Summary
Dette manuskript beskriver produktion, karakterisering og potentielle anvendelser af et manipuleret væv 3D esophageal konstruktion fremstillet af normal primære humane esophageal fibroblast og pladeepitelceller podet i en de-cellularized porcint stillads. Resultaterne demonstrerer dannelsen af et modent stratificeret epitel ligner den normale menneskelige spiserøret.
Abstract
Forekomsten af både esophageal adenocarcinom og dens forløber, Barretts Metaplasi, stiger hurtigt i den vestlige verden. Endvidere esophageal adenocarcinom har generelt en dårlig prognose, med en lille forbedring i overlevelsesrater i de senere år. Det er vanskelige betingelser for at studere, og der har været en mangel på egnede eksperimentelle platforme til at undersøge sygdomme i esophageal slimhinde.
En model af den menneskelige esophageal mucosa er blevet udviklet i MacNeil laboratorium, som i modsætning til konventionelle 2D cellekultursystemer, rekapitulerer celle-celle og celle-matrix-interaktioner stede in vivo og danner en moden, stratificeret epitel ligner den normale menneskelige spiserøret. Kort fortalt modellen udnytter ikke-transformerede normale primære humane esophageal fibroblaster og epitelceller dyrket i et porcin-afledt acellulær esophageal stillads. Immunhistokemisk karakterisering af denne modelaf CK4, CK14, Ki67 og involucrin farvning demonstrerer passende sammenfatning af histologi af den normale menneskelige esophageal slimhinde.
Denne model giver en robust, biologisk relevant eksperimentel model af den menneskelige esophageal mucosa. Det kan nemt manipuleres til at undersøge en række forskningsspørgsmål, herunder effektiviteten af farmakologiske midler og virkningen af udsættelse for miljøfaktorer såsom alkohol, toksiner, høj temperatur eller mave-esophageal refluxate komponenter. Modellen letter også forlængede kultur perioder ikke opnåelige med konventionel 2D cellekultur, så bl.a. undersøgelsen af virkningen af gentagen eksponering af en moden epitel til agenten af interesse i op til 20 dage. Desuden er en række forskellige cellelinjer, såsom de afledt af esophageal tumorer eller Barretts Metaplasi, kan inkorporeres i modellen til at undersøge processer såsom tumorinvasion og drug responsiveness i en mere biologisk relevant miljø.
Introduction
Esophageal mucosa omfatter en stratificeret, pladeepitel over et lag af bindevæv, lamina propria, og er en af de første sider for at støde indtagne miljømæssige stressfaktorer. Udsættelse for diætetiske toksiner er impliceret i udviklingen af esophageal pladecarcinom, mens duodenogastro-esophageal reflux er en kritisk faktor i patogenesen af Barretts Metaplasi, som er forbundet med øget risiko for progression til esophageal adenocarcinom. Esophageal karcinomer er den 8. mest almindelige ondartet svulst i britiske mænd og esophageal adenocarcinom er hastigt stigende i den vestlige verden 1. Desuden har der været en lille forbedring i sygdommen prognose, med en samlet 5-års overlevelse på omkring 15%. Derfor er der behov for eksperimentelle platforme for at undersøge virkningen af eksponering for miljømæssige stressfaktorer på denne esophageal epitel og deres potentielle engagement i udvikpment af metaplasi eller neoplasi.
Skønt immortaliserede eller tumorcellelinier tillader forskerne at studere respons af epitelceller til disse stressfaktorer in vitro, forbliver de proliferative og undlader at differentiere til de modne epitelceller findes på de øverste lag af esophageal mucosa. Endvidere kan cellelinier, som allerede gennemgået tumorigenese giver kun begrænset information om de indledende reaktioner af normale celler i epitel miljøfaktorer; og dette er den fase, hvor potentialet for terapeutisk intervention kan være højest. Endelig konventionelle cellekultursystemer undlader at indfange de potentielt vigtige vekselvirkninger mellem epitel- og mesenchymale celler og mellem disse celler og den omgivende matrix, der forekommer inden væv in vivo.
Dyremodeller giver et mere realistisk mikromiljø for at studere svarene fra esophageal epithelium og kan optage den kunstige induktion af gastro-øsofageal reflukssygdom 2. Men det kan være mere udfordrende at manipulere de miljømæssige stressfaktorer i disse modeller, og de kan ikke fuldt ud repræsentere svar inden for den menneskelige spiserøret.
Andre eksperimentelle humane esophageal modeller er blevet udviklet, som anvender primære celler, udødeliggjorte celler eller tumorcellelinier på et collagen, eller kombineret kollagen / Matrigel, stillads indeholdende fibroblaster 3,4. Det er mindre arbejdskrævende at generere disse scaffolds end acellulær esophageal stillads beskrevet i dette manuskript, og disse organotypiske modeller giver et nyttigt redskab, især i studiet af tumorinvasion 5,6, hvor tumorcelle infiltration i kollagen gel kan let observeret. Men disse kollagengeler har ikke-indfødte mekaniske egenskaber og mangler visse funktioner i det oprindelige væv, herunder en specifik basalmembran og appropriate overflade topografi. Dette kan påvirke adfærden hos celler, hvilket resulterer i, for eksempel, dårligere vedhæftning mellem epitelet og stillads ved brug af en kollagengel stillads 7. Som følge heraf acellulær porcin esophageal stillads blev udviklet, med den fordel, at en mere biologisk realistisk stillads og således mere egnet til anvendelse som en eksperimentel platform. Det har også vist sig, at det er bedre at inkorporere primære celler i esophageal konstruktioner end immortaliserede esophageal epiteliale cellelinjer, såsom Het-1A, da disse celler danner en flerlaget epitel, men undlader at stratificere eller differentiere 4,7,8 .
Derfor har denne protokol blevet tilpasset fra en metode, der allerede er i brug i MacNeil laboratoriet for at gøre manipuleret væv hud og mundslimhinden 9,10 og indeholder en de-cellularized porcint esophageal stillads kombineret med primære humane øsofageale epitelceller og fibroblaster. This protokol producerer et modent, stratificeret epitel, svarende til den i det normale humane esophagus som påvist af CK4, CK14, Ki67 og involucrin farvning. Den resulterende model giver en eksperimentel platform til at studere reaktioner på miljømæssige stressfaktorer, og har været brugt effektivt til at undersøge ændringer i genekspression i esophageal epitel svar på refluxate komponenter 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humane øsofageale celler opnås fra patienter, der undergår gastrisk eller esophageal kirurgi. Informeret samtykke opnås for det væv, der skal bruges til forskningsformål, og vævet anvendes anonymt under de relevante etiske godkendelser (SSREC 165/03, Human Research Tissue Bank Licence 12179).
1. Isolering af humane Esophageal epitelceller
- Arbejde i en laminar strømning vævskultur hætte og under anvendelse af steril teknik forberede epitel dyrkningsmedium ved blanding Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) og Hams F12 i en 3: 1-forhold (vol: vol). Tilsæt 10% (v / v) FCS, 10 ng / ml epidermal vækstfaktor, 0,4 ug / ml hydrocortison, 1,8 x 10 -4 M adenin, 5 ug / ml insulin, 5 ug / ml transferrin, 2 x 10 -7 M triiodothyronin, 1 x 10 -10 M koleratoksin, 2 x 10 -3 M glutamin, 100 IE / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 0,625 ug / ml amphotericin B.
- Brug af standardsterile teknikker, satte 11 ml DMEM, 10% FCS, 2 x 10 -3 M L-glutamin, 100 IE / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 0,625 ug / ml amphotericin B i en T75 vævsdyrkningskolbe. Tilføj 1 x 10 6 letalt bestrålede muse-3T3-fibroblaster 12 i 1 ml af det samme medium og inkuberes natten over ved 37 ° C i en 5% CO2, fugtig atmosfære. Dette vil frembringe et fødelag for den efterfølgende dyrkning af epitelceller.
- Ved hjælp af en skalpel og følge anbefalingerne fra en histopathologist, dissekere en ca 2 cm 2 prøve af væv fra sygdomsfrie baggrund region esophageal skællede slimhinde opnået fra patienter, der gennemgår gastrisk eller esophageal kirurgi. Transporten til laboratoriet i en 50 ml beholder med sterilt transportmedium (PBS 100 IE / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 0,625 ug / ml amphotericin B) ved stuetemperatur.
- På dette tidspunkt, opbevares vævet i transportmedium i op til 12 timer (natten over) ved 4 ° C, for nemheds skyld; Men brug ikke længere opbevaring, da de resulterer i reduceret levedygtighed celle.
- Arbejde i en laminar strømning vævskultur hætte og under anvendelse af steril teknik sterilisere en skalpel ved gennemvædning i 70% ethanol i 5 minutter. Skylles i sterilt PBS.
- Placer vævet i en steril petriskål og bruge skalpel til at skære det i 0,5 cm strimler. Tilsæt 5 ml 0,1% (vægt / volumen) trypsin i PBS til petriskålen, placere låget på skålen og inkuberes i 1 time ved 37 ° C.
- Der tilsættes 5 ml FCS til vævet i petriskålen til at inhibere trypsin. Holde strimlen af væv med sterile pincetter, skrabe forsigtigt epiteloverfladen med skalpelbladets i 1-2 min pr strimmel for at fjerne epitelcellerne i det omgivende medium. Fjern skrabet væv og der er afsat. Gentag fremgangsmåden for alle vævsstrimler.
- Saml mediet indeholdende de frigjorte epitelceller i et 15 ml centrifugerørog centrifugeres (5 min, 200 x g). Hæld supernatanten og resuspender pellet i 12 ml epitel medium (beskrevet i trin 1.1).
- Hæld ud og kassér medium fra feeder cellelag i T75 kolben forberedt i trin 1.2. Brug en steril pipette for at tilføje en celle suspension indeholdende de frisk isolerede epitelceller til kolben og der inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO2, fugtig atmosfære.
- Efter 24 timer hældes fjernes og kasseres dyrkningsmediet, som også vil indeholde cellerester, og erstat med 12 ml frisk epitel medium. Fortsæt inkubation ved 37 ° C i en 5% CO2, fugtig atmosfære. Kolonier vil begynde at dukke løbet af de næste 24 til 48 timer og kan ses ved at placere kultur kolbe under en standard lysmikroskop. Hæld det brugte dyrkningsmedium og erstatte med et tilsvarende volumen af frisk medium hver 2 til 3 dage.
- Når kolben har nået 80% konfluens, passage cellerne 13. Split calen i et forhold på 1: 5 for at forøge celleantal til anvendelse i modellen. Følg trin 1.2 at etablere fødelag af bestrålede 3T3-celler i hver kolbe, der vil modtage epitelceller 24 timer før passage af cellerne.
Bemærk: Anvend epitelcellerne i esophageal model beskrevet nedenfor mellem passagerne 1 og kun 4.
2. Isolering af Humane Esophageal fibroblaster
- Arbejde i en laminar strømning kabinet og bruge steril teknik, tage vævet afsat i trin 1.7. Placer i en steril petriskål og hakkekød fint ved at hakke med en steril skalpel. Der tilsættes 10 ml 0,5% (vægt / volumen) collagenase En opløsning og placere låget på petriskålen og inkuberes ved 37 ° C natten over i en 5% CO2, fugtig atmosfære.
- Overfør fordøjede til et 15 ml centrifugerør og centrifugeres (10 minutter, 200 xg), hæld forsigtigt fjernes og kasseres supernatanten, og pellet resuspenderes i 10 ml fibroblast dyrkningsmedium (DMEM 10% FCS, 2 x 10 -3 M L-glutamin, 100 IE / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 0,625 ug / ml amphotericin B).
- Anbring suspension i en T75-kolbe og inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO2, fugtig atmosfære. Efter 24 timer hæld mediet, som vil indeholde snavs og erstatte med 12 ml frisk fibroblast medium. Erstatte dyrkningsmediet hver 2 til 3 dage og passage-celler, når de har nået 80% konfluens 13, opdeling af cellerne i en 1: 5-forhold for at øge celletallet.
Bemærk: Brug fibroblastcellerne i følgende model mellem passager 4 og kun 10.
3. Forberedelse af De-cellularized Esophageal Scaffold
- Opnå intakt porcin esophagi på et slagteri fra friskslagtede Landrace svin, der anvendes til fødevareproduktion. En enkelt spiserøret vil give tilstrækkelige stilladser i ca. 30 separate konstruktioner.
Bemærk: På grund af den omfattende og tid consuming sterilisering påkrævede, er det normalt værd at opnå og behandle et minimum på 10 esophagi på én gang. - Anbring straks frisk udskåret spiserøret i en 180 ml steril pot indeholdende ca. 150 ml 10% povidon-iod-opløsning i 5 min for at reducere eventuelle kontaminerende mikrobielle belastning. Overfør spiserøret til en anden potte indeholdende ca. 100 ml sterilt PBS indeholdende 200 IU / ml penicillin, 200 ug / ml streptomycin og 1,25 pg / ml amphotericin B.
- Sæt låget på beholderen og transportere esophagi tilbage til laboratoriet ved stuetemperatur. To eller tre esophagi kan transporteres i hver beholder, afhængigt af deres størrelse.
- Når på laboratoriet, håndtag vævet i en laminar flow hætte hjælp af aseptisk teknik for at minimere mikrobiel kontaminering. Sterilisere pincet, saks og skalpelblade ved neddypning i 5 minutter i 70% ethanol, og skylning i sterilt PBS.
- Håndter esophagus anvendelse af sterile pincetter. Hjælp saksen, skåret op i spiserøret på langs. Skyl vævet ved at placere spiserøret i en 180 ml steril pot indeholdende ca. 100 ml sterilt PBS og forsigtig omrystning for at fjerne eventuelle rester.
- Rens en kork dissektion bord ved at sprøjte rigeligt med 70% ethanol og lad det tørre.
- Fjern spiserøret fra PBS, og ved hjælp af sterile nåle, pin ud i spiserøret på bordet, slimhindeoverfladen opad. Fatte slimhindeoverfladen ved den ene ende af esophagus med sterile pincetter og trække sig væk fra brættet. Dette vil adskille slimhinden fra den underliggende submucosa.
- Brug derefter en steril skalpel at dissekere spiserøret længderetningen langs lamina propria, fjerne stifter som dissektion skrider at tillade slimhinden, der skal løftes væk.
- Behold det dissekerede slimhinde og kassér den underliggende submucosa.
- Skær og kassér de mest proksimale og distale 2 cm af than slimhinde, da der er et større antal submukøse kirtler og en tykkere lamina propria i disse områder, henholdsvis 7.
- Brug en skalpel til at skære den resterende væv i 5 cm2. Placere alle snittet vævet ind i en 180 ml steril pot indeholdende ca. 150 ml sterilt PBS og agitere forsigtigt at skylle vævet. Hvis forarbejdning mere end fem esophagi på én gang, kan det være nødvendigt at bruge flere potter til dette og de tre efterfølgende trin.
- Anvendelse af steril pincet, overføre snittet væv ind i en 180 ml pot indeholdende 150 ml steril 1 M NaCl, 200 IE / ml penicillin, 200 ug / ml streptomycin og 1,25 pg / ml amphotericin B. Der inkuberes i 72 timer ved 37 ° C.
- Placer vævet ind i en frisk 180 ml pot indeholdende 150 ml sterilt PBS. Epitelet, er begyndt at synligt adskilt fra det underliggende væv. Skræl forsigtigt løsne epitel fra grisen spiserøret med sterile pincetter og kassér.
- Placer de resterende tudstedelse i et frisk 180 ml gryden og tilsæt 150 ml sterilt PBS. Omryst forsigtigt i 5 minutter til vask. Hæld PBS og gentag yderligere to gange med frisk PBS.
- Placere alle væv i en 500 ml glasflaske indeholdende 400 ml steril 80% (vol / vol) glycerol opløsning i 24 timer ved stuetemperatur. Overførsel til 400 ml steril 90% (vol / vol) glycerol-opløsning i yderligere 24 timer.
- Opbevares i 400 ml steril 100% glycerol-opløsning ved stuetemperatur i mindst 4 måneder til at dehydrere, og der steriliseres vævet samtidig bevare integriteten af basalmembranen.
4. Produktion af Kultur Media
- Forbered chelateret nyfødt kalveserum til anvendelse i dyrkningsmediet.
- Hæld 100 g Chelex 100 i et glas 1 L flaske og tilføje de-ioniseret vand. Den nøjagtige mængde er ikke kritisk, men skal tilsættes tilstrækkeligt vand til at dække Chelex pulver. Tilføj en magnetisk omrører, og der steriliseres ved autoklavering (121 ° C i15 min).
- Lader man flasken afkøle, og Chelex at sætte sig. I en laminar strømning hæld det overskydende vand, tilsæt 500 ml nyfødt kalveserum (NCS) og lad omrøre natten over ved 4 ° C.
- Stop omrøring og lad Chelex at bosætte dette kan tage op til 30 minutter. I en laminar strømning kabinet dekanteres chelaterede serum ved hjælp af en steril pipette, pas på ikke at forstyrre Chelex, og opbevar det i 10 ml portioner ved -20 ° C.
- Forbered tre forskellige medier i en laminar strømning skab, begyndende med pro-proliferative og slutter med pro-differentiative formuleringer.
- Forbered Composite Medium I består af DMEM og Hams F12 i en 3: 1-forhold (vol: vol), 4 x 10 -3 M L-glutamin, 0,5 ug / ml hydrocortison, 1 x 10 -4 M O -phosphorylethanolamine, 2 x 10 -12 M triiodthyronin, 1,8 x 10 -4 M adenin, 1,88 x 10 -3 M CaCl2, 4 x 10 -12 M progesteron, 10 ug / ml iSulin, 10 pg / ml transferrin, 10 ng / ml selen, 1 x 10 -3 M ethanolamin og 0,1% (v / v) chelateret NCS.
- Forbered Composite Medium II som Composite Medium I, bortset erstatte chelateret serum med 0,1% (v / v) ikke-chelateret NCS.
- Forbered Composite Medium III som Composite Medium II med undtagelse af udeladelse progesteron og stigning serum til 2% (v / v) ikke-chelateret NCS.
5. Produktion af Human Esophageal Mucosa Model
- Udfør alt arbejde i en laminar flow hætte, ved hjælp af aseptisk teknik til at opretholde et sterilt miljø. Sterilisere alle værktøjer ved opblødning i 70% ethanol i 5 minutter, før skylning i sterilt PBS.
- Dagen før det pålægges, rehydrere acellulær porcin esophageal stillads. Ét stykke af stilladset er påkrævet for hver konstruktion skal forberedes.
- At rehydrere de væv sted tilstrækkelige stykker af svin stillads i en gryde, som indeholder 100 ml sterilt PBS, agitere og suge i 10 min. Decant PBS og erstatte med frisk PBS. Gentag vaskeprocessen fem gange for at sikre fjernelse af alle spor glycerol.
- Test stilladset sterilitet ved at inkubere rehydreret væv natten over i 100 ml DMEM ved 37 ° C. Hvis der ikke er nogen ændring i farve eller uklarhed af dyrkningsmediet i slutningen af inkubationsperioden stilladset antages at være sterile. Når sterilitet er blevet bekræftet, skal du placere 5 cm2 acellulær stillads i en 6-brønds plade, submucosal side opad.
- Placer en steril medicinsk kvalitet rustfrit stål ring (indvendig diameter 10 mm, udvendig diameter 20 mm) på midten af hver stillads og tryk forsigtigt ned med steril pincet, for at sikre en tilstrækkelig tætning med vævet.
- Høst fibroblasterne anvendelse af trypsin-EDTA 13 til frembringelse af en cellesuspension. Tæl celler ved hjælp af et hæmocytometer 14. Centrifuger cellesuspensionen (10 min, 200 x g). Resuspender cellepelleten i en Appropriate volumen af fibroblast medium til frembringelse af en endelig celletælling på 2,5 x 10 6 celler pr.
- Tilføj 0,2 ml fibroblast medium, der indeholder 5 x 10 5 humane esophageal fibroblaster, inden hver ring. Oversvømme området omkring ydersiden af ringen med ca. 2 ml fibroblast medium. Der inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO2, fugtig atmosfære.
- Efter 24 timer fjernes ringe og fibroblast medium og tilsæt mindst 5 ml frisk fibroblast medium til hver brønd, der sikrer, at stilladset er fuldstændig nedsænket i mediet. Kultur i 1 uge ved 37 ° C i en 5% CO2, befugtet atmosfære erstatte medium hver 2 til 3 dage.
- Efter 1 uge fjerne de 6 brønds plader indeholdende stilladser til en laminar oversvømmelse hætte, fjern medium og vend hver stillads med sterile pincetter, anbringelse slimhindeoverfladen øverst. Dette tidspunkt benævnes dag 0.
- Placer stålringe på slimhindeoverfladen i centrum afvævet som i trin 5.4.
- Forbered T75 kolber af epitelceller til trypsinbehandling 13. Efter PBS vaske og før tilsætningen af trypsin-EDTA-opløsning, der tilsættes 2 ml sterilt 0,02% (w / v) EDTA-opløsning til hver kolbe. Der inkuberes i 2 minutter ved 37 ° C. Tryk kolben forsigtigt til selektivt frigøre i3T3 feederlag mens epithelcellerne vedlagt.
Bemærk: Det er generelt ikke praktisk eller nødvendigt til patient matche de epitelceller til fibroblasterne allerede er indarbejdet i modellen den foregående uge. - Hæld EDTA-opløsning indeholdende fødelag og tilføj trypsin-EDTA-opløsning for at høste epitelcellerne 13. Tæl celler ved hjælp af et hæmocytometer 14. Centrifuger cellesuspensionen (10 min, 200 x g). Resuspender cellepelleten i et passende volumen Composite medium 1 til frembringelse af en endelig celletælling på 5 x 10 6 celler pr.
- Tilsæt 0,2 ml Composite Medium I, indeholdende 1 x 10 6 epitelceller, inden for ringen. Oversvømme området omkring ydersiden af ringen med ca. 2 ml Composite Medium I og placere konstruktioner i inkubatoren ved 37 ° C i en 5% CO2, fugtig atmosfære.
- Efter 24 timer (dag 1) fjerne ringe og medium og tilsæt mindst 5 ml frisk Composite Medium I, sikrer stilladserne er fuldt nedsænket og vende tilbage til inkubatoren. Efter yderligere 24 timer (dag 2) at fjerne mediet og erstattes med mindst 5 ml Composite Medium II, hvilket igen sikrer stilladserne er fuldt neddykket og vende tilbage til inkubatoren.
- På dag 4 sted sterile medicinsk kvalitet rustfrit stål mesh net (2 cm bred x 2 cm lang x 0,5 cm høj), i friske 6 brønde, én pr konstruktion. Brug sterile pincetter til at overføre konstruktionerne på toppen af stål gitre, slimhindeoverflade opad.
- Tilsæt tilstrækkeligt Composite Medium III, således at væsken når undersiden af kompositten, men overfladen erudsat for luft, sikrer dette, at prøven opretholdes ved en luft-væske-grænsefladen. Det nøjagtige volumen af medium vil variere afhængig af tykkelsen af stilladset, volumenet af brønden og den præcise højde af rustfrit stålgitter.
- Vedligehold kompositter ved en luft-væske-grænseflade til mellem 10 og 20 dage (dag 14 til dag 24), afhængigt af kravene til forsøget. Udskift Composite Medium III med frisk medium hver 2 til 3 dage (mandag, onsdag, fredag er en brugervenlig ordning).
Bemærk: Efter 5 dage på en luft-væske grænsefladen (dag 9) konstruktionerne har en tilstrækkelig modent esophageal epitel skal anvendes i forsøg af virkningen af miljømæssige faktorer på esophageal epitel. - Ved afslutningen af forsøget, fastsætte konstruktioner til histologisk analyse og immunhistokemisk farvning 7 eller ekstrakt protein 15 eller RNA 11,16 fra epithelet for yderligere analyser. Hvis det kræves, bevarer det konditionerede dyrkningsmedium til analyse af ekstracellulære signalmolekyler 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette håndskrift beskriver processen krævede, vist i skematisk form i figur 1, til kultur 3D-modeller af det menneskelige esophageal epitel med succes. For at bekræfte egnetheden af modellen som en eksperimentel platform histologiske og immunhistokemiske undersøgelser er blevet gennemført sammenligne de dyrkede væv med humant normalt esophageal skællede slimhinde.
Histologisk vurdering af epitelet fremstillet ved den beskrevne fremgangsmåde viser en moden, flerlaget, stratificeret skællet epitel (figur 2B), som er sammenlignelig med den iagttaget med normal human spiserøret (figur 2A), omend tyndere (5 til 10 lag af celler sammenlignet med 10 til 20 til normal esophagus), idet cellerne blev progressivt fladere og i sidste ende anuclear når de trækker mod overfladen.
Immunhistokemisk karakterisering af centrale markører for spredning og differentiation viser, at microanatomy af modellen epitel svarer til normal human esophageal epitel. Observeres sammenlignelige Ki67-ekspression i både det native spiserøret og modellen epitel, med farvning begrænset til en delmængde af celler i basal og umiddelbart suprabasallagene (figur 3A og 3B). Dette er analogt til undersøgelser, der rapporterer, at mindre end 10% af cellerne viser generelt ekspression af proliferationen markering, Ki67, i den normale esophageal epitel 18. CK4 udtrykkes normalt i stratificeret og søjleformede epitel men generelt mangler de basale lag, mens CK14 er kun positiv i det basale lag 19. I både den normale og model esophageal epitel, er CK14 observeret i alle celler i det basale lag (fig 3D og 3E), mens CK4 observeres i hele epitel undtagelse af de to mest basale lag (figur 3G og
Forsøg på at erstatte de primære esophageal epitelceller med immortaliserede øsofageale epitelceller, såsom Het-1A, var mindre vellykket og producerede ikke en gyldig model af den normale esophageal epitel. En multi-lag epitel blev dannet; men den proliferative Ki67 blev detekteret i hele epitel (figur 3C) med ingen ekspression detekteret for eventuelle markører for differentiering (fig 3F, 3i og 3L), hvilket indikerer, at Het-1A-celler produceret en hyperproliferativ epitel uden tegn på normal stratificering eller modning.
Imidlertid har modellen væretheld modificeres til at inkorporere tumorceller ved erstatning af primære epitelceller med enten esophageal adenocarcinom (OE33) eller pladecarcinom (OE21) celler. Dette viser fleksibiliteten af modellen, så dens anvendelse i behandlingen af en række esophageal lidelser på forskellige stadier af progression gennem inddragelse af en række forskellige cellelinjer. Det kan ses, at der er en markant forskel i svarene fra disse to cellelinier. OE21 skællede carcinomceller frembringer et epithel synlig på konstruktionen som et defineret gult region (figur 4A) med store kløfter inden epithelet (figur 4B), som kan afspejle dysfunktionelle celleadhæsionsmolekyler. Herunder OE33 adenocarcinomaceller i modellen resulterer i en stor mængde af stillads nedbrydning, synlig med det blotte øje som en udtynding af stilladset efter 2 uger vækst ved luft / væske-grænsefladen (figur 4C), og bekræftet i H + E-analyse somen indlysende reduktion i tykkelsen af stilladset i området under cellerne (figur 4D). Dette er en sandsynligvis være et resultat af en vekselvirkning mellem tumorcellerne og fibroblaster, da stilladset degeneration ikke observeres i fravær af fibroblaster (figur 4E og 4F). Vi har observeret lignende virkninger på tumorinvasion i nærvær og fravær af fibroblaster i tilsvarende melanom modeller 21.
Figur 1: Skematisk diagram, der viser produktionen af esophageal mucosa model Humane øsofageale fibroblaster podes på det submukøse overflade af stilladset og dyrket i 7 dage.. Stilladset er inverteret, humane øsofageale epitelceller tilsat og dyrket nedsænket i 4 dage. Konstruktionen hæves til en luft-væske-grænseflade til mellem 10 og 20 days. Ved afslutningen af forsøget konstruktionen kan undergå yderligere analyse efter behov. Venligst klik her for at se en større version af figuren.
Figur 2: Sammenligning af epitel produceret i esophageal model med normal human esophageal epitel H + E-analyse af (A) normal human esophageal epitel og (B) esophageal epitel dannet i model af den menneskelige esophageal mucosa.. Scale bar er 500 um. Klik her for at se en større version af figuren.
Figur 4: Inddragelsen af tumorcellelinjer indenesophageal model. De primære epitelceller blev erstattet af pladecarcinom cellelinie, OE21 eller adenocarcinom cellelinie, OE33. Billeder viser konstruktionen med OE21 celler (A) eller OE33 celler enten i forbindelse med (C) eller i fravær af (E) fibroblaster, før fastsættelse ved udgangen af dyrkningsperioden. Epitelerne herunder OE21 (B) eller OE33 celler med (D) eller uden (F) fibroblaster visualiseres af H + E farvning. Scale bar er 500 um. Klik her for at se en større version af figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskript beskriver fremstilling og karakterisering af en biologisk relevant menneskelig esophageal slimhinde model egnet til anvendelse som en eksperimentel platform for at studere virkningen af eksponering for miljømæssige stressfaktorer på esophageal epitel.
De mest kritiske trin for vellykket produktion af en human esophageal mucosal model er: at sikre, at størstedelen af de epiteliale celler forbliver proliferative og ikke allerede begyndt at differentiere før såning dem på stillads; opretholde en luft-væske-grænseflade for kompositten for at sikre korrekt modning af epitelet; opretholdelse af sterilitet i hele den forlængede dyrkningsperioden.
På grund af de begrænsede mængder af humant væv rådighed til celleisolering er det generelt ikke muligt at opnå tilstrækkelige celler fra en enkelt vævsprøve til frø frisk isolerede celler direkte på stilladset og dermed en celleekspansion phase er nødvendig, hvor cellerne dyrkes i standard 2D celledyrkningsbetingelser. Det er vigtigt at sikre, at celler forbliver proliferative i denne periode. Dette opnås ved at sikre, at kulturerne aldrig får lov til at nå fuld konfluens, under anvendelse af celler i modellen kun op til passagen 4 og omhyggeligt overvåge cellemorfologi. Således celler bør bevare deres karakteristiske proliferative polygonale morfologi og den stramme "brosten" fortovet udseende er karakteristisk for proliferative epitelceller snarere end den mere diffust udseende observeret i kulturer som er begyndt at differentiere. Det andet kritiske trin styres ved at sikre, at celledyrkningsmediet omfatter den øverste overflade af rustfrit stål gitre anvendes til at løfte kulturerne til luft-væske-grænsefladen, men den øverste overflade af konstruktionen i sig selv ikke under vand. Det tredje skridt er afhængig af streng overholdelse den forlængede sterilisering protokol, når producerer de-cellularizedporcin stillads og anvendelse af god steril teknik under hele processen.
Vores resultater viser, at primære humane esophageal celler er kræves for at producere en normal, moden, stratificeret epitel. Hvis anvendtes en udødeliggjort cellelinie, omend afledt fra den humane esophageal epitel forblev cellerne proliferative og undlod at differentiere til dannelse af et modent stratificeret epitel. Den resulterende epitel kunne ikke anvendes som en tilfredsstillende model for normalt epitel, hvilket viser den manglende tilpasning af den immortaliserede cellelinie Het-1A til anvendelse i modellen. Men andre cellelinjer, såsom sådanne afledt af esophageal tumorer eller Barretts Metaplasi kan inkorporeres i modellen enten i stedet for eller ud over de primære epitelceller til at producere modeller for studiet af tumorprogression, invasion og respons på farmakologiske midler.
Eksperimenter kan udføres under anvendelse esophageal model til simulate eksponeringen af spiserøret til diskrete, pulserende begivenheder i løbet synke eller tilbagesvaling. Dette opnås ved gentagne gange at nedsænke konstruktionerne i dyrkningsmedium indeholdende forbindelse (r), der skal testes og skylning i PBS før returnering konstruktionen til en luft-væske-grænsefladen. Eksponeringstiderne og frekvens kan ændres for at afspejle den proces, der simuleres, der sikrer, at epithellaget udsættes for miljømæssig faktor (er), samtidig med at kulturen at fortsætte på en luft-væske-grænsefladen. Denne metode er blevet anvendt i vores laboratorium for at undersøge virkningen af tilbagesvaling på den normale esophageal epitel, hvor modellen blev udsat for specifikke gastro-esophageal reflux komponenter i 10 minutter to gange om dagen i 11 dage 11. Alternativt konstruktionerne kan blive udsat for kontinuerlige niveauer af miljømæssige stressfaktorer ved at medtage disse forbindelser i dyrkningsmediet. Dog skal da epitel blive udsat for en luft-væske-grænseflade for epitheTrifolium at modne og differentiere korrekt 7, er det ikke muligt kontinuerligt nedsænkes konstruktionerne i dyrkningsmediet. Derfor vil eksponering for stressor kun via submukøse overflade i disse eksperimenter, som kan begrænse relevansen af opnåede resultater.
Teknikken er relativt arbejdskrævende og derfor er bedre egnet til screening af relativt begrænsede antal forbindelser. Som et resultat, når du bruger modellen som en eksperimentel platform, er det hensigtsmæssigt først at udføre forundersøgelser ved hjælp af konventionelle celledyrkningsteknikker at identificere et begrænset antal betingelser før yderligere analyse ved hjælp af mere fysiologisk relevant esophageal model her 11 beskrevet. I tillæg til immunhistokemisk analyse har det også været muligt at undersøge ændringer i epitel genekspression profil efter eksponering for miljømæssige stressfaktorer. Dette blev opnået ved manuelt stripning væk epithelium, ekstraktion af RNA og omdanne det til cDNA til at isolere de gener, der udtrykkes og analyse af microarray til opnåelse genekspression profiler 11. På den måde har det været muligt at øge de tilgængelige oplysninger fra modellen som en eksperimentel platform. Er blevet foreslået tidlige ændringer i epitel genekspression profil efter simuleret eksponering for mave-esophageal reflux og fra disse resultater nye områder er blevet foreslået til yderligere undersøgelser i forebyggelse af udviklingen af Barretts Metaplasi, den metaplastisk forløber for OAC 11. Modellen kan også anvendes til at studere protein-ekspression under anvendelse af fremgangsmåder, såsom Western blot-analyse 15 og genekspression ved anvendelse Northern blot-analyse 16. Desuden studier af ekstracellulære signalmolekyler kunne udføres på dyrkningsmediet 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Roger Ackroyd, Andrew Wyman og Chris Stoddard, konsulent Kirurger på Sheffield Undervisning Hospitals NHS Foundation Trust, for deres hjælp i at erhverve esophageal vævsprøver og deres støtte til vores arbejde. Vi takker Ashraful Haque for hans hjælp indarbejde tumorcellelinjer i modellen. Vi takker for finansiel støtte til denne undersøgelse af tilskud fra Bardhan Forskning og Uddannelse Trust (BRET) og Yorkshire Cancer Research (YCR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | BD Biosciences | 215240 | Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilize. Warm in 37 °C water bath before use. |
| DMEM | Labtech | LM-D1112 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F12 | Labtech | LM-H1236 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Foetal Calf Serum | Labtech | FB-1090 | |
| Epidermal Growth Factor | R+D Systems | 236-EG-200 | Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS |
| Hydorcortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2767 | Prepare 10 mg/ml solution in 0.01 M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilize before use |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | Prepare stock solution in water |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Brand name Fungizone |
| PBS | Oxoid | BR0014 | Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilize |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| Povidone-iodine solution | Ecolab | 10830E | Brand name Videne |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| Newborn calf serum | Gibco | 26010074 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use use |
| O-phosphorylethanolamine | Sigma-Aldrich | P0503 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Lonza | 17-838Z | Used for composite media preparation |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA 0.02% solution | Sigma-Aldrich | E8008 | Warm in 37 °C water bath before use |
| T75 culture flask | VWR | 734-2313 | |
| 50 ml centrifuge tube | Fisher | 11819650 | |
| 15 ml universal tube | SLS | SLS7504 | |
| 180 ml pot | VWR | 216-2603 | |
| Petri dish | SLS | 150350 | |
| 6 well plate | VWR | 734-2323 | |
| stainless steel rings | Manufactured in house - medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm | ||
| steel mesh grids | Manufactured in house - sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2 cm (w) x 2 cm (d) x 0.5 cm (h) | ||
| ki67 | Novocastra | KI67-MM1-L-CE | Clone MM1. Use at 1:100. |
| CK4 | Abcam | ab9004 | Clone 6B10. Use at 1:200. |
| CK14 | Novocastra | LL002-L-CE | Clone LL002. Use at 1:200. |
| Involucrin | Novocastra | INV | Clone SY5. Use at 1:100. |
| OE21 | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| OE33 | Sigma-Aldrich | 96070808 | |
| Het-1A | ATCC-LGC | CRL-2692 | |
| Mouse 3T3 fibroblasts | ATCC-LGC | CRL-1658 | previously growth arrested by irradiation (60 Gy) |
References
- Pera, M., Manterola, C., Vidal, O., Grande, L. Epidemiology of esophageal adenocarcinoma. J. Surg. Oncol. 92 (3), 151-159 (2005).
- Manea, G. S., Lupusoru, C., Caruntu, I. D. Experimental study on the effect of bile, and bile and hydrochloric acid mixture on the esophageal mucosa. Rom. J. Morphol. Embryol. 50 (1), 61-66 (2009).
- Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 278 (3), 1824-1830 (2003).
- Underwood, T. J., et al. A comparison of primary oesophageal squamous epithelial cells with HET-1A in organotypic culture. Biol. Cell. 102 (12), 635-644 (2010).
- Nystrom, M. L., et al. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J. Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Okawa, T., et al. The functional interplay between EGFR overexpression, hTERT activation, and p53 mutation in esophageal epithelial cells with activation of stromal fibroblasts induces tumor development, invasion, and differentiation. Genes & Development. 21 (21), 2788-2803 (2007).
- Green, N., et al. The development and characterization of an organotypic tissue-engineered human esophageal mucosal model. Tissue Eng Part A. 16 (3), 1053-1064 (2010).
- Harada, H., et al. Telomerase induces immortalization of human esophageal keratinocytes without p16INK4a inactivation. Mol. Cancer Res. 1 (10), 729-738 (2003).
- Bhargava, S., Chapple, C. R., Bullock, A. J., Layton, C., MacNeil, S. Tissue-engineered buccal mucosa for substitution urethroplasty. BJU. Int. 93 (6), 807-811 (2004).
- Ralston, D. R., et al. Keratinocytes contract human dermal extracellular matrix and reduce soluble fibronectin production by fibroblasts in a skin composite model. Br. J. Plast. Surg. 50 (6), 408-415 (1997).
- Green, N. H., et al. Pulsatile exposure to simulated reflux leads to changes in gene expression in a 3D model of oesophageal mucosa. Int. J. Exp. Pathol. 95 (3), 216-228 (2014).
- Wang, C. S., et al. Selective culture of epithelial cells from primary breast carcinomas using irradiated 3T3 cells as feeder layer. Pathol. Res. Pract. 197 (3), 175-181 (2001).
- Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. J. Vis. Exp. (16), e755 (2008).
- Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2014).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N. Am. J. Med. Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat. Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Morgan, E., et al. Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clin. Immunol. 110 (3), 252-266 (2004).
- Xu, M., et al. The abnormal expression of retinoic acid receptor-beta, p 53 and Ki67 protein in normal, premalignant and malignant esophageal tissues. World J. Gastroenterol. 8 (2), 200-202 (2002).
- Moll, R., Divo, M., Langbein, L. The human keratins: biology and pathology. Histochem. Cell Biol. 129 (6), 705-733 (2008).
- Rice, R. H., Green, H. Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions. Cell. 18 (3), 681-694 (1979).
- Eves, P., et al. Melanoma invasion in reconstructed human skin is influenced by skin cells - investigation of the role of proteolytic enzymes. Clin. Exp. Metastasis. 20 (8), 685-700 (2003).
