Summary
Dette manuskriptet beskriver produksjon, karakterisering og potensielle anvendelser av en vev konstruert 3D esophageal konstruere forberedt fra normal primære humane esophageal fibroblast og squamous epitelceller seeded innenfor en de-cellularized svin stillaset. Resultatene viser dannelsen av et modent stratifisert epitel lik den normale humane spiserøret.
Abstract
Forekomsten av både esophageal adenokarsinom og dens forløper, Barretts Metaplasi, stiger raskt i den vestlige verden. Videre esophageal adenokarsinom har generelt en dårlig prognose, med liten forbedring i overlevelse de siste årene. Disse er vanskelige forhold for å studere og det har vært en mangel på egnede eksperimentelle plattformer for å undersøke sykdommer i spiserøret mucosa.
En modell av det menneskelige esophageal mucosa har blitt utviklet i laboratoriet MacNeil som, i motsetning til konvensjonell 2D-cellekultursystemer, sammenfatter de celle-celle og celle-matriks-vekselvirkninger er tilstede in vivo og gir et modent, stratifisert epitel lik som den normale humane spiserøret. I korthet benytter modell ikke-transform normale primære humane fibroblaster esophageal og epitelceller dyrket i et svine-avledet acellulær esophageal stillaset. Immunhistokjemisk karakterisering av denne modellenav CK4, CK14, Ki67 og involucrin farging demonstrerer riktig gjentagelse av histologi av den normale menneskelige esophageal slimhinner.
Denne modellen tilveiebringer en robust, biologisk relevant eksperimentell modell av det menneskelige esophageal mucosa. Det kan lett bli manipulert til å etterforske en rekke problemstillinger, inkludert effekten av farmakologiske midler og virkningen av eksponering for miljøfaktorer som alkohol, giftstoffer, høy gastro-esophageal refluksatet komponenter temperatur eller. Modellen forenkler også utvidede kultur perioder ikke oppnåelig med konvensjonelle 2D cellekultur, slik at blant annet studiet av effekten av gjentatt eksponering av en moden epitel til agent av interesse for opp til 20 dager. Videre er en rekke cellelinjer, slik som de som er avledet fra tumorer eller esophageal Barretts Metaplasi, kan bli innlemmet i en modell for å undersøke prosesser som tumorinvasjon og medikament responsiveness i en mer relevant biologisk miljø.
Introduction
Spiserør mucosa omfatter en lagdelt, plateepitel over et lag av bindevev, lamina propria, og er en av de første områder til å støte inntatte frie radikaler. Eksponering for diett toksiner er implisert i utviklingen av esophageal plateepitel carcinom, mens duodenogastro-esophageal reflux er en kritisk faktor i patogenesen av Barretts Metaplasi, som er forbundet med økt risiko for progresjon til esophageal adenokarsinom. Esophageal karsinomer er den 8. vanligste ondartet svulst i britiske menn og esophageal adenokarsinom er raskt økende i den vestlige verden en. Videre har det vært liten bedring i sykdomsprognose, med en samlet 5-års overlevelse på rundt 15%. Følgelig er det et behov for eksperimentelle plattformer for å undersøke effekten av eksponering for miljømessige belastninger på denne esophageal epitel og deres potensielle engasjement i utvikledepment av metaplasia eller neoplasi.
Selv immortaliserte eller tumorcellelinjer tillater forskere å undersøke responsen til epitelceller i disse stressfaktorer in vitro, forblir de proliferative og unnlater å differensiere til modne epitelceller som finnes på de øverste lagene i esophageal mucosa. Videre kan cellelinjer som allerede har gjennomgått tumorigenesis gir bare begrenset informasjon om de innledende reaksjoner av normale celler i epitelet til miljøfaktorer; og dette er scenen når potensialet for terapeutisk intervensjon kan være høyest. Til slutt, konvensjonelle cellekultursystemer mislykkes i å fange opp potensielt viktige interaksjoner mellom epitelceller og mesenchymale celler, og mellom disse celler og den omgivende grunnmasse som oppstår i vev in vivo.
Dyremodeller gir et mer realistisk mikromiljøet for å studere svarene av esophageal epithelium og kan innlemme den kunstige induksjon av gastro-esophageal reflux sykdom 2. Men det kan være mer utfordrende å manipulere miljømessige stressfaktorer i disse modellene, og de kan ikke fullt ut representerer svar innen den menneskelige spiserøret.
Andre eksperimentelle menneskelige esophageal modeller har blitt utviklet som utnytter primærceller, udødeliggjort celler eller tumorcellelinjer på en kollagen, eller kombinert kollagen / Matrigel, stillas inneholder fibroblaster 3,4. Den er mindre arbeidskrevende å generere disse stillaser enn acellulær esophageal stillas som er beskrevet i dette manuskriptet, og disse organotypiske modellene gir et nyttig verktøy, spesielt i studiet av tumorinvasjon 5,6, hvor tumorcelleinfiltrasjon inn i kollagen gel kan lett observert. Men disse kollagen gels har ikke-innfødte mekaniske egenskaper og mangler enkelte funksjoner i den opprinnelige vev, inkludert en bestemt basalmembran og appropriate overflatetopografi. Dette kan påvirke oppførselen av celler som resulterer i for eksempel dårligere adhesjon mellom epitel og stillaset ved bruk av en gel av kollagen stillas 7. Som en konsekvens av dette acellulær porcint esophageal stillaset ble utviklet, med fordelen av å være et mer realistisk biologisk stillaset og således mer passende for bruk som en eksperimentell plattform. Det har også vist seg at det er bedre å innlemme primære celler i esophageal konstruksjonene enn udødeliggjorte esophageal epiteliale cellelinjer, for eksempel Het-1A, siden disse cellene danner en flerlags epitel, men unnlater å stratifisere eller differensiere 4,7,8 .
Følgelig har denne protokollen er tilpasset fra en metode som allerede er i bruk i MacNeil laboratoriet for å gjøre vevet konstruert hud og slimhinner i munnen 9,10 og har en de-cellularized porcin esophageal stillaset kombineres med primære humane esophageal epitelceller og fibroblaster. This protokollen produserer en moden, stratifisert epitel, lik som den normale humane spiserøret som demonstrert ved CK4, CK14, og Ki67 involucrin farging. Den resulterende modellen gir en eksperimentell plattform for å studere respons på miljøstressfaktorer, og har vært brukt effektivt til å undersøke endringer i genekspresjon i esophageal epitelet i respons til refluksatet komponenter 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humane esophageal celler oppnås fra pasienter som gjennomgår kirurgi mage eller spiserør. Informert samtykke er innhentet for vev som skal brukes til forskningsformål, og vevet brukes anonymt under riktige etiske godkjenninger (SSREC 165/03, Human Forskning Tissue Bank Licence 12179).
1. Isolering av menneskelige Esophageal Epitelceller
- Å arbeide i en laminær strømningshette vevskultur og ved hjelp av steril teknikk, fremstille den epiteliale kulturmediet ved blanding av Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) og Hams F12 i et 3: 1 forhold (v: v). Tilsett 10% (v / v) FCS, 10 ng / ml epidermal vekstfaktor, 0,4 ug / ml hydrokortison, 1,8 x 10 -4 M adenin, 5 ug / ml insulin, 5 ug / ml transferrin, 2 x 10 -7 M trijodtyronin, 1 x 10 -10 M koleratoksin, 2 x 10 -3 M glutamin, 100 IU / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, og 0,625 ug / ml amfotericin B.
- Ved hjelp av standardsterile teknikker, satt 11 ml av DMEM, 10% FCS, 2 x 10 -3 M L-glutamin, 100 IU / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, og 0,625 ug / ml amfotericin B i en T75 vevskulturkolbe. Legg 1 x 10 6 letalt bestrålte mus 3T3 fibroblaster 12 i 1 ml av det samme mediet og inkuberes over natten ved 37 ° C i en 5% CO2, fuktig atmosfære. Dette vil gi en matesjikt for den etterfølgende kultur av epitelceller.
- Ved hjelp av en skalpell og følge anbefalinger fra en histopathologist, dissekere en ca 2 cm 2 prøve av vev fra sykdomsfri bakgrunn regionen esophageal plateepitel slimhinnen hentet fra pasienter som gjennomgår gastrisk eller esophageal kirurgi. Transport til laboratoriet i en 50 ml beholder med sterilt transportmedium (PBS 100 IU / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 0,625 ug / ml amfotericin B) ved romtemperatur.
- På dette tidspunkt lagrer vevet i transportmedium i opptil 12 timer (over natten) ved 4 ° C, for enkelhets skyld; men bruker ikke lengre lagringsperioder som de resultere i redusert celle levedyktighet.
- Arbeide i en laminær vev kultur hette og bruk steril teknikk, sterilisere en skalpell blad ved å dyppe i 70% etanol i 5 min. Skyll i steril PBS.
- Plasser vevet i en steril petriskål og bruke skalpell for å skjære den i 0,5 cm strimler. Tilsett 5 ml 0,1% (w / v) trypsin i PBS til petriskål, legg lokket på fatet og inkuberes i 1 time ved 37 ° C.
- Tilsett 5 ml av FCS til vevet i petriskål for å inhibere trypsin. Å holde den stripen av vev med steril pinsett, forsiktig skrape epiteloverflaten med skalpellblad i 1-2 min per strimmel for å fjerne epitelceller i det omgivende medium. Fjern skrapt vev og sett til side. Gjenta prosessen for alle vev strimler.
- Samle det medium som inneholder de frittliggende epitelceller i et 15 ml sentrifugerørog sentrifuge (5 minutter, 200 x g). Hell av supernatanten og resuspender pelleten i 12 ml epitel medium (beskrevet i trinn 1.1).
- Hell av og kast mediet fra materen cellelaget i T75-kolbe fremstilt i trinn 1.2. Bruk av en steril pipette til å legge cellesuspensjonen inneholdende de nylig isolerte epitelceller til kolben og inkuber ved 37 ° C i en 5% CO2, fuktig atmosfære.
- Etter 24 timer helles av og kastes dyrkningsmediet, som også vil inneholde celleavfall, og erstatte med 12 ml friskt medium epitel. Fortsett inkubering ved 37 ° C i en 5% CO2, fuktig atmosfære. Kolonier vil begynne å dukke opp i løpet av de neste 24 til 48 timer og kan sees ved å plassere kulturflaske under en standard lysmikroskop. Hell av brukt dyrkningsmediet og erstatte med et like stort volum ferskt medium hver 2 til 3 dager.
- Når kolben har nådd 80% sammenflyting, passasje cellene 13. Splitte calen i et forhold på 1: 5 for å øke antall celler for anvendelse i modellen. Følg trinn 1.2 for å etablere næringslag av bestrålt 3T3-celler i hver flaske som skal motta epitelceller 24 timer før aging cellene.
Merk: Bruk epitelceller i esophageal modellen beskrevet nedenfor mellom passasjene 1 og 4 bare.
2. Isolering av menneske Esophageal Fibroblaster
- Arbeide i en laminær kabinett og bruke steril teknikk, ta vev avsatt i trinn 1.7. Plasser i en steril petriskål og hakke fint ved chopping med en steril skalpell blad. Tilsett 10 ml 0,5% (vekt / volum) kollagenase En løsning og plassere lokket på petriskålen og inkuber ved 37 ° C over natten i en 5% CO2, fuktig atmosfære.
- Overfør Digest til et 15 ml sentrifugerør og sentrifuge (10 minutter, 200 x g), forsiktig helles av og kast supernatanten og resuspender pelleten i 10 ml fibroblast kulturmedium (DMEM 10% FCS, 2 x 10 -3 M L-glutamin, 100 IU / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, og 0,625 ug / ml amfotericin B).
- Plassere suspensjonen i en T75-kolbe og inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO2, fuktig atmosfære. Etter 24 timer helle av mediet, som vil inneholde rusk og erstatte med 12 ml frisk fibroblast medium. Sett på kulturmediet hver 2 til 3 dager, og passasje celler når de har nådd 80% sammenflyting 13, splitte cellene i et 1: 5-forhold for å øke celle tall.
Merk: Bruk fibroblastceller i modellen beskrevet nedenfor mellom passasjene 4 og 10 bare.
3. Utarbeidelse av De-cellularized Esophageal Stillas
- Skaff intakt svin spiserør ved et slakteri fra ferske slaktet Landrace griser som brukes til matproduksjon. Ett enkelt spiserør vil gi tilstrekkelige stillaser for ca 30 separate konstruksjoner.
Merk: På grunn av den omfattende og tid consuming sterilisering protokoll som kreves, er det normalt verdt innhenting og behandling av minimum 10 spiserør på en gang. - Umiddelbart plassere ferskt skåret spiserøret inn i en 180 ml steril potten inneholdende ca. 150 ml 10% povidon-jod-løsning i 5 minutter for å redusere et eventuelt forurensende mikrobiell belastning. Overfør spiserøret til en andre potten inneholdende ca. 100 ml steril PBS inneholdende 200 IU / ml penicillin, 200 ug / ml streptomycin, og 1,25 ug / ml amfotericin B.
- Sett lokket på beholderen og transportere spiserør tilbake til laboratoriet ved romtemperatur. To eller tre spiserør kan transporteres i hver beholder, avhengig av deres størrelse.
- Når på laboratoriet, håndtere vevet i en laminær hette ved bruk av aseptisk teknikk for å minimere mikrobiell kontaminasjon. Sterilisere pinsett, saks og skalpellblader ved bløtlegging i 5 min i 70% etanol, og skylling i steril PBS.
- Håndter esophagus bruker sterile pinsetter. Ved hjelp av saks, klippe åpen spiserøret i lengderetningen. Skyll vev ved å plassere spiserøret inn i en 180 ml steril potten inneholdende ca. 100 ml steril PBS og forsiktig risting for å fjerne eventuelle rester.
- Rengjør en kork disseksjon bord ved å spraye rikelig med 70% etanol og la tørke.
- Fjern spiserøret fra PBS, og ved hjelp av sterile nåler, pin ut spiserøret inn i styret, slimhinnen øverst. Ta tak i slimhinnen i den ene enden av spiserøret med steril pinsett og dra bort fra brettet. Dette vil skille mucosa fra den underliggende submucosa.
- Deretter bruker en steril skalpell blad å dissekere spiserøret i lengderetningen langs lamina propria, fjerne pinner som disseksjon utvikler seg slik at slimhinnen kan løftes vekk.
- Behold dissekert slimhinner og kast den underliggende submucosa.
- Klipp av og kast de proksimale og distale 2 cm av tHan slimhinne som det er et større antall submukosale kjertler og en tykkere lamina propria i disse områdene, henholdsvis 7.
- Bruk en skalpell til å kutte de resterende vevet inn 5 cm 2. Plassere alle kuttet vevet inn i en 180 ml steril potten inneholder ca 150 ml steril PBS og agitere forsiktig å skylle vev. Dersom behandlingen mer enn fem spiserør på en gang, kan det være nødvendig å bruke flere gryter for dette og de tre etterfølgende trinn.
- Ved hjelp av sterile pinsetter, overføre snitt vevet inn i en 180 ml gryte som inneholder 150 ml steril 1 M NaCl, 200 IU / ml penicillin, 200 ug / ml streptomycin og 1,25 ug / ml amfotericin B. inkuberes i 72 timer ved 37 ° C.
- Plasser vevet inn i en ny 180 ml pot inneholder 150 ml steril PBS. Epitelet vil ha begynt å synlig skille fra det underliggende vevet. Forsiktig skrelle løsne epitel fra gris øsofagus med steril tang og kast.
- Legg den gjenværende tproblemet i en fersk 180 ml gryte og tilsett 150 ml steril PBS. Agitere forsiktig i 5 min for å vaske. Hell av PBS og gjenta ytterligere to ganger med frisk PBS.
- Plasser alt vevet inn i en 500 ml glassflaske som inneholdt 400 ml steril 80% (v / v) glycerol-løsning i 24 timer ved romtemperatur. Overføring til 400 ml steril 90% (v / v) glycerol-løsning i ytterligere 24 timer.
- Oppbevar i 400 ml steril 100% glycerol-løsning ved romtemperatur i minst 4 måneder for å tørke og sterilisere vevet samtidig bevare integriteten av basalmembranen.
4. Produksjon av Culture Media
- Forbered chelaterte nyfødt kalveserum for anvendelse i dyrkningsmediet.
- Hell 100 g av Chelex 100 til en glassflaske og en L legge til de-ionisert vann. Den nøyaktige volum er ikke kritisk, men tilstrekkelig mengde vann må tilsettes for å dekke Chelex pulver. Legg til en magnetrører og sterilisere ved autoklavering (121 ° C i15 min).
- Tillat flasken avkjøles og Chelex å avgjøre. I en laminær kabinett hell av overflødig vann, tilsett 500 ml nyfødt kalv serum (NCS) og la røre over natten ved 4 ° C.
- Stopp omrøring og la Chelex å bosette, dette kan ta opp til 30 min. I en laminær kabinett dekanter chelated serum ved hjelp av en steril pipette, tar seg ikke å forstyrre Chelex, og butikken i 10 ml porsjoner ved -20 ° C.
- Forbered tre ulike medier i en laminær kabinett, som starter med pro-proliferativ og slutter med pro-differensierende formuleringer.
- Forbered Composite medium I består av DMEM og Hams F12 i et 3: 1 forhold (v: v), 4 x 10 -3 M L-glutamin, 0,5 ug / ml hydrokortison, 1 x 10 -4 M O -phosphorylethanolamine, 2 x 10 -12 M trijodtyronin, 1,8 x 10 -4 M adenin, 1,88 x 10 -3 M CaCl2, 4 x 10 -12 M progesteron, 10 ug / ml iSulin, 10 ug / ml transferrin, 10 ng / ml selen, 1 x 10 -3 M etanolamin og 0,1% (v / v) gelatert NCS.
- Forbered Composite Medium II som Composite Medium Jeg bortsett erstatte chelated serum med 0,1% (v / v) ikke-chelated norsk sokkel.
- Forbered Composite Medium III som Composite Medium II unntatt utelate progesteron og økning serum til 2% (v / v) ikke-chelated norsk sokkel.
5. Produksjon av Human Esophageal Mucosa Model
- Utføre alt arbeid i en laminær hette, ved bruk av aseptisk teknikk for å opprettholde et sterilt miljø. Sterilisere alle verktøy ved bløtlegging i 70% etanol i 5 minutter, før du skyller i steril PBS.
- Dagen før det er nødvendig, rehydrere acellulær porcine esophageal stillaset. En del av stillaset er nødvendig for hver konstruksjon for å være forberedt.
- Å rehydrere vevet sted tilstrekkelige stykker av svin stillas i en pott som inneholder 100 ml steril PBS, agitere og bløt i 10 min. Decant PBS og erstatte med frisk PBS. Gjenta vaskingen fem ganger for å sikre fjerning av alle spor glyserol.
- Test stillaset sterilitet ved inkubering av rehydrert vevet over natten i 100 ml DMEM ved 37 ° C. Dersom det ikke er noen endring i farge eller turbiditeten av kulturmediet på slutten av inkubasjonsperioden stillaset er antatt å være sterilt. Når sterilitet er bekreftet, plasserer 5 cm 2 acellulær stillas til en 6-brønners plate, submucosal side øverst.
- Plasser en steril medisinsk kvalitet rustfritt stål ring (innvendig diameter 10 mm, ytre diameter 20 mm) på midten av hver stillas og trykk forsiktig ned ved hjelp av sterile pinsetter, for å sikre en tilstrekkelig tetning med vevet.
- Høste fibroblaster ved hjelp av Trypsin-EDTA 13 for å fremstille en cellesuspensjon. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer 14. Sentrifuger cellesuspensjonen (10 min, 200 xg). Resuspender cellepelleten i en appropriate volum av fibroblast medium for å produsere en endelig celletall på 2,5 x 10 6 celler pr ml.
- Legg 0,2 ml fibroblast medium, inneholdende 5 x 10 5 humane esophageal fibroblaster, i hver ring. Svømme området rundt utsiden av ringen med tilnærmet 2 ml fibroblast medium. Inkuber ved 37 ° C i en 5% CO2, fuktig atmosfære.
- Etter 24 timers fjerne ringer og fibroblast medium og legge til minst 5 ml frisk fibroblast medium til hver brønn, slik at stillaset er totalt oppslukt i medium. Kultur for en uke ved 37 ° C i en 5% CO2, fuktig atmosfære erstatte mediet hver 2 til 3 dager.
- Etter en uke fjerne 6 brønners plater som inneholder stillasene til en laminær flom hette, fjerne medium og invertere hver stillaset ved hjelp steril tang, plassere slimhinnen øverst. Dette tidspunktet refereres til som dag 0.
- Plasser stålringene på slimhinneoverflaten i sentrum avvevet som i trinn 5.4.
- Forbered T75 kolber av epitelceller for trypsinization 13. Etter at PBS vaske og før tilsetningen av trypsin-EDTA-oppløsning, tilsett 2 ml steril 0,02% (w / v) EDTA-løsning til hver kolbe. Inkuber i 2 min ved 37 ° C. Tapp forsiktig kolben til selektivt løsne i3T3 mater lag samtidig la epitelceller vedlagt.
Merk: Det er generelt ikke praktisk eller nødvendig til pasient matche epitelceller til fibroblaster allerede innarbeidet i modellen forrige uke. - Hell av EDTA-oppløsning inneholdende matelaget og tilsett trypsin-EDTA-oppløsning for å høste de epitelceller 13. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer 14. Sentrifuger cellesuspensjonen (10 min, 200 xg). Resuspender cellepelleten i et egnet volum av komposittmedium 1 for å fremstille en endelig celletall på 5 x 10 6 celler pr ml.
- Legg 0,2 ml Composite Medium I, inneholdende 1 x 10 6 epitelceller, innenfor ringen. Svømme området rundt utsiden av ringen med tilnærmet 2 ml av kompositt medium I og plassere konstruksjonene inn i inkubator ved 37 ° C i en 5% CO2, fuktig atmosfære.
- Etter 24 timer (dag 1) fjerne de ringer og medium og legge til minst 5 ml frisk Composite Medium jeg, som sikrer stillasene er helt nedsenket og gå tilbake til inkubatoren. Etter ytterligere 24 timer (dag 2) fjerne mediet og erstattes med minst 5 ml av kompositt Medium II, igjen slik at stillasene er helt nedsenket og gå tilbake til inkubatoren.
- På dag fire sted sterilt medisinsk karakter rustfritt stål tråd-nett (2 cm brede x 2 cm lang x 0,5 cm høy), inn ferske 6 brønners plater, én per konstruksjon. Bruk sterile pinsetter for å overføre konstruksjonene på toppen av stålnett, slimhinnen øverst.
- Tilsett tilstrekkelig Composite Medium III, slik at væsken når undersiden av den sammensatte, men overflaten erutsettes for luft, sikrer dette at prøven holdes ved en luft-væske-grenseflate. Det nøyaktige volum av medium som kreves, vil variere avhengig av tykkelsen av stillaset, volumet av brønnen og den nøyaktige høyde av det rustfrie stålnett.
- Oppretthold komposittene ved en luft-væske-grensesnittet for mellom 10 og 20 dager (dag 14 til dag 24), avhengig av kravene i eksperimentet. Bytt ut Composite Medium III med friskt medium hver 2 til 3 dager (mandag, onsdag, fredag er en brukervennlig regime).
Merk: Etter 5 dager ved en luft-væske-grenseflate (dag 9) konstruksjonene har et tilstrekkelig moden esophageal epitel som skal anvendes i eksperimenter av virkningen av miljøfaktorer på esophageal epitel. - Ved slutten av eksperimentet, feste konstruksjonene for histologisk analyse og immunhistokjemisk farging 7, eller ekstrakt 15 protein eller RNA 11,16 fra epitelet for ytterligere analyser. Hvis det er nødvendig, beholder det kondisjonerte kulturmediet for analyse av ekstracellulære signalmolekyler 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette manuskriptet beskriver prosessen er nødvendig, er vist i skjematisk form på figur 1, til dyrknings 3D-modeller av human epitel esophageal med hell. For å bekrefte egnetheten av modellen som en eksperimentell plattform histologiske og immunhistokjemiske studier har blitt gjennomført sammenligne de dyrkede vev med normal menneskelig esophageal plateepitel slimhinnen.
Histologisk vurdering av epitel fremstilt ved fremgangsmåten beskrevet viser en moden, flerlags, stratifisert plateepitel (figur 2B), som er sammenlignbar med den som observeres med den normale humane spiserøret (figur 2A), dog tynnere (5 til 10 lag av celler sammenlignet med 10 til 20 for normal spiserøret), og cellene blir progressivt flatere og til slutt anuclear som de vandrer mot overflaten.
Immunhistokjemisk karakterisering av viktige markører for spredning og differentiation demonstrerer at mikroanatomi av modellen epitelet er lik den normale humane esophageal epitel. Sammenlignbare Ki67 ekspresjon observeres i både den native spiserøret og modellen epitel, med flekker begrenset til en undergruppe av celler i basal og umiddelbart suprabasal lag (Figurene 3A og 3B). Dette er analogt med studier som rapporterer at mindre enn 10% av cellene viser generelt uttrykk for spredning markør, Ki67, i den normale esophageal epitel 18. CK4 normalt uttrykt i lagdelt og søyle epithelia men er generelt fraværende fra basal lag mens CK14 er bare positivt i basal laget 19. I både den normale og modellen esophageal epitel, er CK14 observert i alle celler i basallaget (figurene 3D og 3E), mens CK4 er observert i hele epitelet med unntak av de to mest basale lag (figur 3G og
Forsøk på å erstatte de primære esophageal epitelceller med immortaliserte esophageal epitelceller, for eksempel Het-1A, var mindre vellykket og førte ikke til en gyldig modell av den normale esophageal epitel. En flerlags epitel ble dannet; imidlertid den proliferative Ki67 ble detektert i løpet av epitelet (figur 3C) med ingen ekspresjon detektert for alle markører for differensiering (fig 3F, 3I og 3L), noe som indikerer at Het-1A-celler produsert en hyperproliferativ epitel uten noe tegn på lagdeling eller normal modning.
Imidlertid har modellen værthell modifisert for å innlemme tumorceller ved utskifting av primære epitelceller med enten esophageal adenokarsinom (OE33) eller skvamøst karsinom (OE21) celler. Dette viser fleksibiliteten av modellen, slik at dets anvendelse i å undersøke en rekke esophageal lidelser på ulike stadier av progresjon gjennom inkludering av et antall forskjellige cellelinjer. Det kan sees at det er en markert forskjell i responsene fra disse to cellelinjene. OE21 plateepitel karsinom celler produserer et epitel synlig på konstruksjonen som en ytelses gul region (Figur 4A) med store kløfter i Epitel (4B), sannsynligvis for å reflektere dysfunksjonelle celleadhesjonsmolekyler. Inkludert OE33 adenokarsinomceller innenfor modellen resulterer i en stor mengde av stillaset degradering, som er synlig ved øyet som en fortynning av stillaset etter to ukers vekst ved luft / væske-grensesnittet (figur 4C) og bekreftet i H + E analyse somen tydelig reduksjon i tykkelsen av stillaset i området under cellene (figur 4d). Dette er en sannsynlig å være et resultat av et samspill mellom tumorceller og fibroblaster, ettersom stillaset degenerasjon er ikke observert i fravær av fibroblaster (figurene 4E og 4F). Vi har observert tilsvarende effekter på tumorinvasjon i nærvær og fravær av fibroblaster i tilsvarende melanom modeller 21.
Figur 1: Skjematisk diagram som viser produksjon av esophageal mucosa modellen Menneskelige fibroblaster esophageal blir sådd ut på submucosal overflaten av stillaset og dyrket i 7 dager.. Stillaset er invertert, menneske esophageal epitelceller lagt og dyrket nedsenket i 4 dager. Konstruksjonen heves til en luft-væske-grensesnittet for mellom 10 og 20 days. Ved slutten av forsøket konstruksjonen kan gjennomgå ytterligere analyse etter behov. Klikk her for å se en større versjon av figuren.
Figur 2: Sammenligning av epitel produsert i esophageal modell med normal human esophageal epitel H + E-analyse av (A) normal human esophageal epitel og (B) esophageal epitel dannet i modell for human esophageal mucosa.. Scale bar er 500 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av figuren.
Figur 4: Inkludering av tumorcellelinjer innenforspiserør modellen. De primære epitelceller ble erstattet av plateepitel carcinom cellelinje, OE21 eller adenokarsinom-cellelinje, OE33. Bildene viser konstruksjonen med den OE21 celler (A) eller OE33 celler, enten i forbindelse med (C), eller i fravær av (E) fibroblaster, før fiksering ved slutten av dyrkningsperioden. Den epitel inkludert OE21 (B) eller OE33 celler med (D) eller uten (F) fibroblaster blir visualisert ved hjelp av H + E farging. Scale bar er 500 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskriptet beskriver fremstillingen og karakteriseringen av et biologisk relevant human esophageal slimhinnemodell egnet for bruk som en eksperimentell plattform for å studere effekten av eksponering for miljømessige belastninger på esophageal epitel.
De mest kritiske trinn for vellykket produksjon av en human esophageal slimhinne modellen: å sørge for at de fleste av de epiteliale celler forblir proliferativ og ikke allerede har begynt å skille før såing dem på stillaset; opprettholde en luft-væske-grensesnittet for den sammensatte å sikre korrekt modning av epitel; opprettholde sterilitet hele den utvidede kulturperiode.
På grunn av de begrensede mengder av menneskelig vev er tilgjengelig for celleisolasjon er det generelt ikke mulig å oppnå tilstrekkelig antall celler fra en enkelt vevsprøve til frø nyisolerte celler direkte på stillaset og følgelig en celle ekspansjon phase er påkrevet, hvor cellene ble dyrket i standard 2D cellekulturbetingelser. Det er viktig å sikre at cellene forblir proliferativ i denne perioden. Dette oppnås ved å sikre at kulturene er aldri tillates å nå full konfluens, ved hjelp av celler i modellen bare opp til passasjen 4 og nøye overvåkning av cellemorfologi. Dermed cellene skal beholde sin karakteristiske proliferative kantet morfologi og tight "brostein" fortau-lignende utseende karakteristisk for proliferative epitelceller i stedet for de mer diffuse utseende observert i kulturer som har begynt å skille. Den andre kritiske trinnet kontrolleres ved å sikre at cellekulturmediet dekker toppoverflaten av de rustfrie stålnett som brukes til å løfte kulturene til luft-væske-grenseflate, men den øvre overflaten av konstruksjonen i seg selv ikke er neddykket. Det tredje trinnet er avhengig av streng overholdelse av den utvidede sterilisering protokollen når produsere de-cellularizedporcine stillas og anvendelse av steril teknikk god gjennom hele prosessen.
Våre resultater viser at primære humane esophageal celler er nødvendig for å produsere en normal, voksen, stratifisert epitel. Dersom en udødeliggjort cellelinje ble anvendt, enskjønt avledet fra den humane esophageal epitel, forble cellene proliferativ og mislyktes i å differensiere for å danne et modent stratifisert epitel. Den resulterende epitel kan ikke brukes som en tilfredsstillende modell for normal epitel, demonstrerer uegnet udødeliggjort cellelinje Het-1A for bruk i modellen. Men andre cellelinjer, slik som de som er avledet fra esophageal tumorer eller Barretts Metaplasi kan inkorporeres i modellen enten i stedet for eller i tillegg til de primære epitelcellene å frembringe modeller for studier av tumorprogresjon, invasjon og responsen på farmakologiske midler.
Eksperimenter kan utføres ved hjelp av spiserørs modellen for å simulate eksponering av spiserøret til diskrete, pulsatile hendelser under svelge eller refluks. Dette oppnås ved gjentatt neddykking konstruksjonene i kulturmedium inneholdende forbindelsen (e) som skal testes og skylling i PBS før retur konstruksjonen til en luft-væske-grenseflate. De eksponeringstider og frekvens kan modifiseres til å reflektere den prosess som simuleres, slik at epitellaget er utsatt for miljøfaktoren (e) samtidig som den tillater kulturen å fortsette i en luft-væske-grenseflate. Denne metoden har vært brukt i vårt laboratorium for å undersøke virkningen av tilbakeløps på normal esophageal epitel, hvor modellen ble utsatt for spesifikke gastro-øsofageal refluks komponenter i 10 minutter to ganger om dagen i 11 dager 11. Alternativt konstruksjonene kan bli utsatt for kontinuerlige nivåer av miljømessige belastninger ved å inkludere disse forbindelsene i dyrkningsmediet. Men siden epitelet må være utsatt for en luft-væske-grensesnittet for epitheLium å modne og differensiere ordentlig 7, er det ikke mulig å kontinuerlig senke konstruksjonene i kulturmediet. Følgelig vil eksponering for stressfaktoren bare via den submucosal overflaten i disse eksperimenter, som kan begrense relevansen av resultatene som er oppnådd.
Teknikken er forholdsvis arbeidskrevende og følgelig er bedre egnet til screening av relativt begrensede antall av forbindelser. Som et resultat, ved bruk av produktet som en eksperimentell plattform, er det hensiktsmessig først å utføre preliminære studier ved bruk av konvensjonelle celledyrkingsteknikker for å identifisere et begrenset antall tilstander før videre analyse ved hjelp av flere fysiologisk relevant esophageal modellen beskrevet her 11. I tillegg til immunhistokjemisk analyse har det også vært mulig å undersøke endringer i epiteliale genekspresjon profil etter eksponering for miljømessige stressfaktorer. Dette ble oppnådd ved manuelt å strippe bort epithelium, ekstrahering av RNA og konvertere det til cDNA for å isolere genene blir uttrykt og analysere med microarray for å oppnå genekspresjonsprofiler 11. På denne måten har det vært mulig å øke den informasjon som er tilgjengelig fra modellen som en eksperimentell plattform. Tidlige forandringer i epiteliale genekspresjon profilen etter eksponering overfor simulert gastro-øsofageal refluks har vært foreslått, og fra disse resultatene nye områder har blitt foreslått for videre undersøkelser i forebygging av utvikling av Barretts Metaplasi, den metaplastiske forløperen til OAC 11. Modellen kan også brukes til å studere protein ekspresjon ved anvendelse av metoder slik som Western blot-analyse 15 og gen-ekspresjon ved hjelp av Northern blot-analyse 16. Videre studier av ekstracellulære signalmolekyler kan bli utført på kulturmediet 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for Mr Roger Ackroyd, Mr Andrew Wyman og Mr Chris Stoddard, konsulent Kirurger ved Sheffield Teaching Hospitals NHS Foundation Trust, for deres hjelp i å anskaffe esophageal vevsprøver og deres støtte til vårt arbeid. Vi takker Ashraful Haque for hans hjelp innlemme tumorcellelinjer inn i modellen. Vi erkjenner takknemlig økonomisk støtte til denne studien med tilskudd fra Bardhan forskning og utdanning Trust (BRET) og Yorkshire kreftforskning (YCR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | BD Biosciences | 215240 | Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilize. Warm in 37 °C water bath before use. |
| DMEM | Labtech | LM-D1112 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F12 | Labtech | LM-H1236 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Foetal Calf Serum | Labtech | FB-1090 | |
| Epidermal Growth Factor | R+D Systems | 236-EG-200 | Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS |
| Hydorcortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2767 | Prepare 10 mg/ml solution in 0.01 M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilize before use |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | Prepare stock solution in water |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Brand name Fungizone |
| PBS | Oxoid | BR0014 | Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilize |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| Povidone-iodine solution | Ecolab | 10830E | Brand name Videne |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| Newborn calf serum | Gibco | 26010074 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use use |
| O-phosphorylethanolamine | Sigma-Aldrich | P0503 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Lonza | 17-838Z | Used for composite media preparation |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA 0.02% solution | Sigma-Aldrich | E8008 | Warm in 37 °C water bath before use |
| T75 culture flask | VWR | 734-2313 | |
| 50 ml centrifuge tube | Fisher | 11819650 | |
| 15 ml universal tube | SLS | SLS7504 | |
| 180 ml pot | VWR | 216-2603 | |
| Petri dish | SLS | 150350 | |
| 6 well plate | VWR | 734-2323 | |
| stainless steel rings | Manufactured in house - medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm | ||
| steel mesh grids | Manufactured in house - sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2 cm (w) x 2 cm (d) x 0.5 cm (h) | ||
| ki67 | Novocastra | KI67-MM1-L-CE | Clone MM1. Use at 1:100. |
| CK4 | Abcam | ab9004 | Clone 6B10. Use at 1:200. |
| CK14 | Novocastra | LL002-L-CE | Clone LL002. Use at 1:200. |
| Involucrin | Novocastra | INV | Clone SY5. Use at 1:100. |
| OE21 | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| OE33 | Sigma-Aldrich | 96070808 | |
| Het-1A | ATCC-LGC | CRL-2692 | |
| Mouse 3T3 fibroblasts | ATCC-LGC | CRL-1658 | previously growth arrested by irradiation (60 Gy) |
References
- Pera, M., Manterola, C., Vidal, O., Grande, L. Epidemiology of esophageal adenocarcinoma. J. Surg. Oncol. 92 (3), 151-159 (2005).
- Manea, G. S., Lupusoru, C., Caruntu, I. D. Experimental study on the effect of bile, and bile and hydrochloric acid mixture on the esophageal mucosa. Rom. J. Morphol. Embryol. 50 (1), 61-66 (2009).
- Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 278 (3), 1824-1830 (2003).
- Underwood, T. J., et al. A comparison of primary oesophageal squamous epithelial cells with HET-1A in organotypic culture. Biol. Cell. 102 (12), 635-644 (2010).
- Nystrom, M. L., et al. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J. Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Okawa, T., et al. The functional interplay between EGFR overexpression, hTERT activation, and p53 mutation in esophageal epithelial cells with activation of stromal fibroblasts induces tumor development, invasion, and differentiation. Genes & Development. 21 (21), 2788-2803 (2007).
- Green, N., et al. The development and characterization of an organotypic tissue-engineered human esophageal mucosal model. Tissue Eng Part A. 16 (3), 1053-1064 (2010).
- Harada, H., et al. Telomerase induces immortalization of human esophageal keratinocytes without p16INK4a inactivation. Mol. Cancer Res. 1 (10), 729-738 (2003).
- Bhargava, S., Chapple, C. R., Bullock, A. J., Layton, C., MacNeil, S. Tissue-engineered buccal mucosa for substitution urethroplasty. BJU. Int. 93 (6), 807-811 (2004).
- Ralston, D. R., et al. Keratinocytes contract human dermal extracellular matrix and reduce soluble fibronectin production by fibroblasts in a skin composite model. Br. J. Plast. Surg. 50 (6), 408-415 (1997).
- Green, N. H., et al. Pulsatile exposure to simulated reflux leads to changes in gene expression in a 3D model of oesophageal mucosa. Int. J. Exp. Pathol. 95 (3), 216-228 (2014).
- Wang, C. S., et al. Selective culture of epithelial cells from primary breast carcinomas using irradiated 3T3 cells as feeder layer. Pathol. Res. Pract. 197 (3), 175-181 (2001).
- Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. J. Vis. Exp. (16), e755 (2008).
- Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2014).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N. Am. J. Med. Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat. Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Morgan, E., et al. Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clin. Immunol. 110 (3), 252-266 (2004).
- Xu, M., et al. The abnormal expression of retinoic acid receptor-beta, p 53 and Ki67 protein in normal, premalignant and malignant esophageal tissues. World J. Gastroenterol. 8 (2), 200-202 (2002).
- Moll, R., Divo, M., Langbein, L. The human keratins: biology and pathology. Histochem. Cell Biol. 129 (6), 705-733 (2008).
- Rice, R. H., Green, H. Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions. Cell. 18 (3), 681-694 (1979).
- Eves, P., et al. Melanoma invasion in reconstructed human skin is influenced by skin cells - investigation of the role of proteolytic enzymes. Clin. Exp. Metastasis. 20 (8), 685-700 (2003).
