Summary
이 프로토콜의 목표는 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)를 사용하여 인간의 림프 기형 낭종 같은 선박과 포피 선을 긋고있는 림프 내피 세포를 분리하는 것입니다. 이후 세포 배양하고이 세포의 확장, 유전 단백체, 기능 및 세포 분화 연구를위한 실험적인 새로운 수준의 정교한을 허용합니다.
Abstract
같은 차 림프 부종, 림프 기형 및 림프 종양과 같은 림프 시스템 장애는 상당한 사망률의 원인이 있지만, 거의가 자신의 생물학에 대해 알려진 드문 경우입니다. 질병과 건강한 조직에서 매우 순수한 인간의 림프 내피 세포 (수정체 상피)을 분리하는 것은, 유전 분자 및 세포 수준에서 림프 내피 세포의 연구를 촉진한다. 이들 연구는 이러한 조건의 임상 관리를 변경할 수 있습니다 새로운 치료법에 대한 목표를 공개 할 수 것으로 예상된다. 수정체 상피 및 림프 기형 림프 내피 세포 (LM 수정체 상피) 포피 인간의 고립을 설명하는 프로토콜이 표시됩니다. 획득하기 위해 단일 세포 현탁액 조직 다진 및 효소 디스 파제 II 및 II 콜라겐을 사용하여 처리 하였다. 얻어진 단일 세포 현탁액을 분화 (CD) 마커 CD34, CD31, 혈관 내피 성장 인자 3 (VEGFR-3) 및 PODOPLANIN의 클러스터에 대한 항체로 표지 하였다. 스테인레스네드 가능한 세포는 다른 내피 세포 및 비 혈관 내피 세포에서 CD34 CD31 낮은 순위 VEGFR-3 순위 PODOPLANIN 순위 LM LEC 인구를 분리하는 형광 활성화 세포 분류기 (FACS)에 분류되었다. 분류 LM 수정체 상피가 배양 및 추가 실험 사용 피브로넥틴 코팅 된 플라스크에 확대했다.
Introduction
림프계 혈관 시스템의 주요 기능은 림프, 지질, 단백질 및 세포 성분을 함유하는 과량의 간질 유체를 흡수하고, 피 정맥 시스템으로 수행 할 수있다. 임파 모세 혈관의 네트워크가 외부 항원, 면역 감시 및 외래 항원을 중화 백혈구의 전개에 중요한 프로세스의 존재에 대해 스크리닝 림프절 림프 지시한다.
단방향 림프계 초기 림프 모세관, 림프 엔트리 1,2- 허용 특화된 세포 접합부와 박벽 평면 내피 세포의 단일 층을 가진 불연속 독특한 구조와 조직에서 시작한다. 이러한 증가 된 모세관 압력 간극 (3)의 존재 하에서 혈관 붕괴를 방지하기 위해 필라멘트를 고정 통하여 인접 결합 조직 매트릭스에 부착된다. 림프 모세관 수집에 빈 초기 림프 모세 혈관그 큰 림프관이나 혈관에 합체. 비교 림프관 두껍게 혈관벽, 페어링 림프 밸브가 몇 평활근 세포 (4)를 포함하는 불연속 기저막에 의해 이탈되어 수집 임파 모세 혈관 최초. 평활근 세포의 협정 개구 및 림프 밸브 폐쇄 및 수축은 림프 (3)의 흐름을 용이하게한다. 흉관과 오른쪽 림프관 : 인간에서, 신체의 여러 지역에서 림프계 혈관 두 림프 덕트를 형성하기 위해 병합 림프계 줄기를 형성하는 조인. 흉관 가슴 아래 신체의 좌측에서 우측에서 림프 배수 동안 머리, 목 및 가슴의 오른팔과 오른쪽에서 오른쪽 림프관 배수 림프절. 두 덕트 목 5 쇄골 하 정맥에 림프를 실시하고 있습니다.
림프 시스템의 장애는 크게 취득으로 그룹화ND 선천성 (표 1). 취득 조건의 예는 림프관과 이차 림프 부종이다. 림프관 염 인해 세균 감염에 림프관의 염증이다. 영향을받는 림프관은 팽창과 삼출물 포함 다형 핵 세포를 입력합니다. 피부, 이러한 림프관은 종종 관련된 배수 림프절 (임파선 염) 6의 확대와 함께 빨강, 고통스러운 피하 줄무늬로 볼 수 있습니다. 차 림프 부종은 림프관 또는 림프절 방해 손상 또는 방해의 결과로 발생한다. 이는 손상이나 장애물에 림프 말단의 축적으로 만성 진보적 인 팽창에 연결됩니다. 선진국에서는 이차 림프 부종은 가장 일반적으로 전이되는 종양 림프관 또는 림프절을 방해하거나, 항암 요법의 결과로서 림프절, 조사 후 섬유증 및 염증 후 throm 제거 수술 따라 악성 종양과 연관된bosis 및 흉터 7. 세계의 다른 부분에서, 이차 림프 부종은 사상충 6으로 기생충에 의한 림프 방해에 보조 할 수있다.
| 림프 혈관 시스템의 장애 | |||
| 획득 한 | 타고난 | ||
| 림프절염 이차 림프 부종 | 차 림프 부종 (10) | 산발적 림프 기형 (13) | 증후군 (13)와 림프 기형 관련 |
| 예를 들어, Milroy는 증후군 Meige 증후군 | 간단한 : 림프 기형 | 예를 들어, Klippel-Tranaunay 증후군 공원 웨버 증후군 스터 지 - 웨버 증후군 | |
| 결합 : 모세관 - 림프 기형 모세관 - 림프 - 정맥 기형 모세관 - 림프 - 동정맥 기형 모세관 - 림프 정맥 - 동정맥 기형 | |||
림프 혈관 시스템의 장애 표 1. 개요.
림프계의 선천성 장애는 유전 적 돌연변이, 림프관 확장증과 림프 시스템 8,9의 이상에 의해 발생하는 것으로 생각 차 (특발성) 림프 부종을 포함한다. 차 림프 부종은 아마 드 노보 돌연변이에 의해 발생, 또는 상속 산발적 될 수 있습니다. 림프 질환은 또한 단리 될 또는 더 일반화 증후군 (10)의 일부를 포함 할 수있다. 림프의 소아에서, 97 %림프 부종은 지역적 배수 (11)을 손상 림프관 구조 이상으로 산발적이다. Milroy는 질환은 출생시 분명 또는 직후 12 VEGFR-3 유전자의 돌연변이에 의해 발생 차 림프 부종의 예입니다. 대부분 가족 상태이지만, Milroy는 질환도 Milroy는 질병 (32)의 가족 병력이없는 영아에서 확인 할 수있다. 어떤 림프 부종의 정도는 림프 생산 및 정맥 순환 6 림프를 다시 수송 능력의 양에 따라 달라집니다.
임상 양상과 현장 내피 세포 증식에 본사를 둔, 림프계의 이상은 림프 종양 또는 림프 기형 (13)으로 분류된다. Kaposiform lymphangiomatosis는 LEC 암 (14)의 예이다. 림프 기형은 배아 개발하는 동안 발생 및 아동 (15, 16)에 비례하여 증가 할 것으로 생각된다. 그들은 거의 퇴화 없지만 remai 수 있습니다N 증상이 외상이나 감염은 임상 적 합병증에 이르는 빠른 성장을 침전 될 때까지. 상기 한 정맥 순환에 조직에서 림프 네트워크 및 림프의 전도의 질서 구조는 림프 유체로 채워진 이상 낭성 구조의 지역화 된 컬렉션을 구성 림프 기형에 교란된다. 이러한 낭포 성 혈관들이 기능 림프 밸브를 포함하는 림프 순환에 연결 또는 것을 임상 적 또는 실험적 증거는 없지만, 자신의 림프 ID는 같은 PODOPLANIN, CD31, 림프 혈관 내피 세포의 수용체 1과 림프 세포 마커의 범위의 발현에 의해 확인 (LYVE-1), 프로스페로의 호 메오 박스 단백질 1 (PROX-1) 및 VEGFR-3 15,17,18. 이 낭성 구조는 하나의 작은 (microcystic) 또는 대형 (macrocystic)을 할 수 있지만, 대부분의 림프 기형은 microcystic과 macrocystic 구성 요소 (그림 1) (16)을 모두 포함한다. 수술 후, injectioN 경화 요법 및 / 또는 무선 주파수는 림프 기형은 종종 다시 발생 절제.
인간의 림프 혈관과 림프 기형의 그림 1. 형태론. 보통 사람의 림프 (A)와 PODOPLANIN에 항체로 표지 림프 기형 혈관 (B와 C) (갈색 라벨, 화살표). 인간의 림프 기형 혈관이 현저하게 팽창과 루멘의 크기에 상당한 변화를 특징으로한다. 이러한 지역화 이상 낭성 구조는 작은 (microcystic, *) (B) 또는 대형 (macrocystic, #) (C)이 될 수 있습니다. 대부분의 림프 기형 모두 microcystic과 macrocystic 구성 요소가 포함되어 있습니다. 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. </ P>
일부 연구자들은 림프 기형은 수정체 상피의 이상 성장 가능성이없는 대신 정상적인 순환 (19)에 연결하는 데 실패하는 림프 혈관의 발달 장애를 나타내는 것을 제안했다. 그러나, 우리는 LM 수정체 상피 빠른 증식과 수정체 상피 (15)가 LM 수정체 상피에서 일차 결함이 있음을 시사 포피 아폽토시스보다 더 내성임을 발견 하였다. LM 수정체가 마우스 이종 이식 모델에서 이식되는 경우, 그들은 림프 기형 15 연상 구조를 형성한다. 이것은 림프 기형은 태아의 개발 과정에서 LM 수정체 상피에서 발생 하나 이상의 체세포 돌연변이에 의해 발생 될 수 있음을 가설을 지원합니다. 사실, 최근의 보고서는 포스-3 키나제 (PIK3CA) 유전자 (20)의 p110α 촉매 서브 유닛에 하나의 돌연변이를 확인했다.
DNA 염기 서열 기술, 관련 돌연변이의 C의 발전을 감안할 때울드는 더 쉽게 이러한 조건의 미래 연구를 안내, 고립 된 LM 수정체 상피에서 확인 될 수있다. 가능한 수정체 상피의 분리가 감소 영양소 가용성 또는 프로 - 세포 사멸 에이전트 (15)에 대한 응답 등의 이동, 증식, 튜브 형성 능력과 생존 등의 분석에서 비정상과 정상 수정체 상피 사이의 비교를 용이하게한다. 고립 된 수정체 상피 더 새로운 LEC의 소집단을 묘사하기 위해, 세포 특이 유전자 발현 및 단백질 체학 연구를 수행 할 수있게하고 림프 기형의 임상 관리에 적합한 새로운 약리 에이전트를 발견 할 것입니다.
우리는 이전에 신생아 포피과 림프 기형 15 수정체 상피의 자기 비드 분리에 따라 LEC 분리 방법을 발표했다. 우리는 CD31 양성 선택에 NEG CD34 세포 분획을 실시 하였다 CD34 발현의 유무에 기초하여 혈관 내피 세포에서 정상 및 질병 수정체 상피를 분리 전략을보고했다.그러나,이 방법은 잔류 비 - 내피 세포의 존재에 의해 방해 하였다. 이는 후속 결합 조직 분해 이전 표피를 제거 독립적이었다. 이러한 오염 물질은 일반적으로 더 빠르게 증식하므로 결국 LEC 분리를 반복하는 후속 시도에도 불구하고 내피 세포 배양을 overgrew. 실제로, 2 ~ 5 %의 낮은 비 - 내피 세포의 초기 오염 LEC 인구 (15)을 압도하기에 충분했다. 이 LEC 세포 수율과 순도를 향상시킬 수있는 옵션으로 형광 활성 세포 정렬 방법을 탐구하는 우리를 자극했다. 또, CD34 CD31 순위 낮음 VEGFR-3 순위 PODOPLANIN 순위 수정체 상피를 식별하는 선택 마커 및 VEGFR-3을 첨가 PODOPLANIN, LEC 개체군의 특이성을 향상시키기 위해 분류 다중 파라미터를 사용했다.
이러한 마커를 선택하기위한 이론적 근거는 보고서를 기반으로 한 것 수정체 상피 및 혈액 혈관 내피 가전 동안혈액 혈관 내피 세포에 비해 21-23 LLS 예컨대 CD31 같은 공통의 많은 세포 표면 마커를 가지고, 수정체는 CD34, PODOPLANIN 및 VEGFR-3 세포 표면 마커의 발현에서 표현형 변화를 나타낸다. CD31는 또한 혈소판 내피 세포 부착 분자 1 (PECAM-1)로 알려진 130 kDa의 막 횡단 당 단백질이다. 그것은이 혈액과 림프 혈관 21,24,25 모든 유형에서 발현되기 때문에 범 내피 세포 마커로 간주됩니다. CD34는 대부분의 조혈 전구에 110-kDa의 횡단 당 단백질 존재하고 세포, 혈관 내피 세포와 일부 림프관 26 줄기.
VEGFR-3, 혈관 내피 성장 수용체, C 및 D 요인 마우스 배아 현상 정맥에 초기에 존재하지만 전사에 의해 규제 림프 명세서에 이어 (SOX) -18, C의 hicken을 SRY 관련 HMG-상자 요인 O valbumin U pstreaM p를 romoter T는 ranscription f를 배우 2 (COUPTF-II) 및 PROX-1, VEGFR-3 정맥 표현이 손실되고 이는 배아 수정체 상피 25, 27로 제한된다. PODOPLANIN는 38 kDa의 막을 mucoprotein, 최초의 마우스 배아 발달 (28)의 약 배아 림프관 일 (11) (~ E11.0)에 주목하고 강력하게 미세 혈관 림프 혈관, 림프 기형에 macrocystic 림프 내피 세포에 의해 PODOPLANIN 식으로 표현된다 동안 15 개 변수입니다. 실험은 적어도 일부 CD34 CD31 높은 순위 내피 세포는 림프 마커 PODOPLANIN (29)을 표현하는 것이 좋습니다 유동 세포 계측법. 인간의 림프 기형에 LYVE-1과 PODOPLANIN 염색의 체계적인 평가는 모두 LYVE-1 초기 림프에 강하게 존재하는 것으로보고, 정상 조직에서, 림프 기형의 내피 (30) 염색에 효과가 있음을 보여 주었다 있지만모세 혈관 내피 세포하지만 감소 수집 림프 내피 (31)도 존재. 우리의 목표는 분리이므로 모두 우리가 선택했다 초기 및 수집 림프 내피 세포는 우리의 셀 선택 전략의 일환으로 LYVE-1을 사용하지. 마지막으로, 이러한 마커를 사용하는 결정은 현미경 이미징 림프 혈관을 라벨에 대한 단적으로 사용되는 항체의 가용성, 유동 세포 계측법 및 면역 연구 사이의 상관 관계를 허용 할 기능을 기반으로했다.
이 문서는 포피와 림프 기형에서 CD34 낮은 CD31 순위 VEGFR-3 순위 PODOPLANIN 순위 수정체 상피의 성공적인 분리뿐만 아니라 CD34 높은 CD31 순위 VEGFR-3 순위 PODOPLANIN 순위 내피 세포에 필요한 조직 소화 방법, 세포 염색 및 FACS 설정을 설명합니다 조직.
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Protocol
윤리 문 : 림프 기형 및 포피 조직의 수집을위한 윤리 승인 왕립 어린이 병원, 멜버른, 호주에서 인간 연구 윤리위원회로부터 얻은 것입니다. 서명 동의는 수술 전에 환자의 부모로부터 받았습니다. 조직 샘플은 선택 과목 할례를 받고 임상 관리의 일환으로 수술을받은 LMS 환자로 진단 환자에서 수집되었다. 모든 실험은 국립 보건 의료 연구위원회, 호주의 지침에 따라 수행되었다.
포피와 림프 기형 조직에서 세포 현탁액 1. 준비
- 버퍼 및 미디어 준비.
- EGM-2 미디어를 따뜻하게 부드럽게 37 ° C의 물을 욕조에 키트의 구성 요소를 해동 상용화 EGM-2 MV 총알 키트를 사용하여 완전한 내피 세포 미디어를 준비합니다. 클래스 II 바이오 안전성 캐비닛에, 무균EGM-2 미디어에 각 구성 요소를 추가 할 수 있습니다. 일단 모든 구성 요소가 미디어에 추가, '완전한 내피 세포 미디어'등이 미디어를 참조하십시오. 사용하기 전에 내용을 혼합 멸균 50 ㎖ 피펫을 사용합니다.
참고 : 세포 배양에 관한 모든 단계는 클래스 II 생물 학적 캐비닛에서 수행됩니다. 모든 솔루션은 제조자의 지시에 따라, 4 ℃에서 보관하고 사용하기 전에 실온으로 가온된다. 완전한 내피 세포 배지, 세포 배양, 효소 및 버퍼 용액은 사용하기 전에 20 분 동안 37 ℃에서 가온된다. - 50 NG / ㎖ VEGF-C와 완전한 내피 세포 미디어를 보충합니다. 사용까지 4 ° C에서 50 ml의 멸균 튜브 및 저장소로 보충 내피 세포 미디어를 나누어지는. 4 ℃에서 저장 될 때 매체는 적어도 4 주간 안정하다.
- 8.752 g의 염화나트륨, 1.416 g의 나 2 HPO을 용해하여 칼슘, 마그네슘 무료 인산염 완충 식염수 (PBS)를 준비 4 · 2H 2 O 및를 1,000 ml의 물에 0.395 g의 KH 2 PO 4. 7.4으로 산도를 조정합니다. 필터는 4 ° C에서 0.22 μm의 필터와 저장소를 사용하여 PBS를 소독. (: 100 1에서 사용) 안티 곰팡이 / 항생제 솔루션을 추가 사용하기 전에.
- 인간 피브로넥틴 준비 멸균 수 10ml에 1 mg의 피브로넥틴을 용해. 스토어는 -20 ° C에서 100 μL 분취에 솔루션을 재구성. 사용의 일 피브로넥틴 분취 량 100 ㎕로 멸균 PBS 10 ㎖를 추가 ON (10 μg의 / ㎖의 최종 농도로 작업을 얻었다).
- 효소 매체를 들어, 멸균 PBS에 0.04 % 디 스파 아제 (Dispase) II, 0.25 % 콜라게나 제 II 0.01 %의 DNase I을 함유하는 용액을 제조 하였다. 첫째, 멸균 50 ㎖ 튜브에 디스 파제 및 콜라게나 제, 장소 무게 PBS의 필요한 부피를 추가하여 용해하여 37 ℃에서 진탕하면서 30 분간 배양한다. 일단 바이오 안전성 후드 필터 소독 (0.22 μm의 필터) 디스 파제 / 콜라겐 솔루션, 용해. 무균 37 ° C에서의 DNase I. 스토어에게까지 효소 용액을 추가사용합니다.
참고 : DNase의 내가 멸균 동결 건조 분말로 사용할 수있는 상용 세포 배양 등급 시약입니다.
- EGM-2 미디어를 따뜻하게 부드럽게 37 ° C의 물을 욕조에 키트의 구성 요소를 해동 상용화 EGM-2 MV 총알 키트를 사용하여 완전한 내피 세포 미디어를 준비합니다. 클래스 II 바이오 안전성 캐비닛에, 무균EGM-2 미디어에 각 구성 요소를 추가 할 수 있습니다. 일단 모든 구성 요소가 미디어에 추가, '완전한 내피 세포 미디어'등이 미디어를 참조하십시오. 사용하기 전에 내용을 혼합 멸균 50 ㎖ 피펫을 사용합니다.
포피와 림프 기형에서 세포 현탁액 2. 준비
- DMEM / 2 % 항생제 항진균제 용액 10 ㎖를 함유하는 50 ㎖ 튜브를 단다. 이 튜브는 조직 수집을 위해 사용될 것이다.
- 기형 및 림프 조직 포피 제거 수술에 이어, 무균 세포 배양 실험에 얼음 이송 튜브와 티슈 시편을 추가한다.
- 조직을 포함하는 튜브의 무게를 측정하고 조직의 무게를 계산한다. 조직을 소화하는 데 필요한 효소 용액의 부피를 계산하는 가중치를 사용하여이.
- 클래스 II 바이오 안전성 캐비닛에, 100mm 조직 배양 접시에 조직과 미디어를 전송하는 멸균 집게를 사용합니다. 미세 ~ 1mm 3 조각으로 조직을 말하다에 멸균 가위를 사용합니다.
- 전송 다진 조직 미디어 나 혼합멸균 DMEM / 2 % 항생제 항진균제 용액 10 ㎖를 추가로 함유하는 50 ㎖ 튜브 NTO. 조직을 다시 중단 반전 섞는다. 5 분 동안 300 XG에 샘플을 원심 분리기.
- 상층 액을 제거합니다. 티슈 중량을 기준으로, 예열 (37 ° C) 콜라게나 제 II 다진 조직의 100 mg의 당 /의 DNase I / II 스파 아제 (Dispase) 분해 액 1ml를 추가한다. 일반적 다진 조직의 약 1g위한 효소 용액 10 ㎖를 사용한다.
- 상수는 200 rpm으로 진탕 20-90 분 동안 37 ° C의 배양기에서 조직을 품어. 이 기간의 끝에서, 즉, 거의 모든 조직의 미세 파편으로 절단되어 있는지.
주 : 기본 조직에 영향 세포 생존율로부터 분리시 콜라게나 제와 디스 파제에 세포의 노출. 우리는 섬유 성 림프 기형 샘플을 소화 60 ~ 90 분을 필요로하는 반면 대부분의 신생아 포피 샘플을 최적으로, 소화 20 ~ 30 분을 필요로하는 것이 경험적으로 발견했다. LM LEC 수율S는 현재 섬유증의 양에 의해 영향을 받는다, 더 섬유 조직 아마도 인해 콜라겐 II와 디스 파제 II에 장기간 노출의 해로운 효과, 적은 수의 세포를 얻었다. - 소화 후, 바이오 안전성 캐비닛에 튜브를 전송하고 멸균 50 ML 튜브에 넣고 70 μm의 스트레이너를 통해 소화 조직 솔루션을 전달합니다. 세포 외 기질의 작은 흔적이 관찰 될 때까지 고무 플런저 3 ㎖ 주사기 피스톤을 사용하여, 나머지 조직을 분쇄.
- 체질하고, 효소를 실활 붙어 균체를 회수 효소 매체 해리 볼륨 내피 세포 배지 당량 부피 셀 스트레이너을 씻는다. 예를 들어, 다진 조직 소화 효소 해리 배지 2㎖를 들면, 효소를 불 활성화 내피 세포 배지 2 ㎖를 추가한다.
- 5 분 300 XG에 셀 솔루션을 원심 분리기와 뜨는을 대기음. R> 10 ml의 PBS에 세포를 E는 일시 중지. 300 XG에 원심 분리기 세포5 분 후, 두 번 세포 세척을 반복 뜨는을 제거합니다. > 내피 세포 배지 20ml에 세포 펠렛을 재현 탁. 트리 판 블루를 사용하여 시드 다음 세포를 2 × 개수> 150cm 6 셀>이 플라스크 내피 세포 배지 20 ㎖의 최종 부피 피브로넥틴 프레 코트. 가습 공기 인큐베이터에서 5 % CO>이 37 ° C에서 문화.>
참고 : 트리 판 블루 배제 추정으로 유핵 세포의 75 % -90 %가 조직 소화 살아남을 것으로 예상된다. 초기 세포 수는 세포 현탁액의 모든 유핵 세포 (즉, 각질 세포, 백혈구, 대식 세포, 연결 조직 세포 및 혈관 세포)를 반영한다. 5~7일에서 세포 수는 부착 생존과 세포 배양 동안 증식 한 세포를 반영한다. 피브로넥틴과 조직 배양 플라스크를 코팅하면 다음 LEC와 LM LEC 생존을 향상시킵니다. - 하룻밤 배양 후, P와 세 세척에 결합되지 않은 세포를 씻으BS / 1 % 항생제 항진균제 솔루션과 신선한 내피 세포 매체를 추가 할 수 있습니다. 효과적으로 플라스크에 존재 언 바운드 세포와 적혈구를 제거하는 세 가지 세척을 수행하십시오. 모든 둘째 날 미디어를 변경합니다. 세포 5-7 일 후 ~ 80 %의 합류 될 것입니다.
유동 세포 계측법에 대한 림프 내피 세포 표면 마커에 대한 세포의 3 항체 염색법
- 세포를 PBS로 80 % 합류, 흡 매체 린스 세포에 도달 한 후.
- 이러한 150cm, 37 ℃에서 5 ~ 7 분 동안 2 플라스크 당 Accutase로 세포 분리 솔루션의 7 mL를 세포를 배양하여 부착 세포를 분리합니다.
- 수확 분리 세포는 내피 세포의 매질 (3) 볼륨을 첨가하여 세포 분리 용액을 비활성화 및 새로운 멸균 튜브에 세포 현탁액을 전송.
- 5 분 동안 300 XG에 세포를 원심 분리기.
- 기음 뜨는 및 PBS의 5 ml의 세포를 다시 일시 중지합니다. 5 분 300 XG에 원심 분리기 세포의 제거upernatant는 세포 세척을 반복합니다. PBS 5ml에 세포를 다시 일시.
- 생존 세포 수를 계산. 0.4 % 트리 판 블루 90 μL와 세포 현탁액의 10 μl를 섞는다. 이 서스펜션의 전송 10 μL은 계산을 위해 혈구합니다.
주 : 최종 세포 수율이 처리 된 표본의 크기에 따라 달라집니다. 가능한 세포의 7 × 10 5-1.2 × 106에서 150cm 2 플라스크 범위 당 보통의 세포 수율. - 세포 얼룩에 대한 항체 솔루션을 준비합니다.
참고 : 다음 희석 100 μL의 염색 볼륨 1 × 10 6 염색에 대한 적정 하였다.- 희석 PE 접합 마우스 항 인간 VEGFR-3 (1시 50분); PE-Cy7 공액 접합 마우스 항 인간 CD34 (1 : 200); APC 접합 마우스 항 인간 CD31 (1 : 100) 및 알렉사 488 공역 랫트 항 인간 PODOPLANIN (1 : 200) 100 μl를 조직 샘플 당 멸균 5 % FBS / PBS 용액의 총 부피이다. 의 준비에 따라항체 용액은 사용할 때까지 얼음에 보관하십시오. 마찬가지로 게이트 유세포의 설정을 용이하게하기 위하여 묽은 이소 타입 대조군 항체의 혼합물을 제조한다.
- 항체의 결합 특이성 줄이기 위해 원심 분리기 세포 2 분 300 XG에는, 상층 액은 다음 멸균 5 % FBS가 / 샘플 당 PBS 용액은 염색 할 100 μL의 세포를 중단 제거합니다. 4 ℃에서 20 분 동안 얼음에 세포를 품어.
- 5 분 300 XG에 원심 분리기 세포는 공액 항체 칵테일의 세포를 일시 중지 한 후 다시 뜨는을 제거. 또한, 100 ㎕의 이소 타입 대조군 항체 혼합물에 세포 (1 × 105)의 작은 부분 표본을 염색. 20 분 동안 얼음에 세포를 품어.
- , 언 바운드 항체를 제거하는 5 분 동안 300 XG에 FBS / PBS 용액과 원심 분리기에게 세포를 2 % 2 ㎖를 추가합니다. 뜨는을 기음과 세척을 반복합니다.
- 이소 제어 및 항체 염색 표본 세포 펠렛을 재현 탁 것은 / ㎖ 프로피 듐 IO 0.5 mg을 300 μL로 정렬 될dide / 2 % FBS / PBS 용액. 정렬 될 때까지 얼음에 튜브를 놓습니다.
4. 셀 정렬
- 악기를 설정하기 위해 다음과 같은 물질을 사용; 예컨대 Accudrop 형광 구슬 같은 상업적으로 이용 가능한 형광 입자, 인산염 완충 식염수 기반 시스 유체 및 드롭 지연 구슬 같은 정렬 구슬.
- 다중 매개 변수 형광 활성화 된 셀 정렬 기기에 정제 된 인간의 수정체 상피를 분리합니다. 악기를 설정하고 제조업체의 권장 사항에 따라 정렬합니다. 또한, 보상 매트릭스를 생성하기 위해 각각의 정렬로 단일 얼룩 보정 제어를 실행하고, 따라서 이러한 PE-사이클 채널에 PE로 형광 색소의 발광을 통해 상당한 출혈을 제거하기 위해.
주 : 100 ㎛ 노즐이 사용되며, 세포가 혈관 내피 세포 배지로 정렬되는 경우 세포 정렬 FACS의 비율이 높은 절연을 생존.
5. 세포 배양 후 FACS 정렬ING
- 5 분 동안 300 XG에 정렬, 원심 분리 후 세포. 뜨는을 대기음 (셀을 배정 할 플라스크에 따라 다름) 미디어의 5 ~ 10 ml의 세포를 재현 탁. 50,000 미만의 셀들이 정렬되는 경우, 세포가 피브로넥틴 코팅 25cm 2 플라스크에서 배양된다.
- 그렇지 배양 5 % CO 2, 공기 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 75cm 2 피브로넥틴 - 코팅 된 플라스크에서 세포. 이일 후 미디어를 변경합니다.
주 : 매체의 변화 사이의 시간을 연장하는 것은 비 내피 세포의 생존을 선호하는 나타나기 때문에 셀 미디어는 매초마다 하루 변경됩니다. 세포가 더 확장 (15)에 대한 첫 번째 분할 때 PROX-1, VEGFR-3, Podoplanin, CD34 및 CD31 : 우리는 마커의 면역 검출을 사용하여 림프 내피 세포의 표현형을 확인합니다.
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Representative Results
초기 티슈 소화 후, 분획 시료의 배양 24 시간 후, 별개의 내피 세포 콜로니 함께 섬유 아세포 유사 세포 및 평활근 세포 (도 2A)를 관찰 할 수있다. 다음 정렬 및 세포 배양에서 24 시간 후에, CD34 CD31 낮은 순위 VEGFR-3 순위 Podoplanin 순위 세포가 부착 전형적인 조약돌 형태 (그림 2B 및 C)를 보여줍니다. 상술 한 FACS 방법을 사용하여, 우리는 높은 CD34 CD31 순위 VEGFR-3 순위 Podoplanin 순위 내피 세포에서 그들을 99.8 % 순도로 세포를 정제하고 구별 할 수있다. 전략 게이팅 및도 3에 제시되어 정렬 대표 결과.이 문제는 자기 비드 분리 방법을 사용할 때 발생 해결했다. 지금까지 우리는 LM 수정체 상피와 LEC 포피,이 구절 후 통로 (13)까지 이들 세포를 계대 배양 한S는 형태 학적 변화와 감소 세포 분열과 함께, 노화로 시작합니다.
그림 2. 포피 수정체 상피 및 LM-LEC. 24 시간이 효소 소화 한 후, 분류되지 않은 세포는 내피 세포 (화살표) 및 비 혈관 내피 세포 (A)을 모두 포함한다. CD34 낮은 CD31 순위 VEGFR-3 순위 Podoplanin 순위 외과 세포 격리 후, 수정체 상피 (B) 및 LM-수정체 상피 (C) 포피가 아닌 내피 세포의 결여하고 조약돌 형태를 유지한다. 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
세포 혈관의 정렬 및 림프 내피 세포에 대한 게이트 전략을 정렬 그림 3. 형광 활성화 세포에스. (A) 생균 제 각각 VEGFR-3 PODOPLANIN 게이팅에 정렬 혈관 (B) 및 림프관 내피 (C) 세포, CD34 및 CD31의 발현에 게이트 따른다. > 98 % 혈관 내피 세포의 표현형 분류 CD34 CD31 높은 순위 VEGFR-3 순위 PODOPLANIN 순위 세포 쇼 (D)를 다시 분석. CD34 CD31 낮은 순위 VEGFR-3 순위 PODOPLANIN 순위 표현형으로 정렬 (E) LEC 세포는> 98 % 순수. 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
수정체 상피 유체 항상성, 외래 항원 흡수 및 일부 영양소의 수송에 대한 면역 반응을 유지하는데 중요한 역할을한다. LEC 항상성은 박테리아 감염 및 종양 전이와 같은 질병 과정에 의해 영향을받을 수 있지만, 수정체 상피 또한 영향을받는 환자에 대한 역기능 림프관 형성 및 이환율을 초래할 체세포 돌연변이를 개발할 수있다. 생체 이식 및 생체 외 실험을 통해 림프 기형 병인 더 이해하고 새로운 치료 방법을 발견하기 위해, 우리는 먼저 CD34 NEG CD31 순위 선택 전략 (15)를 사용하여 자성 비드 선택 전략에 기초 LEC 분리 방법을 개발 하였다. 그러나, 얻어진 배양 물은 종종 제거하기 어려웠다 내피 세포 이외의 세포를 함유 하였다. 그 후, 방법은 CD34 CD31 낮은 순위 VEGR3 (P)를 표현하는 수정체 상피를 정렬 FACS를 이용하여 정제 하였다OS PODOPLANIN 순위 표현형. 이 방법은 후 정렬 검사에 <비 CD34 CD31 낮은 순위 VEGR3 순위 PODOPLANIN 순위 세포의 0.5 %를 포함하는 상대적으로 균일 한 LEC 문화를 초래. 실용적인 관점에서, 세포를 FACS에 의해 분류의 이점은 <0.5 %의 비 존재 수정체의 감소이다. 배양 된 수정체 상피 및 LM 수정체 상피는 전형적인 조약돌 형태를 가지고 통로 (13)의 주위에 노화된다.
이 연구에서 우리는 세포 표면 마커 세트 (CD34 낮은 CD31 순위 VEGR3 순위 PODOPLANIN POS)의 발현을 기준으로 정상 및 비정상 조직에서 분리 매우 풍부한 수정체 상피의 문화에 대한 유동 세포 계측법 기반 프로토콜을 설명했다. 세포는 체외 확장 5-7 일 분리시 조직에서의 주파수에 비해 LEC의 실질적인 농축을 초래 한 단계 아래의 기본 조직에서 분류했다. 의시urgery 우리는 몇 마이크로 그램의 무게 그램의 수십에 이르기까지 조직을 구하십시오. 이 조직은 현재 림프 기형 혈관, 조직 흉터 및 림프 기형 낭종 혈전의 존재의 볼륨에 대한 조성에 크게 다를 수 있습니다. 이러한 모든 구성 요소는 병든 조직으로부터 단리 할 수있는 방법에 많은 영향을 줄 것이다 셀. 따라서 시작 세포 수는 수백만 개의 세포에 몇 천 세포에 이르기까지 다양 할 수 있습니다. 마찬가지로,이 세포 현탁액의 조성에 영향을주고, 소트 세포의 수는 하나의 샘플에서 서로 다를 의미 세포 수를 시작한다.
LM 수정체 상피 0.8 % 내지 12.43 %의 범위에있는 반면 배양 5~7일 다음 포피 정렬되지 않은 샘플에서 수정체의 주파수는 0.52 % 내지 4.7 % 범위이다. LEC 배양 구성> 99 % 낮은 CD34 CD31 순위 VEGR3 순위 PODOPLANIN 순위 세포를 다시 분석을 정렬 포스트 유지 전형적인 cobbleston 후비 내피 요소로 자라하지 않고 통로에서 노화 ~ 13까지 문화 전자 형태.
그것은 초기 조직 소화 다음과 포피 또는 림프 기형 세포 중 하나의 수율이 일반적으로 낮기 때문에 정렬 세포 생체을 확장 할 필요가있다. 따라서, 림프관 내피 세포의 팽창은 종래 난 N 관내 마우스 실을 시드하는 데 필요한 ~ 2 × 106 세포의 생성을 허용한다. 이 5-7 일 체외 확장 단계가 필요합니다. 우리는 세포 배양 물은 일차 세포에서 표현형 변화를 유도 할 수 있다는 것을 수락 동안, 우리는 이러한 배양 세포는 마우스 이종 이식 모델 (15)에 림프 기형 형 구조를 형성하는 능력을 유지하는 것으로 나타났다.
FACS에 의해 세포를 정렬 할 때 성공의 정도를 결정하는 프로토콜 내에서 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 가장 중요한 단계는 콜라게나하는 세포의 노광 시간단계 2.7에 기재된 바와 같이 일차 조직으로부터 분리하는 동안 디스 파제. 이은 양와 현재뿐만 아니라 사용되는 효소의 배치에 의해 조직의 유형에 의해 영향을받지 않습니다. 또한, 세포 집단을 특성화하는 데 사용되는 형광 표지 된 항체는, 바람직하게는 모노클로 적정 될 필요가있다. 우리는 트립신 / EDTA, EDTA, TrypLE 선택 및 세포 분리 솔루션으로 여러 다른 세포 분리 솔루션을 테스트했다. 우리는 EDTA는 종종 남아 세포와 잔여 세포 덩어리를 분리하기 위해 오랜 시간에 사용되는 한 것으로 나타났습니다. 대조적으로, 단일 세포 현탁액을 트립신 / EDTA, 세포 분리 용액 및 TrypLE 선택 인큐베이션 3-5 분 이내에 발생 하였다. 우리는 효소 솔루션의 치료 다음 CD31, CD34, Podoplanin 및 VEGFR-3의 발현에 실질적인 차이를 찾을 수 없습니다. 단일 스테인드 샘플도 겹치지 않도록 형광 색소의 발광 스펙트럼을 보장하기 위해 모든 분류 실험으로 수행되어야하며따라서 잘못된 측정 값을 제공합니다. 이러한 중요한 단계는 셀룰라 프로토콜 수정 정렬 계측법 흐름 중에 필요한 문제 될 수있는 단계를 구성한다.
수정체 상피 (15) 우리의 이전에 발행 된 자기 비드 분리 비교했을 때, FACS에 의해 분리 수정체 상피의 장점은 다음을 포함한다 : 이기종 샘플 내에서 높은 순도와 분리 된 세포 하위 집합 희귀 인구의 식별과 세포의보다 신속한 격리. FACS 기반 LEC와 LM LEC 분리의 주요 제한은 주위 세포 정렬 결과 다음과 같은 검증 가능한 세포의 수를 제한 회귀한다. 모든 시도가 우리의 분석과 기기 설정을 표준화하려고하는 동안 또한, 이러한 동일한 매개 변수는 반드시 다른 실험실에서 재현되지 않을 수 있습니다. 따라서, 결과에 약간의 변화가 발생할 수 있습니다. 또한 림프 생물학 직면하는 문제들 중 하나는 특정 세포 마커의 부재는그 초기 모세관 LEC 마커 및 모세관 LEC 마커를 수집 구별 것이다. 이 단계에서, 우리는 아직 건강한 수정체 상피 및 LM 수정체 상피 구별 할 LEC 마커를 확인하지 못했습니다. 림프 기형 조직은 또한 포함하고 있으므로 림프 혈관 (그림 1A)를 정상 찾고, 그 결과 CD34 CD31 낮은 순위 VEGR3 순위 PODOPLANIN 순위는 정상 수정체 상피의 비율뿐만 아니라 병에 걸린 표현형의 사람들이 포함됩니다. 앞으로의 연구 조사 LEC와 LM LEC 유전자 발현과 단백질 체학은 같은 조직에서 수정체 상피에서 LM 수정체 상피를 구별 할 수 더 구체적인 LM LEC 마커를 향해 우리를 안내 할 수 있습니다.
미래에, 우리는 모두 포피와 림프 기형의 LEC 인구의 드문 하위 집합을 식별하는 시도 외과 및 새로운 LEC 마커를 활용할 것으로 예상된다. 이것은 우리가이 세포 집단을 분리하고 lymp의 개발에 자신의 역할을 연구 허용hatic 혈관 시스템과 림프 기형.
CD34 CD31 낮은 순위 VEGR3 순위 PODOPLANIN 순위를 기반으로 분리 수정체 상피 및 LM 수정체 상피 크게 비 내피 세포의 오염을 감소시켰다. 또한, FACS 기술은 우리가 CD31, PODOPLANIN 및 VEGFR-3 세포 표면 마커의 발현에 기초하여 하위 유형으로 수정체 상피를 분리하는 세포 계보의 개발이 문맥을 이해 할 수있다. 수정체 상피 질환, 이것은 시험 관내 및 동물 이종 이식 모델에서 다양한 세포 자극에 반응하는 질환 및 LEC LEC 용량을 일으키는 유전자에 추가 되거 것이다 셀 고유 시험을 허용한다.
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Acknowledgments
저자는 베이커 재단과 Zerina Lokmic의 지원 로얄 어린이 재단 '과학 원정대의 여성을 인정하고 싶습니다. 앤드류 G. Elefanty와 에두아르 G. 스탠리는 NHMRC 선임 연구 펠로우 있습니다. 자신의 실험실에서 작업은 NHMRC 및 줄기 세포 호주에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies (Gibco) | 11965-092 | Used to collect tissue samples from the operating theatre. |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid. |
| VEGF-C | R&D Systems | 2179-VC-025 | Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/ml VEGF-C |
| Antibiotic-antimycotic solution (100x) | Life Technologies (Gibco) | 15240-062 | This solution contains 10,000 U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution. |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F2006 | Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 °C and maintained sterile. Use 7 ml to coat 150 cm2 flask. |
| StemPro Accutase Cell dissociation reagent | Life Technologies (Gibco) | A11105-01 | StemPro®Accutase® is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment. |
| 0.4% Trypan Blue dye | Life Technologies (Gibco) | 15250-061 | Used as a viability stain. |
| Dispase II | Roche Applied Biosciences | 4942078001 | Used at 0.04% |
| Collagenase II | Worthington Lab | 4176 | Used at 0.25% |
| DNase I | Roche Applied Biosciences | 11284932001 | Used at 0.01% |
| 70 mm nylon cell strainers | BD Falcon | 352350 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59 | BioLegend | 356204 | Used at 1:50 dilution |
| PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581 | BioLegend | 343516 | Used at 1:200 dilution |
| APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59 | BioLegend | 303116, | Used at 1:100 dilution |
| Alexa 488-conjugated rat anti human Podoplanin, clone NC-80. | BioLegend | 337006 | Used at 1:200 dilution |
| PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400112 | Used at 1:50 dilution |
| PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400126 | Used at 1:200 dilution |
| APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400120 | Used at 1:100 dilution |
| Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758 | BioLegend | 400525 | Used at 1:200 dilution |
References
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