Produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un 3D tissutale umano esofageo mucose Modello

Summary

Questo manoscritto descrive la produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un tessuto ingegnerizzato costrutto esofageo 3D preparati da normale fibroblasti esofageo umano primario e cellule epiteliali squamose seminate all'interno di un ponteggio suina de-cellularized. I risultati dimostrano la formazione di un epitelio stratificato maturo simile al normale esofago umano.

Abstract

L'incidenza di adenocarcinoma esofageo e il suo precursore, metaplasia di Barrett, sono in rapido aumento nel mondo occidentale. Inoltre adenocarcinoma esofageo ha in genere una prognosi infausta, con scarso miglioramento dei tassi di sopravvivenza negli ultimi anni. Queste sono condizioni difficili da studiare e vi è stata una mancanza di piattaforme sperimentali adatti per indagare i disturbi della mucosa esofagea.

Un modello della mucosa esofagea umano è stato sviluppato in laboratorio MacNeil che, a differenza dei sistemi di coltura cellulare 2D convenzionali, ricapitola le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice presenti in vivo e produce un maturo, epitelio stratificato simile a quello della normale umana esofago. In breve, il modello si usano cellule non trasformate normali primari fibroblasti umani esofagee e epiteliali coltivate all'interno di un ponteggio acellulare esofageo suina di derivazione. Caratterizzazione immunoistochimica di questo modelloda CK4, CK14, Ki67 e involucrina colorazione dimostra adeguata ripresa del istologico della mucosa esofagea umano.

Questo modello fornisce un robusto, modello sperimentale biologicamente rilevanti della mucosa esofagea umana. Può essere facilmente manipolato per indagare su una serie di domande di ricerca, tra cui l'efficacia di agenti farmacologici e l'impatto dell'esposizione a fattori ambientali, come l'alcool, le tossine, ad alta temperatura o componenti refluito gastro-esofageo. Il modello facilita anche periodi prolungati di coltura non ottenibili con coltura cellulare convenzionale 2D, consentendo, tra l'altro, lo studio dell'impatto di esposizione ripetuta di un epitelio maturo per l'agente di interessi per un massimo di 20 giorni. Inoltre, una varietà di linee cellulari, come quelli derivati ​​da tumori esofagei o metaplasia di Barrett, può essere incorporata nel modello per studiare processi come invasione tumorale e responsivene drogass in un ambiente più biologicamente rilevante.

Introduction

La mucosa esofagea comprende una stratificato, epitelio squamoso sopra uno strato di tessuto connettivo, la lamina propria, ed è uno dei primi siti per incontrare stress ambientali ingeriti. L'esposizione a tossine alimentari è implicato nello sviluppo del carcinoma squamoso dell'esofago, mentre reflusso duodenogastro-esofageo è un fattore critico nella patogenesi della Barrett Metaplasia, che è associata ad un aumentato rischio di progressione di adenocarcinoma esofageo. Carcinomi esofagei sono l'8 ^° più comune tumore maligno nei maschi del Regno Unito e di adenocarcinoma esofageo è in rapido aumento nel mondo occidentale ^1. Inoltre, c'è stata poca miglioramento nella prognosi della malattia, con un tasso di sopravvivenza a 5 anni complessiva di circa il 15%. Di conseguenza, vi è la necessità per le piattaforme sperimentali per studiare l'impatto dell'esposizione a fattori di stress ambientali su questo epitelio esofageo e il loro potenziale coinvolgimento nella svipment di metaplasia o neoplasia.

Sebbene linee cellulari immortalizzate o tumorali permettono ai ricercatori di studiare la risposta delle cellule epiteliali a questi fattori di stress in vitro, rimangono proliferativa e non riescono a differenziarsi in cellule epiteliali mature trovate su gli strati superficiali della mucosa esofagea. Inoltre, linee cellulari che hanno già subito tumorigenesi possono fornire solo informazioni limitate per quanto riguarda le reazioni iniziali di cellule normali all'interno dell'epitelio a fattori ambientali; e questa è la fase in cui il potenziale di intervento terapeutico potrebbe essere più alta. Infine, i sistemi di coltura cellulare convenzionali non riescono a catturare le interazioni potenzialmente importanti tra cellule epiteliali e mesenchimali e tra queste cellule e la matrice circostante che si verificano all'interno dei tessuti in vivo.

Modelli animali forniscono un microambiente più realistico per studiare le risposte del epitheli esofageoum e può incorporare l'induzione artificiale della malattia da reflusso gastro-esofageo ^2. Tuttavia può essere più impegnativo per manipolare i fattori di stress ambientali in questi modelli, e non può rappresentare appieno la risposta entro dell'esofago umano.

Altri modelli sperimentali esofagee umani sono stati sviluppati che utilizzano cellule primarie, cellule immortalizzate o linee cellulari tumorali su un collagene, o combinati collagene / Matrigel, impalcatura contenenti fibroblasti ^3,4. È meno laborioso per generare questi scaffold rispetto al ponteggio esofageo acellulare descritto in questo manoscritto, e questi modelli organotipiche fornire uno strumento utile, in particolare nello studio di invasione del ^5,6, dove l'infiltrazione delle cellule tumorali nel gel di collagene può essere prontamente osservato. Tuttavia questi gel di collagene hanno non nativi proprietà meccaniche e mancano di alcune caratteristiche del tessuto originale, tra cui una membrana basale specifico e l'appropriate topografia della superficie. Ciò può influenzare il comportamento delle cellule con conseguente, ad esempio, più povera adesione tra l'epitelio e scaffold utilizzando un gel di collagene scaffold ^7. Di conseguenza è stato sviluppato il acellulare porcine scaffold esofageo, con il vantaggio di essere un ponteggio biologicamente più realistica e quindi più appropriato per l'uso come una piattaforma sperimentale. E 'stato anche dimostrato che è preferibile incorporare cellule primarie nei costrutti esofagee di linee cellulari immortalizzate esofagee epiteliali, come Het-1A, poiché queste cellule formano un epitelio multistrato ma non riescono a stratificare o differenziare ^4,7,8 .

Di conseguenza, questo protocollo è stato adattato da un metodo già in uso in laboratorio MacNeil per fare ingegneria tessutale della pelle e della mucosa orale ^9,10 e incorpora un porcine scaffold esofageo de-cellularized combinata con cellule primarie umane esofagee epiteliali e fibroblasti. Thiprotocollo s produce un maturo, epitelio stratificato, simile a quello della normale esofago umano come dimostrato da CK4, CK14, Ki67 e involucrin colorazione. Il modello risultante fornisce una piattaforma sperimentale per studiare le risposte ai fattori di stress ambientale, ed è stato utilizzato in modo efficace per studiare i cambiamenti nell'espressione genica nell'epitelio esofageo in risposta a refluito componenti ^11.

Protocol

Cellule esofagee umane sono ottenute da pazienti sottoposti a chirurgia gastrica o esofagea. Il consenso informato è ottenuto per il tessuto da utilizzare a scopo di ricerca, e il tessuto utilizzato in modo anonimo sotto le opportune approvazioni etiche (SSREC 165/03, Tessuto umano di ricerca Bank Licenza 12179).

1. Isolamento di cellule umane esofageo epiteliali

1. Lavorando in una cappa coltura tissutale flusso laminare e con tecnica sterile, preparare il terreno di coltura epiteliale mescolando medio Modified Eagle Dulbecco (DMEM) e F12 di Ham in un rapporto 3: 1 (v: v). Aggiungere 10% (v / v) FCS, 10 ng / ml fattore di crescita epidermico, 0,4 mg / ml idrocortisone, 1,8 x 10 ^-4 M adenina, 5 mg / ml di insulina, 5 mg / ml transferrina, 2 x 10 ^-7 M triiodotironina, 1 x 10 ^-10 M tossina colerica, 2 x 10 ^-3 M glutammina, 100 IU / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, e 0,625 mg / ml anfotericina B.
2. Utilizzo di serietecniche sterili, mettono 11 ml di DMEM, 10% FCS, 2 x 10 ^-3 M L-glutammina, 100 IU / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, e 0,625 mg / ml di amfotericina B in un pallone di coltura tissutale T75. Aggiungere 1 x 10 ⁶ lethally irradiati topo fibroblasti 3T3 ¹² in 1 ml dello stesso terreno e incubare una notte a 37 ° C in un CO _2, atmosfera umidificata al 5%. Ciò produrrà uno strato alimentatore per la successiva coltura di cellule epiteliali.
3. Usando un bisturi e seguendo le raccomandazioni di un anatomopatologo, sezionare un ² campione di circa 2 cm di tessuto dallo sfondo regione libera da malattia esofagea mucosa squamosa ottenuti da pazienti sottoposti a chirurgia gastrica o esofagea. Trasporto al laboratorio in un contenitore 50 ml di terreno di trasporto sterile (PBS 100 IU / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina e 0.625 mg / ml anfotericina B) a temperatura ambiente.
4. A questo punto, memorizzare il tessuto nel trasportomezzo per fino a 12 ore (una notte) a 4 ° C, per convenienza; tuttavia non utilizzare periodi di inattività quali risultano nella vitalità cellulare ridotta.
5. Lavorando in una cappa coltura tissutale flusso laminare e con tecnica sterile, sterilizzare un bisturi per immersione in etanolo al 70% per 5 min. Sciacquare in PBS sterile.
6. Collocare il tessuto in una piastra di Petri sterile e utilizzare il bisturi per tagliare in 0,5 centimetri strisce. Aggiungere 5 ml di 0,1% (w / v) in PBS tripsina al piatto Petri, posizionare il coperchio sul piatto e incubare per 1 ora a 37 ° C.
7. Aggiungere 5 ml di FCS al tessuto in piastra di Petri di inibire la tripsina. Tenendo la striscia di tessuto con pinze sterili, raschiare delicatamente la superficie epiteliale con la lama di bisturi per 1-2 min per strip per rimuovere le cellule epiteliali nel mezzo circostante. Rimuovere il tessuto raschiato e mettere da parte. Ripetere il processo per tutte le strisce di tessuto.
8. Raccogliere il terreno contenente le cellule epiteliali staccate in una provetta da centrifuga da 15 mle centrifugare (5 min, 200 xg). Versare il surnatante e risospendere il pellet in 12 ml di terreno epiteliale (descritto al punto 1.1).
9. Eliminare e scartare il supporto dallo strato di cellule di alimentazione nel pallone T75 preparato al punto 1.2. Utilizzare una pipetta sterile per aggiungere la sospensione cellulare contenente cellule epiteliali appena isolate nel pallone e incubare a 37 ° C in 5% CO _2, atmosfera umidificata.
10. Dopo 24 ore versare fuori e scartare il terreno di coltura, che conterrà anche detriti cellulari, e sostituirlo con 12 ml di mezzo fresco epiteliale. Continuare incubando a 37 ° C in un CO _2, atmosfera umidificata al 5%. Colonie inizierà ad apparire nei prossimi 24-48 ore e possono essere visualizzati posizionando il pallone di coltura al microscopio ottico standard. Versare il terreno di coltura esaurito e sostituirlo con un volume uguale di mezzo fresco ogni 2 o 3 giorni.
11. Una volta che il pallone ha raggiunto l'80% di confluenza, il passaggio delle cellule ^13. Dividere il cells in un rapporto di 1: 5 per aumentare il numero di cellule per uso nel modello. Seguire passo 1.2 per stabilire strati di alimentazione del combustibile irraggiato 3T3 in ogni contenitore che riceverà le cellule epiteliali 24 ore prima di passaging cellule.
    Nota: utilizzare le cellule epiteliali del modello esofageo descritto di seguito tra i passaggi 1 e solo il 4.

2. Isolamento di fibroblasti umani esofagee

1. Lavorare in una cappa a flusso laminare e con tecnica sterile, prendere il tessuto accantonato nella fase 1.7. Mettere in una piastra di Petri sterile e tritare finemente da taglio con una lama di bisturi sterile. Aggiungere 10 ml di 0,5% (w / v) collagenasi Una soluzione e posizionare il coperchio sulla piastra di Petri e incubare a 37 ° C durante la notte in un CO _2, atmosfera umidificata al 5%.
2. Trasferire il digest in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare (10 min, 200 xg), con attenzione versare fuori e scartare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di terreno di coltura di fibroblasti (DMEM 10% FCS, 2 x 10 ^-3 M L-glutammina, 100 IU / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, e 0,625 mg / ml anfotericina B).
3. Posizionare la sospensione in un pallone T75 e incubare a 37 ° C in un CO _2, atmosfera umidificata al 5%. Dopo 24 ore versate fuori dal mezzo, che conterrà detriti e sostituirlo con 12 ml di terreno fresco fibroblasti. Sostituire il terreno di coltura ogni 2 o 3 giorni e le cellule di passaggio una volta raggiunto l'80% di confluenza ^13, dividendo le cellule in un rapporto 1: 5 per aumentare il numero di cellule.
   Nota: utilizzare le cellule di fibroblasti nel modello descritto di seguito tra i passaggi 4 e solo il 10.

3. Preparazione del De-cellularized esofageo Scaffold

1. Ottenere intatto suina esofagi a un mattatoio di suini Landrace appena macellati che vengono utilizzati per la produzione alimentare. Una sola esofago fornirà ponteggi sufficienti per circa 30 costrutti separati.
   Nota: A causa della vasta e ora consuming protocollo di sterilizzazione richiesto, è normalmente vale ottenimento e l'elaborazione di un minimo di 10 esofagi contemporaneamente.
2. Porre immediatamente l'esofago appena asportato in una pentola sterile 180 ml contenente circa 150 ml di soluzione di iodio-povidone 10% per 5 minuti per ridurre qualsiasi carica microbica contaminante. Trasferire l'esofago di una seconda pentola contenente circa 100 ml di PBS sterile contenente 200 UI / ml di penicillina, 200 mg / ml di streptomicina, e 1,25 mg / ml di amfotericina B.
   1. Rimettere il coperchio sul recipiente e trasportare il esofagi torna al laboratorio a temperatura ambiente. Due o tre esofagi possono essere trasportati in ciascun contenitore, a seconda delle loro dimensioni.
3. Una volta in laboratorio, gestire il tessuto in una cappa a flusso laminare con tecnica asettica per minimizzare la contaminazione microbica. Sterilizzare pinzette, forbici e lame bisturi immergendo per 5 minuti nel 70% di etanolo, e risciacquo in PBS sterile.
4. Maneggiare le esophagus utilizzando una pinzetta sterile. Utilizzando le forbici, tagliare aperto l'esofago longitudinalmente. Sciacquare il tessuto posizionando l'esofago in una pentola sterile 180 ml contenente circa 100 ml di PBS sterile e scuotendo delicatamente per rimuovere eventuali detriti.
5. Pulire una bacheca di sughero dissezione spruzzando liberamente con il 70% di etanolo e lasciare asciugare.
6. Rimuovere l'esofago dalla PBS, e l'utilizzo di aghi sterili, pin out l'esofago sul bordo, mucosa più in alto di superficie. Afferrare la superficie mucosa ad una estremità dell'esofago con una pinzetta sterile e tirare fuori dal bordo. Questo separerà mucosa dalla sottomucosa sottostante.
   1. Quindi, utilizzare un bisturi sterile per sezionare l'esofago longitudinalmente lungo la lamina propria, rimuovendo gli spilli dissezione progredisce per consentire la mucosa per essere sollevato lontano.
7. Conservare la mucosa sezionato e gettare la sottomucosa sottostante.
8. Tagliare ed eliminare i più prossimale e distale 2 cm di tegli mucosa in quanto vi è un maggior numero di ghiandole della sottomucosa e una spessa lamina propria in quelle aree, rispettivamente, ^7.
9. Utilizzare un bisturi per tagliare il tessuto rimanente in 5 centimetri ^2. Mettere tutto il tessuto tagliato in una pentola sterile 180 ml contenente circa 150 ml di PBS sterile e agitare delicatamente per lavare il tessuto. Se il trattamento più di cinque esofagi contemporaneamente, può essere necessario utilizzare più vasi per questo e le tre fasi successive.
10. Con una pinzetta sterile, trasferire il tessuto tagliato in una pentola 180 ml contenente 150 ml di sterile 1 M NaCl, 200 UI / ml di penicillina, 200 mg / ml streptomicina e 1,25 mg / ml di amfotericina B. Incubare per 72 ore a 37 ° C.
11. Collocare il tessuto in una nuova pentola 180 ml contenente 150 ml di PBS sterile. L'epitelio avrà iniziato a separare visibilmente dal tessuto sottostante. Buccia delicatamente l'epitelio staccarsi dal esofago maiale con pinza sterile e scartare.
    1. Posizionare il restante tproblema in una nuova pentola 180 ml e aggiungere 150 ml di PBS sterile. Agitare delicatamente per 5 minuti per lavare. Eliminare il PBS e ripetere altre due volte con PBS fresco.
12. Posizionare tutto il tessuto in una bottiglia di vetro da 500 ml contenente 400 ml di soluzione sterile 80% (v / v) di glicerolo soluzione per 24 ore a temperatura ambiente. Trasferimento a 400 ml di soluzione sterile 90% (v / v) di glicerolo per altre 24 ore.
13. Conservare in 400 ml di soluzione di glicerolo sterile al 100% a temperatura ambiente per un minimo di 4 mesi a disidratarsi e sterilizzare il tessuto preservando l'integrità della membrana basale.

4. Produzione della cultura mediatica

1. Preparare siero di vitello neonato chelato per l'uso nel terreno di coltura.
   1. Versare 100 g di Chelex 100 in una bottiglia di vetro 1 L e aggiungere acqua deionizzata. Il volume esatto non è critica ma acqua sufficiente deve essere aggiunto a coprire la polvere Chelex. Aggiungere un agitatore magnetico e sterilizzare in autoclave (121 ° C per15 min).
   2. Lasciare che la bottiglia si raffreddi e la Chelex di stabilirsi. In una cappa a flusso laminare versare l'acqua in eccesso, aggiungere 500 ml di siero di vitello neonato (NCS) e lasciare suscitare una notte a 4 ° C.
   3. Smettere di mescolare, lasciare il Chelex di stabilirsi, questo può richiedere fino a 30 minuti. In una cappa a flusso laminare decantare il siero chelato con una pipetta sterile, facendo attenzione a non disturbare il Chelex, e conservare in 10 ml aliquote a -20 ° C.
2. Preparare tre diversi media in una cappa a flusso laminare, che inizia con pro-proliferativa e termina con formulazioni pro-differenziativi.
   1. Preparare Composite Media I composto da DMEM e Hams F12 in un rapporto 3: 1 (v: v), 4 x 10 ^-3 M L-glutammina, 0.5 mg / ml idrocortisone, 1 x 10 ^-4 M O -phosphorylethanolamine, 2 x 10 ^-12 M triiodotironina, 1,8 x 10 ^-4 M adenina, 1,88 x 10 ^-3 M CaCl _2, 4 x 10 ^-12 M progesterone, 10 mg / ml ininsulina, 10 ug / ml transferrina, 10 ng / ml di selenio, 1 x 10 ^-3 M etanolammina e 0,1% (v / v) chelato NCS.
   2. Preparare Composite Media II come Composite Media I eccetto sostituire siero chelato con 0,1% (v / v) non chelato NCS.
   3. Preparare composito medio III come Composite Media II tranne progesterone omettere e siero aumento al 2% (v / v) non chelato NCS.

5. La produzione della mucosa esofagea modello umano

1. Eseguire il lavoro in una cappa a flusso laminare, con tecnica asettica per mantenere un ambiente sterile. Sterilizzare tutti gli strumenti da immersione in etanolo al 70% per 5 minuti, prima di risciacquare in PBS sterile.
2. Il giorno prima che sia necessario, reidratare il acellulare suina patibolo esofageo. Un pezzo di scaffold è richiesto per ogni costrutto per essere preparati.
   1. Per reidratare i tessuti posto sufficienti pezzi di ponteggio suina in una pentola contenente 100 ml di PBS sterile, agitarsi e ammollo per 10 minuti. Decant PBS e sostituirlo con PBS fresco. Ripetere il processo di lavaggio cinque volte per garantire la rimozione di ogni traccia di glicerolo.
3. Testare la sterilità scaffold incubando il tessuto reidratato notte in 100 ml di DMEM a 37 ° C. Se non vi è alcun cambiamento del colore o torbidità del terreno di coltura alla fine del periodo di incubazione del ponteggio viene considerato sterile. Una volta che la sterilità è stata confermata, posizionare il 5 centimetri ² acellulare ponteggio in un piatto ben 6, lato sottomucosa alto.
4. Inserire un anello sterile grado medico acciaio inossidabile (diametro interno 10 mm, diametro esterno 20 mm) sul centro di ciascun scaffold e premere delicatamente con pinza sterile, per garantire una tenuta adeguata con il tessuto.
5. Raccogliere i fibroblasti utilizzando Tripsina-EDTA ¹³ per produrre una sospensione cellulare. Contare le cellule utilizzando un emocitometro ^14. Centrifugare la sospensione cellulare (10 minuti, 200 xg). Risospendere il pellet di cellule in un appropriate volume di terreno fibroblasti per produrre un conteggio cellulare finale di 2,5 x 10 ⁶ cellule per ml.
6. Aggiungere 0,2 ml di terreno fibroblasti, contenente 5 x 10 ⁵ fibroblasti esofagee umani, all'interno di ogni anello. Inondare la zona intorno all'esterno dell'anello con circa 2 ml di terreno di fibroblasti. Incubare a 37 ° C in un CO _2, atmosfera umidificata al 5%.
7. Dopo 24 ore rimuovere il anelli e fibroblasti medio e aggiungere almeno 5 ml di terreno di fibroblasti fresco in ogni pozzetto, assicurando che il ponteggio è totalmente immerso nella media. Culture per 1 settimana a 37 ° C in 5% CO _2, atmosfera umidificata sostituendo la soluzione ogni 2 o 3 giorni.
8. Dopo 1 settimana rimuovere le piastre e 6 contengono i ponteggi ad una cappa diluvio laminare, rimuovere il supporto e capovolgere ogni impalcatura con pinza sterile, ponendo la superficie della mucosa superiore. Questo punto di tempo è indicato come giorno 0.
9. Posizionare gli anelli in acciaio sulla superficie della mucosa nel centro diil tessuto come al punto 5.4.
10. Preparare i flaconi T75 delle cellule epiteliali per tripsinizzazione ^13. Dopo il lavaggio PBS e prima dell'aggiunta della soluzione di tripsina-EDTA, aggiungere 2 ml di soluzione sterile 0,02% (w / v) di EDTA a ciascun contenitore. Incubare per 2 min a 37 ° C. Toccare delicatamente il pallone staccare selettivamente lo strato alimentatore i3T3 lasciando le cellule epiteliali allegati.
    Nota: Generalmente non è pratico o necessario al paziente abbinare le cellule epiteliali dei fibroblasti già incorporati nel modello della settimana precedente.
11. Eliminare la soluzione EDTA contenente il livello di alimentazione e aggiungere la soluzione tripsina-EDTA per raccogliere le cellule epiteliali ^13. Contare le cellule utilizzando un emocitometro ^14. Centrifugare la sospensione cellulare (10 minuti, 200 xg). Risospendere il pellet di cellule in un volume appropriato di composito Piano 1 per produrre un conteggio cellulare finale di 5 x 10 ⁶ cellule per ml.
12. Aggiungere 0,2 ml di composito Media I, contenente 1 x 10 ⁶ cellule epiteliali, all'interno del ring. Inondare la zona intorno all'esterno dell'anello con circa 2 ml di Composite medio I e posizionare i costrutti in incubatore a 37 ° C in 5% CO _2, atmosfera umidificata.
13. Dopo 24 ore (giorno 1) rimuovere gli anelli e medie e aggiungere almeno 5 ml di fresco Composite Medio I, garantendo i ponteggi sono completamente sommerse e tornare alla incubatrice. Dopo un ulteriore 24 ore (Day 2) rimuovere il supporto e sostituiti con almeno 5 ml di Composite Media II, ancora una volta garantendo i ponteggi sono completamente sommerse e tornare al incubatrice.
14. Il giorno 4 place grado medico sterile griglie maglia di acciaio inossidabile (2 cm di larghezza x 2 centimetri alti lunghezza x 0,5 cm), entro piastre 6 e fresco, uno per ogni costrutto. Utilizzare pinzette sterili per trasferire i costrutti sulla parte superiore delle griglie in acciaio, mucosa alto superficie.
    1. Aggiungere sufficiente Composite Piano III in modo che il liquido raggiunge la parte inferiore del composito, ma la superficie èesposto all'aria, questo assicura che il campione viene mantenuto ad una interfaccia aria-liquido. Il volume esatto di medio richiesto varierà a seconda dello spessore del ponteggio, il volume del pozzo e l'altezza esatta del reticolo in acciaio inossidabile.
15. Mantenere i compositi in un'interfaccia aria-liquido da 10 a 20 giorni (giorno 14 al giorno 24), a seconda delle esigenze dell'esperimento. Sostituire il composito medio III con terreno fresco ogni 2 o 3 giorni (Lunedi, Mercoledì, Venerdì è un regime user-friendly).
    Nota: Dopo 5 giorni a un'interfaccia aria-liquido (giorno 9) i costrutti hanno un epitelio esofageo sufficientemente maturo per essere utilizzato in esperimenti di impatto dei fattori ambientali sull'epitelio esofageo.
16. Alla fine dell'esperimento, fissare i costrutti per analisi istologica e immunoistochimica ^7, o estratto proteico ¹⁵ o RNA ^11,16 dall'epitelio per ulteriori analysè. Se necessario, trattenere il terreno di coltura condizionato per analisi di molecole di segnalazione ¹⁷ extracellulari.

Representative Results

Questo manoscritto descrive il processo necessario, indicata schematicamente in figura 1, alla cultura modelli 3D dell'epitelio esofageo umana con successo. Per confermare l'idoneità del modello come una piattaforma sperimentale istologico e gli studi di immunoistochimica sono stati intrapresi confrontando i tessuti coltivati ​​con mucosa esofagea squamose umano.

Valutazione istologica dell'epitelio prodotto con il metodo descritto mostra un maturo, multistrato, epitelio squamoso stratificato (Figura 2B) che è paragonabile a quella osservata con la normale esofago (Figura 2A) umana, seppur più sottili (da 5 a 10 strati di cellule rispetto al 10 a 20 per l'esofago normale), con le cellule diventa progressivamente più piatta e infine anuclear mentre migrano verso la superficie.

Caratterizzazione immunoistochimica di marcatori chiave di proliferazione e differentiation dimostrano che microanatomia del modello epitelio è simile al normale epitelio esofageo umana. Paragonabile espressione Ki67 è osservata sia esofago nativo e il modello dell'epitelio, con colorazione limitata a un sottoinsieme di cellule all'interno del basale e strati immediatamente soprabasali (Figure 3A e 3B). Questo è analogo a studi che riportano che meno del 10% di cellule mostrano generalmente espressione del marcatore proliferazione Ki67, nel normale epitelio esofageo ^18. CK4 è normalmente espresso in epiteli stratificati e colonnare ma è generalmente assente dagli strati basali mentre CK14 è positiva solo nello strato basale ^19. Sia il normale e il modello epiteli esofageo, CK14 si osserva in tutte le cellule nello strato basale (figure 3D e 3E) mentre CK4 viene osservato in tutto l'epitelio tranne i due strati più basali (Figure 3G e 20. Anche in questo caso sia il normale tessuto esofageo umani e lo spettacolo colorazione modello di epitelio che riflette questa (Figure 3J e 3K).

I tentativi di sostituire le cellule epiteliali esofagee primarie con le cellule epiteliali esofagee immortalizzate, come Het-1A, sono stati meno di successo e non hanno prodotto un modello valido del normale epitelio esofageo. È stato formato un epitelio più livelli; tuttavia il marcatore proliferativa Ki67 è stato rilevato durante l'epitelio (Figura 3C) senza alcuna espressione rilevato per eventuali marcatori di differenziazione (Figure 3F, 3I e 3L), indicando che le cellule Het-1A ha prodotto un epitelio iperproliferativo con nessuna evidenza di stratificazione normale o la maturazione.

Tuttavia, il modello è statosuccesso modificato per includere le cellule tumorali dalla sostituzione delle cellule epiteliali primarie sia con adenocarcinoma esofageo (OE33) o carcinoma squamoso (OE21) cellule. Ciò dimostra la flessibilità del modello, consentendo il suo uso ad istruire una gamma di disturbi esofagei a diversi stadi di progressione attraverso l'inclusione di un numero di linee cellulari differenti. Si può notare che vi è una marcata differenza nelle risposte da queste due linee cellulari. OE21 cellule di carcinoma squamoso produce un epitelio visibile sul costrutto come una regione gialla definita (figura 4A) con grandi fenditure nel epitelio (figura 4B), che possono riflettere molecole di adesione cellulare disfunzionali. Compresi cellule di adenocarcinoma OE33 all'interno dei risultati del modello in una grande quantità di degradazione scaffold, visibile ad occhio come un assottigliamento del ponteggio dopo 2 settimane di crescita all'interfaccia aria / liquido (Figura 4C) e confermato in analisi H + E comeuna evidente riduzione dello spessore del ponteggio nella regione sotto le celle (Figura 4D). Questo è un probabile essere un risultato di una interazione tra le cellule tumorali e fibroblasti, dal momento che la degenerazione scaffold non è osservata in assenza di fibroblasti (figure 4E e 4F). Abbiamo osservato effetti simili su invasione tumorale in presenza e assenza di fibroblasti in modelli melanoma equivalenti ^21.

Figura 1: schema che mostra la produzione del modello mucosa esofagea fibroblasti umani esofagee vengono seminate sulla superficie sottomucosa del ponteggio e coltivati ​​per 7 giorni.. Il ponteggio è invertita, cellule epiteliali esofagee umane aggiunte e coltivate sommerse per 4 giorni. Il costrutto viene sollevata ad una interfaccia aria-liquido per tra 10 e 20 days. Alla fine dell'esperimento costrutto può subire ulteriori analisi come richiesto. Clicca qui per vedere una versione più grande della figura.

Figura 2: Confronto dell'epitelio prodotta in modello esofagea con normale epitelio esofageo umano H + E analisi (A) normale epitelio esofageo umana e (B) dell'epitelio esofageo formata nel modello della mucosa esofagea umana.. Bar Scala è di 500 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande della figura.

(A - C), CK14 (D, E), CK4 (G, H) e involucrina colorazione (J, K). Bar Scala è di 200 micron. (Questa cifra è stata modificata. ⁷⁾ Cliccate qui per vedere una versione più grande della figura.

Figura 4: L'inclusione di linee cellulari tumorali all'internoil modello esofageo. Le cellule epiteliali primarie sono state sostituite dalla linea cellulare di carcinoma squamoso, OE21, o la linea cellulare di adenocarcinoma, OE33. Immagini mostrano il costrutto con le cellule OE21 (A) o cellule OE33 sia in combinazione con (C) o in assenza di (E) fibroblasti, prima della posa al termine del periodo di coltura. Il epiteli compreso il OE21 (B) o cellule OE33 con (D) o senza (F) fibroblasti sono visualizzati per H + E colorazione. Bar Scala è di 500 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande della figura.

Discussion

Questo manoscritto descrive la produzione e caratterizzazione di un modello mucosa esofagea umana biologicamente rilevante adatto per l'uso come una piattaforma sperimentale per studiare l'impatto dell'esposizione a fattori di stress ambientali sulla dell'epitelio esofageo.

I passi più critici per la produzione di successo di un modello mucosa esofagea umano sono: garantire che la maggior parte delle cellule epiteliali rimangono proliferativa e non hanno già cominciato a differenziarsi prima semina loro sul ponteggio; mantenendo un interfaccia aria-liquido per il composito per garantire la corretta maturazione dell'epitelio; mantenendo la sterilità durante il periodo di coltura prolungato.

A causa delle limitate quantità di tessuto umano disponibili per l'isolamento delle cellule non è generalmente possibile ottenere cellule sufficienti da un singolo campione di tessuto per seminare cellule appena isolate direttamente sul ponteggio e conseguentemente un ph espansione delle cellulease è richiesto se le cellule sono coltivate in condizioni standard 2D coltura cellulare. È importante garantire che cellule rimangono proliferativa durante questo periodo. Ciò si ottiene facendo in modo che le culture non sono mai permesso di raggiungere la piena confluenza, utilizzando cellule nel modello solo fino a passaggio 4 e monitorando attentamente la morfologia cellulare. Così le cellule dovrebbero mantenere il loro distintivo morfologia poligonale proliferativa e stretto "ciottoli" marciapiede come aspetto caratteristico delle cellule epiteliali proliferative, piuttosto che l'aspetto più diffuso osservata in culture che hanno cominciato a differenziarsi. Il secondo passo critico è controllata facendo in modo che il mezzo di coltura cellulare copre la superficie superiore delle griglie in acciaio inossidabile utilizzati per sollevare le culture all'interfaccia aria-liquido, ma la superficie superiore del costrutto sé non è sommerso. Il terzo passo è dipende dalla stretta aderenza al protocollo di sterilizzazione estesa quando si produce la de-cellularizedscaffold suina e l'uso di buona tecnica sterile durante tutto il processo.

I nostri risultati dimostrano che le cellule esofagee umane primarie sono tenuti a produrre una normale, maturo, epitelio stratificato. Se è stata utilizzata una linea cellulare immortale, seppur derivato dall'epitelio esofageo umano, le cellule rimaste proliferativa e non è riuscito a differenziarsi per formare un epitelio stratificato maturo. L'epitelio risultante non poteva essere usato come modello soddisfacente per l'epitelio normale, dimostrando l'inadeguatezza della linea cellulare immortale Het-1A per l'uso nel modello. Tuttavia altre linee cellulari come quelli derivati ​​da tumori esofagei o metaplasia di Barrett può essere incorporato nel modello sia in sostituzione o in aggiunta alle cellule epiteliali primarie per produrre modelli per lo studio della progressione del tumore, invasione e la risposta agli agenti farmacologici.

Gli esperimenti possono essere eseguiti utilizzando il modello esofagea per simulate l'esposizione dell'esofago a discreti, eventi pulsatili durante la deglutizione o reflusso. Ciò si ottiene ripetutamente immergendo i costrutti in terreno di coltura contenente il composto (s) da testare e risciacquo in PBS prima di restituire il costrutto a un'interfaccia aria-liquido. I tempi e la frequenza di esposizione possono essere modificati per riflettere il processo simulato, assicurando che lo strato epiteliale è esposto al fattore ambientale (s), consentendo la coltura di continuare ad un'interfaccia aria-liquido. Questo metodo è stato utilizzato nel nostro laboratorio per studiare l'impatto del reflusso sul normale epitelio esofageo, dove il modello è stato esposto a specifici componenti di reflusso gastro-esofageo per 10 minuti due volte al giorno per 11 giorni ^11. In alternativa, i costrutti possono essere esposti a continui livelli di stress ambientali, includendo questi composti nel terreno di coltura. Tuttavia, poiché l'epitelio devono essere esposte ad una interfaccia aria-liquido per la epithelium di maturare e differenziare correttamente ^7, non è possibile immergere continuamente i costrutti nel mezzo di coltura. Di conseguenza, l'esposizione al fattore di stress sarà solo attraverso la superficie sottomucosa in questi esperimenti, che possono limitare la pertinenza dei risultati ottenuti.

La tecnica è relativamente laborioso e di conseguenza è più adatto per la proiezione di numero relativamente limitato di composti. Come risultato, quando si utilizza il modello come una piattaforma sperimentale, è opportuno effettuare prima studi preliminari che utilizzano tecniche di coltura cellulare convenzionali per identificare un numero limitato di condizioni prima di ulteriori analisi utilizzando il modello più fisiologicamente rilevanti esofageo qui ¹¹ descritto. Oltre ad analisi immunoistochimica è stato anche possibile esaminare i cambiamenti del profilo di espressione genica epiteliale dopo l'esposizione a stress ambientali. Questo è stato ottenuto mettendo a nudo manualmente via la postapithelium, estrarre l'RNA e la sua conversione in cDNA isolare i geni di essere espressi e analisi mediante microarray per ottenere profili di espressione genica ^11. In questo modo è stato possibile aumentare le informazioni disponibili dal modello come una piattaforma sperimentale. Primi cambiamenti nella profilo di espressione genica epiteliali a seguito di esposizione simulata al reflusso gastro-esofageo sono stati proposti e da questi risultati sono state proposte nuove aree per ulteriori indagini nella prevenzione dello sviluppo di Barrett Metaplasia, il precursore metaplastica di OAC ^11. Il modello può essere utilizzato anche per studiare l'espressione di proteine ​​utilizzando metodi come Western blot ¹⁵ e l'espressione genica mediante analisi Northern blot ^16. Inoltre studi di molecole di segnalazione extracellulari possono essere eseguite sul terreno di coltura ^17.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trypsin	BD Biosciences	215240	Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilize. Warm in 37 °C water bath before use.
DMEM	Labtech	LM-D1112	Warm in 37 °C water bath before use
Ham's F12	Labtech	LM-H1236	Warm in 37 °C water bath before use
Foetal Calf Serum	Labtech	FB-1090
Epidermal Growth Factor	R+D Systems	236-EG-200	Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS
Hydorcortisone	Sigma-Aldrich	H0396	Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use
Adenine	Sigma-Aldrich	A2786	Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use
Insulin	Sigma-Aldrich	I2767	Prepare 10 mg/ml solution in 0.01 M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilize before use
Transferrin	Sigma-Aldrich	T2036	Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T2752	Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052	Prepare stock solution in water
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Brand name Fungizone
PBS	Oxoid	BR0014	Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilize
Collagenase A	Roche	10103578001
Povidone-iodine solution	Ecolab	10830E	Brand name Videne
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901
Newborn calf serum	Gibco	26010074
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use use
O-phosphorylethanolamine	Sigma-Aldrich	P0503	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use
ITS (insulin, transferrin, selenium)	Lonza	17-838Z	Used for composite media preparation
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T3924	Warm in 37 °C water bath before use
EDTA 0.02% solution	Sigma-Aldrich	E8008	Warm in 37 °C water bath before use
T75 culture flask	VWR	734-2313
50 ml centrifuge tube	Fisher	11819650
15 ml universal tube	SLS	SLS7504
180 ml pot	VWR	216-2603
Petri dish	SLS	150350
6 well plate	VWR	734-2323
stainless steel rings			Manufactured in house - medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm
steel mesh grids			Manufactured in house - sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2 cm (w) x 2 cm (d) x 0.5 cm (h)
ki67	Novocastra	KI67-MM1-L-CE	Clone MM1. Use at 1:100.
CK4	Abcam	ab9004	Clone 6B10. Use at 1:200.
CK14	Novocastra	LL002-L-CE	Clone LL002. Use at 1:200.
Involucrin	Novocastra	INV	Clone SY5. Use at 1:100.
OE21	Sigma-Aldrich	96062201
OE33	Sigma-Aldrich	96070808
Het-1A	ATCC-LGC	CRL-2692
Mouse 3T3 fibroblasts	ATCC-LGC	CRL-1658	previously growth arrested by irradiation (60 Gy)