Summary
I följande protokoll, beskriver vi ett mycket enkelt sätt att isolera neutrofila Extracellulär fällor (nät) från humant helblod använder lättillgängliga reagens. Vi visar sedan hur de isolerade NET kan användas i en in vitro-vidhäftningsanalys med cancerceller.
Abstract
Neutrofila Extracellulär Fällor (nät) har nyligen identifierats som en del av neutrofila s antimikrobiell armamentarium. Bortsett från deras roll i kampen mot infektioner, har ny forskning visat att de kan vara inblandade i många andra sjukdomsprocesser, inklusive cancer progression. Isolera renade NET är en avgörande faktor för att möjliggöra studier av dessa funktioner.
I denna video visar vi en förenklad metod för cellfritt NET isolering från humant helblod använder lättillgängliga reagens. Isolerade NET kan sedan användas för immunofluorescensfärgning, läsk eller olika funktionella analyser. Detta möjliggör en bedömning av deras biologiska egenskaper i frånvaro av de potentiella felkällor effekter neutrofiler själva.
En densitetsgradient separationsteknik används för att isolera neutrofiler från frisk donator helblod. Isolerade neutrofiler stimuleras sedan genom forbol 12-myristate 13-acetat (PMA) för att inducera NETosis. Aktiverade neutrofiler sedan kasseras och en cellfritt NET lager erhålls.
Vi visar sedan hur isolerade NET kan användas i en vidhäftningsanalys med A549 humana lungcancerceller. NET lager används för att belägga brunnarna i en 96 brunnars cellodlingsplatta O / N, och efter att garantera en tillräcklig NET monoskikt bildning på botten av brunnarna, märkta CFSE A549-celler tillsätts. Vidhäftande celler kvantifieras med hjälp av en Nikon TE300 fluorescerande mikroskop. I vissa brunnar, är 1000U DNAse1 sattes 10 minuter före räkning att nedbryta NET
Introduction
Neutrofila cellulära fällor (nät) är nyupptäckta neutrofilspecifika härledda element består av strängar av extracellulärt DNA dekorerade av hundratals proteiner och histoner. De utsöndras av neutrofiler i samband med infektion och inflammation följande specifika stimuli och de ursprungligen erkänt att vara en del av neutrofila försvarsmekanismer mot infektioner. De var först visat att främja infångning av olika mikrobiella inkräktare inklusive bakterier, virus och svampar 1-3. Svällning av mikroben skulle då leda till dess undergång både direkt av NET-associerade proteiner 3,4 och indirekt genom lokal rekrytering av fagocytceller 5,6. Roll NET dock inte verkar vara begränsat till värdförsvaret. På senare tid har de visat sig spela en viktig roll vid autoimmuna sjukdomar 7,8, trombos 9, graviditetsrelaterade störningar 10 och även cancer progression11,12. Följaktligen förefaller det som NET spelar en viktig roll i ett stort antal olika fysiologiska processer. Men med tanke på nya karaktären av sådan forskning, återstår mycket att belysas med avseende på de mekanismer genom vilka NET utövar sina effekter. Häri, presenterar vi en förenklad metod för isolering av NET i frånvaro av neutrofiler.
I följande video visar vi en förenklad och enkel teknik för att isolera NET från humant helblod. Cellfria NET kan sedan användas i ett antal in vitro-försök, vilket omfattar färgning, imuunofluorescence, läsk liksom ett antal analyser, såsom adhesion, spridning och migrering. Andra protokoll existerar 13, 19, men de är vanligen långa, komplexa, dyra och ofta, lågt utbyte 13. Detta förenklade protokoll använder basiska reagens och minskar antalet steg som krävs för att isolera neutrofiler således minimera längden av procedure samtidigt maximera avkastningen.
Följande metod kombinerar olika tekniker för neutrofil isolering tidigare beskrivits i litteraturen för att erhålla ett enkelt protokoll vilket gav ett mycket rent prov av levande neutrofiler. Som föreslås i litteraturen, är venöst blod samlas i EDTA-rör och används inom 10 minuter för att undvika neutrofilaktivering 14. Vi använder lymfocytseparationsmedium media (LSM) densitetsgradientcentrifugering för att isolera granulocyter och röda blodkroppar från hepariniserat helblod, en metod anpassad från Ficoll densitetscentrifugering teknik initialt beskrivits av Boyum m.fl. 15. LSM är en modifiering av Boyum formulering som ersätter natrium diatrizoat för natrium metrizoate och har använts med framgång i många studier att isolera neutrofiler 16-18.
Efter differentiell densitetscentrifugering, är monocyter och lymfocyter kastas; röda blodkroppar är sedan sedimentmed hjälp av en 6% dextran-lösning 14 och de återstående RBC lyseras för att erhålla en population av rena neutrofiler, vilket verifieras med trypanblått och metylenblått färgning.
Talrika medel har använts för att inducera NETosis både in vitro och in vivo, inkluderande lipopolysackarid (LPS), och forbolmyristatacetat (PMA) och interleukiner (IL-8) 3,5,6. I följande protokoll, är isolerade neutrofiler stimuleras med 500 nM PMA under 4 timmar, vilket har visat sig vara en lämplig koncentration för att möjliggöra en konsekvent och pålitlig NET bildning utan att främja apoptos 19,20.
Efter isolering, visar vi hur cellfria NET erhållna från detta protokoll kan användas i en adhesionsanalys. DNAse1 används för att smälta och bryta ned NET såsom tidigare beskrivits och tjänar sålunda som en kontroll 2,3,11. Andra alternativ är att använda neutrofilelastas hämmare (NEi) att hämma NET formatipå, vilket är ett acceptabelt alternativ när målet är att hämma NET bildningen i stället påverka deras nedbrytning 11. Även NEi har ett antal olika funktioner, har det tidigare visat att NET nedfall kan hämmas genom NEi genom blockering av kromatin decondensation, kärnkraft degranulation och neutrofil död 12
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla experiment genomfördes i enlighet med lokala institutionella etiska riktlinjer.
1. Blod Teckning
- Genom antecubital venipucture, samlar 14 rör med blod från en frisk frivillig i grön topp (hepariniserade) rör och vänd varje rör innan lösa på is. Samla blod inom 10 - 15 minuter för experiment för att säkerställa optimal neutrofila avkastning.
2. Neutrofil Isolering från helblod
- Tvätta varje grön topp tub av blod med 5 ml PBS utan Ca och Mg för att späda ut blodet. I var och en av 4 x 50 ml koniska rör, tillsätt 15 ml Lymphocyte Separation Media (LSM) vid RT. Med hjälp av en 18 G nål monterad på en 60 ml spruta, försiktigt lager den utspädda blodet på LSM, skapa en skarp LSM-blod-gränssnitt.
OBS: Undvik att blanda av skikten så mycket som möjligt. - Centrifugera vid 800 xg under 30 min vid 21 ° C utan avbrott.
OBS: Plötslig pauser kanorsaka blandning av de olika skikten. - Beakta erytrocyter och neutrofiler sediment på botten. Sug och kasta de bästa 2 lager (plasma och LSM) att se till att bli av gränssnittet mellan dessa skikt som innehåller lymfocyter och mononukleära celler, vilket innebär att endast den nedre röda lagret.
- Till varje rör tillsätts 20 ml av fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) och 20 ml av 6% Dextran lösning. Försiktigt invertera varje rör för att blanda med skiktet av erytrocyter och neutrofiler och låt stå vid RT i 30 min.
NOTERA: Detta kommer att tillåta röda blodkroppar (RBC) för att sedimentera vid botten. - Efter 30 minuter, överför neutrofila rika supernatanten i nya rör och kassera RBC pellets. Centrifugera supernatanter vid 450 xg vid 4 ° C under 5 min. Efter centrifugering, kasta supernatanten. Pelleten kommer att innehålla mestadels neutrofiler och några RBK.
- Bered en lyseringslösning genom att tillsätta 0,5 ml lyseringsbuffert till 4,5 ml sterilt vatten. Lyse kvar RBC med than förberett 5 ml lyseringslösning, överföra alla återsuspenderad pellet i ett rör. Tillåt lys vid RT i mörker under 10 minuter.
- Centrifugera vid 450 xg vid 4 ° C under 5 min. Kassera supernatanten och tvätta pellets med 5 ml PBS utan Ca och Mg och centrifugera igen vid 450 xg vid 4 ° C för att bli av med någon kvarlyseringslösning. Pelleten som erhållits vid denna punkt innehåller neutrofilerna. Suspendera pelleten i 30 ml kall 3% RPMI och sätta på is.
OBS: 3% RPMI görs genom att komplettera RPMI-medium med 3% fetalt bovint serum (FBS) - Verifiera renhet av provet med användning av färgning med metylenblått. > 95% av cellerna bör vara granulocyter med fler Lobar kärnor. Använd Trypanblått färgning att verifiera> 95% livskraft celler och räkna det slutliga neutrofila avkastningen. Späd neutrofiler i iskall 3% RPMI för att erhålla en slutlig koncentration av 5 x 10 6 neutrofiler / ml.
3. NET Generation
- Stimulera neutrofiler med 500 nM PMA (per 30 ml av neutrofil lösning) och inkubera på en 150 x 25 mm platta vävnadsodlingsskål med 20 mm raster under 4 h vid 37 ° C 5% CO2. Detta kommer att möjliggöra NETosis.
- Efter 4 h av stimulering, försiktigt aspirera och kassera mediet, som lämnar skiktet av NET och neutrofiler vidhäftade vid botten. Inte störa detta lager.
- Med användning av totalt 15 ml kall PBS utan Ca och Mg per skål, tvätta botten på varje skål genom att pipettera 15 ml PBS på botten av skålen för att lyfta bort allt vidhäftande material från botten.
- Samla lösning erhållits från tvättning varje skål (steg 3.3) i en 15 ml koniska rör och centrifugera i 10 minuter vid 450 xg vid 4 ° C. Neutrofiler och eventuella återstående celler kommer pellet vid botten, vilket lämnar en cellfri NET-rik supernatant.
- Divide supernatanten i 1,5 ml mikro-centrifugrör och centrifugera i 10 minuter vid 18.000 xg vid 4 ° C. Detta gör att alla DNA till pellets.
OBS: centrifugering i större tubes är enklare och mindre tidskrävande om sådana höga hastigheter kan uppnås på den reguljära centrifug, annars måste dela supernatanter i mindre rör för att kunna använda höghastighets mikrocentrifug. - Kassera supernatanten och resuspendera alla erhållna pellet tillsammans i iskall PBS till en koncentration motsvarande 2 x 10 7 neutrofiler per 100 fil PBS. Detta kommer att ge den cellfria NET lager som kan användas för efterföljande experiment.
- Mät DNA-koncentrationen i provet erhålls med användning spektrofotometri eller suppleant DNA kvantifiering verktyg. En adekvat koncentration i provet bör ligga mellan 140-180 ng / l.
4. NET-Cancer Cell Statisk Adhesion analys
- Lägg 100 pl av den tidigare erhållna NET lager per brunn i en 96 brunnars flatbottenplatta och tillåter att belägga brunnar O / N vid 4 ° C i mörker.
- Mellan 12 och 20 h senare, kontrollera bildandet av en enhetlig monoskikt av cellerfria NET på botten av brunnarna under mikroskop (Figur 1). Vid denna punkt, försiktigt aspirera alla icke-vidhäftande material ur brunnarna, och se till att inte störa NET monolager i botten.
- Lägg 100 pl av 1% bovint serumalbumin (BSA) blockeringslösning till varje brunn och låt stå i 1 h vid RT.
- Drag av A549 cancerceller från en T-75 kolv med användning av 2 ml av 0,25% trypsin-lösning. När fristående, tillsätt 10 ml A549 media till trypsiniserade celler och centrifugera vid 450 xg vid 4 ° C i 5 min. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i media för att få en koncentration av 2 x10 4 cancerceller per 100 ^ media.
OBS: A549-celler odlades separat. I korthet, cellerna odlades och upprätthölls i DMEM F12-medium innehållande 10% FBS och 1% Penicillin Streptomycin och inkuberades vid 37 ° C 5% CO2. När 70-80% cellsammanflöde nåddes, var de fristående med användning 0,25% trypsin-EDTA och återsuspenderades i samma mediumbeskrivits ovan. - Fläckcancerceller med CFSE genom tillsats 1 il CFSE per ml medium och lämna att färga vid RT under 10 min. Efter färgning centrifugera ned vid 450 xg vid 4 ° C under 5 min, sedan kassera supernatanten och återsuspendera celler i ursprungliga volymen av media för att erhålla en koncentration av 2 x 10 4 cancerceller per 100 | il medium.
- Efter 1 timme av NET blockerar försiktigt aspirera blockerande lösningen och tillsätt 2 x10 4 cancerceller i media, vilket motsvarar 100 l, per brunn över nätet cellslager och låt fastnar i 90 minuter vid 37 ° C 5% CO2. Aspirera försiktigt cellerna och tillsätt 100 l PBS till varje brunn för att tvätta alla icke-vidhäftande celler.
- I vissa brunnar, lägga 1000U för DNAse1 per brunn i 10 min innan du tvättar att försämra NET. Detta kommer att fungera som negativ kontroll. I andra brunnar, tillsätt 100 l sterilt vatten per brunn i 10 min, vilket kommer att tjäna på fordonet kontroll (VC).
OBS: 3 replikat per condition utförs vanligen för att öka urvalets storlek. - Aspirera och kasta all lösning i brunnarna lämnar endast NET och vidhäftande cancerceller vid botten. Lägg 100 pl 4% formaldehydlösning per brunn för att fixa vidhäftande cancerceller till NETS och läsa analysen under fluorescensmikroskop (Figur 1). Plot och analysera resultaten (Figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Klarat av ett statiskt adhesionsanalysen med NET kräver tillräckliga beläggning av brunnarna med ett monolager av NET före tillsats av cancerceller (Figur 1). Alla efterföljande steg måste göras med omsorg att inte störa det lagret. När en adekvat lager av NET bildas, förväntas det att se betydande cancerceller vidhäftning till NET som ses i figur 2A och 2C. Denna effekt upphävs genom tillsats av DNAse1, vilket försämrar NET såsom ses i figurerna 2B och 2D. Omvänt bör det inte finnas någon signifikant minskning av A549 vidhäftning till NET i närvaro av fordonsstyrning (Figur 3). För att få en bra uppskattning av medelcancer celladhesion per hög effekt fält (HPF), rekommenderas att räkna minst fyra slump HPF per brunn. Fält som inte är väl belagda i NET på grund av tekniska problem inte bör beaktas vid counting som dessa kan förfalska resultatet.
Figur 1. NET monolager. Ljusmikroskopi bilder av de 96 brunnar brunnar belagda med NET visar (A) enhetlig monolager av NET hela väl i motsats till (B) bra beläggning av väl med en avbruten lager av NET. Skala barer representerar 40 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. A549 Cancer Cell Adhesion till NET in vitro. (A) A549 cancerceller (pilar) hålla sig till monolager av NET in vitro. (B) Additipå av DNAse1 signifikant minskar nivån av cancercellvidhäftning; (C) visar en representativ bild av cancer cell adhesion på nät under fluorescerande ljus under lysrörs mikroskopi (Nikon TE300) före (C) och efter (D) tillägg av DNAse1. Skala barer representerar 40 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Resultat för In Vitro Adhesion analys. GraphPad mjukvara användes för att rita och analysera resultaten från A549 cancer celladhesionsanalys till NET. I närvaro av DNAse, vidhäftningen var 13,90% jämfört med obehandlade NET. I närvaro av vehikelkontroll (VC), vidhäftningen var 77,26% jämfört med obehandlade NET. Data presenteras som medelvärde +/-SEM. Signifikans bestämdes med användning av Kruskall Wallis test med ** p <0,001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den neutrofila Extracellulär Trap isoleringsprotokoll demonstreras i den här videon kombinerar olika tekniker som används i litteraturen för neutrofila isolering och NET bildning. Det förenklar en ganska komplex och variabel processen och erbjuder en mycket pålitlig och reproducerbara sättet att isolera renade cellfria NET med färre steg än andra protokoll. Dessutom är lättillgängliga reagenser sysselsatt lägga till protokoll enkelhet och avsevärt minska sina kostnader. Tillämpningen av NET mot ett statiskt adhesionsanalysen tjänar att visa den flexibilitet som ges genom detta isoleringsteknik, som NET koncentration lätt kan manipuleras för att passa ett visst mål (17). Följaktligen kan NET isolerats genom demonstrerade tekniken användas för olika typer av tester inkluderande dynamisk vidhäftningsanalyser, migrationsanalyser, proliferationsanalyser immunofluorescens och konfokal avbildning, elektronmikroskopi, flödescytometri liksom traditionell Western blotting. Det finns ett antal steg i detta protokoll som är kritiska för dess framgång. Först får neutrofiler oavsiktligt aktiveras under processen för isolering som leder till apoptos. Det är därför viktigt att utföra alla isoleringssteg under sterila förhållanden under dragskåp, undvika aggressiv blandning av rör, hålla alla prover på is efter RBC lys steget, och undvika långa väntetider mellan stegen. För det andra, om målet för analysen är att belägga brunnar för att bedöma vidhäftning, är det viktigt att respektera den föreslagna NET koncentrationen per brunn samt den föreslagna slutliga DNA-koncentrationen i "NET lager", eftersom detta kommer att säkerställa en jämn och konsekvent monolager av NET. Lägre koncentration kan producera endast fläckvis beläggning av brunnen och därför mindre tillförlitliga resultat. Slutligen är det också viktigt att hantera den NET monoskiktet mycket försiktigt medan analysen utförs för att förhindra dess avbrott. Detta kan underlättas genom att justeraintensiteten av sug- och pipettering på sidorna av brunnarna.
Begränsningar av denna teknik inkluderar det faktum att det fortfarande krävs en avsevärd tid för att producera NET, mestadels orsakade av 4 h PMA stimulering steg. Dessutom är en betydande mängd blod erfordras för att isolera ett tillräckligt antal neutrofiler som krävs för ett experiment. Det är definitivt förlust av en betydande mängd NET vid första centrifugeringssteget (steg 3.4.) Vid kasse neutrofiler. Ändringar för att minimera nettoförlust på denna punkt skulle avsevärt öka den slutliga nettoavkastningen. Dessutom måste isolerade NET användas inom 12-24 timmar av sin isolering, vilket kräver noggrann experiment planering och tidshantering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Wisent | 311-425-CL | |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent | 305-010-CL | |
| Dextran hydrochloride (powder) | Spectrum | DE130 | 6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | 3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum |
| BD Pharm Lyse Lysing buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Alrdrich | P8139 | |
| DNAse1 | Roche | 11284932001 | |
| F12 DMEM | Wisent | 319-075-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Integrid tissue culture dish with 20 mm grid (150 x 25 mm) | Falcon | 353025 |
References
- Saitoh, T., et al. Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1. Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).
- Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin RodA. PLoS Pathog. 6 (4), e1000873 (2010).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Papayannopoulos, V., Zychlinsky, A. NETs: a new strategy for using old weapons. Trends Immunol. 30 (11), 513-521 (2009).
- McDonald, B., Urrutia, R., Yipp, B. G., Jenne, C. N., Kubes, P. Intravascular neutrophil extracellular traps capture bacteria from the bloodstream during sepsis. Cell Host Microbe. 12 (3), 324-333 (2012).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. J Immunol. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).
- Khandpur, R., et al. NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis. Sci Transl Med. 5 (178), 178ra140 (2013).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Hahn, S., Giaglis, S., Hoesli, I., Hasler, P. Neutrophil NETs in reproduction: from infertility to preeclampsia and the possibility of fetal loss. Front Immunol. 3, 362 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. J Clin Invest. , (2013).
- Cools-Lartigue, J., Spicer, J., Najmeh, S., Ferri, L. Neutrophil extracellular traps in cancer progression. Cell Mol Life Sci. , (2014).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. J Vis Exp. (36), (2010).
- Maqbool, M., Vidyadaran, S., George, E., Ramasamy, R. Optimisation of laboratory procedures for isolating human peripheral blood derived neutrophils. Med J Malaysia. 66 (4), 296-299 (2011).
- Boyum, A. Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand J Immunol. Suppl. 5, 9-15 (1976).
- Calado, R. T., et al. Sex hormones, acting on the TERT gene, increase telomerase activity in human primary hematopoietic cells. Blood. 114 (11), 2236-2243 (2009).
- Zhong, C., Qu, X., Tan, M., Meng, Y. G., Ferrara, N. Characterization and regulation of bv8 in human blood cells. Clin Cancer Res. 15 (8), 2675-2684 (2009).
- Wu, Y. J., et al. In vivo leukocyte labeling with intravenous ferumoxides/protamine sulfate complex and in vitro characterization for cellular magnetic resonance imaging. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (5), C1698-C1708 (2007).
- Saffarzadeh, M., et al. Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones. PLoS One. 7 (2), e32366 (2012).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
