Summary
在下面的协议中，我们描述了一个非常简单的方法来分离中性粒细胞外使用容易获得的试剂从人全血中的陷阱（母语）。然后，我们说明如何分离的母语可以与癌细胞在体外粘附试验中使用。
Abstract
中性粒细胞胞外陷阱（英语教师），最近被确定为中性粒细胞的抗菌医疗设备的一部分。除了它们在对抗感染的作用，最近的研究表明，它们可能涉及许多其他疾病过程，包括癌症的发展。隔离净化网是一个关键因素，让这些功能的研究。
在这段视频中，我们展示无细胞NET隔离从人全血使用现成的试剂的简化方法。孤立母语然后可用于免疫荧光染色，印迹或各种功能测定。这使得他们的生物特性在没有中性粒细胞本身的潜在混杂影响的评估。
密度梯度分离技术是用于分离来自健康供体的全血嗜中性粒细胞。嗜中性粒细胞分离的，然后通过佛波醇12- MYR刺激状态IState 13-乙酸酯（PMA），以诱导NETosis。嗜中性粒细胞活化，然后被丢弃，并且获得无细胞NET库存。
然后，我们说明如何分离母语可以与A549人肺癌细胞的粘附实验中使用。该NET库存被用于涂布的96孔细胞培养板O / N，并确保在孔的底部的适当网单层形成后，CFSE标记的A549细胞加入孔中。贴壁细胞使用的是尼康TE300荧光显微镜量化。在有些井，1000U DNAse1加10分钟计时，以降低母语之前
Introduction
中性粒细胞胞外陷阱（英语教师）是新发现的细胞外的DNA链由数百蛋白质和组蛋白的装饰组成的中性粒细胞衍生的元素。它们是由下列具体的刺激在感染和炎症的上下文中的中性粒细胞分泌的，它们最初被认为是对抗感染的嗜中性粒细胞的防御机制的一部分。他们首先证明能促进各种微生物的入侵，包括细菌，病毒和真菌1-3诱捕。然后圈住微生物将其破坏双方直接NET相关蛋白3,4和间接通过吞噬细胞5,6当地招聘领导。然而，似乎教师的角色不局限于宿主防御。最近，它们已显示出在自身免疫性疾病7,8-重要作用，血栓9，妊娠相关疾病10乃至癌的进展11,12。因此，看来母语在大量不同的生理过程中发挥了重要作用。然而，由于这类研究的新特性，仍有许多关于由哪个网络发挥其作用机制阐明。在此，我们提出了一个简单的方法，这些教师在没有嗜中性粒细胞的隔离。
在下面的视频中，我们展示一个简化和简单的技术来隔离人全血的教师。无细胞母语然后可以在多个体外实验包括染色，imuunofluorescence使用，印迹以及许多测定法如粘附，增殖和迁移的。其他协议存在13，19，但它们通常是冗长的，复杂的，昂贵的，并且常常，产量低13。这种简化的协议使用基本试剂和减小的分离嗜中性粒细胞所需的步骤数，因此减少了程序，可以的长度再同时最大限度地提高产量。
以下方法结合不同的技术来粒细胞隔离先前在文献中描述的，以获得一个简单的协议，得到活嗜中性粒细胞的非常纯的样品。如在文献中，静脉血收集在EDTA管中，并在10分钟用来避免中性粒细胞活化14。我们使用淋巴细胞分离介质（LSM）密度梯度离心，从肝素化的全血，改编自由Boyum等人15首先描述的Ficoll密度离心分离法的方法分离粒细胞和红细胞。 LSM是Boyum制剂代替泛影酸钠的甲泛影钠，并已成功地用在许多研究中，分离的中性粒细胞16-18的变形。
下面的微分密度离心，单核细胞和淋巴细胞被丢弃;然后红细胞沉降用6％的葡聚糖溶液14和剩余的红细胞被裂解，以获得纯的中性粒细胞，其与台盼蓝和亚甲基蓝染色证实的群体。
众多剂已被用于诱导NETosis 在体外和体内 ，包括脂多糖（LPS），以及佛波醇肉豆蔻乙酸酯（PMA）和白介素（IL-8）-3,5,6-。在下面的协议中，分离的嗜中性粒细胞刺激与500nM的PMA 4小时，这已被证明是足够的浓度，以允许一致和可靠的净形成而不促进细胞凋亡19,20。
分离后，我们展示了如何从该协议得到的无细胞的教师可以在附着测定中使用。 DNAse1用于消化和如前所述降解母语，因此作为控制2,3,11。其它选项包括使用中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂（NEI）的抑制NET formati上，这是当目标是抑制NET形成而不影响它们的降解11的可接受的替代品。虽然支持间隙具有许多不同的功能，它已被以前曾表明，净沉积可以通过染色质解聚，核脱粒和嗜中性粒细胞死亡12的堵塞来抑制由支持间隙
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Protocol
注：所有实验均按照当地机构的道德准则进行的。
1.采血
- 通过肘静脉穿刺，取血14管从健康志愿者为青顶（肝素）管和结算冰上反转前每管。在采集血液10 - 实验的15分钟，以保证最佳的中性粒细胞的产量。
从全血中性粒细胞2.隔离
- 洗血每一个绿色的顶管用5毫升的PBS无钙和镁，以稀释血液。在每4×50毫升锥形管中，在室温添加15毫升淋巴细胞分离介质（LSM）的。使用18G的针头装在60毫升注射器，仔细一层稀释血液到LSM，创造一个尖锐的LSM-血接口。
注：避免混合层尽可能。 - 离心机在800 XG为30分钟，在21°C不休息。
注：突然断裂能引起的不同层的混合。 - 观察红细胞和嗜中性粒细胞沉淀在底部。吸并丢弃顶2层（血浆和LSM）确保这些层包含淋巴细胞和单核细胞之间摆脱了接口，只留下底部的红层。
- 向每个管中，加入20毫升磷酸盐缓冲液盐水（PBS）和20毫升6％葡聚糖溶液。轻轻颠倒每个管混合与红细胞和嗜中性粒细胞的层，并允许坐在RT下30分钟。
注意：这将允许红血细胞（红细胞），以沉淀在底部。 - 30分钟后，转移的嗜中性粒细胞丰富上清到新鲜试管，弃去红细胞粒料。离心上清在450×g离心在4℃下5分钟。离心后，弃去上清液。颗粒将包含多为中性粒细胞和红细胞数。
- 通过加入0.5ml裂解缓冲液至4.5毫升的无菌水的制备裂解液。裂解剩余RBC伴t他准备5毫升裂解液，将全部再悬浮颗粒进入一管。允许裂解在室温在黑暗中进行10分钟。
- 离心机在450×g离心在4℃下5分钟。弃上清，用5毫升PBS中再在450×g离心在4℃下洗涤沉淀不含Ca和Mg和离心机摆脱任何剩余裂解溶液。在这点上得到的粒料中含有的嗜中性粒细胞。悬浮颗粒在30毫升冷的3％RPMI和雪藏。
注：3％的RPMI由补充RPMI培养基与由3％胎牛血清（FBS）的 - 验证使用亚甲蓝染色样品的纯度。 > 95％的细胞应粒具有多叶核。用台盼蓝染色，以验证>细胞95％的生存能力和计算最终的中性粒细胞的产量。稀释在冰冷的3％的RPMI嗜中性粒细胞，以获得5×10 6中性粒细胞/ ml的终浓度。
3.英语教师代
- 刺激中性粒细胞与500 NPMA的M个（每30毫升的中性粒细胞的溶液），并孵育在150×25毫米平组织培养皿用20毫米的网格4小时，在37℃，5％CO 2。这将允许NETosis。
- 4小时的刺激后，轻轻吸并丢弃媒体，留下网和嗜中性粒细胞粘附在底部的层。不要破坏这层。
- 使用总共15毫升冷的PBS无钙和镁每皿，通过以抬离所有附着的物质从底部吹打在培养皿的底部15毫升的PBS冲洗每个培养皿的底部。
- 收集来自在450×g离心在15ml锥形管中，并离心洗涤每个培养皿（步骤3.3）进行10分钟，在4℃下得到的溶液中。嗜中性粒细胞和任何剩余的细胞将沉淀在底部，留下无细胞的NET-富上清液。
- 除法上清液进1.5毫升微离心管中，自旋10分钟，在18000×g离心在4℃下。这将允许所有的DNA沉淀。
注：离心较大TUBES是更容易和耗时更少如果这样高的速度是可以实现在常规离心机，否则将需要划分在较小的管的上清液，以便使用高速微离心机。 - 弃上清，重悬所得一起在冰冷PBS到对应于每100微升的PBS的2×10 7嗜中性粒细胞的浓度的所有颗粒。这将产生的无细胞NET股票，可以用于后续的实验。
- 测量DNA浓度用分光光度法或候补DNA的定量工具得到的样品中。样品中的适当浓度应介于140 - 180纳克/微升。
4. NET-癌细胞静态粘附实验
- 在黑暗中添加100微升每孔的以前取得的净股票在96孔平底板，并允许以涂覆孔O / N在4℃。
- 后12至20小时，确认形成细胞均匀单层在孔的显微镜下的底部自由母语（ 图1）。在这一点上，轻轻地吸出所有非粘附材料从孔中，确保不破坏网的单层的底部。
- 加入100微升的1％牛血清白蛋白（BSA）的封闭溶液以每孔并离开在RT 1小时。
- 从T-75烧瓶中使用2-毫升0.25％胰蛋白酶溶液中分离的A549癌细胞。一旦分离，加入10 mL的A549媒体来胰蛋白酶细胞和离心机在450×g离心在4℃下5分钟。弃上清，重悬细胞培养基，以获得2×10 4个 ，每100微升培养基的癌细胞的浓度。
注：A549细胞分别生长。简言之，将细胞培养，并保持在含有10％FBS和1％青霉素链霉素，37℃，5％CO 2的DMEM F12培养基。一旦70％ - 80％的细胞汇合达到，他们使用0.25％胰蛋白酶-EDTA进行分离，并重新悬浮在相同的媒体如上所述。 - 用CFSE通过加入1微升每ml培养基CFSE和离开染色在室温10分钟染色癌细胞。染色，离心下来，在450×g离心在4℃下5分钟后，然后弃上清，重悬细胞的培养基的初始体积，以获得2×10 4个 ，每100微升培养基的癌细胞的浓度。
- 1小时后的教师阻断，轻轻吸封闭溶液，并添加2×10 4个肿瘤细胞中的媒体，这相当于100微升，每孔过网单层，并允许在37℃，5％CO 2的粘附90分钟的。轻轻吸出细胞，并添加100微升PBS中，以每个孔洗任何非贴壁细胞。
- 在一些井中，洗涤前DNAse1的添加1000U每孔10分钟以降解母语。这将作为阴性对照。在其他井，10分钟后，将作为车辆控制（VC）的添加100微升每孔的无菌水。
注：3元conditio复制n为通常执行以增加样本量。 - 吸并丢弃在井只剩下网和贴壁肿瘤细胞在底部的所有解决方案。加入100微升每孔的4％甲醛溶液固定粘附癌细胞蚊帐和荧光显微镜下读取测定（ 图1）。打印和分析结果（ 图3）。
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Representative Results
成功实现用母语静态粘附实验的需要将孔与教师的加成癌细胞之前单层（ 图1）适当的涂层。所有的后续步骤必须谨慎进行不破坏那层。当形成教师的足够层，则有望看到显著癌细胞粘附于母语， 如图2A和2C所示。这种效果是通过加入DNAse1的，这会降低母语如在图2B和2D看出废止。相反地，不应该有显著下降的A549粘附于母语的车辆控制（ 图3）的存在。以获得每高倍视野（HPF）的平均肿瘤细胞粘附的良好估计，建议进行计数，每孔至少4个随机HPFS。未很好涂在由于技术问题的教师字段不应被考虑为COUN婷它们可能会伪造结果。
图1. NET单层。涂以母语显示教师的（A）单层统一整个以及相对于井（B）不足涂料用网的中断层的96孔板井光显微镜图像。比例尺代表40微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. A549癌细胞粘附篮网体外 。（A）A549肿瘤细胞（箭头）坚持体外英语教师单层。 （B）Additi对DNAse1显著降低癌细胞的粘附的水平; （C）的前（C）和后（D）的加成DNAse1的显示了下下荧光显微镜（尼康TE300）荧光灯母语癌细胞的粘附的代表图像。比例尺代表40微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.结果体外粘附实验。格拉夫派得软件进行绘制和分析来自A549癌细胞粘附实验，以母语成绩。在DNA酶的存在下，密合性为13.90％，比未处理的母语。在车辆控制（VC）的存在下，密合性为77.26％，比未处理的母语。数据表示为平均值+/-SEM。意义是使用Kruskall Wallis检验与** P <0.001确定。
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Discussion
在这部影片中表现出的嗜中性粒细胞胞外陷阱隔离协议将在文献中用于中性粒细胞的分离和NET形成不同的技术。它简化了一个相当复杂而多变的过程，并提供了一个非常可靠的，可复制的方式来隔离纯化无细胞的教师比其他协议的步骤更少。此外，一应俱全试剂采用增加了协议的简单性和显著降低其成本。教师的朝向一个静态粘附试验中的应用用来表明由该隔离技术所提供的灵活性，因为净浓度可以很容易被操纵以适应特定目标（17）。因此，可以使用母语分离的展示技术各种类型的测定法，包括动态的附着力试验，迁移测定，增殖测定免疫荧光和共焦成像，电子显微镜，流式细胞仪，以及传统的Western印迹。 有许多在该协议，这对于其成功的关键步骤。首先，嗜中性粒细胞可被意外地隔离导致细胞凋亡的过程中被激活。因此重要的是要执行在无菌条件下的所有分离步骤通风柜下，避免管侵略性的混合，使所有样品的RBC裂解步骤之后冰，并避免长期的等待时间的步骤之间。其次，如果在测定的目的是涂覆井评估附着力的目的，它要尊重每孔所建议的NET浓度以及在“NET股票”建议的最终DNA浓度，因为这将确保一个更重要的是和一致的英语教师单层。低浓度可产生很好的唯一片状涂层，因此较不可靠的结果。最后，同样重要的是处理网单层非常仔细而执行检测，以防止其破坏。这可以通过调整来促进上的孔的侧面的吸入和吸移的强度。
这种技术的局限性包括一个事实，即，我们仍然需要显著量的时间，以产生母语，大多引起的4小时的PMA刺激步骤。此外，需要一个显著量的血液以分离所需的一个实验的中性粒细胞的数量充足。有肯定是一个显著量的教师在第一离心分离步骤的损失（步骤3.4）。嗜中性粒细胞丢弃时。修改，以尽量减少在这一点上的净亏损可能显著增加最终净收益。 24小时的隔离，这需要仔细的实验的规划和时间管理 - 而且，孤立的教师必须在12使用。
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Disclosures
作者什么都没有透露
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Wisent | 311-425-CL | |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent | 305-010-CL | |
| Dextran hydrochloride (powder) | Spectrum | DE130 | 6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | 3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum |
| BD Pharm Lyse Lysing buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Alrdrich | P8139 | |
| DNAse1 | Roche | 11284932001 | |
| F12 DMEM | Wisent | 319-075-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Integrid tissue culture dish with 20 mm grid (150 x 25 mm) | Falcon | 353025 |
References
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