Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Isolering af human lymfeendotelceller af Multi-parameter Fluorescens-aktiveret cellesortering

Published: May 1, 2015 doi: 10.3791/52691
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1,2,3, 1,2, 1,2,3
1Murdoch Childrens Research Institute, The Royal Children’s Hospital, 2Department of Paediatrics, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, The University of Melbourne, 3Department of Anatomy and Developmental Biology, Faculty of Medicine, Nursing and Health Sciences, Monash University, Clayton

Summary

Målet med denne protokol er at isolere lymfeendotelceller foring menneskelige lymfatisk misdannelse cyste-lignende fartøjer og Forhud anvender fluorescens-cellesortering (FACS). Efterfølgende celledyrkning og udvidelse af disse celler tillader et nyt niveau af eksperimentel raffinement for genetiske, proteomiske, funktionelle og celle differentiering undersøgelser.

Abstract

Lymfesystem såsom primær Lymphedema, lymfe misdannelser og lymfe tumorer er sjældne betingelser, der forårsager betydelig sygelighed, men lidt er kendt om deres biologi. Isolere meget rene humane lymfeendotelceller (LEC) fra sygt og sundt væv vil lette undersøgelser af lymfatisk endotel på genetiske, molekylære og cellulære niveauer. Det forventes, at disse undersøgelser kan afsløre mål for nye behandlingsformer, der kan ændre den kliniske behandling af disse tilstande. En protokol, der beskriver isolering af menneskelige forhud LEC og lymfe misdannelse lymfeendotelceller (LM LEC) præsenteres. Til opnåelse af en enkelt cellesuspension væv blev hakket og enzymatisk behandlet ved anvendelse af dispase II og collagenase II. Den resulterende enkelt cellesuspension blev derefter mærket med antistoffer mod klynge af differentiering (CD) markører CD34, CD31, karendotelvækstfaktor-3 (VEGFR-3) og PODOPLANIN. Stainerede levedygtige celler blev sorteret på en fluorescens-aktiveret cellesorterer (FACS) for at adskille CD34 Low CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos LM LEC befolkning fra andre endotel og ikke-endotelceller. De sorterede LM LEC blev dyrket og udvidet på fibronectincoatede kolber for yderligere eksperimenterende brug.

Introduction

En væsentlig funktion af det lymfatiske vaskulære system er at absorbere lymfe, et overskud interstitiel væske indeholdende lipider, proteiner og cellulære komponenter og udføre det til blodet venøse system. Et netværk af lymfe kapillærer dirigerer lymfe til lymfeknuderne, hvor det er screenet for tilstedeværelse af fremmede antigener, en vigtig proces i immun overvågning og implementering af hvide blodlegemer til at neutralisere fremmede antigener.

Uni-directional lymfesystemet starter i væv med den oprindelige lymfatisk kapillarrør, en unik struktur med diskontinuert enkelt lag af tyndvæggede flade endotelceller med specialiserede celle vejkryds, der tillader lymfeknuder post 1,2. Disse kapillærer er fastgjort til den tilstødende bindevæv matricen via forankring filamenter til forebyggelse fartøj sammenbrud i nærvær af øget interstitiel tryk 3. De indledende lymfe kapillærer tømmes i indsamling lymfe kapillærerat smelte sammen i større lymfekar eller vener. I sammenligning med indledende lymfatiske kapillærer, indsamling lymfekar har tykkere karvægge, parret lymfe ventiler og er omsluttet af en diskontinuerlig basalmembran, hvor et par glatte muskelceller er indlejret 4. Koordineret åbning og lukning af lymfatiske ventiler og sammentrækning af glatte muskelceller letter strømmen af lymfeknuder 3. Hos mennesker, de lymfatiske vener fra forskellige områder af kroppen slutte danner lymfe kufferter, der fusionerer for at danne to lymfegange: bryst ventilationskanal og retten lymfe kanal. Den thorakale kanal dræner lymfeknuder fra venstre side af kroppen og fra højre side under brystet mens højre lymfatiske kanal- afløb lymfeknuder fra højre arm og højre side af hovedet, hals og brystkasse. Begge kanaler gennemføre lymfeknuder i subclavia vener i nakken 5.

Lidelser i det lymfatiske system er stort set inddeles i erhvervet ennd medfødt (tabel 1). Eksempler på tilkøbte betingelser er lymphangitis og sekundær Lymphedema. Lymphangitis er en betændelse i en lymfekar grund af bakteriel infektion. De berørte lymfevejene spile og fyldes med eksudat indeholder polymorfonukleære celler. I hud, disse lymfekar er synlige som rød, smertefuld subkutan striber ofte ledsaget af udvidelsen af det tilhørende drænende lymfeknude (lymfadenitis) 6. Sekundær lymfeødem opstår som følge af beskadigelse eller obstruktion af lymfekar eller lymfeknude obstruktion. Dette fører til kronisk progressiv hævelse på grund af ophobning af lymfeknuder distalt for skade eller obstruktion. I de udviklede lande, er sekundær lymfeødem mest almindeligt tilknyttet malignitet hvor metastaserende tumorer hindrer lymfekar eller regionale lymfeknuder, eller som følge af anti-cancer behandling efter kirurgisk fjernelse af lymfeknuder, post-bestråling fibrose og post-inflammatorisk Thrombosis og ardannelse 7. I andre dele af verden, kan sekundær lymfeødem være sekundære til lymfatisk obstruktion forårsaget af parasitiske orme, såsom Wuchereria bancrofti 6.

Lidelser af lymfatisk karsystemet
Erhvervet Medfødt
Lymfadenitis
Sekundær Lymphedema 		Primær Lymphedema 10 Sporadiske lymfe Misdannelser 13 Lymfe Misdannelser associeret med syndromer 13
f.eks
Milroy Syndrome
Meige Syndrome 		Simple:
Lymfe misdannelser 		f.eks
Klippel-Tranaunay syndrom
Parker Weber syndrom
Sturge-Weber syndrom
Kombineret:
Kapillære-lymfe misdannelser
Kapillær-lymfe-venøs misdannelse
Kapillær-lymfe-arteriovenøs misdannelse
Kapillær-lymfatisk venøs-arteriovenøs misdannelse

Tabel 1. Oversigt over sygdomme i lymfe karsystem.

Medfødte lidelser i lymfesystemet indbefatter primær (idiopatisk) lymfeødem menes at være forårsaget af genetiske mutationer, lymphangiectasia og anomalier i lymfesystemet 8,9. Primær lymfeødem kan være sporadisk formodentlig forårsaget af de novo mutationer, eller arvet. Lymfesystem kan også være isoleret eller omfatte en del af en mere generel syndrom 10. I den pædiatriske befolkning, 97% af lymfeknuderødem er sporadisk med abnormaliteter i lymfekar struktur, der forringer den regionale lymfedrænage 11. Milroy sygdom er et eksempel på primær lymfeødem forårsaget af mutation i VEGFR-3-genet tydelig ved fødslen eller lige efter 12. Selvom det meste familiær tilstand, kan Milroy sygdom også identificeres hos spædbørn uden familie historie Milroy sygdom 32. Alvorligheden af eventuelle lymfeødem er afhængig af mængden af lymfeknuder produktion og evne til at transportere lymfeknuder tilbage til venøse cirkulation 6.

Baseret på klinisk præsentation og in situ endotelcelleproliferation, er uregelmæssigheder i lymfesystemet klassificeret som lymfatiske tumorer eller lymfatiske misdannelser 13. Kaposiform lymphangiomatosis er et eksempel på en LEC tumor 14. Lymfatiske misdannelser menes at opstå under fosterudviklingen og vokse i forhold til barnet 15,16. De sjældent relatere men kan remain asymptomatisk indtil traume eller infektion udfælder hurtig vækst fører til kliniske komplikationer. Velordnet struktur af lymfatisk netværk og ledning af lymfeknuder fra vævet til venøse cirkulation beskrevet ovenfor forstyrres i lymfatiske misdannelser, der består af lokaliserede samlinger af abnorme cystiske strukturer fyldt med lymfevæske. Mens der er ingen kliniske eller eksperimentelle beviser for, at disse cystiske fartøjer er forbundet til det lymfatiske cirkulation, eller at de indeholder funktionelle lymfe ventiler, deres lymfe identitet bekræftet ved ekspression af vifte af lymfatiske cellemarkører såsom PODOPLANIN, CD31, lymfatisk Vessel Endothelial Receptor 1 (LYVE-1), Prospero homeobox protein 1 (PROX-1) og VEGFR-3 15,17,18. Disse cystiske strukturer kan enten være små (microcystic) eller store (macrocystic), men de fleste lymfatiske misdannelser indeholder både microcystic og macrocystic komponenter (figur 1) 16. Efter operation, injektionsvæsken sclerotherapy og / eller radiofrekvens ablation de lymfatiske misdannelser ofte opstå igen.

Figur 1
Figur 1. Morfologi af humane lymfekar og lymfatiske misdannelser. Normalt humant lymfe (A) og lymfe misdannelser fartøjer (B og C) er mærket med antistof mod PODOPLANIN (brun etiket, pil). Humane lymfe misdannelser skibe er præget af markant dilatation og betydelig variation i lumen størrelse. Disse lokaliserede abnorme cystiske strukturer kan enten være små (microcystic, *) (B) eller store (macrocystic, #) (C). Mest lymfe misdannelser indeholder både microcystic og macrocystic komponenter. Klik her for at se en større version af figuren. </ P>

Nogle forskere har foreslået, at lymfatiske misdannelser repræsenterer en udviklingsforstyrrelse af lymfatisk vaskulatur, hvor LEC ikke har unormal vækstpotentiale, men i stedet har undladt at forbinde til normal brug 19. Vi har imidlertid fundet, at LM LEC prolifererer hurtigere og er mere resistente over for apoptose end forhuden LEC 15 tyder på, at der er en primær defekt i LM LEC. Når LM LEC implanteres i en mus xenograft model, danner de strukturer, der minder om lymfatiske misdannelser 15. Dette understøtter en hypotese om, at lymfatiske misdannelser kan være forårsaget af en eller flere somatiske mutationer opstår i LM LEC under fosterudviklingen. Faktisk har nylige rapporter identificeret en sådan mutation i p110α katalytiske underenhed af phosphoinositid-3-kinase (PIK3CA) gen 20.

I betragtning af de fremskridt inden for DNA-sekventering teknologi, relevante mutationer could være mere let identificeres i isolerede LM LEC, vejlede fremtidige studier af disse betingelser. Isolering af levedygtige LEC vil lette sammenligninger mellem abnorme og normale LEC i assays, såsom migration, spredning, rør danner evne og overlevelse som reaktion på reduceret tilgængelighed af næringsstoffer eller pro-apoptotiske agenter 15. Isolerede LEC vil yderligere gøre det muligt at udføre celle-specifikke genekspression og proteomiske undersøgelser, at afgrænse nye LEC subpopulationer og opdage nye farmakologiske midler, der er egnede til klinisk håndtering af lymfatiske misdannelser.

Vi har tidligere udgivet en LEC isolation metode baseret på magnetisk perle adskillelse af LEC fra neonatal forhud og lymfe misdannelser 15. Vi rapporteret en strategi for at adskille normale og syge LEC fra vaskulære endotelceller baseret på fravær af CD34-ekspression, efterfulgt ved at udsætte CD34 Neg fraktion celle til positiv selektion for CD31.Imidlertid blev denne metode hæmmet af tilstedeværelsen af ​​resterende ikke-endotelceller. Dette var uafhængigt af fjerne epidermis inden efterfølgende bindevæv fordøjelse. Disse forureninger generelt spredt hurtigere og dermed i sidste ende overgrew de endotel cellekulturer trods efterfølgende forsøg på at gentage LEC isolation. Faktisk en indledende forurening af ikke-endotelceller så lave som 2% til 5% var tilstrækkelig til at overvælde LEC befolkning 15. Det fik os til at udforske fluorescens cellesortering metode som en mulighed for at forbedre LEC celle udbytte og renhed. Derudover brugte vi flere parameter sortering at øge specificiteten af de LEC befolkninger, tilføjer VEGFR-3 og PODOPLANIN til udvælgelse markører til at identificere CD34 Low CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos LEC.

Begrundelsen for at vælge disse markører var baseret på de rapporter, mens LEC og blod vaskulær endotel ceLLS have mange celleoverflademarkører fælles såsom CD31, LEC viser fænotypisk variation i deres ekspression af CD34, PODOPLANIN og VEGFR-3 celleoverflademarkør sammenlignet med blod vaskulære endotelceller 21-23. CD31 er et 130 kDa transmembrant glycoprotein også kendt som blodplade endotelial celleadhæsion molekyle 1 (PECAM-1). Det anses for at være en pan-endotelcelle-pen, der er udtrykt på alle typer af blod- og lymfekar 21,24,25. CD34 er 110 kDa transmembrane glycoprotein stede på de fleste hæmatopoietiske og stamceller, vaskulære endothelceller og nogle lymfekar 26.

VEGFR-3, receptoren for vaskulær endothelial vækstfaktorer C og D, er oprindeligt til stede på udviklingslandene vener i muse embryo, men efter lymfe specifikation reguleret af transkriptionsfaktorer SRY-beslægtet HMG-box (SOX) -18, c Hicken o valbumin u pstream p romoter t ranscription f skuespiller 2 (COUPTF-II) og PROX-1 er VEGFR-3 venøs udtryk tabt, og det bliver begrænset til embryonale LEC 25,27. PODOPLANIN, en 38 kDa-membran bemærkes mucoprotein, først på lymfekar ved ca. embryonale dag 11 (~ E11.0) af mus fosterudvikling 28 og mens det er stærkt udtrykt af mikrovaskulære lymfekar, PODOPLANIN udtryk ved macrocystic lymfatisk endotel i lymfe misdannelser er mere variabel 15. Flowcytometri forsøg antyder, at i det mindste nogle CD34 High CD31 Pos endotelceller udtrykker det lymfatiske markør PODOPLANIN 29. Selv om systematisk vurdering af LYVE-1 og PODOPLANIN farvning i humane lymfatiske misdannelser viste, at både er effektive til farvning lymfatisk endotel misdannelse 30, i normale væv, LYVE-1 blev rapporteret at være stærkt til stede i den oprindelige lymfekapillærendotelet men reduceres og endog fraværende i indsamling lymfatisk endotel 31. Da vores mål er at isolere både de indledende og indsamling lymfeendotelceller vi har valgt ikke at bruge LYVE-1 som en del af vores udvalg celle strategi. Endelig blev beslutningen om at ansætte disse markører også baseret på tilgængeligheden af ​​antistoffer, der bruges diagnostisk til mærkning lymfekar til mikroskopisk billeddannelse, en funktion, der gør det muligt sammenhæng mellem flowcytometri og immunfluorescerende studier.

Denne artikel vil beskrive vævet fordøjelsesmetode, cellefarvning og FACS indstillinger, der kræves for en vellykket isolering af CD34 Low CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos LEC samt CD34 High CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos endotelceller fra forhud og lymfe misdannelser væv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik erklæring: Etisk godkendelse til indsamling af lymfe misdannelser og forhud væv blev opnået fra Human Research etiske komitéer på Royal Børnehospital, Melbourne, Australien. Signeret samtykke blev modtaget fra patienters forældre før operation. Vævsprøver blev indsamlet fra patienter diagnosticeret med LMS gennemgår kirurgiske procedurer som led i deres kliniske behandling og patienter, der gennemgår elektiv omskæring. Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra National Health og Medical Research Council, Australien.

1. Fremstilling af cellesuspension fra Foreskin og lymfatisk Misdannelser væv

  1. Buffere og medier Forberedelse.
    1. Forberede komplet endotelcelle medier ved anvendelse af kommercielt tilgængelige EGM-2 MV Bullet Kit ved opvarmning EGM-2-medier og forsigtigt optøning kitkomponenter i 37 ° C vandbad. I klasse II biosikkerhed kabinet, aseptisktilføje hver komponent til EGM-2 medier. Når alle komponenter tilsættes til medierne, se dette medie som "komplet endothelcelle medier«. Brug steril 50 ml pipette til at blande indholdet før brug.
      BEMÆRK: Alle trin vedrørende cellekultur er udført i et klasse II biohazard kabinet. Alle opløsninger opbevares ved 4 ° C efter fabrikantens anvisninger og er opvarmet til stuetemperatur før brug. De fuldstændige endotheliale celle medier, cellekultur buffere og enzymløsninger opvarmes ved 37 ° C i 20 minutter før brug.
    2. Supplement komplet endothelcelle medier med 50 ng / ml VEGF-C. Alikvot den supplerede endothelcelle medier i 50 ml sterile rør og opbevares ved 4 ° C indtil brug. Medierne er stabil i mindst 4 uger ved opbevaring ved 4 ° C.
    3. Forberede calcium og magnesium fri phosphatbufret saltvand (PBS) ved at opløse 8,752 g NaCl, 1,416 g Na 2 HPO 4 .2H 2 O og0,395 g KH 2 PO 4 i 1.000 ml vand. Indstil pH til 7,4. Filtersteriliser PBS under anvendelse af 0,22 um filter og opbevares ved 4 ° C. Før brug tilføje antibiotika / antimykotisk opløsning (bruges ved 1: 100).
    4. For at fremstille human fibronectin, opløses 1 mg fibronectin i 10 ml sterilt vand. Store rekonstituerede opløsning i 100 alikvoter pi ved -20 ° C. På dagen for brug tilsættes 10 ml sterilt PBS til 100 pi fibronectin portion (for at give en endelig arbejdskoncentration på 10 ug / ml).
    5. For enzymet medier, fremstilles en opløsning indeholdende 0,04% Dispase II, 0,25% collagenase II og 0,01% DNase I i sterilt PBS. Først vejes dispase og collagenase, sted i et sterilt 50 ml rør, tilsættes den nødvendige mængde PBS og inkuberes i 30 minutter under omrystning ved 37 ° C til opløsning. Når opløst, filter sterilisere (0,22 um filter) dispase / collagenaseopløsning i biosikkerhed hætte. Tilsættes aseptisk DNase I. Store den enzymatiske opløsning ved 37 ° C, indtilbruge.
      BEMÆRK: DNase I er en kommerciel cellekultur kvalitet reagens fås som sterilt frysetørret pulver.

2. Forberedelse af cellesuspension fra forhud og lymfe Misdannelser

  1. Et 50 ml rør indeholdende 10 ml DMEM / 2% antibiotikum antimykotisk opløsning vejes. Dette rør vil blive anvendt til væv samling.
  2. Efter kirurgisk fjernelse af lymfatisk misdannelser og forhud væv, tilsættes aseptisk vævsprøven til røret og overførsel på is til cellekulturen laboratorium.
  3. Røret med vævet veje og beregne vævsvægt. Bruge denne vægt til at beregne volumenet af enzymatisk opløsning nødvendig for at fordøje vævet.
  4. I en klasse II biosikkerhed kabinet, brug steril pincet til at overføre vævet og medier i en 100 mm vævskulturskål. Brug sterile sakse til fint hakke vævet i ~ 1 mm 3 stykker.
  5. Overførsel hakket væv blandet med medierne into et 50 ml rør indeholdende yderligere 10 ml sterilt DMEM / 2% antibiotikum antimykotisk opløsning. Bland ved at vende til at re-suspendere vævet. Centrifugeres prøven ved 300 x g i 5 min.
  6. Fjern supernatanten. Baseret på væv vægt, tilsættes 1 ml forvarmet (37 ° C) collagenase II / DNase I / Dispase II fordøjelse opløsning pr 100 mg af hakket væv. Generelt anvendes 10 ml enzymopløsning til ca. 1 g hakket væv.
  7. Inkubere vævet i et 37 ° C inkubator i 20-90 minutter under konstant omrystning ved 200 rpm. Ved slutningen af ​​denne periode for at næsten alle væv fordøjes i fine fragmenter.
    BEMÆRK: Udsættelse af cellerne til kollagenase og dispase ved isolation fra det primære væv påvirkninger celleoverlevelse. Vi har fundet empirisk, at de fleste neonatale forhud prøver optimalt kræver 20-30 min med fordøjelsen, mens fibrotiske lymfe misdannelser prøver kan kræve 60-90 minutter med fordøjelsen. LM LEC udbyttes er påvirket af mængden af ​​fibrose stede, mere fibrøst væv gav færre celler, muligvis på grund af skadelige virkninger af langvarig udsættelse for collagenase II og dispase II.
  8. Efter fordøjelse, overføre røret til biosikkerhed kabinet og passere den fordøjede væv løsning gennem en 70 um si placeret i et sterilt 50 ml rør. Under anvendelse af 3 ml sprøjte stempel med gummistempel, slibe ned resterende væv indtil kun små spor af ekstracellulære matrix overholdes.
  9. Vask cellefilter med et volumen endotelcelle medium ækvivalent til volumenet af dissocierende enzym til at retablere celler fastbrændte at sigte og at inaktivere enzymerne. For eksempel til 2 ml af dissociering enzym medium til at fordøje det hakkede væv, der tilsættes 2 ml endotelcelle medium for at inaktivere enzymerne.
  10. Centrifuger cellen opløsning ved 300 xg i 5 minutter og aspireres supernatanten. R> e-suspendere cellerne i 10 ml PBS. Centrifuger cellerne ved 300 xgi 5 minutter, supernatanten fjernes derefter gentage celle vask to gange. > Resuspender cellepelleten i 20 ml endotelcelle medium. Tæl celler under anvendelse af trypanblåt derefter frø 2 x 10> 6 celler i 150 cm> 2 kolbe pre-coatet med fibronectin i et endeligt volumen på 20 ml endotelcelle medium. Dyrkning ved 37 ° C i en 5% CO> 2 i befugtet luft-inkubator.>
    BEMÆRK: Det forventes, at 75% -90% af kerneholdige celler overlever vævsfordøjelse som estimeret ved trypan blå eksklusion. Den initiale celletal afspejler alle kerneholdige celler i cellesuspensionen (dvs. keratinocytter, leukocytter, makrofager, bindevævsceller og blodkarceller). Celletallet på 5-7 dage afspejler celler, der har knyttet, overlevet og prolifererede under cellekultur. Overtrækning vævskulturkolber med fibronectin forbedrer også efterfølgende LEC og LM LEC overlevelse.
  11. Efter inkubation natten over, vaskes væk ubundne celler i tre vaske med PBS / 1% antibiotika-antimykotisk løsning og tilsæt frisk endothelcelle medium. Udføre tre vaske til effektivt at fjerne ubundne celler og røde blodlegemer til stede i kolben. Skift medier hver anden dag. Celler vil være ~ 80% sammenflydende efter 5-7 dage.

3. Antistof Farvning af celler til lymfatisk endotelcelleoverfladen Markers til flowcytometri

  1. Efter at cellerne har nået 80% konfluens, aspireres medium og skyl celler med PBS.
  2. Frigør adhærente celler ved at inkubere cellerne med 7 ml Cellefrigørelse opløsning såsom Accutase pr 150 cm2 kolbe i 5-7 min ved 37 ° C.
  3. Harvest fritliggende celler, inaktivere Cellefrigørelse opløsning ved tilsætning af 3 rumfang endotelcelle medium og overføre cellesuspensionen til et nyt sterilt rør.
  4. Centrifuger cellerne ved 300 x g i 5 min.
  5. Aspirer supernatanten og resuspender cellerne i 5 ml PBS. Centrifuger cellerne ved 300 xg i 5 min, fjerne supernatant derefter gentage celle vask. Genopslæmmes cellerne i 5 ml PBS.
  6. Tæl antallet af levedygtige celler. Bland 10 pi cellesuspension med 90 pi 0,4% trypanblåt. Transfer 10 pi af denne suspension til hæmocytometer til tælling.
    BEMÆRK: Det endelige celleudbytte vil afhænge af prøvens størrelse behandlet. Den sædvanlige celle udbytte pr 150 cm2 kolbe varierer fra 7 x 10 5-1,2 x 10 6 af levedygtige celler.
  7. Forbered antistof-opløsninger til cellefarvning.
    BEMÆRK: Følgende fortyndinger blev titreret til farvning 1 x 10 6 i en farvning volumen på 100 pi.
    1. Fortynd PE konjugeret muse anti human VEGFR-3 (1:50); PE-Cy7 konjugeret muse anti human konjugeret CD34 (1: 200); APC-konjugeret muse anti human CD31 (1: 100) og Alexa 488-konjugeret rotte-anti human PODOPLANIN (1: 200) i samlet volumen på 100 pi sterilt 5% FBS / PBS opløsning pr vævsprøve. Efter fremstilling afantistofopløsning, holder på is indtil brug. På lignende måde fremstilles fortyndede antistof blanding isotypekontrol at lette indstilling af flowcytometri porte.
  8. For at reducere ikke-specifik binding af antistofferne, centrifuge cellerne ved 300 x g i 2 minutter, fjern supernatanten derefter suspendere cellerne i 100 pi sterilt 5% FBS / PBS-opløsning pr prøve, der skal farves. Cellerne inkuberes på is i 20 minutter ved 4 ° C.
  9. Centrifuger cellerne ved 300 xg i 5 min, fjern supernatanten derefter re-suspendere celler i konjugerede antistof cocktail. Også farve et mindre alikvot af celler (1 x 10 5) i 100 pi isotypekontrolantistof blanding. Cellerne inkuberes på is i 20 minutter.
  10. For at fjerne ubundet antistof, tilsættes 2 ml 2% FBS / PBS-opløsning og centrifuger cellerne ved 300 xg i 5 min. Aspirere supernatanten og gentag vask.
  11. Resuspender cellepelleten for isotypekontrol og antistoffet farvede prøve, der skal sorteres i 300 pi 0,5 mg / ml propidium ioDide / 2% FBS / PBS-opløsning. Rørene anbringes på is indtil sortering.

4. Cell Sortering

  1. Brug følgende materialer til at oprette instrumentet; alignment perler såsom kommercielt tilgængelige fluorescerende partikler, phosphatpufret saltopløsning baseret sheathvæske og drop forsinkelse perler, såsom Accudrop fluorescerende perler.
  2. Isolere de oprensede humane LEC på en multi-parameter fluorescensaktiveret cellesortering instrument. Opstil instrumentet og tilpasse som pr fabrikantens anbefalinger. Desuden køre enkelt kontrol pletten kompensation med hver slags til at generere kompensation matrix og således eliminere væsentlig bløder gennem af emissionen af ​​fluorokromer såsom PE ind i PE-Cy-kanal.
    BEMÆRK: En højere andel af FACS sorterede celler overlever isoleringen hvis en 100 um dyse anvendes, og cellerne sorteres i endotelcelle medium.

5. Cell Culture Indlæg FACS SortING

  1. Efter sortering, centrifugeres celler ved 300 xg i 5 min. Aspirere supernatanten og resuspender cellerne i 5-10 ml medium (afhængigt af kolben anvendes til podning cellen). Hvis mindre end 50.000 celler sorteres, dyrkes cellerne i fibronectin overtrukket 25 cm2 kolbe.
  2. Ellers cellerne i 75 cm2 fibronectin-coatede kolbe ved 37 ° C i en 5% CO2, luft fugtig inkubator kultur. Skift medier efter 2 dage.
    BEMÆRK: Cell medier ændres hver anden dag, fordi forlænge tiden mellem medieændringer synes at begunstige overlevelse af de ikke-endotelceller. Vi validerer det lymfatiske endotel cellefænotype hjælp immunhistokemisk detektion af markører: PROX-1, VEGFR-3, Podoplanin, CD34 og CD31, når cellerne er første split for yderligere ekspansion 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter den indledende vævsfordøjelse, efter 24 timer i kultur af ufraktionerede prøver, distinkte endotheliale cellekolonier kan observeres (figur 2A) sammen med fibroblastlignende celler og glatte muskelceller. Efter sortering og efter 24 timer i cellekultur, CD34 lav CD31 Pos VEGFR-3 Pos Podoplanin Pos celler vedhæfte og vise typiske brosten morfologi (figur 2B og C). Ved anvendelse af FACS fremgangsmåde beskrevet ovenfor, er vi i stand til at oprense celler op til 99,8% renhed og skelne dem fra CD34 High CD31 Pos VEGFR-3 Pos Podoplanin Pos endotelceller. Repræsentative resultater af gating strategi og sortering er vist i figur 3. Dette har løst de problemer opleves, når der anvendes magnetisk-perle isoleringsmetode. Til dato har vi passeret disse celler op til passage 13. Efter denne passage, LM LEC og forhuden LECs begynder at senescens ledsaget af morfologiske ændringer og reduceret celledeling.

Figur 2
Figur 2. forhud LEC og LM-LEC. Fireogtyve timer efter enzymatisk fordøjelse, usorterede celler indeholder både endotel (pil) og ikke-endotelceller (A). Efter CD34 Lav CD31 Pos VEGFR-3 Pos Podoplanin Pos FACS celleisolering, forhuden LEC (B) og LM-LEC (C) er blottet for ikke-endotelceller og vedligeholde brosten morfologi. Klik her for at se en større version af figuren .

Figur 3
Figur 3. Fluorescens-aktiveret cellesortering gating strategier for celle sortering af vaskulære og lymfatiske endotelcelles. (A) Levende celler først gatet på CD34 og CD31-ekspression, efterfulgt af VEGFR-3 og PODOPLANIN gating at sortere vaskulær (B) og lymfatiske endotel (C) celler hhv. (D) Re-analyse af sorteres CD34 High CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos celler viser> 98% vaskulær endotel celle fænotype. (E) LEC celler sorteret på CD34 Low CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos fænotype er også> 98% ren. Klik her for at se en større version af figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LEC spiller en vigtig rolle i at opretholde væske homeostase, immunrespons på fremmede antigener og absorption og transport af visse næringsstoffer. LEC homeostase kan påvirkes af sygdomsprocesser, såsom bakterielle infektioner og tumormetastase, men LEC kan også udvikle somatiske mutationer, der resulterer i dannelsen af ​​dysfunktionelle lymfekar og betydelig sygelighed for de ramte patienter. For at få mere forståelse af lymfatisk misdannelser ætiologi gennem in vivo implantation og ex vivo eksperimenter, og opdage nye behandlingsmuligheder, vi først udviklet en LEC isolation metode baseret på magnetisk perle valg strategi ved hjælp af CD34 Neg CD31 Pos valg strategi 15. Men de resulterende kulturer ofte indeholdt andre end endotelceller, der var vanskelige at fjerne celler. Efterfølgende blev den metode raffineres ved hjælp af FACS for at sortere LEC, der udtrykker CD34 Low CD31 Pos VEGR3 POS PODOPLANIN Pos fænotype. Denne tilgang resulterede i relativt homogene LEC kulturer indeholder <0,5% af ikke- CD34 Low CD31 Pos VEGR3 Pos PODOPLANIN Pos celler på post-sortering check. I praksis er fordelen ved sortering celler ved FACS, er, at reduktionen af ​​ikke- LEC tilstedeværelse til <0,5%. Dyrkede LEC og LM LEC har en typisk brosten morfologi og blive senescent omkring passage 13.

I denne undersøgelse har vi beskrevet en flowcytometri baseret protokol til isolering og dyrkning af højt beriget LEC fra normale og unormale væv baseret på deres udtryk for en suite af celleoverflademarkører (CD34 Low CD31 Pos VEGR3 Pos PODOPLANIN Pos). Celler blev sorteret fra primære væv efter 5-7 dages in vitro-udvidelse, et skridt, der resulterede i betydelig berigelse af LEC forhold til hyppigheden i væv på tidspunktet for isolation. Under surgery vi får væv spænder fra flere mikrogram til et tocifret antal gram i vægt. Dette væv kan variere meget i sin sammensætning med hensyn til mængden af ​​lymfatisk misdannelser fartøjer til stede, væv ardannelse og tilstedeværelse af lymfatisk misdannelser cyste tromber. Alle disse komponenter vil påvirke, hvor mange celler kan isoleres fra det syge væv. Derfor udgangs celletallet kan variere fra nogle få tusinde celler til flere millioner celler. Ligeledes vil dette påvirke sammensætningen af ​​cellesuspensionen og start celleantal betyder, at antallet af sorterede celler også vil adskille sig fra den ene prøve til den anden.

Hyppigheden af ​​LEC i usorterede forhud prøver efter 5-7 dage i kultur varierer fra 0,52% til 4,7%, mens LM LEC spænder fra 0,8% til 12,43%. LEC kulturer omfattede> 99% CD34 Low CD31 Pos VEGR3 Pos PODOPLANIN Pos celler efter post-sortering re-analyse og opretholdt en typisk cobblestone morfologi i kultur indtil degeneration ved passage ~ 13 uden overvækst af ikke-endotel elementer.

Det er nødvendigt at udvide celler ex vivo efter indledende vævsfordøjelse og sortering fordi udbyttet af enten forhud eller lymfatiske misdannelser celler er generelt lav. Således forudgående udvidelse af lymfatiske endotelceller i n vitro tillader genereringen af ~ 2x10 6 celler, der er nødvendige til at pode en mus kammer. Dette kræver en in vitro ekspansion fase af 5-7 dage. Mens vi accepterer, at cellekultur kan inducere fænotypiske ændringer i de primære celler har vi vist, at disse dyrkede celler bevarer deres evne til at danne lymfatiske misdannelse-lignende strukturer i en mus xenograftmodel 15.

Der er flere kritiske trin i protokollen, der bestemmer graden af ​​succes ved sortering celler ved FACS. Det mest kritiske trin er tidspunktet for eksponering af cellerne for collagenaseog dispase under isolering fra de primære væv som beskrevet i trin 2.7. Dette er ikke kun påvirkes af mængden og typen af ​​væv til stede, men også af den batch af anvendte enzymer. Desuden fluorescensmærkede antistoffer anvendt til at karakterisere cellepopulationer skal titreres og fortrinsvis monoklonale. Vi testede flere forskellige celle udstationeringsprocedurer løsninger såsom trypsin / EDTA, EDTA, TrypLE Vælg og celle detachement løsning. Vi fandt, at EDTA skulle anvendes i en længere periode for at frigøre celler og resterende celleklumper ofte forblev. I modsætning hertil blev der enkeltcelle-suspensioner genereres inden for 3-5 minutters inkubation i trypsin / EDTA, celle løsrivelse løsning og TrypLE Vælg. Vi fandt ingen væsentlig forskel i ekspressionen af ​​CD31, CD34, Podoplanin og VEGFR-3 efter behandling med nogen af ​​enzymopløsningerne. Enkelt farvede prøver bør også gøres med hver sortering eksperiment for at sikre, at fluorokrom emissionsspektrene ikke overlapper hinanden, ogderfor giver forkerte aflæsninger. Disse kritiske trin udgør også trin, hvor ændringer af celle-protokollen kan blive nødvendige eller fejlfinding under flowcytometri sortering.

Sammenlignet med vores tidligere offentliggjorte magnetiske perler isolering af LEC 15, fordelen ved isolering LEC ved FACS omfatter følgende: hurtigere isolering af celler med høj renhed og identifikation af diskrete celleundergrupper og sjældne populationer inden en heterogen prøve. De store begrænsninger FACS-baserede LEC og LM LEC isolation drejer sig om at begrænset antal celler til rådighed for validering efter celle sortering resultater. Hertil kommer, mens ethvert forsøg er lavet til at standardisere vores analyser og instrument set-up, de samme parametre kan ikke nødvendigvis kunne reproduceres i andre laboratorier. Derfor kan nogle variation i resultaterne forekomme. Desuden et af de spørgsmål, som lymfe biologer står er fraværet af celle specifikke markørerder ville skelne mellem indledende kapillær LEC markører og indsamle kapillære LEC markører. På dette stadium, har vi endnu ikke identificeret LEC markører, der ville skelne mellem raske LEC og LM LEC. Da lymfatisk misdannelse væv indeholder også normalt udseende lymfekar (figur 1A), vil den resulterende CD34 Low CD31 Pos VEGR3 Pos PODOPLANIN Pos indeholde en andel af normale LEC såvel som dem af den syge fænotype. Fremtidige undersøgelser undersøger LEC og LM LEC genekspression og proteomforskning kan være i stand til at lede os i retning af mere specifikke LM LEC markører, der kunne skelne LM LEC fra LEC i samme væv.

I fremtiden forventer vi at udnytte FACS, og disse nye LEC markører i forsøg på at identificere sjældne delmængder af LEC befolkninger både forhud og lymfesystemet misdannelser. Dette ville gøre det muligt at isolere disse cellepopulationer og studere deres rolle i udviklingen af ​​lymphatic karsystemet og lymfatiske misdannelser.

Isolerende LEC og LM LEC baseret på CD34 lav CD31 Pos VEGR3 Pos PODOPLANIN Pos reducerede signifikant forurening ikke-endotelcelle. Endvidere FACS-teknologi giver os mulighed for at adskille LEC i subtyper baseret på ekspressionen af ​​CD31, PODOPLANIN og VEGFR-3 celleoverflademarkører og at forstå dette i forbindelse med cellelinie udvikling. For syge LEC, dette giver mulighed for celle-specifikke undersøgelser, der vil kaste yderligere lys på gener forårsager LEC sygdomme og LEC kapacitet til at reagere på forskellige celle stimuli in vitro og in dyr xenograftmodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende Baker Foundation og Royal Børns Foundation 'Women in Science Fellowship' støtte til Zerina Lokmic. Andrew G. Elefanty og Edouard G. Stanley er NHMRC Senior Research Fellows. Arbejde i deres laboratorier blev støttet af NHMRC og Stamceller Australien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies (Gibco) 11965-092 Used to collect tissue samples from the operating theatre.
EGM-2 MV Bullet Kit Lonza CC-3202 EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid.
VEGF-C R&D Systems 2179-VC-025 Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/ml VEGF-C
Antibiotic-antimycotic solution (100x) Life Technologies (Gibco) 15240-062 This solution contains 10,000 U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution.
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F2006 Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 °C and maintained sterile. Use 7 ml to coat 150 cm2 flask.
StemPro Accutase Cell dissociation reagent Life Technologies (Gibco) A11105-01 StemPro®Accutase® is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment.
0.4% Trypan Blue dye Life Technologies (Gibco) 15250-061 Used as a viability stain.
Dispase II Roche Applied Biosciences 4942078001 Used at 0.04%
Collagenase II Worthington Lab 4176 Used at 0.25%
DNase I Roche Applied Biosciences 11284932001 Used at 0.01%
70 mm nylon cell strainers BD Falcon 352350
Name Company Catalog Number Comments
PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59 BioLegend 356204 Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581 BioLegend 343516 Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59 BioLegend 303116, Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated rat anti human Podoplanin, clone NC-80. BioLegend 337006 Used at 1:200 dilution
PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400112 Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400126 Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400120 Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758 BioLegend 400525 Used at 1:200 dilution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baluk, P., et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. J Exp Med. 204 (10), 2349-2362 (2007).
  2. Yao, L. C., Baluk, P., Srinivasan, R. S., Oliver, G., McDonald, D. M. Plasticity of button-like junctions in the endothelium of airway lymphatics in development and inflammation. Am J Pathol. 180 (6), 2561-2575 (2012).
  3. Zawieja, D. C. Contractile physiology of lymphatics. Lymphat Res Biol. 7 (2), 87-96 (2009).
  4. Witte, M. H., et al. Structure function relationships in the lymphatic system and implications for cancer biology. Cancer Metastasis Rev. 25 (2), 159-184 (2006).
  5. Andrade, M., Jacomo, A. Anatomy of the human lymphatic system. Cancer Treat Res. 135, 55-77 (2007).
  6. Kumar, V., Abbas, A. K., Aster, J. C., Ch Fausto, N. Cotran Pathologic Basis of Disease. 43-78. 2, Elsevier Saunders. Robbins. (2009).
  7. Shayan, R., Achen, M. G., Stacker, S. A. Lymphatic vessels in cancer metastasis: bridging the gaps. Carcinogenesis. 27 (9), 1729-1738 (2006).
  8. Mulliken & Young's Vascular Anomalies Hemangiomas and. , University Press. Oxford. 1059-1076 (2013).
  9. Mulliken & Young's Vascular Anomalies Hemangiomas. 14, University Press. Oxford. 562-594 (2013).
  10. Bellini, C., Hennekam, R. C. Clinical disorders of primary malfunctioning of the lymphatic system. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 187-204 (2014).
  11. Schook, C. C., et al. Primary lymphedema: clinical features and management in 138 pediatric patients. Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2419-2431 (2011).
  12. Brouillard, P., Boon, L., Vikkula, M. Genetics of lymphatic anomalies. J Clin Invest. 124 (3), 898-904 (2014).
  13. for the Study of Vascular Anomalies (ISSVA) classification. Available from: http://www.issva.org/classification.com. , (2014).
  14. Croteau, S. E., et al. Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly. J Pediatr. 164 (2), 383-388 (2014).
  15. Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic malformation endothelial cells, their in vitro characterization and in vivo survival in a mouse xenograft model. Angiogenesis. 17 (1), 1-15 (2014).
  16. Smith, R. J. Lymphatic malformations. Lymphat Res Biol. 2 (1), 25-31 (2004).
  17. Chen, E. Y., et al. Similar histologic features and immunohistochemical staining in microcystic and macrocystic lymphatic malformations. Lymphat Res Biol. 7 (2), 75-80 (2009).
  18. Norgall, S., et al. Elevated expression of VEGFR-3 in lymphatic endothelial cells from lymphangiomas. BMC cancer. 7 (2), 75-80 (2007).
  19. Garzon, M. C., Huang, J. T., Enjolras, O., Frieden, I. J. Vascular malformations. Part I. J Am Acad Dermatol. 56 (3), 353-370 (2007).
  20. Osborn, A., Dickie, P., Adams, D., Dickie, B. 20th International workshop on Vascular Anomalies. ISSVA. , Melbourne, Australia. (2014).
  21. Baluk, P., McDonald, D. M. Markers for microscopic imaging of lymphangiogenesis and angiogenesis. Ann N Y Acad Sci. 1131, 1-12 (2008).
  22. Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Engineering the microcirculation. Tissue engineering. Part B, Reviews. 14 (1), 87-103 (2008).
  23. Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Visualisation and stereological assessment of blood and lymphatic vessels. Histol Histopathol. 26 (6), 781-796 (2011).
  24. Hagerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. EMBO J. 32 (5), 629-644 (2013).
  25. Pollmann, C., Hagerling, R., Kiefer, F. Visualization of lymphatic vessel development, growth, and function. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 167-186 (2014).
  26. Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).
  27. Kaipainen, A., et al. Expression of the fms-like tyrosine kinase 4 gene becomes restricted to lymphatic endothelium during development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3566-3570 (1995).
  28. Schacht, V., et al. T1alpha/podoplanin deficiency disrupts normal lymphatic vasculature formation and causes lymphedema. EMBO J. 22 (14), 3546-3556 (2003).
  29. Kriehuber, E., et al. Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages. J Exp Med. 194 (6), 797-808 (2001).
  30. Florez-Vargas, A., et al. Comparative analysis of D2-40 and LYVE-1 immunostaiing in lymphatic malformations. Lymphology. 41 (3), 103-110 (2008).
  31. Makinen, T., et al. PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature. Genes Dev. 19 (3), 397-410 (2005).
  32. Connell, F. C., et al. Analysis of coding regions of VEGFR3 and VEGFRC in Milroy disese and other primary lymphoedemas. Hum Genet. 124 (6), 625-631 (2009).

Tags

Medicin , flowcytometrisk sortering, celleoverflademarkører
Isolering af human lymfeendotelceller af Multi-parameter Fluorescens-aktiveret cellesortering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lokmic, Z., Ng, E. S., Burton, M.,… More

Lokmic, Z., Ng, E. S., Burton, M., Stanley, E. G., Penington, A. J., Elefanty, A. G. Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting. J. Vis. Exp. (99), e52691, doi:10.3791/52691 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter