопа Nikon TE300. В некоторых скважинах 1000U DNAse1 добавляется 10 мин перед подсчетом деградировать сетей не
Introduction
Нейтрофилов внеклеточных ловушек (НРТ) недавно обнаружили элементы нейтрофилов, полученных состоящие из нитей внеклеточной ДНК, украшенный сотнями белков и гистонов. Они вырабатываются нейтрофилов в контексте инфекции и воспаления следующие конкретные стимулы, и они были первоначально признаны как часть нейтрофилов в защитных механизмов против инфекции. Они были впервые показаны в целях содействия захвата различных микробных захватчиков в том числе бактерий, вирусов и грибков 1-3. Захват микроба бы затем привести к его разрушению как непосредственно Net-ассоциированных белков 3,4 и косвенно, через местной основе фагоцитирующих клеток 5,6. Роль сетей, однако, похоже, не ограничивается иммунной защиты. Совсем недавно, они, как было показано, играют важную роль в аутоиммунных заболеваний 7,8, тромбоз 9, связанных с беременностью расстройств 10 и даже прогрессирование рака11,12. Соответственно, очевидно, что НРТ играют важную роль в большом количестве различных физиологических процессах. Однако, учитывая роман характер таких исследований, многое еще предстоит выяснить в отношении механизмов, посредством которых НРТ проявляют свое действие. Здесь мы представляем упрощенный метод для изоляции сетей при отсутствии нейтрофилов.
В следующем видео мы демонстрируем Простота и удобство технику, чтобы изолировать сетей с помощью цельной крови человека. Бесклеточные НРТ затем могут быть использованы в ряде экспериментов в пробирке в том числе окрашивание, imuunofluorescence, блоттинга, а также ряда анализов, таких как адгезии, пролиферации и миграции. Существуют и другие протоколы, 13, 19, тем не менее, они, как правило, длительный, сложный, дорогостоящий, и часто, низкий выход 13. Этот упрощенный протокол использует основные реагенты и уменьшает количество шагов, необходимых для выделения нейтрофилов, следовательно, свести к минимуму длину процедуры, применяемыеRe при максимальном урожай.
Следующий метод сочетает в себе различные методы для выделения нейтрофилов ранее описаны в литературе, чтобы получить простой протокол получая очень чистый образец живых нейтрофилов. Как было предложено в литературе, венозной крови собирают в пробирки с ЭДТА и использовать в течение 10 мин, чтобы избежать активации нейтрофилов 14. Мы используем лимфоцитов раздела сред (МНК) центрифугирования в градиенте плотности для выделения гранулоциты и эритроциты из гепаринизированной цельной крови, способу приспособленного с техникой плотности Ficoll центрифугированием первоначально описанной Boyum и др 15. LSM является модификация состава Boyum, который замещает диатризоат натрия для metrizoate натрия и успешно используется во многих исследованиях, чтобы изолировать нейтрофилы 16-18.
После дифференциального центрифугирования в градиенте плотности, моноциты и лимфоциты отбрасываются; красные кровяные клетки затем осаждаютс использованием 6% -ного раствора декстрана 14, а остальные эритроциты лизируют, чтобы получить население чистой нейтрофилов, что проверяется с трипанового синего и метиленовый синий окрашивания.
Многочисленные агенты были использованы для индуцирования NETosis как в пробирке и в естественных условиях, в том числе липополисахарида (LPS), а также форболмиристатацетата (РМА) и интерлейкины (IL-8) 3,5,6. В следующем протоколе, изолированные нейтрофилы стимулировали 500 нМ ФМА в течение 4 ч, который, как было показано, чтобы быть адекватной концентрации, чтобы обеспечить постоянное и надежное формирование чистого, не способствуя апоптозу 19,20.
После выделения, показано, как бесклеточных НРТ, полученные из этого протокола могут быть использованы в анализе адгезии. DNAse1 используется, чтобы переварить и ухудшает сетей не как описано выше, и, таким образом, служит в качестве контроля 2,3,11. Другие варианты включают в себя использование ингибитора эластазы нейтрофилов (Nei) ингибировать NET formatiна, который является приемлемой альтернативой, когда цель заключается в ингибировании формирование чистого, а не производить их деградации 11. Хотя NEi имеет ряд различных функций, ранее было показано, что NET осаждения может быть запрещена по Неи через блокирование хроматина деконденсации, ядерной дегрануляции и нейтрофилов смерти 12
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты были проведены в соответствии с местными институциональными этических принципов.
1. взятия крови
- Через локтевой venipucture, собирать 14 Пробирки с кровью от здорового добровольца в зеленый топ (гепарин,) труб и инвертировать каждую пробирку, прежде чем остановиться на льду. Сбор крови в течение 10 - 15 мин эксперимента, чтобы обеспечить оптимальный выход нейтрофилов.
2. нейтрофилов Изоляция из цельной крови
- Промыть каждый зеленый верхнюю трубку крови с 5 мл PBS без Са и Mg, чтобы разбавить кровь. В каждом из 4 х 50 мл конические пробирки, добавляют 15 мл лимфоцитов раздела сред (LSM) при комнатной температуре. Использование 18 G иглу, установленную на 60 мл шприц, тщательно слой разбавленного крови на МНК, создавая резкий интерфейс LSM-крови.
Примечание: Во избежание смешения слоев, насколько это возможно. - Центрифуга на 800 мкг в течение 30 мин при 21 ° С без перерыва.
Примечание: Резкие разрывы могутвызвать смешение различных слоев. - Соблюдайте эритроцитов и нейтрофилов осадок на дне. Отберите и отбросить верхние 2 слоя (плазменные и LSM), убедившись, чтобы избавиться от интерфейса между этими слоями, которая содержит лимфоциты и мононуклеарные клетки, оставляя только нижнюю красную слой.
- В каждую пробирку, добавляют 20 мл фосфатного буфера солевым раствором (PBS) и 20 мл 6% декстрана раствор. Осторожно инвертировать каждую пробирку, чтобы смешать со слоем эритроцитов и нейтрофилов и позволить, чтобы сидеть при комнатной температуре в течение 30 мин.
Примечание: Это позволит эритроциты (эритроцитов), чтобы осадить на дне. - Через 30 мин передачи нейтрофилов богатый надосадочную жидкость в чистые пробирки и отбросить гранул RBC. Центрифуга супернатанты на 450 мкг при 4 ° С в течение 5 мин. После центрифугирования, отбросить супернатант. Осадок будет в основном содержат нейтрофилов и несколько БС.
- Готовят раствор лизиса путем добавлени 0,5 мл лизирующего буфера с 4,5 мл стерильной воды. Lyse остальные РБК с тон подготовил 5 мл лизиса решение, передав все ресуспендировали гранул в одной пробирке. Разрешить лизис при КТ в темноте в течение 10 мин.
- Центрифуга при 450 х г при 4 ° С в течение 5 мин. Удалите супернатант и мыть гранул с 5 мл PBS без Са и Mg и центрифуги снова в 450 мкг при 4 ° C, чтобы избавиться от остатков лизирующим решения. Осадок, полученный в этой точке содержит нейтрофилов. Ресуспендируют осадок в 30 мл холодной 3% RPMI и помещали на лед.
Примечание: 3% RPMI выполнен путем дополнения RPMI носитель с 3% фетальной бычьей сыворотки (FBS) - Проверка чистоты образца с использованием метиленового синего окрашивания. > 95% клеток должны быть гранулоциты с мульти-Лобара ядер. Используйте окрашивания трипановым синим, чтобы убедиться,> 95% Жизнеспособность клеток и считать конечный выход нейтрофилов. Развести нейтрофилов в ледяной 3% RPMI, чтобы получить конечную концентрацию 5 × 10 6 / мл нейтрофилов.
3. НРТ поколения
- Стимулировать нейтрофилов с 500 пМ ФМА (в 30 мл раствора нейтрофилов) и инкубировать на 150 х 25 мм плоским ткани культуральной чашке с 20 мм сеткой в течение 4 ч при 37 ° С с 5% CO 2. Это позволит NETosis.
- После 4 ч стимуляции, осторожно аспирации и выбросить носитель, в результате чего слой сетки и нейтрофилов, прилипших на дне. Не нарушить этот слой.
- Использование в общей сложности 15 мл холодного PBS без Са и Mg на чашку, моют дно каждой тарелки с помощью пипетки 15 мл PBS на дно тарелки, чтобы снять с все клейкий материал снизу.
- Собирают раствор, полученный от промывки каждую тарелку (шаг 3,3) в 15 мл коническую пробирку и центрифугируют в течение 10 мин при 450 х г при 4 ° С. Нейтрофилы и любые остальные клетки осаждения на дно, оставляя бесклеточной NET богатых супернатант.
- Разделить супернатант в 1,5 мл микро-центрифужные пробирки и спина в течение 10 мин при 18000 х г при 4 ° С. Это позволит всем ДНК для осаждения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугирование в большей ТуBES является более простым и менее трудоемким, если такие высокие скорости могут быть достигнуты на регулярной центрифуги, в противном случае необходимо будет разделить супернатантов в небольших пробирках для того, чтобы использовать высокоскоростной микро-центрифуги. - Удалите супернатант и ресуспендируют все гранулы, полученные вместе в охлажденный льдом PBS до концентрации, соответствующей 2 · 10 7 нейтрофилов в 100 мкл PBS. Это даст NET запас бесклеточной, который можно использовать для последующих экспериментов.
- Измерьте концентрацию ДНК в образце, полученном с помощью спектрофотометрии или альтернативный инструмент Количественное определение ДНК. Адекватная концентрация в образце должна быть в пределах от 140 - 180 нг / мкл.
4. NET-клеточного рака статическому притяжению Анализ
- Добавить 100 мкл полученного выше NET наличии на лунку в 96-луночный плоской нижней плите и позволить, чтобы покрыть скважин O / N при 4 ° С в темноте.
- Между 12 и 20 ч позже, убедитесь, формирование единой монослоя клетокБесплатные сетей в нижней части скважины под микроскопом (рис 1). На данный момент, мягко аспирации все неадгезированных материал из лунок, следя, чтобы не нарушить NET монослой на дне.
- Добавить 100 мкл 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), блокирующего раствора в каждую лунку и оставить на 1 ч при комнатной температуре.
- Отделить раковые клетки А549 с Т-75 колбу с помощью 2 мл 0,25% -ного раствора трипсина. После того, как отдельные, добавить 10 мл А549 СМИ Трипсинизированные клеток и центрифуге при 450 мкг при 4 ° С в течение 5 мин. Отбросить супернатант и ресуспендируют клеток в среде с получением концентрации 2 × 10 4 клеток рака в 100 мкл среды.
Примечание: Клетки А549 выращивали отдельно. Вкратце, клетки культивировали и поддерживали в DMEM F12 среды, содержащей 10% FBS и 1% пенициллина стрептомицина и инкубируют при 37 ° C с 5% CO 2. После 70 - 80% слияния клеток была достигнута, они были отделены с помощью 0,25% трипсина-ЭДТА и ресуспендировали в той же средеописано выше. - Раковые клетки с помощью красителей CFSE добавлением 1 мкл CFSE на мл среды и оставить для окрашивания при комнатной температуре в течение 10 мин. После окрашивания, центрифуги вниз на 450 мкг при 4 ° С в течение 5 мин, затем отбросить супернатант и ресуспендируют клеток в первоначальном объеме среды, чтобы получить концентрацию 2 × 10 4 клеток рака в 100 мкл среды.
- После 1 ч сетей блокирующих, мягко аспирата блокирующем растворе и добавить 2 x10 4 раковых клеток в средствах массовой информации, что эквивалентно 100 мкл, на лунку через сетку монослоя и позволяют придерживаться в течение 90 мин при 37 ° C 5% CO 2. Осторожно аспирации клеток и добавить 100 мкл PBS в каждую лунку, чтобы вымыть любые не прилипшие клетки.
- В некоторых скважинах, добавить 1000U из DNAse1 на лунку в течение 10 мин перед промывкой деградировать сети. Это будет служить в качестве отрицательного контроля. В других скважин, добавить 100 мкл стерильной воды в скважине в течение 10 мин, который будет служить в качестве контроля транспортного средства (VC).
ПРИМЕЧАНИЕ: 3 повторяет за Conditioп обычно выполняются, чтобы увеличить размер выборки. - Отберите и отбросить все раствора в лунках оставив только сети и прилипшие раковые клетки в нижней части. Добавить 100 мкл 4% раствора формальдегида на лунку, чтобы исправить прилипшие клетки рака сетей и читать анализа под флуоресцентным микроскопом (рис 1). Участок и анализировать результаты (рисунок 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешное достижение статического анализа адгезии с сетями требует соответствующего покрытия из скважин с монослоем сеток перед добавлением раковых клеток (рисунок 1). Все последующие шаги должны осуществляться с осторожностью, чтобы не нарушать этот слой. Когда адекватной слой сеток формируется, как ожидается, будет наблюдать существенный раковые клетки адгезию к сетям, как показано на рисунке 2А и 2С. Этот эффект отменяется при добавлении DNAse1, что снижает сетей не как видно на фиг 2В и 2D. С другой стороны, не должно быть никакого существенного снижения А549 адгезией к сети в присутствии управления транспортным средством (рисунок 3). Чтобы получить хорошую оценку средней адгезии клеток рака в большой области питания (HPF), рекомендуется, чтобы рассчитывать по меньшей мере, четыре случайных HPFS на лунку. Поля, которые не очень хорошо с покрытием в сетях из-за технических проблем не должно быть принято во внимание при страка, как они могут фальсифицировать результаты.
Рисунок 1. NET монослой. Световой микроскопии снимки из 96 лунок планшета с покрытием с сетями, показывающий (А) равномерное монослой сетей в течение также, в отличие от (B) недостаточной покрытия и с прерванного слоем сетки. Шкала бары представляют 40 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. A549 сотовый Рак Адгезия к сети в пробирке. () Рака A549 клетки (стрелки) придерживаться монослоя сетей в пробирке. (В) дополнительОдной из DNAse1 значительно снижает уровень адгезии раковых клеток; (С) показан репрезентативный образ адгезии клеток рака на сетях под флуоресцентным светом при флуоресцентной микроскопии (Nikon TE300) до (С) и после (D) добавлением DNAse1. Шкала бары представляют 40 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. Результаты для программного обеспечения In Vitro Адгезия анализа. GraphPad был использован для построения и анализа результатов от рака A549 адгезии клеток к сетям. В присутствии ДНКазы, адгезии 13,90% по сравнению с необработанными сетками. В присутствии управления транспортным средством (VC), адгезия была 77,26%, по сравнению с необработанными сетками. Данные представлены в виде среднего +/-SEM. Значение определяется с помощью теста Крускала Уоллис с ** р <0,001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол изоляция Trap нейтрофилов внеклеточной показано в этом видео сочетает в себе различные методы, используемые в литературе для изоляции нейтрофилов и формирование чистого. Это упрощает достаточно сложный и переменный процесс и предлагает очень надежную и воспроизводимую способ изолировать очищенные клетки без сети с меньшим количеством стадий, чем другие протоколы. Кроме того, легко доступные реагенты используются добавив к простоте протоколов и значительно снижает его стоимость. Приложение сетей к статической адгезии анализа служит для демонстрации гибкости, обеспечиваемой с помощью этого метода изоляции, как NET концентрация может быть легко манипулировать, чтобы удовлетворить определенной цели (17). Соответственно, НРТ, выделенные демонстрируемой техники могут быть использованы для различных типов анализов, включая динамическое адгезии анализов, анализов миграции, пролиферации иммунофлуоресценции и конфокальной микроскопии, электронной микроскопии, проточной цитометрии, а также традиционные Вестерн-блоттинга. Есть ряд шагов в этом протоколе, что имеют решающее значение для успеха. Во-первых, нейтрофилы могут быть случайно активируется в процессе выделения ведущего к апоптозу. Поэтому важно, чтобы выполнить все шаги изоляции в стерильных условиях под вытяжным колпаком, избегают агрессивных смешивание труб, сохранить все образцы на льду после лизиса этапе РБК, и снижения времени ожидания между шагами. Во-вторых, если цель анализа является пальто скважин с целью оценки адгезии, важно уважать предложенный чистой концентрации на лунку, а также предлагаемого конечная концентрация ДНК в "NET складе", так как это обеспечит даже и в соответствии монослой сетей. Более низкой концентрации может привести только пятнистый покрытие из скважины и, следовательно, менее надежные результаты. Наконец, важно также, чтобы справиться с NET монослой очень тщательно при выполнении анализа, чтобы предотвратить его разрушение. Это может быть облегчено путем регулировкиИнтенсивность всасывания и пипеткой на сторонах лунок.
Ограничения этого метода относится то, что она по-прежнему требует значительного количества времени, чтобы произвести сетей, в основном, вызванных 4 ч шага PMA стимуляции. Кроме того, значительное количество крови требуется, чтобы изолировать достаточное количество нейтрофилов, необходимых для одного эксперимента. Там, безусловно, является потеря значительного количества сетей на первом этапе центрифугирования (шаг 3,4.), Когда отбрасывая нейтрофилов. Изменения к минимуму Чистый убыток в этой точке может значительно увеличить конечный выход NET. Кроме того, отдельные НРТ должны быть использованы в течение 12 - 24 ч их изоляции, которая требует тщательного планирования эксперимента и тайм-менеджмент.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Wisent | 311-425-CL | |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent | 305-010-CL | |
| Dextran hydrochloride (powder) | Spectrum | DE130 | 6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | 3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum |
| BD Pharm Lyse Lysing buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Alrdrich | P8139 | |
| DNAse1 | Roche | 11284932001 | |
| F12 DMEM | Wisent | 319-075-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Integrid tissue culture dish with 20 mm grid (150 x 25 mm) | Falcon | 353025 |
References
- Saitoh, T., et al. Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1. Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).
- Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin RodA. PLoS Pathog. 6 (4), e1000873 (2010).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Papayannopoulos, V., Zychlinsky, A. NETs: a new strategy for using old weapons. Trends Immunol. 30 (11), 513-521 (2009).
- McDonald, B., Urrutia, R., Yipp, B. G., Jenne, C. N., Kubes, P. Intravascular neutrophil extracellular traps capture bacteria from the bloodstream during sepsis. Cell Host Microbe. 12 (3), 324-333 (2012).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. J Immunol. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).
- Khandpur, R., et al. NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis. Sci Transl Med. 5 (178), 178ra140 (2013).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Hahn, S., Giaglis, S., Hoesli, I., Hasler, P. Neutrophil NETs in reproduction: from infertility to preeclampsia and the possibility of fetal loss. Front Immunol. 3, 362 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. J Clin Invest. , (2013).
- Cools-Lartigue, J., Spicer, J., Najmeh, S., Ferri, L. Neutrophil extracellular traps in cancer progression. Cell Mol Life Sci. , (2014).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. J Vis Exp. (36), (2010).
- Maqbool, M., Vidyadaran, S., George, E., Ramasamy, R. Optimisation of laboratory procedures for isolating human peripheral blood derived neutrophils. Med J Malaysia. 66 (4), 296-299 (2011).
- Boyum, A. Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand J Immunol. Suppl. 5, 9-15 (1976).
- Calado, R. T., et al. Sex hormones, acting on the TERT gene, increase telomerase activity in human primary hematopoietic cells. Blood. 114 (11), 2236-2243 (2009).
- Zhong, C., Qu, X., Tan, M., Meng, Y. G., Ferrara, N. Characterization and regulation of bv8 in human blood cells. Clin Cancer Res. 15 (8), 2675-2684 (2009).
- Wu, Y. J., et al. In vivo leukocyte labeling with intravenous ferumoxides/protamine sulfate complex and in vitro characterization for cellular magnetic resonance imaging. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (5), C1698-C1708 (2007).
- Saffarzadeh, M., et al. Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones. PLoS One. 7 (2), e32366 (2012).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
