Summary
Im folgenden Protokoll beschreiben wir eine sehr einfache Möglichkeit, Neutrophil Extracellular Traps (NETs) aus humanem Vollblut unter Verwendung leicht verfügbarer Reagenzien zu isolieren. Dann zeigt, wie die isolierten Netze können in einem in vitro-Adhäsionstest mit Krebszellen verwendet werden.
Abstract
Neutrophil Extracellular Traps (NETs) sind vor kurzem im Rahmen der antimikrobiellen Rüstzeug der Neutrophilen zu hinterlassen. Neben ihrer Rolle bei der Bekämpfung von Infektionen haben jüngere Untersuchungen gezeigt, dass sie in vielen anderen Krankheitsprozessen, einschließlich Tumorprogression beteiligt sind. Isolieren von gereinigtem NETs ist ein wesentliches Element, um das Studium dieser Funktionen zu ermöglichen.
In diesem Video zeigen wir, ein vereinfachtes Verfahren zur zellfreien NET Isolierung aus humanem Vollblut unter Verwendung leicht verfügbarer Reagenzien. Isolierte NETs kann dann für die Immunfluoreszenzfärbung Blotting oder verschiedenen funktionellen Assays verwendet werden. Dies ermöglicht eine Bewertung ihrer biologischen Eigenschaften in Abwesenheit des potenziellen confounding Wirkungen Neutrophile selbst.
Ein Dichtegradient-Trenntechnik verwendet wird, um Neutrophile von gesunden Spender Vollblut zu isolieren. Isolierte Neutrophile werden dann von Phorbol-12-myr stimuliertistate 13-Acetat (PMA) zu NETosis induzieren. Aktivierten Neutrophilen werden dann verworfen, und eine zellfreie NET Lager erhalten wird.
Dann zeigt, wie isolierte Netze können in einem Adhäsionstest mit menschlichen A549-Lungenkrebszellen verwendet werden. Die NET-Aktie zur Beschichtung die Vertiefungen einer 96-Well-Zellkulturplatte O / N, und nach Gewährleistung eines angemessenen NET Monoschichtbildung auf dem Boden der Vertiefungen, beschriftet CFSE A549-Zellen zugegeben. Adhärente Zellen werden quantifiziert unter Verwendung eines Nikon TE300 Fluoreszenzmikroskop. In einigen Brunnen, wird 1000U DNAse1 10 Minuten vor dem Zählen zu NETs abbauen hinzugefügt
Introduction
Neutrophil Extracellular Traps (NETs) sind neu entdeckte Neutrophilen stammenden Elemente der Stränge der extrazelluläre DNA von Hunderten von Proteinen und Histone dekoriert zusammen. Sie werden von Neutrophilen im Rahmen von Infektionen und Entzündungen folgende spezifische Reize sezerniert und Erstverbuchung galt, einen Teil der neutrophilen Abwehrmechanismen gegen Infektionen. Sie wurden erstmals gezeigt, dass das Einfangen von verschiedenen mikrobiellen Eindringlinge wie Bakterien, Viren und Pilze 1-3 fördern. Überfüllung der Mikrobe würde dann führen zu seiner Zerstörung sowohl direkt durch NET-assoziierten Proteinen 3,4 und indirekt über lokale Rekrutierung von Phagozyten 5,6. Die Rolle der NETs jedoch scheint nicht beschränkt auf die Verteidigung zu hosten. In jüngerer Zeit haben sie gezeigt, eine wichtige Rolle bei Autoimmunerkrankungen spielen 7,8, Thrombose 9, schwangerschaftsbedingten Störungen 10 und sogar Krebsprogression11,12. Dementsprechend scheint es, daß NETs spielen eine wichtige Rolle in einer großen Anzahl von verschiedenen physiologischen Prozessen. Angesichts der Neuartigkeit dieser Forschung, bleibt noch viel zu in Bezug auf die Mechanismen, durch die NETs ihre Wirkungen ausüben aufgeklärt werden. Hier berichten wir über ein vereinfachtes Verfahren für die Isolierung von NETs in der Abwesenheit von Neutrophilen.
Im folgenden Video zeigen wir, eine vereinfachte und einfache Technik, um NETs aus humanem Vollblut zu isolieren. Zellfreie NETs kann dann in einer Reihe von in vitro-Versuche, einschließlich der Färbung imuunofluorescence verwendet werden, Blotting sowie eine Anzahl von Tests, wie Adhäsion, Proliferation und Migration. Andere Protokolle existieren 13, 19, sie sind jedoch in der Regel langwierig, komplex, teuer und oft geringe Ausbeute 13. Diese vereinfachte Protokoll verwendet basischen Reagenzien, und verringert die Anzahl der erforderlichen Schritte, um Neutrophile zu isolieren, damit die Minimierung der Länge des procedure bei gleichzeitiger Maximierung Ausbeute.
Das folgende Verfahren kombiniert verschiedene Techniken zur Isolation neutrophiler zuvor in der Literatur beschrieben, um ein einfaches Protokoll, wodurch eine sehr reine Probe lebender Neutrophilen erhalten. Wie in der Literatur vorgeschlagen wird venöses Blut in EDTA-Röhrchen gesammelt und innerhalb von 10 min verwendet, um die Aktivierung von Neutrophilen 14 zu vermeiden. Wir verwenden Lymphocyte Separation Medien (LSM) Dichtegradientenzentrifugation Granulozyten und Erythrozyten aus heparinisiertem Vollblut, ein Verfahren von der Ficoll-Dichtezentrifugation Technik zunächst Boyum et al 15 beschrieben angepasst isolieren. LSM ist eine Modifikation des Boyum Formulierung, Natriumdiatrizoat substituiert den Natrium Metrizoat und erfolgreich in vielen Studien verwendet worden, um Neutrophile 16-18 zu isolieren.
Folgende Differential Dichtezentrifugation, Monozyten und Lymphozyten werden verworfen; roten Blutzellen werden dann sedimentiertVerwendung einer 6% Dextran-Lösung 14 und die verbleibenden RBCs lysiert, um eine Population von reinem Neutrophile, die mit Trypanblau und Methylenblau-Färbung verifiziert erhalten.
Zahlreiche Mittel wurden zur NETosis sowohl in vitro und in vivo zu induzieren, einschließlich Lipopolysacchariden (LPS) und Phorbolmyristatacetat (PMA) und Interleukine (IL-8) 3,5,6. In dem folgenden Protokoll werden isolierte Neutrophilen mit 500 nM PMA für 4 h, was gezeigt wurde, dass eine ausreichende Konzentration, um konsistente und zuverlässige NET Bildung ohne die Förderung der Apoptose 19,20 ermöglichen stimuliert.
Nach Isolierung, zeigen wir, wie zellfreien NETs diesem Protokoll erhalten wird, kann in einem Adhäsionstest verwendet werden. DNAse1 verwendet zu verdauen und zu zersetzen NETs, wie zuvor beschrieben, und dient als Kontrolle 2,3,11 somit. Weitere Optionen sind die Verwendung von Neutrophilen-Elastase-Inhibitor (NEI), um NET formati hemmenauf, die eine akzeptable Alternative, wenn das Ziel ist, die NET Bildung anstatt hemmen bewirken deren Abbau 11 ist. Obwohl NEi hat eine Reihe von unterschiedlichen Funktionen hat sich bereits gezeigt, dass NET Abscheidung kann durch NEi durch Blockade der Chromatindekondensation, Kern Degranulation von Neutrophilen und Tod 12 gehemmt werden
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Protocol
HINWEIS: Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den lokalen institutionellen ethischen Richtlinien durchgeführt.
1. Blut Zeichnung
- Durch Ellen venipucture, sammeln 14 Röhrchen Blut von einem gesunden Freiwilligen in grüne Spitze (Heparin) Röhrchen und Invertzucker jedes Rohr, bevor sie sich auf dem Eis. Sammeln Blut innerhalb von 10 bis 15 min von Experiment, um eine optimale Neutrophilen Ausbeute zu gewährleisten.
2. Neutrophile Isolierung aus Vollblut
- Waschen Sie jedes grüne Spitze Blutröhrchen mit 5 ml PBS ohne Ca und Mg, um das Blut zu verdünnen. In jeder der 4 x 50 ml konische Röhrchen werden 15 ml der Lymphozytentrennmedien (LSM) bei RT. Mit einer 18 G-Nadel auf einem 60-ml-Spritze montiert, sorgfältig Schicht des verdünnten Blut auf den LSM, die Schaffung einer starken LSM-Blut-Schnittstelle.
HINWEIS: Verwechseln der Schichten so weit wie möglich. - Zentrifuge bei 800 xg für 30 Minuten bei 21 ° C, ohne Pause.
HINWEIS: Sudden Pausen könnenein Mischen der verschiedenen Schichten. - Beachten Sie die Erythrozyten und Neutrophilen Sediment am Boden. Absaugen und entsorgen Sie die oberen zwei Schichten (Plasma und LSM) und achten Sie auf der Grenzfläche zwischen diesen Schichten, die Lymphozyten und mononukleären Zellen enthält loszuwerden, so dass nur die untere rote Schicht.
- In jedes Röhrchen werden 20 ml Phosphatpuffer-Saline (PBS) und 20 ml 6% iger Dextranlösung. Vorsichtig umdrehen jedes Rohr mit der Schicht aus Erythrozyten und Neutrophilen vermischen und bei Raumtemperatur 30 min stehen.
HINWEIS: Dies ermöglicht es den roten Blutkörperchen (Erythrozyten), um am Ende zu sedimentieren. - Nach 30 Minuten überweisen Sie den Neutrophilen reiche Überstand in frische Röhrchen und entsorgen Sie die RBC-Pellets. Zentrifugenüberstände bei 450 × g bei 4 ° C für 5 min. Nach dem Zentrifugieren Überstand verwerfen. Das Pellet wird zumeist Neutrophilen und einigen roten Blutkörperchen enthalten.
- Vorbereiten einer lysierenden Lösung durch Zugabe von 0,5 ml Lyse-Puffer und 4,5 ml steriles Wasser. Lyse verbleibenden RBC mit ter bereit 5 ml Lyse-Lösung, Übertragung aller resuspendierten Pellets in ein Rohr. Zulassen Lyse bei RT im Dunkeln für 10 min.
- Zentrifuge bei 450 × g bei 4 ° C für 5 min. Überstand verwerfen und Pellet Waschen mit 5 ml PBS ohne Ca und Mg und erneut zentrifugieren bei 450 × g bei 4 ° C zu einer restlichen Lyselösung loszuwerden. Die an dieser Stelle erhaltene Pellet enthält die Neutrophilen. Das Pellet in 30 ml kalter 3% RPMI und setzen auf Eis.
HINWEIS: 3% RPMI wird durch Hinzu RPMI Medium mit gemacht 3% fötales Rinderserum (FBS) - Verifizieren Reinheit der Probe unter Verwendung von Methylenblau-Färbung. > 95% der Zellen sollten Granulozyten mit mehr lobar Kerne sein. Verwenden Trypanblaufärbung um zu überprüfen,> 95% Lebensfähigkeit der Zellen und zählen Sie die letzte Neutrophilen Ausbeute. Verdünne Neutrophilen in eiskalter 3% RPMI bis zu einer Endkonzentration von 5 x 10 6 Neutrophile / ml zu erhalten.
3. NETs-Generation
- Stimulieren Neutrophilen mit 500 nM PMA (pro 30 ml der Neutrophilen-Lösung) und Inkubieren auf einem 150 x 25 mm flachen Gewebekulturschale mit 20 mm-Raster für 4 h bei 37 ° C 5% CO 2. Dies wird NETosis ermöglichen.
- Nach 4 Stunden der Stimulation vorsichtig absaugen und entsorgen Sie die Medien, so dass die Schicht von NETs und Neutrophilen an der Unterseite befestigt. Stören Sie nicht diese Schicht.
- Mit insgesamt 15 ml kaltem PBS ohne Ca und Mg pro Schale, waschen Sie den unteren Rand jeder Schale durch Pipettieren von 15 ml PBS auf dem Boden der Schale, um vom Boden abzuheben alle haftenden Material.
- Sammeln von Waschen jedes Gericht (Schritt 3.3) in einem 15 ml konischen Rohr und Zentrifuge für 10 Minuten bei 450 × g bei 4 ° C erhaltenen Lösung. Neutrophile und die verbleibenden Zellen werden am unteren Rand zu pelletieren, so dass eine zellfreie NET-reiche Überstand.
- Dividieren Überstand in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Spinn für 10 min bei 18.000 × g bei 4 ° C. Auf diese Weise können alle DNA zu pelletieren.
HINWEIS: Die Zentrifugation in größeren tubes ist einfacher und weniger zeitaufwendig, wenn eine solche hohe Geschwindigkeiten erreichbar sind auf den regulären Zentrifuge, sonst müssen die Überstände in kleinere Rohre, um Hochgeschwindigkeitsmikrozentrifuge verwenden teilen. - Überstand verwerfen und Resuspendieren alle in eiskaltem PBS auf eine Konzentration, die 2 x 10 7 Neutrophilen je 100 ul PBS zusammen erhaltenen Pellets. Dies wird die zellfreie NET Lager, die für nachfolgende Experimente verwendet werden können erhalten.
- Messen DNA-Konzentration in der Verwendung von Spektrophotometrie oder alternative DNA Quantifizierungswerkzeug erhaltenen Probe. 180 ng / ul - Eine ausreichende Konzentration in der Probe sollte zwischen 140 reichen.
4. NET-Krebszelle Static Adhäsionsassay
- 100 l des zuvor erhaltenen NET Lager pro Vertiefung einer 96-Well-Flachbodenplatte und ermöglichen die Beschichtung Brunnen O / N bei 4 ° C im Dunkeln.
- Zwischen 12 und 20 Stunden später überprüfen Bildung einer einheitlichen Monolage von Zellenfreie NETs am Boden der Vertiefungen unter dem Mikroskop (Figur 1). An dieser Stelle vorsichtig aspirieren alle nicht haftenden Materials aus den Brunnen, um sicherzustellen, nicht auf die NET-Monoschicht an der Unterseite zu stören.
- Füge 100 ul 1% Rinderserumalbumin (BSA) Blockierungslösung in jede Vertiefung und lassen für 1 h bei RT.
- Nehmen A549 Krebszellen von einem T-75-Kolben verwenden 2 ml 0,25% Trypsin-Lösung. Einmal gelöst, 10 ml A549 Medien trypsiniert Zellen und Zentrifuge bei 450 × g bei 4 ° C für 5 min. Überstand verwerfen und die Zellen in Medien, um eine Konzentration von 2 x 10 4 Tumorzellen pro 100 & mgr; l Medium zu erhalten.
HINWEIS: A549-Zellen wurden getrennt gezüchtet. Kurz gesagt, wurden Zellen kultiviert und in DMEM F12-Medium, das 10% FBS und 1% Penicillin Streptomycin und bei 37 ° C 5% CO 2 inkubiert gehalten. Nachdem 70 bis 80% Zellkonfluenz erreicht worden war, unter Verwendung von 0,25% Trypsin-EDTA abgelöst und sie in dem gleichen Medium resuspendiertoben beschrieben. - Stain Krebszellen mit CFSE durch Zugabe von 1 ul CFSE pro ml Medium und lassen bei RT für 10 Minuten zu färben. Nach dem Färben Zentrifuge nach unten bei 450 × g bei 4 ° C für 5 min, dann Überstand verwerfen und die Zellen in anfänglichen Volumens von Medien, um eine Konzentration von 2 x 10 4 Tumorzellen pro 100 & mgr; l Medium zu erhalten.
- Nach 1 h NETs Blockierung leicht absaugen Blockierungslösung und mit 2 x 10 4 Tumorzellen in Medium, die äquivalent zu 100 & mgr; l ist, pro Vertiefung über das Netz Monoschicht und lassen für 90 min bei 37 ° C 5% CO 2 anhaften. Vorsichtig aspirieren die Zellen und mit 100 ul PBS in jede Vertiefung, alle nicht-adhärenten Zellen zu waschen.
- In einigen Brunnen, fügen 1000U der DNAse1 pro Vertiefung für 10 Minuten vor dem Waschen zu NETs beeinträchtigen. Dies wird als negative Kontrolle dienen. Mit anderen Brunnen, fügen 100 ul sterilem Wasser pro Vertiefung für 10 Minuten, die als die Fahrzeugsteuerung (VC) dienen wird.
HINWEIS: 3 Wiederholungen pro condition sind in der Regel durchgeführt, um Stichprobengröße zu erhöhen. - Absaugen und entsorgen Sie alle Lösung in die Vertiefungen so dass nur NETs und haftende Krebszellen an der Unterseite. 100 l 4% Formaldehydlösung pro Vertiefung zu adhärenten Krebszellen zu reparieren und NETS Ableseassay unter dem Fluoreszenzmikroskop (Bild 1). Plot und Analyse der Ergebnisse (Abbildung 3).
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Representative Results
Erfolgreiches Erreichen eines statischen Adhäsionsassay mit Netzen erfordert eine adäquate Beschichtung der Vertiefungen mit einer Monoschicht von NETs vor der Zugabe von Krebszellen (Abbildung 1). Alle weiteren Schritte müssen mit Vorsicht durchgeführt, um diese Schicht nicht stören werden. Wenn eine ausreichende Schicht NETs gebildet ist, wird erwartet, dass signifikante Krebszellen Haftung an NETs, wie in 2A und 2C gesehen zu werden. Dieser Effekt wird durch die Zugabe von DNAse1, die NETs abbaut, wie in den 2B und 2D ersichtlich aufgehoben. Umgekehrt, sollte es keine signifikante Abnahme der A549 Haftung an NETs in Gegenwart der Vehikelkontrolle (Abbildung 3). Um eine gute Abschätzung der mittleren Krebs Zelladhäsion pro Gesichtsfeld (HPF) zu erhalten, empfiehlt es sich, mindestens 4 Zufalls hpfs pro Vertiefung zählen. Felder, die nicht gut in NETs aufgrund von technischen Problemen beschichtet werden, sollten nicht in Betracht für coun genommen werdenting diese könnten Ergebnisse verfälschen.
Abbildung 1. NET Monolayer. Die Lichtmikroskopie Bilder der 96 Vertiefungen Plattenvertiefungen mit NETs, die (A) gleichmäßigen Monoschicht von NETs gesamten sowie (B) unzureichend Beschichtung der auch gegenüber mit einer unterbrochenen Schicht NETs beschichtet. Maßstabsbalken repräsentieren 40 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. A549 Cancer Cell Adhesion an NETs In Vitro. (A) A549 Krebszellen (Pfeile) haften Monolage von NETs in vitro. (B) Additiauf der DNAse1 deutlich abnimmt das Niveau der Krebs Zelladhäsion; (C) zeigt ein repräsentatives Bild von Krebs Zelladhäsion auf NETs unter Fluoreszenzlicht unter Fluoreszenzmikroskopie (Nikon TE300) vor (C) und nach (D) Zugabe von DNAse1. Maßstabsbalken repräsentieren 40 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Ergebnisse der In-vitro-Adhesion Assay. GraphPad Software wurde verwendet, um zu zeichnen und zu analysieren, ergibt sich aus der A549-Krebs Zelladhäsionsassay zu NETs. In Gegenwart von DNAse, war die Haftbindung 13,90% im Vergleich zu unbehandelten NETs. In Anwesenheit von Vehikelkontrolle (VC), war die Haftbindung 77,26% im Vergleich zu unbehandelten NETs. Die Daten werden als Mittelwert +/- vorgestelltSEM. Die Signifikanz wurde mittels Kruskall Wallis-Test mit ** p <0,001 bestimmt.
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Discussion
Das Neutrophil Extracellular-Falle Isolierungsprotokoll in diesem Video gezeigt, kombiniert verschiedene Techniken, die in der Literatur für neutrophile Isolation und NET Bildung verwendet. Es vereinfacht eine ziemlich komplexe und variable Prozess und bietet eine sehr zuverlässige und reproduzierbare Weise gereinigt zellfreien NETs mit weniger Schritte als andere Protokolle zu isolieren. Außerdem werden leicht erhältliche Reagenzien Zugabe verwendet, um die Protokolle der Einfachheit und die Kosten deutlich reduziert werden. Die Anwendung der NETs hin zu einer statischen Adhäsionsassay dient dazu, die Flexibilität, die diese Isolationstechnik geboten zu demonstrieren, wie NET-Konzentration kann leicht manipuliert werden, um ein bestimmtes Ziel (17) angepasst werden. Dementsprechend kann durch den NETs gezeigt Technik getrennt für verschiedene Arten von Tests einschließlich dynamischer Adhäsionsassays, Migrationsassays, Proliferationsassays Immunfluoreszenz und die konfokale Abbildung, Elektronenmikroskopie eingesetzt werden, Durchflusszytometrie sowie traditionellen Western-Blotting. Es gibt eine Reihe von Schritten in diesem Protokoll, die kritisch für den Erfolg sind. Erstens kann Neutrophilen Versehen während des Verfahrens der Isolierung führt zu Apoptose aktiviert werden. Es ist daher wichtig, um alle Isolierungsschritte unter sterilen Bedingungen unter dem Abzug lange Wartezeiten zwischen den Schritten durchzuführen, zu vermeiden aggressive Mischung von Rohren, halten alle Proben auf Eis nach dem RBC-Lyse, und zu vermeiden. Zweitens, wenn das Ziel des Tests ist die Beschichtung Brunnen für die Beurteilung der Haftung, ist es wichtig, den vorgeschlagenen NET Konzentration pro Well und respektieren, wie die vorgeschlagene endgültige DNA-Konzentration in der "NET Lager", da dies auch zu gewährleisten ein und konsequente Monolage von NETs. Geringere Konzentration darf nur lückenhafte Beschichtung der gut und daher weniger zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Schließlich ist es auch wichtig, die NET-Monoschicht sehr sorgfältig zu behandeln, während der Durchführung des Tests zu seiner Zerstörung zu verhindern. Dies kann durch Anpassung erleichtert werdendie Intensität der Saug- und Pipettieren auf die Seiten der Vertiefungen.
Einschränkungen dieser Technik umfassen die Tatsache, daß es immer noch erfordert eine erhebliche Menge an Zeit, um NETs, überwiegend nach der 4 Stunden PMA-Stimulation Schritt verursacht herzustellen. Zusätzlich wird eine beträchtliche Menge von Blut benötigt, um eine ausreichende Anzahl von Neutrophilen bei einem Experiment erforderlich isolieren. Es ist auf jeden Fall dem Verlust einer erheblichen Menge an NETs am ersten Zentrifugationsschritt (Schritt 3.4.), Wenn das Verwerfen Neutrophilen. Änderungen an Nettoverlust an dieser Stelle zu minimieren könnte die endgültige Rendite deutlich steigern. 24-Stunden ihrer Isolation, die eine sorgfältige Versuchsplanung und Zeitmanagement erfordert - Außerdem muss isoliert NETs innerhalb von 12 verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Wisent | 311-425-CL | |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent | 305-010-CL | |
| Dextran hydrochloride (powder) | Spectrum | DE130 | 6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | 3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum |
| BD Pharm Lyse Lysing buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Alrdrich | P8139 | |
| DNAse1 | Roche | 11284932001 | |
| F12 DMEM | Wisent | 319-075-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Integrid tissue culture dish with 20 mm grid (150 x 25 mm) | Falcon | 353025 |
References
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