Summary
Het doel van dit protocol is om lymfatische endotheelcellen voering de menselijke lymfatische misvorming cyste-achtige schepen en voorhuiden met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) te isoleren. Latere cel kweken en uitbreiding van deze cellen maakt een nieuw niveau van experimentele verfijning voor genetische, proteomics, functioneel en celdifferentiatie studies.
Abstract
Lymfestelsel aandoeningen zoals primaire lymfoedeem, lymfatische misvormingen en lymfatische tumoren zijn zeldzame omstandigheden die aanzienlijke morbiditeit veroorzaken, maar er is weinig bekend over hun biologie. Het isoleren van zeer zuiver menselijke lymfatische endotheelcellen (LEC's) van zieke en gezonde weefsel zou studies van het lymfatische endotheel bij genetische, moleculaire en cellulaire niveau te vergemakkelijken. Verwacht wordt dat deze onderzoeken targets kunnen openbaren nieuwe therapieën die de klinische behandeling van deze aandoeningen kunnen veranderen. Een protocol beschrijft de isolatie van menselijke voorhuid LEC's en lymfatische misvorming lymfatische endotheelcellen (LM LEC's) wordt gepresenteerd. Voor het verkrijgen van een enkele celsuspensie weefsel werd fijngehakt en enzymatisch behandeld met collagenase en dispase II II. De resulterende celsuspensie werd vervolgens gemerkt met antilichamen tegen cluster van differentiatie (CD) markers CD34, CD31, vasculaire endotheliale groeifactor-3 (VEGFR-3) en podoplanin. Stained levensvatbare cellen werden gesorteerd op een fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) om de CD34 Low CD31 pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos LM LEC populatie gescheiden van andere endotheliale en niet- endotheelcellen. De gesorteerde LM LEC's werden gekweekt en uitgebreid on-fibronectine gecoate flessen voor verdere experimenteel gebruik.
Introduction
Een belangrijke functie van het lymfatische vasculaire systeem te lymfe, een teveel interstitiële vloeistof bevattende lipiden, eiwitten en cellulaire bestanddelen te absorberen en dirigeren het bloed veneuze systeem. Een netwerk van lymfatische haarvaten leidt lymfe naar de lymfeknopen waar het wordt gescreend op de aanwezigheid van vreemde antigenen, een belangrijk proces in immune surveillance en invoering van witte bloedcellen om vreemde antigenen te neutraliseren.
De unidirectionele lymfatisch systeem start in weefsels, waarbij de initiële lymfatische capillair, een unieke structuur en discontinu enkele laag dunwandige vlakke endotheelcellen met gespecialiseerde cel contacten die lymfe ingang 1,2 toe. Deze haarvaten worden via verankering filamenten om vat ineenstorting in aanwezigheid van verhoogde interstitiële druk 3 voorkomen dat de omliggende bindweefsel matrix bevestigd. De initiële lymfatische haarvaten leeg in het verzamelen van lymfatische haarvatendie samenvloeien tot grotere lymfevaten of aderen. In vergelijking met lymfatische haarvaten initieel, verzamelen lymfevaten dikkere vaatwanden, gepaarde lymfe kleppen en omhuld door een discontinue basale membraan waarin een paar gladde spiercellen ingebed 4. Gecoördineerde openen en sluiten van lymfatische kleppen en contractie van gladde spiercellen vergemakkelijkt de doorstroming van lymfe 3. Bij de mens, de lymfatische aderen uit verschillende regio's van het lichaam mee te doen met lymfatische stammen die fuseren tot twee lymfevaten te vormen: de thoracale buis en de rechter lymfatische kanaal. De ductus thoracicus draineert lymfe van de linkerkant van het lichaam en vanaf de rechterzijde onder de borst, terwijl de juiste lymfevat afvoeren lymfe van de rechterarm en rechterkant van het hoofd, nek en borst. Beide leidingen voeren lymfe in de subclavia in de nek 5.
Aandoeningen van het lymfestelsel zijn over het algemeen gegroepeerd in een verworvennd aangeboren (tabel 1). Voorbeelden van verworven omstandigheden lymfangitis en secundaire lymfoedeem. Lymphangitis is een ontsteking van een lymfevat gevolg van bacteriële infectie. De getroffen lymfevaten verwijden en vul met exsudaat bevatten polymorfonucleaire cellen. In skin deze lymfevaten zichtbaar rood, pijnlijke onderhuidse stroken vaak gepaard met de uitbreiding van de bijbehorende drainerende lymfeklier (lymfadenitis) 6. Secundair lymfoedeem ontstaat als gevolg van beschadiging of obstructie van het lymfevat of lymfklier obstructie. Dit leidt tot chronische progressieve zwelling door de ophoping van lymfe distaal van de beschadiging of obstructie. In ontwikkelde landen is secundaire lymfoedeem meestal geassocieerd met kanker, waar metastaserende tumoren belemmeren lymfvaten of regionale lymfeknopen, of ten gevolge van anti-kanker therapie na chirurgische verwijdering van lymfeklieren, nabestralingsonderzoek fibrose en post-inflammatoire Thromtrombose en littekens 7. In andere delen van de wereld, mogelijk secundair lymfoedeem secundaire lymfatische obstructie door parasitaire wormen zoals Wuchereria bancrofti 6.
| Aandoeningen van Lymfatische Vascular System | |||
| Verworven | Aangeboren | ||
| Lymphadenitis Secundair lymfoedeem | Primair lymfoedeem 10 | Sporadische Lymfatische misvormingen 13 | Lymfatische misvormingen gerelateerd syndromen 13 |
| bv Milroy Syndrome Meige syndroom | Eenvoudig: Lymfatische misvormingen | bv Klippel-Tranaunay Syndroom Parks Weber Syndrome Sturge-Weber-syndroom | |
| Gecombineerd: Capillaire-lymfatische misvormingen Capillaire-lymfatische-veneuze misvormingen Capillaire-lymfatische-arterioveneuze misvorming Capillair-lymfatische veneuze-arterioveneuze misvorming | |||
Tabel 1. Overzicht van de aandoeningen van lymfatische vasculaire systeem.
Aangeboren aandoeningen van het lymfesysteem omvatten primaire (idiopathische) lymfoedeem gedacht te worden veroorzaakt door genetische mutaties lymphangiectasia en afwijkingen van het lymfestelsel 8,9. Primair lymfoedeem kan sporadisch worden vermoedelijk veroorzaakt door de novo mutaties, of geërfd. Lymfatische aandoeningen kunnen ook worden geïsoleerd of bestaan uit een deel van een meer algemene syndroom 10. In de pediatrische populatie, 97% van de lymfeoedeem is sporadisch met afwijkingen in lymfatische structuur vat dat regionale lymfedrainage 11 schaden. Ziekte Milroy is een voorbeeld van primair lymfoedeem veroorzaakt door mutatie in het VEGFR-3-gen zichtbaar bij geboorte of kort daarna 12. Hoewel vooral familiale toestand, kan de ziekte Milroy ook worden geïdentificeerd bij zuigelingen zonder familiegeschiedenis van Milroy de ziekte 32. De ernst van lymfoedeem is afhankelijk van de hoeveelheid lymfe produktie en het vermogen om lymfe terug transporteren naar veneuze circulatie 6.
Op basis van de klinische presentatie en in situ endotheelcelproliferatie, zijn afwijkingen van het lymfestelsel geclassificeerd als lymfatische tumoren of lymfatische misvormingen 13. Kaposiform lymphangiomatosis is een voorbeeld van een LEC tumor 14. Lymfatische malformaties worden verondersteld te ontstaan tijdens de embryonale ontwikkeling en groeien in verhouding tot het kind 15,16. Ze regressie zelden maar kan Remain asymptomatisch tot trauma of infectie precipiteert snelle groei leidt tot klinische complicaties. De geordende structuur van lymfenetwerk en geleiding van lymfe uit het weefsel veneuze circulatie hierboven beschreven verstoord in lymfatische malformaties die bestaan uit plaatselijke verzamelingen van abnormale cysteuze structuren gevuld met lymfevocht. Hoewel er geen klinisch of experimenteel bewijs dat deze cystic vaten zijn verbonden met de lymfatische circulatie of dat zij functionele lymfatische kleppen bevat, hun lymfatische identiteit bevestigd door expressie van reeks lymfatische celmarkers zoals podoplanin, CD31, lymfevat Endothelial Receptor 1 (LYVE-1), Prospero homeobox eiwit 1 (PROX-1) en VEGFR-3 15,17,18. Deze cysteuze structuren zijn zowel kleine (microcystische) of grote (macrocystic), maar de meeste lymfatische malformaties bevatten zowel microcystische en macrocystic componenten (Figuur 1) 16. Na de operatie, spuitgietenn sclerotherapie en / of radiofrequente ablatie de lymfatische misvormingen vaak terugkomen.
Figuur 1. Morfologie van menselijke lymfevaten en lymfatische misvormingen. Normale humane lymfatische (A) en misvorming lymfatische vaten (B en C) gemerkt met antilichaam tegen podoplanin (bruine label, pijl). Human lymfatische misvorming schepen worden gekenmerkt door duidelijke dilatatie en aanzienlijke variatie in lumen grootte. Deze gelokaliseerde abnormale cystische structuren kunnen zowel kleine (microcystische, *) (B) of grote (macrocystic, #) (C) zijn. De meeste lymfatische misvormingen bevatten zowel microcystische en macrocystic componenten. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding weer te geven. </ P>
Sommige onderzoekers hebben gesuggereerd dat lymfatische misvormingen zijn een ontwikkelingsstoornis van lymfatische vasculatuur waarbij de LEC geen abnormale groeipotentieel maar hebben geen verbinding met de normale bloedsomloop 19. Wij hebben echter gevonden dat de LM LEC sneller prolifereren en zijn beter bestand tegen apoptosis dan voorhuid LEC 15 suggereert dat er een primair defect in de LM LEC's. Bij LM LEC worden geïmplanteerd in een muis xenograft model, vormen ze structuren denken aan lymfatische misvormingen 15. Dit ondersteunt de hypothese dat lymfatische misvormingen kunnen worden veroorzaakt door een of meer somatische mutaties ontstaan in LM LEC tijdens de foetale ontwikkeling. Inderdaad hebben recente rapporten zo'n mutatie in het p110α katalytische subeenheid van fosfoinositide 3-kinase (PIK3CA) genen 20 geïdentificeerd.
Gezien de vorderingen in DNA sequencing technologie, relevante mutaties cOuld gemakkelijker worden geïdentificeerd in geïsoleerde LM LEC's, het begeleiden van toekomstige studies van deze voorwaarden. De isolatie van levensvatbare LEC zou vergelijkingen tussen abnormale en normale LECs in assays zoals migratie, proliferatie, buis die vermogen en overleving in respons op verminderde beschikbaarheid van voedingsstoffen of pro-apoptotische middelen 15 te vergemakkelijken. Geïsoleerde LEC zou ons in staat te stellen cel-specifieke genexpressie en proteomics studies uitgevoerd om nieuwe LEC subpopulaties bakenen en ontdekken van nieuwe farmacologische middelen die geschikt zijn voor klinische behandeling van lymfatische misvormingen.
We hebben eerder publiceerde een LEC isolatie methode gebaseerd op magnetische kraal scheiding van LEC's van neonatale voorhuid en lymfatische misvormingen 15. We meldden een strategie voor het scheiden normale en zieke LEC's van vasculaire endotheliale cellen op basis van de afwezigheid van CD34 expressie, gevolgd door het onderwerpen CD34 Neg celfractie positieve selectie van CD31.Echter, deze werkwijze belemmerd door de aanwezigheid van achtergebleven niet-endotheelcellen. Dit was onafhankelijk van de epidermis te verwijderen vóór verder bindweefsel digestie. Deze verontreinigingen algemeen prolifereerden sneller en dus uiteindelijk overgrew de endotheliale celculturen ondanks latere pogingen om LEC isolatie herhalen. Inderdaad, een eerste besmetting van niet-endotheelcellen zo laag als 2% tot 5% voldoende om de LEC populatie 15 toelaat. Dit bracht ons naar fluorescent geactiveerde celsortering methode te verkennen als een optie om LEC cel opbrengst en zuiverheid te verbeteren. Daarnaast gebruikten we multi-parameter sorteren om de specificiteit van de LEC populaties verbeteren, toevoeging van VEGFR-3 en podoplanin de selectie markers CD34 Low CD31 pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos LECs identificeren.
De rationale voor de selectie van deze merkers werd gebaseerd op de rapporten die tijdens LEC en bloed vasculaire endotheliale cells hebben veel celoppervlaktemerkers gemeen, zoals CD31, LEC's tonen fenotypische variatie in hun expressie van CD34, podoplanin en VEGFR-3 celoppervlak marker in vergelijking met bloed vasculaire endotheliale cellen 21-23. CD31 is een 130 kDa transmembraan glycoproteïne ook bekend als bloedplaatjes endothelial cell adhesion molecule 1 (PECAM-1). Het wordt beschouwd als een pan-endotheelcel merker omdat het tot expressie wordt gebracht op alle soorten bloed- en lymfevaten 21,24,25. CD34 is 110 kDa transmembraan glycoproteïne aanwezig op de meeste hematopoietische moedercellen en stamcellen, vasculaire endotheelcellen en enkele lymfevaten 26.
VEGFR-3, de receptor voor vasculaire endotheliale groeifactoren C en D, aanvankelijk aanwezig op de ontwikkelende aders in het muizenembryo, maar na lymfatische specificatie gereguleerd door de transcriptiefactoren SRY-gerelateerde HMG-box (SOX) -18, c hicken o valbumin u pstream p romoter t ranscription f actor 2 (COUPTF-II) en PROX-1, is VEGFR-3 veneuze expressie verloren en het wordt beperkt tot embryonale LECs 25,27. Podoplanin, een 38 kDa membraan mucoprotein, wordt eerst opgemerkt op de lymfevaten op ongeveer embryonale dag 11 (~ E11.0) van de muis embryonale ontwikkeling 28 en terwijl het sterk wordt uitgedrukt door microvasculaire lymfevaten, podoplanin expressie door macrocystic lymfatische endotheel in lymfatische misvormingen meer variabel 15. Flowcytometrie experimenten suggereren dat ten minste enkele CD34 Hoge CD31 Pos endotheelcellen drukken de lymfatische marker podoplanin 29. Hoewel systematische evaluatie van LYVE-1 en podoplanin kleuring in humane lymfatische malformaties gebleken dat beide effectief zijn bij het kleuren lymfatisch endothelium misvorming 30, in normale weefsels, LYVE-1 werd gemeld sterk aanwezig in de initiële lymfatische zijncapillaire endotheel maar verminderd en zelfs afwezig bij het verzamelen van lymfatische endotheel 31. Omdat ons doel is om te isoleren zowel de initiële en het verzamelen van lymfatische endotheelcellen we hebben ervoor gekozen niet te LYVE-1 gebruiken als onderdeel van onze mobiele strategie selectie. Tenslotte werd de beslissing om deze markers ook gebruikmaken basis van de beschikbaarheid van antilichamen die diagnostisch zijn voor lymfevaten labelen voor microscopische beeldvorming, een eigenschap die verband tussen flowcytometrie en immunofluorescentie studies zou toestaan.
Dit artikel zal het weefsel spijsvertering methode, cel kleuring en FACS instellingen die nodig zijn voor een succesvolle isolatie van CD34 Lage CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos LEC's evenals CD34 High CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos endotheelcellen van voorhuid en lymfatische misvorming beschrijven weefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek verklaring: ethische goedkeuring voor het verzamelen van lymfatische misvorming en voorhuid weefsel werd verkregen uit de Human Research ethische commissies in het Royal Children's Hospital, Melbourne, Australië. Ondertekend toestemming werd ontvangen van ouders van patiënten voorafgaand aan de operatie. Weefselmonsters werden verzameld van patiënten met LM ondergaan chirurgische procedures als onderdeel van hun klinische behandeling en patiënten die een electieve besnijdenis. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de National Health en Medical Research Council, Australië.
1. Voorbereiding van de Cell Suspension van Voorhuid en Lymfatische Misvorming Tissues
- Buffers en Media Voorbereiding.
- Bereid volledige endotheelcellen media met behulp van commercieel beschikbare EGM-2 MV Bullet Kit met een warming EGM-2-media en zachtjes ontdooien de kit componenten in 37 ° C waterbad. In klasse II bioveiligheid kast, aseptischelke component toe te voegen aan de BAVA-2 media. Zodra alle componenten worden toegevoegd aan de media Raadpleeg deze media als "volledige endothelial cell media. Gebruik steriele 50 ml pipet om de inhoud vóór gebruik te mengen.
LET OP: Alle stappen met betrekking tot celcultuur worden uitgevoerd in een klasse II biohazard kast. Alle oplossingen worden bewaard bij 4 ° C volgens de instructies van de fabrikant en worden opgewarmd tot kamertemperatuur vóór gebruik. De volledige endotheelcel media, celkweek buffers en enzymoplossingen worden verwarmd bij 37 ° C gedurende 20 min vóór gebruik. - Supplement volledige endotheelcel medium met 50 ng / ml VEGF-C. Aliquot de aangevulde endotheelcel-medium in 50 ml steriele buizen en bewaar bij 4 ° C tot gebruik. Het medium is stabiel gedurende tenminste 4 weken indien bewaard bij 4 ° C.
- Bereid calcium en magnesium vrij fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) door het oplossen van 8,752 g NaCl, 1,416 g Na 2 HPO .2H 4 2 O en0,395 g KH 2 PO 4 in 1000 ml water. Pas de pH tot 7,4. Filter steriliseer PBS behulp 0,22 urn filter en bewaar bij 4 ° C. Voor gebruik toe antibiotica / antimycotische oplossing (gebruikt bij 1: 100).
- Om menselijk fibronectine te bereiden, los 1 mg van fibronectine in 10 ml steriel water. WINKEL oplossing in 100 gl aliquots bij -20 ° C. Op de dag van gebruik voeg 10 ml steriel PBS tot 100 ui aliquot fibronectine (tot een uiteindelijke werking concentratie van 10 ug / ml te verkrijgen).
- Voor het enzym media, een oplossing bevattende 0,04% Dispase II, 0,25% collagenase II en 0,01% DNase I in steriele PBS. Eerst weeg dispase en collagenase, plaats in een steriele 50 ml buis, voeg het benodigde volume PBS en incubeer gedurende 30 minuten onder schudden bij 37 ° C op te lossen. Eenmaal opgelost, filter steriliseren (0,22 pm filter) dispase / collagenase oplossing in bioveiligheid kap. Aseptisch de enzymatische oplossing toe de DNase I. Bewaren bij 37 ° C totgebruiken.
OPMERKING: DNase I is een commerciële celkweekniveau reagens beschikbaar als steriel gevriesdroogd poeder.
- Bereid volledige endotheelcellen media met behulp van commercieel beschikbare EGM-2 MV Bullet Kit met een warming EGM-2-media en zachtjes ontdooien de kit componenten in 37 ° C waterbad. In klasse II bioveiligheid kast, aseptischelke component toe te voegen aan de BAVA-2 media. Zodra alle componenten worden toegevoegd aan de media Raadpleeg deze media als "volledige endothelial cell media. Gebruik steriele 50 ml pipet om de inhoud vóór gebruik te mengen.
2. Voorbereiding van de Cell Suspension van Voorhuid en Lymfatische misvormingen
- Weeg een 50 ml buis met 10 ml DMEM / 2% antibiotica-antimycotische oplossing. Deze buis wordt gebruikt voor weefselverzameling.
- Na chirurgische verwijdering van lymfatische malformatie en voorhuid weefsels aseptisch weefselmonster aan de buis en overdracht op ijs aan de celkweek laboratorium.
- Weeg de buis met het weefsel en bereken weefselgewicht. Met dit gewicht aan het volume van enzymatische dat is gebruikt om het weefsel te verteren berekenen.
- In klasse II bioveiligheid kast, gebruik steriele tang om het weefsel en media over in een 100 mm kweekschaal tissue. Gebruik steriele schaar om fijn gehakt het weefsel in ~ 1 mm 3 stuks.
- Transfer gehakt weefsel gemengd met media into een 50 ml buis met een additionele 10 ml steriel DMEM / 2% antibiotica-antimycotische oplossing. Meng door inversie om opnieuw op te schorten het weefsel. Centrifugeer het monster bij 300 xg gedurende 5 minuten.
- Verwijder het supernatant. Op basis weefselgewicht, voeg 1 ml voorverwarmde (37 ° C) collagenase II / DNase I / Dispase II digestie oplossing per 100 mg gehakt weefsel. Algemeen gebruik 10 ml enzymoplossing ongeveer 1 gram gehakt weefsel.
- Incubeer het weefsel in een 37 ° C incubator gedurende 20-90 min onder constant schudden bij 200 rpm. Na afloop van deze periode op toe dat bijna al het weefsel wordt gedigereerd tot kleine fragmenten.
OPMERKING: Blootstelling van de cellen aan collagenase en dispase bij de isolatie van de primaire weefsels invloeden celoverleving. We hebben empirisch gevonden dat de meeste neonatale voorhuid monsters optimaal nodig 20-30 min van de spijsvertering, terwijl fibrotische lymfatische misvorming monsters 60-90 min van de spijsvertering kan vereisen. LM LEC yields worden beïnvloed door de hoeveelheid fibrose wordt meer fibreus weefsel waardoor minder cellen, mogelijk als gevolg van nadelige effecten van langdurige blootstelling aan collagenase en dispase II II. - Na de spijsvertering, de overdracht van de buis naar de bioveiligheid kast en laat de verteerde weefsel oplossing door een 70 urn zeef geplaatst in een steriele 50 ml buis. Met behulp van 3 ml spuit zuiger met rubber zuiger, slijpen de resterende weefsel tot slechts kleine sporen van extracellulaire matrix worden waargenomen.
- Was de cel zeef met een volume van endotheelcellen medium gelijk aan het volume dissociëren enzyme medium om cellen vast te zeven en de enzymen te inactiveren herstellen. Bijvoorbeeld voor 2 ml dissociëren enzym medium aan gehakt weefsel verteren, voeg 2 ml endotheelcel medium om de enzymen te inactiveren.
- Centrifugeer de cellen oplossing bij 300 xg gedurende 5 minuten en zuig de supernatant. R> e-schorsen de cellen in 10 ml PBS. Centrifugeer cellen bij 300 xg5 min, de bovenstaande vloeistof vervolgens tweemaal herhalen cel wassen. > Resuspendeer de celpellet in 20 ml van endotheliale celmedium. Tellen cellen met behulp van trypan blue vervolgens seed 2 x 10> 6 cellen in 150 cm> 2 kolf vooraf bekleed met fibronectine in een eindvolume van 20 ml endotheelcel medium. Kweken bij 37 ° C in een 5% CO> 2 in bevochtigde lucht incubator.>
OPMERKING: De verwachting is dat 75% -90% kernhoudende cellen overleven weefsel digestie zoals geschat door trypan blauw exclusie. Het aanvankelijke aantal cellen betreft alle kernhoudende cellen in de celsuspensie (bijvoorbeeld keratinocyten, leukocyten, macrofagen, bindweefselcellen en bloedvaten cellen). Het aantal cellen bij 5-7 dagen weerspiegelt cellen die zijn aangesloten, overleefde en verspreid tijdens de celcultuur. Coating weefselkweek kolven met fibronectine verbetert ook de daaropvolgende LEC en LM LEC overleven. - Na een nacht incubatie, weg te wassen ongebonden cellen in drie wassingen met PBS / 1% antibiotica-antimycotische oplossing en voeg verse endotheelcellen medium. Voeren drie wasbeurten om effectief te verwijderen ongebonden cellen en rode bloedcellen aanwezig zijn in de kolf. Wijzig media elke tweede dag. Cellen wordt 80% confluent zijn ~ na 5-7 dagen.
3. Antilichaam kleuring van cellen voor Lymfatische endotheelceloppervlak Markers flowcytometrie
- Nadat de cellen 80% confluentie, aspireren medium en spoelen cellen met PBS bereikt.
- Trek hechtende cellen door cellen te incuberen met 7 ml cel onthechting oplossing zoals Accutase per 150 cm2 kolf gedurende 5-7 minuten bij 37 ° C.
- Harvest vrijstaande cellen, inactiveren de cel detachement oplossing door het toevoegen van 3 volumes van endotheelcellen medium en breng de celsuspensie om een nieuwe steriele buis.
- Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 5 min.
- Zuig supernatant en resuspendeer de cellen in 5 ml PBS. Centrifugeer cellen bij 300 xg gedurende 5 minuten, verwijder de supernatant herhaal cel wassen. Resuspendeer de cellen in 5 ml PBS.
- Tel het aantal levensvatbare cellen. Meng 10 pl celsuspensie met 90 gl 0,4% trypan blue. Overdracht 10 ul van deze suspensie hemocytometer voor het tellen.
NB: De uiteindelijke celopbrengst is afhankelijk van de monstergrootte verwerkt. De gebruikelijke celopbrengst per 150 cm2 kolf varieert van 7 x 10 5-1,2 x 10 6 levensvatbare cellen. - Bereid de antilichaamoplossingen voor celkleuring.
Opmerking: De volgende verdunningen werden getitreerd voor het kleuren van 1 x 10 6 in een kleuring volume van 100 pl.- Verdun PE geconjugeerd muizen anti humaan VEGFR-3 (01:50); PE-Cy7 geconjugeerd muizen anti-humaan CD34 geconjugeerd (1: 200); APC-geconjugeerd muizen anti-humaan CD31 (1: 100) en Alexa 488-geconjugeerd rat anti-humaan podoplanin (1: 200) in totaal volume van 100 pi steriel 5% FBS / PBS oplossing per weefselmonster. Na de voorbereiding van deantilichaamoplossing, houdt op ijs tot gebruik. Vergelijkbare wijze, bereid verdunde isotype controle antilichaam mengsel tot instelling van flowcytometrie poorten vergemakkelijken.
- Om niet-specifieke binding van de antilichamen verminderen Centrifugeer cellen bij 300 xg gedurende 2 minuten, verwijder supernatant daarna schorsen de cellen in 100 pi steriel 5% FBS / PBS oplossing per monster worden gekleurd. Incubeer cellen op ijs gedurende 20 min bij 4 ° C.
- Centrifugeer cellen bij 300 xg gedurende 5 minuten, verwijder supernatant daarna resuspendeer cellen in het geconjugeerde antilichaam cocktail. Ook vlek een kleinere hoeveelheid cellen (1 x 10 5) in 100 gl isotype controle antilichaam mengsel. Incubeer cellen op ijs gedurende 20 min.
- Om het ongebonden antilichaam te verwijderen Voeg 2 ml van 2% FBS / PBS oplossing en centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 5 min. Zuig het supernatant en herhaal het wassen.
- Resuspendeer de celpellet de isotype controle en het antilichaam gekleurd monster worden opgelost in 300 pi 0,5 mg / ml propidium iodide / 2% FBS / PBS oplossing. Plaats de buizen op ijs tot het sorteren.
4. Cell Sorting
- Gebruik de volgende materialen voor het opzetten van het instrument; alignment parels zoals commerciële fluorescerende deeltjes, fosfaatgebufferde zoutoplossing gebaseerd omhullingfluïdum and drop delay parels, zoals Accudrop fluorescerende kralen.
- Isoleer het gezuiverde menselijke LEC op een multi-parameter fluorescentie geactiveerde celsortering instrument. Stel het instrument en lijn als per aanbevelingen van de fabrikant. Bovendien run single vlek compensatie controles elke soort de vergoeding matrix produceren en aldus aanzienlijke bloeding te elimineren door middel van de emissie van fluorochromen zoals PE in de PE-Cy channel.
Opmerking: Een groter gedeelte van de FACS gesorteerde cellen overleven de isolatie wanneer een 100 urn mondstuk gebruikt waarbij cellen worden gesorteerd in endotheelcellen medium.
5. Cell Culture Bericht FACS sorterening
- Na het sorteren, centrifuge cellen bij 300 g gedurende 5 min. Zuig het supernatant en suspendeer de cellen opnieuw in 5-10 ml medium (afhankelijk van de kolf gebruikt om de cel zaad). Indien minder dan 50.000 cellen gesorteerd, de cellen gekweekt in fibronectine gecoate 25 cm2 kolf.
- Verder kweken van de cellen in 75 cm 2-fibronectine beklede kolf bij 37 ° C in een 5% CO 2, air bevochtigde incubator. Wijzig media na 2 dagen.
OPMERKING: Cell media wordt elke tweede dag veranderd, omdat het verlengen van de tijd tussen media veranderingen lijkt te overleven van de niet-endotheelcellen bevoordelen. We valideren de lymfatische endotheelcellen fenotype met behulp van immunohistochemische detectie van markers: PROX-1, VEGFR-3, podoplanin, CD34 en CD31 wanneer de cellen zijn in de eerste split voor verdere expansie 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na de eerste digestie weefsel na 24 uur in kweek van niet-gefractioneerde monsters onderscheiden endotheelcel kolonies worden waargenomen (Figuur 2A) met fibroblast-achtige cellen en gladde spiercellen. Na het sorteren en na 24 uur in celkweek, de CD34 Lage CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos cellen hechten en laten typische geplaveide morfologie (figuur 2B en C). De FACS hierboven beschreven, zijn we in staat om cellen te zuiveren tot 99,8% zuiverheid en ze onderscheiden van CD34 High CD31 pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos endotheelcellen. Representatieve resultaten van gating strategie en sorteren worden weergegeven in figuur 3. Dit is opgelost de problemen ondervonden bij het gebruik van magnetische-kraal isolatiemethode. Tot nu toe hebben we deze cellen aan passage tot passage 13. Hierna passage, de LM LEC en voorhuid LECs gaan senescentie, vergezeld van morfologische veranderingen en verminderde celdeling.
Figuur 2. voorhuid LEC en LM-LEC. Vierentwintig uur na enzymatische digestie, ongesorteerde cellen bevatten zowel endotheel (pijl) en niet-endotheelcellen (A). Na CD34 Lage CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos FACS celisolatie, voorhuid LEC (B) en LM-LEC's (C) zijn verstoken van niet-endotheelcellen en geplaveide morfologie houden. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Fluorescentie-geactiveerde celsortering gating strategieën voor celsortering van vasculaire en lymfatische endotheelcellens. (A) Levende cellen worden eerst gated op CD34 en CD31 expressie, gevolgd door VEGFR-3 en podoplanin gating sort vasculaire (B) en lymfatisch endotheel (C) respectievelijk cel. (D) Re-analyse van naargelang CD34 Hoge CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos cellen shows> 98% vasculaire endotheliale cellen fenotype. (E) LEC cellen naargelang op CD34 Lage CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos fenotype zijn ook> 98% zuiver. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LEC's spelen een belangrijke rol bij het handhaven van homeostase fluïdum, immuunrespons tegen vreemde antigenen en opname en het transport van bepaalde nutriënten. LEC homeostase kan worden beïnvloed door ziekteprocessen zoals bacteriële infecties en tumormetastase, maar LEC ook somatische mutaties die resulteren in de vorming van disfunctionele lymfevaten en significante morbiditeit voor de getroffen patiënten. Om meer inzicht in de lymfatische misvorming etiologie te krijgen door middel van in vivo implantatie en ex vivo experimenten, en ontdek nieuwe behandeling opties, hebben we eerst een LEC isolatie methode ontwikkeld op basis van magnetische kraal selectie strategie met CD34 Neg CD31 Pos selectie strategie 15. De resulterende kweken bevatten vaak buiten endotheelcellen die moeilijk te verwijderen zijn cellen. Vervolgens werd de methode verfijnd met behulp van FACS om LEC's dat CD34 Lage CD31 Pos VEGR3 P uiten afstandos podoplanin Pos fenotype. Deze aanpak resulteerde in een relatief homogene LEC kweken die <0,5% van de niet-CD34 Lage CD31 Pos VEGR3 Pos podoplanin Pos cellen op post sorteren check. In de praktijk is het voordeel van cellen door FACS sortering is deze verslechtering niet LECs aanwezigheid <0,5%. Gekweekte LEC's en LM LEC's hebben een typische kasseien morfologie en worden verouderde rond passage 13.
In deze studie hebben we een flowcytometrie gebaseerd protocol voor de isolatie en de cultuur van hoogverrijkt LEC's van normale en abnormale weefsels op basis van hun expressie van een suite van celoppervlaktemerkers (CD34 Lage CD31 Pos VEGR3 Pos podoplanin Pos) beschreven. Cellen werden gesorteerd uit primaire weefsels na 5-7 dagen in vitro expansie, een stap die resulteerde in substantiële verrijking van LEC vergelijking met de frequentie in weefsels ten tijde van isolatie. Tijdens surgery krijgen we weefsels gaande van enkele microgram tot tientallen gram. Dit weefsel kan sterk variëren in zijn samenstelling met betrekking tot de omvang van de lymfatische misvorming vaartuigen, tissue littekens en aanwezigheid van lymfatische misvorming cyste thrombi. Al deze componenten beïnvloedt hoeveel cellen kunnen worden geïsoleerd uit het zieke weefsel. Vandaar het starten celaantal kan variëren van enkele duizenden cellen tot enkele miljoenen cellen. Evenzo zal het de samenstelling van de celsuspensie beïnvloeden en starten celaantallen betekent dat het aantal gesorteerde cellen ook verschillen van monster tot elkaar.
De frequentie van de LEC's in ongesorteerd voorhuid monsters na 5-7 dagen in kweek varieert van 0,52% tot 4,7%, terwijl LM LEC's variëren van 0,8% tot 12,43%. De LEC culturen bestaat> 99% CD34 Lage CD31 Pos VEGR3 Pos podoplanin Pos cellen na post-sortering heranalyse en onderhouden een typische cobblestone morfologie in de cultuur tot veroudering bij passage ~ 13 zonder overgroei door niet-endotheel elementen.
Het is noodzakelijk na initiële weefsel digestie en sorteren omdat de opbrengst van hetzij voorhuid of lymfatische misvorming cellen in het algemeen laag breiden cellen ex vivo. Aldus voorafgaande expansie van lymfatische endotheelcellen i n vitro maakt het genereren van de ~ 2x10 6 cellen nodig om een muis kamer zaad. Dit vereist een in vitro expansie fase van 5-7 dagen. Hoewel wij erkennen dat celkweek fenotypische veranderingen in de primaire cellen kunnen induceren, hebben we aangetoond dat deze gekweekte cellen behouden hun vermogen om lymfatische misvorming-achtige structuren in een muis xenograft model 15.
Er zijn verschillende kritische stappen in het protocol dat de mate van succes bepalen bij het sorteren cellen door FACS. De meest kritische stap is de tijd van blootstelling van de cellen aan collagenaseen dispase tijdens isolatie van het primaire weefsel zoals beschreven in stap 2.7. Dit wordt niet alleen beïnvloed door de hoeveelheid en type weefsel aanwezig maar ook door de partij gebruikte enzymen. Bovendien, fluorescent gelabelde antilichamen die de celpopulaties te karakteriseren moeten worden getitreerd en bij voorkeur monoklonaal. We testten verschillende cel onthechting oplossingen zoals trypsine / EDTA, EDTA, TrypLE Select en mobiele onthechting oplossing. We vonden dat EDTA moest worden gebruikt voor een langere tijd aan cellen en achtergebleven celklonten bleven vaak los. Daarentegen werden enkele celsuspensies gegenereerd binnen 3-5 minuten incubatie in trypsine / EDTA, mobiele onthechting oplossing en TrypLE Select. Er werd geen wezenlijk verschil in de expressie van CD31, CD34, podoplanin en VEGFR-3 na behandeling met een van de enzymoplossingen. Single gekleurd monsters moeten ook worden gedaan bij elke sortering experiment dat fluorochroom emissiespectra niet overlappen waarborgen enDaarom geven onjuiste metingen. Deze kritische stappen vormen ook stappen, waar aanpassingen aan de cel protocol nodig kunnen zijn of het oplossen van problemen tijdens de flowcytometrie sorteren.
Vergeleken met onze eerder gepubliceerde magnetische korrel scheiding van LEC's 15, het voordeel isoleren LEC door FACS omvat het volgende: snellere isolatie van cellen met een hoge zuiverheid en identiteit van discrete cel subsets en zeldzame populaties in een heterogeen monster. De belangrijkste beperkingen van FACS-gebaseerde LEC en LM LEC isolatie draait om het beperkt aantal cellen beschikbaar voor validatie na celsortering resultaten. Bovendien, terwijl elke poging wordt gedaan om onze assays en instrumentinstellingen standaardiseren dezelfde parameters heeft te worden gereproduceerd in andere laboratoria. Daarom kan enige variatie in de resultaten optreden. Bovendien, een van de problemen die lymfatische biologen staan, is de afwezigheid van celspecifieke markersdat zou een onderscheid tussen de eerste capillaire LEC markers en het verzamelen van capillaire LEC markers. In dit stadium hebben we nog niet geïdentificeerd LEC markers die zou onderscheid maken tussen gezonde LEC's en LM LEC's. Aangezien lymfatisch weefsel misvorming bevat ook normaal ogende lymfevaten (figuur 1A), de resulterende CD34 lage CD31 Pos VEGR3 Pos podoplanin Pos verhouding tot normale LEC evenals die van het zieke fenotype bevatten. Toekomstige studies onderzoeken LEC en LM LEC genexpressie en proteomics in staat zijn om ons te richten op meer specifieke LM LEC markers die LM LEC's van LEC's in hetzelfde weefsel kon onderscheiden.
In de toekomst, verwachten we FACS en deze nieuwe LEC merkers te gebruiken in een poging om zeldzame subsets van LEC populaties zowel voorhuid en lymfatische malformaties te identificeren. Hierdoor zouden we deze celpopulaties te isoleren en bestuderen van hun rol bij de ontwikkeling van de lymphatic vasculaire systeem en lymfatische misvormingen.
Het isoleren van LEC's en LM LEC's op basis van CD34 Lage CD31 Pos VEGR3 Pos podoplanin Pos niet-endotheliale cellen besmetting aanzienlijk verminderd. Bovendien is de FACS-technologie kunnen we LEC scheiden in subtypes gebaseerd op de expressie van CD31, podoplanin en VEGFR-3 celoppervlak markers en te begrijpen in de context van de cellijn ontwikkeling. Voor zieke LEC, dit zorgt voor celspecifieke studies die verder licht werpen op genen verantwoordelijk LEC ziekten en LEC vermogen om op verschillende stimuli cellen in vitro en in dierlijke xenograft modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de Baker Foundation en de Stichting 'Women in Science Fellowship' van de Royal Children's ondersteuning van Zerina Lokmić erkennen. Andrew G. Elefanty en Edouard G. Stanley zijn NHMRC Senior Research Fellows. Werk in hun laboratoria werd ondersteund door NHMRC en Stem Cells Australië.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies (Gibco) | 11965-092 | Used to collect tissue samples from the operating theatre. |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid. |
| VEGF-C | R&D Systems | 2179-VC-025 | Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/ml VEGF-C |
| Antibiotic-antimycotic solution (100x) | Life Technologies (Gibco) | 15240-062 | This solution contains 10,000 U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution. |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F2006 | Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 °C and maintained sterile. Use 7 ml to coat 150 cm2 flask. |
| StemPro Accutase Cell dissociation reagent | Life Technologies (Gibco) | A11105-01 | StemPro®Accutase® is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment. |
| 0.4% Trypan Blue dye | Life Technologies (Gibco) | 15250-061 | Used as a viability stain. |
| Dispase II | Roche Applied Biosciences | 4942078001 | Used at 0.04% |
| Collagenase II | Worthington Lab | 4176 | Used at 0.25% |
| DNase I | Roche Applied Biosciences | 11284932001 | Used at 0.01% |
| 70 mm nylon cell strainers | BD Falcon | 352350 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59 | BioLegend | 356204 | Used at 1:50 dilution |
| PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581 | BioLegend | 343516 | Used at 1:200 dilution |
| APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59 | BioLegend | 303116, | Used at 1:100 dilution |
| Alexa 488-conjugated rat anti human Podoplanin, clone NC-80. | BioLegend | 337006 | Used at 1:200 dilution |
| PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400112 | Used at 1:50 dilution |
| PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400126 | Used at 1:200 dilution |
| APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400120 | Used at 1:100 dilution |
| Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758 | BioLegend | 400525 | Used at 1:200 dilution |
References
- Baluk, P., et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. J Exp Med. 204 (10), 2349-2362 (2007).
- Yao, L. C., Baluk, P., Srinivasan, R. S., Oliver, G., McDonald, D. M. Plasticity of button-like junctions in the endothelium of airway lymphatics in development and inflammation. Am J Pathol. 180 (6), 2561-2575 (2012).
- Zawieja, D. C. Contractile physiology of lymphatics. Lymphat Res Biol. 7 (2), 87-96 (2009).
- Witte, M. H., et al. Structure function relationships in the lymphatic system and implications for cancer biology. Cancer Metastasis Rev. 25 (2), 159-184 (2006).
- Andrade, M., Jacomo, A. Anatomy of the human lymphatic system. Cancer Treat Res. 135, 55-77 (2007).
- Kumar, V., Abbas, A. K., Aster, J. C., Ch Fausto, N. Cotran Pathologic Basis of Disease. 43-78. 2, Elsevier Saunders. Robbins. (2009).
- Shayan, R., Achen, M. G., Stacker, S. A. Lymphatic vessels in cancer metastasis: bridging the gaps. Carcinogenesis. 27 (9), 1729-1738 (2006).
- Mulliken & Young's Vascular Anomalies Hemangiomas and. , University Press. Oxford. 1059-1076 (2013).
- Mulliken & Young's Vascular Anomalies Hemangiomas. 14, University Press. Oxford. 562-594 (2013).
- Bellini, C., Hennekam, R. C. Clinical disorders of primary malfunctioning of the lymphatic system. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 187-204 (2014).
- Schook, C. C., et al. Primary lymphedema: clinical features and management in 138 pediatric patients. Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2419-2431 (2011).
- Brouillard, P., Boon, L., Vikkula, M. Genetics of lymphatic anomalies. J Clin Invest. 124 (3), 898-904 (2014).
- for the Study of Vascular Anomalies (ISSVA) classification. Available from: http://www.issva.org/classification.com. , (2014).
- Croteau, S. E., et al. Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly. J Pediatr. 164 (2), 383-388 (2014).
- Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic malformation endothelial cells, their in vitro characterization and in vivo survival in a mouse xenograft model. Angiogenesis. 17 (1), 1-15 (2014).
- Smith, R. J. Lymphatic malformations. Lymphat Res Biol. 2 (1), 25-31 (2004).
- Chen, E. Y., et al. Similar histologic features and immunohistochemical staining in microcystic and macrocystic lymphatic malformations. Lymphat Res Biol. 7 (2), 75-80 (2009).
- Norgall, S., et al. Elevated expression of VEGFR-3 in lymphatic endothelial cells from lymphangiomas. BMC cancer. 7 (2), 75-80 (2007).
- Garzon, M. C., Huang, J. T., Enjolras, O., Frieden, I. J. Vascular malformations. Part I. J Am Acad Dermatol. 56 (3), 353-370 (2007).
- Osborn, A., Dickie, P., Adams, D., Dickie, B. 20th International workshop on Vascular Anomalies. ISSVA. , Melbourne, Australia. (2014).
- Baluk, P., McDonald, D. M. Markers for microscopic imaging of lymphangiogenesis and angiogenesis. Ann N Y Acad Sci. 1131, 1-12 (2008).
- Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Engineering the microcirculation. Tissue engineering. Part B, Reviews. 14 (1), 87-103 (2008).
- Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Visualisation and stereological assessment of blood and lymphatic vessels. Histol Histopathol. 26 (6), 781-796 (2011).
- Hagerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. EMBO J. 32 (5), 629-644 (2013).
- Pollmann, C., Hagerling, R., Kiefer, F. Visualization of lymphatic vessel development, growth, and function. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 167-186 (2014).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).
- Kaipainen, A., et al. Expression of the fms-like tyrosine kinase 4 gene becomes restricted to lymphatic endothelium during development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3566-3570 (1995).
- Schacht, V., et al. T1alpha/podoplanin deficiency disrupts normal lymphatic vasculature formation and causes lymphedema. EMBO J. 22 (14), 3546-3556 (2003).
- Kriehuber, E., et al. Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages. J Exp Med. 194 (6), 797-808 (2001).
- Florez-Vargas, A., et al. Comparative analysis of D2-40 and LYVE-1 immunostaiing in lymphatic malformations. Lymphology. 41 (3), 103-110 (2008).
- Makinen, T., et al. PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature. Genes Dev. 19 (3), 397-410 (2005).
- Connell, F. C., et al. Analysis of coding regions of VEGFR3 and VEGFRC in Milroy disese and other primary lymphoedemas. Hum Genet. 124 (6), 625-631 (2009).
