Summary
Diese Handschrift beschreibt die Herstellung, Charakterisierung und Anwendungsmöglichkeiten eines mittels Tissue Engineering 3D-Ösophagus-Konstrukt von normalen primären humanen Ösophagus-Fibroblasten und Plattenepithelzellen in einem de-cellularized Schweine Gerüst ausgesät vorbereitet. Die Ergebnisse zeigen die Bildung eines reifen geschichteten Epithel ähnlich dem normalen menschlichen Speiseröhre.
Abstract
Die Inzidenz von beiden Adenokarzinom des Ösophagus und seine Vorläufer, Barrett-Metaplasie, steigen schnell in der westlichen Welt. Darüber Adenokarzinom des Ösophagus hat in der Regel eine schlechte Prognose, mit wenig Verbesserung der Überlebensraten in den letzten Jahren. Dies sind schwierigen Bedingungen zu untersuchen, und es wurde ein Mangel an geeigneten Versuchsplattformen Störungen der Schleimhaut der Speiseröhre zu untersuchen.
Ein Modell der menschlichen Schleimhaut der Speiseröhre in der MacNeil Labor, welches im Gegensatz zu herkömmlichen 2D-Zellkultursystemen, fasst die Zell-Zell- und Zell-Matrix-Wechselwirkungen in vivo vorhanden ist und erzeugt ein reifes, geschichteten Epithel ähnlich der der normalen menschlichen entwickelt Ösophagus. Kurz gesagt, verwendet das Modell nicht transformierten normalen primären humanen Ösophagus-Fibroblasten und Epithelzellen innerhalb eines Schweine-abgeleiteten acellular Ösophagus-Gerüst gezüchtet. Immunhistochemische Charakterisierung dieses Modellvon CK4, CK14, Ki67 und Involucrin Färbung zeigt entsprechende Wiederholung der Histologie des normalen menschlichen Schleimhaut der Speiseröhre.
Dieses Modell bietet eine robuste, biologisch relevanten experimentellen Modell der menschlichen Schleimhaut der Speiseröhre. Es kann leicht verändert werden, um eine Reihe von Forschungsfragen auch auf die Wirksamkeit von pharmakologischen Mitteln und die Auswirkungen der Einwirkung von Umweltfaktoren wie beispielsweise Alkohol, Toxine, hoher Temperatur oder gastroösophagealen refluxate Komponenten zu untersuchen. Das Modell erleichtert auch mit herkömmlichen 2D-Zellkultur, so dass unter anderem erreichbare erweiterte Kulturperioden, die Studie über die Auswirkungen einer wiederholten Exposition eines reifen Epithel an den Agenten von Interesse für die bis zu 20 Tage. Ferner ist eine Vielzahl von Zelllinien, wie die von Speiseröhrentumoren oder Barrett-Metaplasie abgeleitet können in das Modell eingearbeitet, um Prozesse wie Tumorinvasion und Drogen responsivene untersuchenss in einer biologisch relevanten Umfeld.
Introduction
Die Schleimhaut der Speiseröhre besteht aus einem geschichteten, Plattenepithel über einer Schicht von Bindegewebe, der Lamina propria, und ist eine der ersten Websites, um aufgenommen belastenden Umweltfaktoren zu begegnen. Die Exposition gegenüber Nahrungsgifte ist in der Entwicklung von Ösophagus-Plattenepithel-Karzinom in Verbindung gebracht, während duodenogastro-Reflux ist ein kritischer Faktor in der Pathogenese von Barrett-Metaplasie, die mit einem erhöhten Risiko der Progression zu einem Adenokarzinom der Speiseröhre verbunden ist. Ösophagus-Karzinome sind die häufigste bösartige Tumor 8. in UK Männchen und Adenokarzinom des Ösophagus ist schnell in der westlichen Welt 1 erhöht. Weiterhin hat es eine geringe Verbesserung der Krankheitsprognose mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von etwa 15%. Folglich gibt es einen Bedarf für experimentelle Plattformen um die Auswirkungen der Exposition gegenüber Umweltbelastungen in diesem ösophagealem Epithel und deren mögliche Beteiligung an der develo untersuchenpment der Metaplasie oder Neoplasien.
Obwohl immortalisierte oder Tumorzelllinien können die Forscher die Reaktion der Epithelzellen auf diese Stressfaktoren in vitro zu studieren, bleiben sie proliferative und scheitern in den reifen Epithelzellen auf den obersten Schichten der Schleimhaut der Speiseröhre gefunden zu unterscheiden. Ferner kann Zellinien, die bereits unterzogen worden sind Tumorigenese nur begrenzte Informationen über die ursprünglichen Antworten von normalen Zellen im Epithel von Umweltfaktoren zu liefern; und dies ist die Phase, wenn das Potential für die therapeutische Intervention kann höchsten sind. Schließlich herkömmlichen Zellkultursystemen nicht den potentiell wichtigen Wechselwirkungen zwischen epithelialen und mesenchymalen Zellen und zwischen diesen Zellen und der umgebenden Matrix, die in Geweben in vivo auftreten, zu erfassen.
Tiermodelle bieten ein realistischeres Mikroumgebung für die Untersuchung der Reaktionen des Ösophagus epithelium und kann die künstliche Induktion von Magen-Reflux-Krankheit 2 zu integrieren. Allerdings kann es schwieriger, um die belastenden Umweltfaktoren in diesen Modellen zu manipulieren und sie können nicht vollständig repräsentativ ist die Reaktion innerhalb des menschlichen Speiseröhre.
Andere experimentelle menschlichen Ösophagus Modelle entwickelt worden, die Primärzellen, immortalisierte Zellen oder Tumorzelllinien auf einem Kollagen zu verwenden, oder in Kombination Collagen / Matrigel, Gerüst Fibroblasten enthaltende 3,4. Es ist weniger arbeitsaufwendig, diese Gerüste als die in diesem Manuskript beschrieben azellulären Speiseröhren Gerüst zu erzeugen und diese organotypischen Modelle ein nützliches Mittel, insbesondere bei der Untersuchung von Tumorinvasion 5,6, bei Tumorzellinfiltration in das Kollagengel kann leicht sein, beobachtet. Aber diese Kollagen-Gele besitzen nicht-native mechanischen Eigenschaften und fehlen bestimmte Eigenschaften des ursprünglichen Gewebes, einschließlich einer spezifischen Basalmembran und der appropriate Oberflächentopographie. Dies kann das Verhalten der Zellen, was zu beeinflussen, beispielsweise, eine schlechtere Haftung zwischen dem Epithel und Gerüst bei Verwendung eines Kollagengels Gerüst 7. Als Folge der azellulären Schweinespeiseröhren Gerüst entwickelt, mit dem Vorteil, dass eine biologisch-realistische Gerüst und zur Verwendung als experimentelle Plattform somit besser geeignet. Es wurde auch gezeigt, dass es besser ist, Primärzellen in die Speiseröhre Konstrukte als immortalisierte Speiseröhre epithelialen Zellinien, wie Het-1A integrieren, da diese Zellen bilden einen mehrschichtigen Epithels aber nicht zu schichten oder zu differenzieren 4,7,8 .
Daher hat dieses Protokoll von einer Methode bereits in der MacNeil Labor zur Herstellung von Tissue Engineering Haut und Mundschleimhaut 9,10 angepasst worden und verfügt über eine de-cellularized Schweine Ösophagus-Gerüst verbunden mit primären humanen Ösophagus-Epithelzellen und Fibroblasten. This Protokoll erzeugt eine ausgereifte, geschichteten Epithel, ähnlich zu derjenigen des normalen menschlichen Speiseröhre durch CK4, CK14, Ki67 und Involucrin Färbung nachgewiesen. Das resultierende Modell stellt eine experimentelle Plattform um Reaktionen auf Umweltstressfaktoren zu untersuchen, und wurde effektiv in Reaktion auf die Veränderung der Genexpression in Ösophagusepithel untersuchen, um Bauteile 11 refluxate.
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Protocol
Menschlichen Ösophagus-Zellen von Patienten, die eine Magen-oder Speiseröhrenkrebs Chirurgie erhalten. Informierte Zustimmung erhalten wird für das Gewebe für Forschungszwecke verwendet werden, und das Gewebe anonym unter den entsprechenden ethischen Genehmigungen (SSREC 165/03, Human Research Tissue Bank Licence 12179) verwendet.
1. Isolierung von menschlichen Ösophagus-Epithelzellen
- Arbeiten in einer laminaren Strömung Gewebekulturhaube und mit einer sterilen Technik bereiten die epithelialen Kulturmedium durch Mischen von Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) und Ham-F12 in einem Verhältnis 3: 1 (v: v). Zugabe von 10% (v / v) FCS, 10 ng / ml epidermaler Wachstumsfaktor, 0,4 & mgr; g / ml Hydrocortison, 1,8 x 10 -4 M Adenin, 5 ug / ml Insulin, 5 ug / ml Transferrin, 2 x 10 -7 M Triiodthyronin, 1 x 10 -10 M Choleratoxin, 2 x 10 -3 M Glutamin, 100 IU / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 0,625 & mgr; g / ml Amphotericin B.
- Verwendung von Standard-sterile Techniken setzen 11 ml DMEM, 10% FCS, 2 x 10 -3 M L-Glutamin, 100 IU / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 0,625 & mgr; g / ml Amphotericin B in einen T75-Gewebekulturkolben. 1 x 10 6 letal bestrahlte Mäuse-3T3-Fibroblasten 12 in 1 ml des gleichen Mediums beimpft und über Nacht bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Atmosphäre. Dies wird eine Feeder-Schicht für die nachfolgende Kultur von Epithelzellen zu produzieren.
- Mit einem Skalpell und die Empfehlungen eines histopathologist, sezieren einen etwa 2 cm 2 Gewebeprobe aus dem krankheitsfreien Hintergrundbereich des Ösophagus-Plattenepithel-Schleimhaut von Patienten, die eine Magen-oder Speiseröhrenkrebs Chirurgie erhalten. Transport zum Labor in einem 50 ml-Behälter mit sterilem Transportmedium (PBS 100 IU / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 0,625 ug / ml Amphotericin B) bei Raumtemperatur.
- Zu diesem Zeitpunkt speichert die Gewebe in der TransportMedium für bis zu 12 h (über Nacht) bei 4 ° C, für die Bequemlichkeit; aber verwenden Sie keine längere Lagerung, wie sie in reduzierter Zelllebensfähigkeit führen.
- Arbeiten in einer laminaren Strömung Gewebekulturhaube und mit einer sterilen Technik sterilisieren einer Skalpellklinge durch Einweichen in 70% Ethanol für 5 min. Spülen in sterilem PBS.
- Legen Sie das Gewebe in eine sterile Petrischale und verwenden Sie das Skalpell, um sie in 0,5 cm Streifen geschnitten. 5 ml von 0,1% (w / v) Trypsin in PBS zu der Petrischale, den Deckel auf der Schüssel und Inkubation für 1 h bei 37 ° C.
- 5 ml FCS auf das Gewebe in der Petrischale, um das Trypsin zu hemmen. Halten des Streifens von Gewebe mit einer sterilen Pinzette vorsichtig abkratzen die Epitheloberfläche der Skalpellklinge für 1-2 min pro Streifen an den Epithelzellen in das umgebende Medium zu entfernen. Entfernen Sie das Gewebe abgeschabt und beiseite stellen. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Gewebestreifen.
- Sammeln Sie das Medium der abgelösten Epithelzellen enthält, in ein 15 ml Zentrifugenröhrchenund zentrifugieren (5 min, 200 xg). Abgießen des Überstandes und Resuspendieren des Pellets in 12 ml epithelialen Medium (in Schritt 1.1 beschrieben).
- Abgießen und verwerfen Sie das Medium aus dem Feeder-Zellschicht in der T75-Kolben in Schritt 1.2 vorbereitet. Eine sterile Pipette, um die Zellsuspension frisch isolierten Epithelzellen enthält, um den Kolben bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Atmosphäre hinzu und inkubiert.
- Nach 24 Stunden abgießen und verwerfen Sie das Kulturmedium, das auch Zelltrümmer enthalten wird, und ersetzen Sie sie durch 12 ml frisches Epithel-Medium. Weiter Inkubieren bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Atmosphäre. Kolonien werden beginnen, in den nächsten 24 bis 48 Stunden angezeigt und können, indem die Kulturflasche unter einem Standardlichtmikroskop betrachtet werden. Gießen Sie das verbrauchte Kulturmedium und ersetzen mit dem gleichen Volumen an frischem Medium alle 2 bis 3 Tage.
- Sobald der Kolben 80% Konfluenz, Durchgang die Zellen 13 erreicht hat. Teilen Sie die cells in einem Verhältnis von 1: 5 bis Zellzahlen zur Verwendung in dem Modell zu erhöhen. Folgen Sie Schritt 1,2 bis Feeder-Schichten von bestrahlten 3T3-Zellen in jedem Kolben werden die Epithelzellen 24 Stunden vor der Passage der Zellen empfangen werden zu etablieren.
Hinweis: Verwenden Sie die Epithelzellen in der unten zwischen den Kanälen 1 und nur 4 beschrieben Ösophagus-Modell.
2. Isolierung von menschlichen Ösophagus-Fibroblasten
- Die Arbeit in einer Sterilbank und mit steriler Technik, nehmen Sie die Seite in Schritt 1.7 festgelegt Gewebe. Zeigen in eine sterile Petrischale und fein zu zerkleinern durch Zerhacken mit einem sterilen Skalpell. 10 ml von 0,5% (w / v) Kollagenase Eine Lösung und setzen Sie den Deckel auf die Petrischale und bei 37 ° C über Nacht in einem 5% CO 2, feuchten Atmosphäre.
- Übertragen Sie die Digest in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge (10 min, 200 xg), sorgfältig abgießen und den Überstand verwerfen und das Pellet in 10 ml Fibroblastenkulturmedium (DMEM 10% FCS, 2 x 10 -3 M L-Glutamin, 100 IU / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 0,625 & mgr; g / ml Amphotericin B).
- Legen Sie die Suspension in eine T75-Flasche und bei 37 ° C in einem 5% CO 2, feuchten Atmosphäre. Nach 24 Stunden abgießen das Medium, die Trümmer enthalten wird, und ersetzen mit 12 ml frischem Fibroblasten-Medium. Ersetzen Sie das Kulturmedium alle 2 bis 3 Tage und Passage-Zellen, sobald sie 80% Konfluenz 13 erreicht haben, die Aufteilung der Zellen in einem 1: 5-Verhältnis zu Zellzahlen zu erhöhen.
Hinweis: Verwenden Sie die Fibroblasten in der folgenden Durchgänge zwischen 4 und 10 beschriebenen Modells.
3. Herstellung der De-cellularized Esophageal Scaffold
- Erhalten intakte Schweine esophagi im Schlachthof von frisch geschlachteten Landrasse, die für die Nahrungsmittelproduktion verwendet werden. Eine einzige Speiseröhre ausreichend Gerüste für etwa 30 separaten Konstrukte bereitzustellen.
Hinweis: Aufgrund der umfangreichen und zeit Consuming Sterilisationsprotokoll erforderlich ist, ist es in der Regel lohnt Beschaffung und Verarbeitung von mindestens 10 esophagi auf einmal. - Sofort platzieren Sie den frisch ausgeschnittenen Speiseröhre in einem 180 ml sterilen Topf mit etwa 150 ml 10% Povidon-Iod-Lösung für 5 Minuten, um jede verunreinigende mikrobielle Belastung zu reduzieren. Übertragen die Speiseröhre zu einem zweiten Topf mit etwa 100 ml sterilem PBS, das 200 IU / ml Penicillin, 200 ug / ml Streptomycin und 1,25 ug / ml Amphotericin B.
- Setzen Sie den Deckel auf den Behälter und den Transport der esophagi zurück an das Labor bei Raumtemperatur. Zwei oder drei esophagi kann in jedem Behälter transportiert werden, abhängig von ihrer Größe.
- Einmal im Labor, behandeln Sie das Gewebe in einer Sterilbank unter aseptischen Bedingungen, um eine mikrobielle Kontamination zu minimieren. Sterilisieren Pinzette, Schere und Skalpellklingen durch Einweichen für 5 Minuten in 70% Ethanol, und Spülen in sterilem PBS.
- Behandeln Sie die esophagus mit sterilen Pinzette. Mit der Schere, aufgeschnitten die Speiseröhre in Längsrichtung. Spülen Sie das Gewebe, indem der Speiseröhre in einem 180 ml sterilen Topf mit ca. 100 ml sterilem PBS und leichtes Schütteln, um alle Fremdkörper zu entfernen.
- Einen Korken Dissektion Bord Reinigen Sie durch Besprühen zügig mit 70% Ethanol und trocknen lassen.
- Entfernen Sie die Speiseröhre aus dem PBS und mit sterilen Nadeln, Stift aus der Speiseröhre in den Vorstand, Schleimhautoberfläche nach oben. Fassen Sie die Schleimhautoberfläche an einem Ende der Speiseröhre mit einer sterilen Pinzette und ziehen weg vom Brett. Dadurch wird die von der darunterliegenden Schleimhaut Submukosa trennen.
- Verwenden Sie dann eine sterile Skalpellklinge, um die Speiseröhre in Längsrichtung entlang der Lamina propria sezieren, Entfernen Pins als die Dissektion fortschreitet, damit die Schleimhaut weg angehoben werden.
- Bewahren Sie die seziert Schleimhaut und entsorgen Sie die zugrunde liegenden Submukosa.
- Abgeschnitten und entsorgen Sie die meisten proximalen und distalen 2 cm von ter Schleimhaut, da es eine größere Anzahl von submukösen Drüsen und eine dickere Lamina propria in jenen Bereichen, die jeweils 7.
- Verwenden Sie ein Skalpell, um die verbleibende Gewebe in 5 cm 2 geschnitten. Zeigen alle geschnittenen Gewebes in einen 180 ml sterile Topf mit ca. 150 ml sterilem PBS und leicht bewegen, um das Gewebe zu spülen. Wenn die Verarbeitung mehr als fünf esophagi zu einem Zeitpunkt kann es notwendig sein, mehrere Töpfe zu diesem und den drei darauffolgenden Schritten verwendet werden.
- Verwendung steriler Pinzetten, übertragen die geschnittenen Gewebes in eine 180 ml Dose, enthaltend 150 ml sterile 1 M NaCl, 200 IE / ml Penicillin, 200 ug / ml Streptomycin und 1,25 ug / ml Amphotericin B. Inkubieren für 72 Stunden bei 37 ° C.
- Legen Sie das Gewebe in eine frische 180 ml Topf mit 150 ml sterilem PBS. Das Epithel wird damit begonnen, sichtbar von dem darunterliegenden Gewebe zu trennen. Ziehen Sie leicht das Ablösen Epithel vom Schwein Speiseröhre mit einer sterilen Pinzette und entsorgen.
- Legen Sie die verbleibenden tAusgabe in eine frische 180 ml Topf und fügen Sie 150 ml sterile PBS. Leicht bewegen 5 Minuten zu waschen. Gießen Sie das PBS und wiederholen Sie noch zweimal mit frischem PBS.
- Stelle die ganze Gewebe in einem 500 ml-Glasflasche mit 400 ml sterilem 80% (v / v) Glycerinlösung 24 Stunden bei Raumtemperatur. Übertragen, um 400 ml sterile 90% (v / v) Glycerinlösung für weitere 24 Stunden.
- Speichern in 400 ml sterilem 100% Glycerinlösung bei Raumtemperatur für mindestens 4 Monate zu dehydratisieren und zu sterilisieren, das Gewebe, während die Integrität der Basalmembran.
4. Herstellung von Kulturmedien
- Vorbereitung chelatisierten Serum von neugeborenen Kälbern zur Verwendung in dem Kulturmedium.
- Gießen Sie 100 g Chelex 100 in ein Glas 1-l-Flasche und fügen entionisiertem Wasser. Das genaue Volumen ist nicht kritisch, aber ausreichend Wasser nachgefüllt, um das Chelex Pulver abzudecken. Hinzufügen eines Magnetrührer und Sterilisieren durch Autoklavieren (121 ° C,15 min).
- Lassen Sie die Flasche zu kühlen und die Chelex zu begleichen. In einer Sterilbank Gießen Sie das überschüssige Wasser, fügen Sie 500 ml Serum von neugeborenen Kälbern (NCS) und lassen Sie es über Nacht bei 4 ° C zu rühren.
- Stoppen Rühren und lassen Sie das Chelex zu regeln, dies kann bis zu 30 Minuten dauern. In einer Sterilbank dekantiert die Chelat-Serum mit einer sterilen Pipette, kümmert sich nicht um die Chelex, und speichern Sie in 10 ml Aliquots bei -20 ° C zu stören.
- Bereiten Sie drei verschiedenen Medien in einer Sterilbank, beginnend mit pro-proliferative und endend mit pro-differenzierenden Formulierungen.
- Vorbereitung Verbundmedium I besteht aus DMEM und Hams F12 in einem 3: 1-Verhältnis (V: V), 4 x 10 -3 M L-Glutamin, 0,5 ug / ml Hydrocortison, 1 x 10 -4 M O -phosphorylethanolamine, 2 x 10 -12 M Trijodthyronin, 1,8 x 10 -4 M Adenin, 1,88 x 10 -3 M CaCl 2, 4 x 10 -12 M Progesteron, 10 & mgr; g / ml insulin, 10 ug / ml Transferrin, 10 ng / ml Selen, 1 x 10 -3 M Ethanolamin und 0,1% (v / v) NCS chelatisiert.
- Bereiten Sie Composite-Medium II als Verbundmedium I außer ersetzen Chelat-Serum mit 0,1% (v / v) Nicht-Chelat-NCS.
- Bereiten Verbundmedium III als Composite-Medium II außer omit Progesteron und Erhöhung Serum bis 2% (v / v) nicht-chelatisierten NCS.
5. Produktion des Menschen Ösophagusmukosa Modell
- Alle Arbeiten in einer Steril, unter aseptischen Bedingungen, um eine sterile Umgebung aufrechtzuerhalten. Sterilisieren aller Werkzeuge durch Einweichen in 70% Ethanol für 5 min vor dem Spülen in sterilem PBS.
- Der Tag, bevor es erforderlich ist, rehydrieren die azellulären Schweinespeiseröhren Schafott. Einen Gerüstteil, erforderlich für jedes Konstrukt hergestellt werden.
- Um das Gewebe ausreichend Platz Stücke von Schweine-Gerüst in einen Topf mit 100 ml sterilem PBS rehydrieren, zu agitieren und genießen für 10 min. DecaNT Die PBS und Ersetzen mit frischem PBS. Wiederholung des Waschprozesses fünfmal, um die Entfernung aller Spuren Glycerin gewährleisten.
- Testen Sie das Gerüst Sterilität durch Inkubation des rehydratisierten Gewebe über Nacht in 100 ml DMEM bei 37 ° C. Wenn es keine Änderung in der Farbe oder die Trübung des Kulturmediums am Ende des Inkubationszeitraums das Gerüst wird angenommen steril sein. Sobald Sterilität bestätigt wurde, legen Sie die 5 cm 2 acellular Gerüst in eine 6-Well-Platte, submuköse Seite nach oben.
- Legen Sie eine sterile medizinischem Edelstahl Ring (Innendurchmesser 10 mm, Außendurchmesser 20 mm) auf die Mitte jedes Gerüst und drücken Sie leicht mit Hilfe einer sterilen Pinzette, um eine ausreichende Abdichtung mit dem Gewebe zu gewährleisten.
- Ernte der Fibroblasten unter Verwendung von Trypsin-EDTA-13, um eine Zellsuspension herzustellen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer 14. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension (10 min, 200 xg). Zellpellet in eine? Fallte Volumen Fibroblastenmedium, um eine endgültige Zellzahl von 2,5 x 10 6 Zellen pro ml herzustellen.
- In 0,2 ml Fibroblasten-Medium, enthaltend 5 x 10 5 menschliche Speiseröhre Fibroblasten, in jedem Ring. Schwemmen das Gebiet um die Außenseite des Rings mit etwa 2 ml Fibroblastenmedium. Inkubieren bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Atmosphäre.
- Nach 24 Stunden entfernen Sie die Ringe und Fibroblasten-Medium und in jede Vertiefung hinzufügen mindestens 5 ml frisches Medium Fibroblasten, sicherzustellen, dass das Gerüst vollständig in Medium eingetaucht. Kultur für 1 Woche, bei 37 ° C in einem 5% CO 2, feuchten Atmosphäre Ersetzen des Mediums alle 2 bis 3 Tage.
- Nach 1 Woche entfernen Sie die 6-Well-Platten, die die Gerüste zu einer laminaren Flut Haube, entfernen Sie das Medium invertieren und jedes Gerüst mit einer sterilen Pinzette, indem die Schleimhautoberfläche nach oben. Dieser Zeitpunkt wird als Tag 0 bezeichnet.
- Zeigen die Stahlringe auf der Schleimhautoberfläche in der Mittedas Gewebe, wie in Schritt 5.4.
- Bereiten Sie die T75-Kolben von Epithelzellen für Trypsinierung 13. Nachdem das PBS waschen und vor der Zugabe von Trypsin-EDTA-Lösung, 2 ml steriler 0,02% (w / v) EDTA-Lösung zu jedem Kolben. Inkubieren für 2 min bei 37 ° C. Tippen Sie auf den Kolben vorsichtig, um selektiv trennen Sie die i3T3 Feeder-Schicht, während die Epithelzellen gebunden.
Hinweis: Es ist in der Regel nicht sinnvoll oder notwendig zu Patient entsprechen den Epithelzellen an die Fibroblasten in der vergangenen Woche bereits in das Modell integriert. - Gießen Sie das EDTA Lösung, die die Feeder-Schicht und fügen Trypsin-EDTA-Lösung, um die Epithelzellen 13 ernten. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer 14. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension (10 min, 200 xg). Zellpellet in einem geeigneten Volumen des Verbund Medium 1, um eine endgültige Zellzahl von 5 x 10 6 Zellen pro ml herzustellen.
- In 0,2 ml Verbundmedium I, mit 1 x 10 6 Epithelzellen, innerhalb des Rings. Schwemmen das Gebiet um die Außenseite des Rings mit etwa 2 ml Verbundmedium I und legen Sie die Konstrukte in den Brutschrank bei 37 ° C in einem 5% CO 2, feuchten Atmosphäre.
- Nach 24 Stunden (Tag 1) entfernen Sie die Ringe und Mittel und fügen Sie mindestens 5 ml frisches Medium Composite-I, die Gewährleistung der Gerüste sind vollständig untergetaucht und zurück in den Inkubator. Nach weiteren 24 Stunden (Tag 2) entfernen Sie das Medium und mindestens 5 ml Composite-Medium II ersetzt, wodurch ebenfalls die Gerüste sind vollständig untergetaucht und zurück in den Inkubator.
- Am Tag 4 Ort sterile medizinischem Edelstahl Maschengitter (2 cm breit x 2 cm lang x 0,5 cm hoch), an die frische 6-Well-Platten, eine pro Konstrukt. Verwenden Sie sterile Pinzette, um die Konstrukte auf der Oberseite des Stahlgitter, Schleimhautoberfläche obersten übertragen.
- Gebe ausreichend Verbundmedium III so daß die Flüssigkeit die Unterseite der zusammengesetzten erreicht, allerdings ist die Oberflächeder Luft ausgesetzt wird, ist sichergestellt, daß die Probe bei einer Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche aufrechterhalten wird. Die genaue Menge an Prüfmedium benötigt, abhängig von der Dicke der Gerüst, das Volumen der Vertiefung und der genauen Höhe der Edelstahlgitter variieren.
- Aufrechterhaltung der Verbundstoffe in einem Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle für zwischen 10 und 20 Tagen (Tag 14 bis Tag 24), abhängig von den Anforderungen des Experiments. Ersetzen Sie den Composite-Medium III mit frischem Medium alle 2 bis 3 Tagen (Montag, Mittwoch, Freitag ist ein benutzerfreundliches Regime).
Hinweis: Nach 5 Tagen bei einer Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (Tag 9) die Konstrukte eine ausreichend reifen Ösophagusepithel in Experimenten der Auswirkungen von Umweltfaktoren auf die Ösophagusepithel verwendet werden. - Am Ende des Experiments, fixieren die Konstrukte für die histologische Analyse und immunhistochemische Färbung 7 oder Protein-Extrakt 15 oder RNA 11,16 aus dem Epithel für weitere Analytikist. Falls erforderlich, behalten die konditionierten Kulturmedium für die Analyse von extrazellulären Signalmolekülen 17.
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Representative Results
Diese Handschrift beschreibt den Prozess erforderlich ist, in schematischer Form in 1 dargestellt ist, die Kultur von 3D-Modellen des menschlichen Ösophagusepithel erfolgreich. Um die Eignung des Modells bestätigen, als Experimentierplattform histologischen und immunhistochemischen Untersuchungen wurden unternommen, den Vergleich der kultivierten Geweben mit normalen menschlichen Ösophagus-Schleimhaut.
Histologische Beurteilung der nach dem beschriebenen Verfahren hergestellten Epithels zeigt einen Reifen, mehrschichtige, Plattenepithel (2B), die vergleichbar mit der des normalen menschlichen Ösophagus (2A) beobachtet wird, wenn auch dünner (5 bis 10 Schichten von Zellen verglichen mit 10 bis 20 zur normalen Speiseröhre), wobei die Zellen schrittweise flacher und letztlich kernlosen wie sie in Richtung der Oberfläche zu wandern.
Immunhistochemische Charakterisierung der wichtigsten Marker der Proliferation und differentiation demonstrieren, dass die Mikroanatomie des Modells Epithel ist ähnlich dem normalen menschlichen Ösophagus Epithel. Vergleichbare Ki67-Expression ist sowohl in der nativen Speiseröhre und dem Modell Epithel, mit der Färbung auf einen Teil der Zellen innerhalb des basalen und sofort Suprabasalschichten (3A und 3B) begrenzt. Dies ist analog zu Studien, die berichten, dass weniger als 10% der Zellen zeigen in der Regel die Expression des Proliferationsmarkers, Ki67, im normalen Ösophagusepithel 18. CK4 wird normalerweise in geschichteter und säulen Epithelien exprimiert, ist aber in der Regel fehlt den basalen Schichten während CK14 ist nur in der untersten Schicht 19 positiv. Sowohl in der normalen und das Modell Ösophagus Epithelien wird CK14 in allen Zellen in der Basalschicht (Figuren 3D und 3E) beobachtet, während CK4 wird während des Epithels mit Ausnahme der beiden basalen Schichten beobachtet (Figuren 3G und
Versuche, die Primär-Ösophagus-Epithelzellen mit immortalisierten Epithelzellen der Speiseröhre, wie Het-1A zu ersetzen, waren weniger erfolgreich und hat kein gültiges Modell der normalen Ösophagusepithel produzieren. Eine mehrschichtige Epithel gebildet wurde; aber die proliferative Markers Ki67 wurde während des Epithels (3C) ohne Ausdruck für Differenzierungsmarker detektiert (3F, 3I und 3L), anzeigt, dass der Het-1A-Zellen produziert eine hyperproliferative Epithel ohne Anzeichen einer normalen Stratifizierung oder Reifung.
Allerdings hat das Modell gewesenerfolgreich modifiziert werden, um Tumorzellen durch den Ersatz von primären Epithelzellen entweder mit Adenokarzinom des Ösophagus (OE33) oder Plattenepithel-Karzinom (OE21) Zellen zu integrieren. Dies zeigt die Flexibilität des Modells, die seinen Einsatz bei der Untersuchung einer Reihe von Erkrankungen der Speiseröhre in verschiedenen Stadien des Fortschreitens durch die Aufnahme einer Reihe von verschiedenen Zelllinien. Es kann gesehen werden, dass es einen deutlichen Unterschied in den Reaktionen aus diesen beiden Zelllinien. OE21 Plattenepithel-Karzinomzellen erzeugt ein Epithel auf das Konstrukt als definierte gelben Bereich (4A) mit großen Spalten im Epithel (4B), wahrscheinlich dysfunktionalen Zelladhäsionsmoleküle reflektieren sichtbar. Einschließlich OE33 Adenokarzinomzellen in dem Modell führt zu einer großen Menge an Gerüst Abbau von Auge sichtbar als Verdünnungs des Gerüsts nach 2 Wochen Wachstum an der Luft / Flüssigkeits-Grenzfläche (4C) und H + E Analyse bestätigteine offensichtliche Verringerung der Dicke des Gerüsts im Bereich unterhalb der Zellen (Figur 4D). Dies ist eine eher das Ergebnis einer Wechselwirkung zwischen den Tumorzellen und Fibroblasten, da das Gerüst Degeneration nicht in Abwesenheit von Fibroblasten (4E und 4F) beobachtet. Wir haben ähnliche Auswirkungen auf die Tumorinvasion in der Gegenwart und Abwesenheit von Fibroblasten in äquivalenten Melanommodell 21 beobachtet.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Herstellung der Schleimhaut der Speiseröhre Modell menschlichen Ösophagus-Fibroblasten auf das submucosale Oberfläche des Gerüsts ausgesät und für 7 Tage kultiviert.. Das Gerüst wird invertiert, menschliche Speiseröhre Epithelzellen zugegeben und 4 Tage lang kultiviert getaucht. Das Konstrukt wird mit einem Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle für zwischen 10 und 20 da angehobenys. Am Ende des Experiments kann das Konstrukt weitere Analyse bei Bedarf zu unterziehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Vergleich von Epithel in der Speiseröhre Modell mit normalen menschlichen Ösophagusepithel H + E Analyse von (A) normalen menschlichen Ösophagusepithel und (B) Ösophagusepithel in dem Modell des menschlichen Schleimhaut der Speiseröhre gebildet produziert.. Maßstabsleiste ist 500 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung zu sehen.
Figur 4: Die Aufnahme von Tumorzelllinien indie Speiseröhre Modell. Die primären Epithelzellen wurden von der Plattenepithel-Karzinom-Zelllinie OE21 oder der Adenokarzinom-Zelllinie, OE33 ersetzt. Bilder zeigen das Konstrukt mit den OE21-Zellen (A) oder OE33 Zellen entweder in Verbindung mit (C) oder in Abwesenheit von (E) Fibroblasten, vor der Fixierung am Ende der Kulturperiode. Epithelien einschließlich OE21 (B) oder OE33-Zellen mit (D) und gegebenenfalls (F) Fibroblasten werden durch H + E-Färbung sichtbar gemacht. Maßstabsleiste ist 500 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung zu sehen.
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Discussion
Diese Handschrift beschreibt die Herstellung und Charakterisierung einer biologisch relevanten menschlichen Ösophagus-Schleimhaut-Modell geeignet für den Einsatz als experimentelle Plattform, um die Auswirkungen der Exposition gegenüber belastenden Umweltfaktoren auf die Ösophagusepithel studieren.
Die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Produktion eines menschlichen Schleimhaut der Speiseröhre Modells sind: Sicherstellung, dass die Mehrheit der Epithelzellen bleibt proliferative und nicht bereits begonnen, zu unterscheiden, bevor sie auf dem Gerüst Animpfen; Aufrechterhalten eines Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche für die zusammengesetzte korrekte Reifung des Epithels zu gewährleisten; Aufrechterhaltung der Sterilität in der erweiterten Kulturperiode.
Aufgrund der beschränkten Mengen an menschlichem Gewebe zur Zellisolierung verfügbar ist es nicht allgemein möglich, genügend Zellen aus einer Gewebeprobe frisch isolierten Zellen direkt auf das Stützgerüst und somit eine Zellexpansion ph Saatgut erhaltenase ist erforderlich, wenn die Zellen in Standard-2D-Zellkulturbedingungen gezüchtet. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Zellen in diesem Zeitraum fort proliferative. Dies wird dadurch erreicht, dass die Kulturen werden nie erlaubt, volle Konfluenz erreichen, unter Verwendung von Zellen, die in dem Modell nur bis zum Durchgang 4 und die sorgfältige Überwachung der Zellmorphologie erreicht. So Zellen sollten ihre unverwechselbare proliferative polygonale Morphologie und die tight "Kopfsteinpflaster" Pflaster-Aussehen charakteristisch proliferative Epithelzellen statt der in Kulturen, die begonnen haben, zu unterscheiden beobachtet diffuser Aussehen zu behalten. Die zweite kritische Stufe wird dadurch erreicht, daß das Zellkulturmedium bedeckt die obere Oberfläche der Edelstahlroste verwendet, die Kulturen der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, sondern der obersten Oberfläche des Konstrukts selbst nicht untergetauchten heben gesteuert. Der dritte Schritt ist abhängig von der strikten Einhaltung der erweiterten Sterilisationsprotokoll bei der Herstellung des de-cellularizedSchweine Gerüst und die Verwendung guter steriler Technik während des gesamten Prozesses.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass primären humanen Ösophagus-Zellen sind erforderlich, um einen normalen, reifen, geschichteten Epithel zu produzieren. Wenn eine immortalisierte Zelllinie verwendet wurde, wenn auch aus dem menschlichen Ösophagusepithel abgeleitet, blieben die Zellen proliferative und es versäumt, zu differenzieren, um ein reifes geschichteten Epithel zu bilden. Die resultierende Epithel konnte nicht als zufriedenstellendes Modell für die normale Epithel verwendet werden, was die Nichteignung des immortalisierte Zellinie Het-1A zur Verwendung in dem Modell. Jedoch können auch andere Zelllinien, wie die von Speiseröhrentumoren oder Barrett-Metaplasie ableitbaren in das Modell eingebracht werden, entweder anstelle von oder zusätzlich zu den primären Epithelzellen, Modelle für die Untersuchung der Tumorprogression, Invasion und der Reaktion auf pharmakologische Mittel zu erzeugen.
Experimente können mit dem Speiseröhren Modell s durchgeführt werden,imulate die Exposition der Speiseröhre zu, pulsatile Ereignisse beim Schlucken oder Reflux diskret. Dies wird durch wiederholtes Eintauchen der Konstrukte in Kulturmedium, das die Verbindung (en) zu testen und Spülen in PBS vor der Rückgabe der Konstrukt an ein Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche erreicht. Die Belichtungszeiten und Frequenz verändert werden, um den Prozess, der simuliert reflektieren, so dass die Epithelschicht während man die Kultur bei einem Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche weiter zu dem Umgebungsfaktor (en) ausgesetzt ist. Dieses Verfahren hat sich im Labor verwendet worden, um die Auswirkungen auf den normalen Rückfluß ösophagealem Epithel, wobei das Modell auf bestimmte Magen-Reflux-Komponenten für 10 Minuten zweimal täglich für 11 Tage 11 exponiert wurden. Alternativ können die Konstrukte können zur kontinuierlichen Niveau des Umweltstressfaktoren, indem diese Verbindungen in dem Kulturmedium ausgesetzt werden. Da das Epithel muß zu einer Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle für den epithe ausgesetzt werdenlium zu reifen und differen richtig 7 ist es nicht möglich, kontinuierlich tauchen die Konstrukte in dem Kulturmedium. Folglich wird die Exposition gegenüber dem Stressor nur über das submucosale Oberfläche in diesen Experimenten, die die Relevanz der Ergebnisse erhalten einschränken.
Das Verfahren ist relativ arbeitsintensiv und somit ist es besser, das Screening der relativ begrenzten Anzahl von Verbindungen geeignet ist. Als Ergebnis wird, wenn unter Verwendung des Modells als experimentelle Plattform, ist es angebracht, zunächst vorläufige Studien mit herkömmlichen Zellkulturtechniken, um eine begrenzte Anzahl von Bedingungen vor der weiteren Analyse und zur Verwendung der hier beschriebenen 11 mehrere physiologisch relevanten Speiseröhren Modell durchzuführen. Zusätzlich zur immunhistochemischen Analyse war es auch möglich, die Änderungen in der epithelialen Genexpressionsprofils nach Exposition gegenüber Umweltstressfaktoren zu untersuchen. Dies wurde durch manuelles Abstreifen der e erreichtpithelium, Extrahieren der RNA und deren Umwandlung in cDNA zu isolieren, die Gene zum Ausdruck gebracht und die Analyse von Mikroarray zu erhalten Genexpressionsprofile 11. Auf diese Weise ist es möglich, die verfügbaren Informationen aus dem Modell als experimentelle Plattform zu erhöhen. Frühe Veränderungen in der epithelialen Genexpressionsprofils folgende simulierte Exposition an der gastroösophagealen Reflux wurden vorgeschlagen und aus diesen Ergebnissen neue Bereiche wurden für eine weitere Untersuchung in der Verhinderung der Entwicklung von Barrett-Metaplasie, metaplastischen Vorläufer OAC 11 vorgeschlagen. Das Modell kann auch verwendet werden, um die Proteinexpression, wie Western-Blot-Analyse 15 und der Genexpression unter Verwendung von Northern-Blot-Analyse unter Verwendung von Verfahren 16 zu untersuchen ist. Außerdem Studien extrazellulärer Signalmoleküle könnten auf das Kulturmedium 17 durchgeführt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Herrn Roger Ackroyd, Herr Andrew Wyman und Herrn Chris Stoddard, Berater Chirurgen bei Sheffield Teaching Hospitals NHS Foundation Trust, für ihre Hilfe beim Erwerb der Speiseröhre Gewebeproben und ihre Unterstützung unserer Arbeit. Wir danken Ashraful Haque für seine Hilfe Einbeziehung Tumorzelllinien in das Modell. Wir bedanken uns für die finanzielle Unterstützung für diese Studie durch Zuschüsse aus dem Bardhan Research and Education Trust (BRET) und Yorkshire Cancer Research (YCR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | BD Biosciences | 215240 | Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilize. Warm in 37 °C water bath before use. |
| DMEM | Labtech | LM-D1112 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F12 | Labtech | LM-H1236 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Foetal Calf Serum | Labtech | FB-1090 | |
| Epidermal Growth Factor | R+D Systems | 236-EG-200 | Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS |
| Hydorcortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2767 | Prepare 10 mg/ml solution in 0.01 M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilize before use |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | Prepare stock solution in water |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Brand name Fungizone |
| PBS | Oxoid | BR0014 | Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilize |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| Povidone-iodine solution | Ecolab | 10830E | Brand name Videne |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| Newborn calf serum | Gibco | 26010074 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use use |
| O-phosphorylethanolamine | Sigma-Aldrich | P0503 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Lonza | 17-838Z | Used for composite media preparation |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA 0.02% solution | Sigma-Aldrich | E8008 | Warm in 37 °C water bath before use |
| T75 culture flask | VWR | 734-2313 | |
| 50 ml centrifuge tube | Fisher | 11819650 | |
| 15 ml universal tube | SLS | SLS7504 | |
| 180 ml pot | VWR | 216-2603 | |
| Petri dish | SLS | 150350 | |
| 6 well plate | VWR | 734-2323 | |
| stainless steel rings | Manufactured in house - medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm | ||
| steel mesh grids | Manufactured in house - sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2 cm (w) x 2 cm (d) x 0.5 cm (h) | ||
| ki67 | Novocastra | KI67-MM1-L-CE | Clone MM1. Use at 1:100. |
| CK4 | Abcam | ab9004 | Clone 6B10. Use at 1:200. |
| CK14 | Novocastra | LL002-L-CE | Clone LL002. Use at 1:200. |
| Involucrin | Novocastra | INV | Clone SY5. Use at 1:100. |
| OE21 | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| OE33 | Sigma-Aldrich | 96070808 | |
| Het-1A | ATCC-LGC | CRL-2692 | |
| Mouse 3T3 fibroblasts | ATCC-LGC | CRL-1658 | previously growth arrested by irradiation (60 Gy) |
References
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