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Bioengineering

Producción, Caracterización y posibles usos de un Humano esofágica mucosas Modelo ingeniería tisular 3D

Published: May 18, 2015 doi: 10.3791/52693

Summary

Este manuscrito describe la producción, caracterización y usos potenciales de un constructo de ingeniería tisular esofágico 3D preparado a partir de fibroblastos humanos primarios normales de esófago y las células epiteliales escamosas sembradas dentro de un andamio-de cellularized porcino. Los resultados demuestran la formación de un epitelio estratificado maduro similar al esófago humano normal.

Abstract

La incidencia tanto de adenocarcinoma de esófago y su precursor, metaplasia de Barrett, están aumentando rápidamente en el mundo occidental. Además adenocarcinoma esofágico generalmente tiene un pronóstico pobre, con pocas mejoras en las tasas de supervivencia en los últimos años. Estas son las condiciones difíciles de estudiar y no ha habido una falta de plataformas experimentales adecuados para investigar los trastornos de la mucosa esofágica.

Un modelo de la mucosa esofágica humano ha sido desarrollado en el laboratorio MacNeil que, a diferencia de los sistemas de cultivo de células 2D convencionales, recapitula las interacciones célula-célula y célula-matriz presentes in vivo y produce un epitelio estratificado maduro similar a la de la humano normal esófago. Brevemente, el modelo utiliza células no transformadas normales fibroblastos humanos primarios esofágicas y epiteliales cultivadas dentro de un andamio acelular de esófago de origen porcino. Caracterización inmunohistoquímica de este modelopor CK4, CK14, Ki67 y involucrina tinción demuestra recapitulación apropiado de la histología de la mucosa esofágica humano normal.

Este modelo proporciona un modelo experimental robusto, biológicamente relevante de la mucosa esofágica humano. Puede ser fácilmente manipulado para investigar una serie de preguntas de investigación, incluyendo la eficacia de agentes farmacológicos y el impacto de la exposición a factores ambientales tales como el alcohol, las toxinas, alta temperatura o componentes el reflujo gastro-esofágico. El modelo también facilita períodos prolongados de cultivo no alcanzables con cultivo celular 2D convencional, lo que permite, entre otras cosas, el estudio del impacto de la exposición repetida de un epitelio maduro para el agente de interés para un máximo de 20 días. Además, una variedad de líneas celulares, tales como las derivadas de tumores de esófago o metaplasia de Barrett, se puede incorporar en el modelo para investigar procesos tales como la invasión tumoral y responsivene drogasss en un entorno más biológicamente relevante.

Introduction

La mucosa esofágica comprende un epitelio escamoso estratificado por encima de una capa de tejido conectivo, la lámina propia, y es uno de los primeros sitios para encontrar factores de estrés ambiental ingeridos. La exposición a las toxinas alimentarias está implicado en el desarrollo del carcinoma escamoso de esófago, mientras que el reflujo esofágico duodenogastro es un factor crítico en la patogénesis de la metaplasia de Barrett, que se asocia con un mayor riesgo de progresión a adenocarcinoma esofágico. Carcinomas esofágicos son la tumor maligno más común en los hombres del Reino Unido y el adenocarcinoma de esófago está aumentando rápidamente en el mundo occidental 1. Por otra parte, ha habido pocas mejoras en el pronóstico de la enfermedad, con una tasa de supervivencia global a 5 años de alrededor del 15%. En consecuencia, existe una necesidad de plataformas experimentales para investigar el impacto de la exposición a factores de estrés ambientales en este epitelio esofágico y su potencial implicación en la Developo de metaplasia o neoplasia.

Aunque las líneas celulares inmortalizadas o tumorales permiten a los investigadores para estudiar la respuesta de las células epiteliales a estos factores de estrés in vitro, siguen siendo proliferativa y fallan a diferenciarse en las células epiteliales maduros que se encuentran en las capas superiores de la mucosa esofágica. Además, las líneas de células que ya han sido sometidos a la tumorigénesis pueden proporcionar información limitada sobre las respuestas iniciales de las células normales dentro del epitelio a factores ambientales; y esta es la etapa en la que el potencial para la intervención terapéutica puede ser más alto. Finalmente, los sistemas de cultivo de células convencionales no logran captar las interacciones potencialmente importantes entre células epiteliales y mesenquimales y entre estas células y la matriz circundante que ocurren dentro de los tejidos in vivo.

Los modelos animales proporcionan un microambiente más realista para el estudio de las respuestas de la epitheli esofágicoum y puede incorporar la inducción artificial de la enfermedad de reflujo gastro-esofágico 2. Sin embargo, puede ser más difícil de manipular los factores de estrés ambientales en estos modelos y que puede no representar plenamente la respuesta dentro del esófago humano.

Otros modelos esofágicas humanos experimentales se han desarrollado que utilizan células primarias, células inmortalizadas o líneas de células tumorales en un colágeno, fibroblastos o combinado colágeno / Matrigel, andamio que contienen 3,4. Es menos mano de obra para generar estos andamios que el andamio de esófago acelular descrito en este manuscrito, y estos modelos organotípicos proporcionan una herramienta útil, en particular en el estudio de la invasión tumoral 5,6, donde la infiltración de células tumorales en el gel de colágeno puede ser fácilmente observado. Sin embargo, estos geles de colágeno tienen propiedades mecánicas no nativos y carecen de ciertas características del tejido original, incluyendo una membrana basal específico y el appropriattopografía de la superficie e. Esto puede influir en el comportamiento de las células resultantes en, por ejemplo, más pobre adhesión entre el epitelio y el andamio cuando se utiliza un andamio de gel de colágeno 7. Como consecuencia de ello se desarrolló el andamio de esófago porcino acelular, con la ventaja de ser un andamio biológicamente más realista y por lo tanto más apropiado para su uso como una plataforma experimental. También se ha demostrado que es mejor para incorporar células primarias en las construcciones de esófago que inmortalizadas líneas de células epiteliales del esófago, tales como Het-1A, ya que estas células forman un epitelio multicapa, pero no para estratificar o diferenciar 4,7,8 .

En consecuencia, este protocolo ha sido adaptado de un método ya en uso en el laboratorio MacNeil para la fabricación de tejidos de la piel y mucosa oral ingeniería 9,10 e incorpora un andamio de esófago porcino-de cellularized combinado con células esofágicas humanas primarias epiteliales y fibroblastos. Thiprotocolo s produce un epitelio estratificado maduro, similar a la de la esófago humano normal como se demuestra por CK4, CK14, Ki67 y involucrina tinción. El modelo resultante proporciona una plataforma experimental para estudiar las respuestas a factores de estrés ambiental, y se ha utilizado eficazmente para investigar los cambios en la expresión génica en el epitelio esofágico en respuesta a el reflujo componentes 11.

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Protocol

Células esofágicas humanas se obtuvieron a partir de pacientes sometidos a cirugía gástrica o esofágica. Se obtuvo el consentimiento informado para que el tejido se puede utilizar con fines de investigación, y el tejido utilizado de forma anónima bajo las aprobaciones éticas adecuadas (SSREC 165/03, Tejido humano de investigación del Banco de licencia 12179).

1. Aislamiento de células humanas epiteliales del esófago

  1. Trabajando en una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar y utilizando una técnica estéril, preparar el medio de cultivo epitelial mediante la mezcla de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y F12 de Ham en una relación 3: 1 (v: v). Añadir 10% (v / v) de FCS, 10 ng del factor de crecimiento epidérmico / ml, 0,4 mg / ml de hidrocortisona, 1,8 x 10 -4 M adenina, 5 g / ml de insulina, 5 mg / ml de transferrina, 2 x 10 -7 M triyodotironina, 1 x 10 -10 M toxina del cólera, 2 x 10 -3 M glutamina, 100 IU / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 0,625 g / ml de anfotericina B.
  2. El uso estándartécnicas estériles, pusieron 11 ml de DMEM, 10% FCS, 2 x 10 -3 M L-glutamina, 100 IU / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 0,625 g / ml de anfotericina B en un matraz de cultivo de tejido T75. Añadir 1 x 10 6 irradiados letalmente fibroblastos 3T3 de ratón 12 en 1 ml del mismo medio y se incuba durante la noche a 37 ° C en un CO 2, ambiente humidificado 5%. Esto producirá una capa de alimentación para el posterior cultivo de células epiteliales.
  3. Con un bisturí y siguiendo las recomendaciones de un anatomopatólogo, diseccionar una muestra de aproximadamente 2 cm 2 de tejido de la región de fondo libre de enfermedad de la mucosa escamosa esofágica obtenidos de pacientes sometidos a cirugía gástrica o esofágica. El transporte al laboratorio en un recipiente de 50 ml de medio de transporte estéril (PBS 100 IU / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 0,625 g / ml de anfotericina B) a temperatura ambiente.
  4. En este punto, almacenar el tejido en el transportemedio para un máximo de 12 horas (durante la noche) a 4 ° C, por conveniencia; Sin embargo, no use los períodos de almacenamiento más largos que son fruto de la viabilidad celular reducida.
  5. Trabajando en una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar y utilizando una técnica estéril, esterilizar una hoja de bisturí por inmersión en etanol al 70% durante 5 min. Enjuague en PBS estéril.
  6. Coloque el tejido en una placa de Petri estéril y utilizar el bisturí para cortar en tiras de 0,5 cm. Añadir 5 ml de 0,1% (w / v) de tripsina en PBS a la placa de Petri, colocar la tapa sobre el plato y se incuba durante 1 hora a 37 ° C.
  7. Añadir 5 ml de FCS al tejido en la placa de Petri para inhibir la tripsina. Sosteniendo la tira de tejido con pinzas estériles, raspar suavemente la superficie epitelial con la hoja del bisturí durante 1-2 min por tira para eliminar las células epiteliales en el medio circundante. Retire el tejido raspado y reservar. Repita el proceso para todas las tiras de tejido.
  8. Recoger el medio que contiene las células epiteliales desprendidas en un tubo de centrífuga de 15 mly centrifugar (5 min, 200 xg). Verter el sobrenadante y resuspender el precipitado en 12 ml de medio epitelial (descrito en el paso 1.1).
  9. Retirar y desechar el medio de la capa de células de alimentación en el matraz T75 preparado en la etapa 1.2. Usar una pipeta estéril para añadir la suspensión de células que contiene las células epiteliales recién aisladas al matraz y se incuba a 37 ° C en un 5% de CO 2, atmósfera humidificada.
  10. Después de 24 horas verter y desechar el medio de cultivo, que también contendrá restos celulares, y reemplazar con 12 ml de medio epitelial fresco. Continuar la incubación a 37 ° C en un CO 2, ambiente humidificado 5%. Colonias comenzarán a aparecer durante el próximo de 24 a 48 horas y pueden ser vistos por colocar el frasco de cultivo bajo un microscopio óptico estándar. Retirar el medio de cultivo gastado y reemplazar con un volumen igual de medio fresco cada 2 a 3 días.
  11. Una vez que el frasco se ha alcanzado el 80% de confluencia, el paso de las células 13. Dividir la cells en una proporción de 1: 5 para aumentar el número de células para su uso en el modelo. Siga el paso 1.2 para establecer capas de alimentación de las células irradiadas 3T3 en cada matraz que recibirá las células epiteliales de las 24 horas anteriores a pases de las células.
    Nota: Utilice las células epiteliales en el modelo de esófago se describe a continuación entre los pasos 1 y sólo el 4.

2. Aislamiento de fibroblastos humanos esofágicas

  1. Trabajando en una cabina de flujo laminar y utilizando una técnica estéril, tome el tejido a un lado en el paso 1.7. Colocar en una placa de Petri estéril y picar finamente cortando con una hoja de bisturí estéril. Añadir 10 ml de 0,5% (w / v) Una solución de colagenasa y coloque la tapa en la caja de Petri y se incuba a 37 ° C durante la noche en una de CO 2, ambiente humidificado 5%.
  2. Transferir el resumen a un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugar (10 min, 200 xg), cuidadosamente verter y desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 ml de medio de cultivo de fibroblastos (DMEM 10% de FCS, 2 x 10 -3 M L-glutamina, 100 IU / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 0,625 g / ml de anfotericina B).
  3. Coloque la suspensión en un matraz T75 e incubar a 37 ° C en un CO 2, ambiente humidificado 5%. Después de 24 horas se vierte fuera el medio, que contendrá los escombros y reemplazar con 12 ml de medio de fibroblastos fresco. Reemplazar el medio de cultivo cada 2 a 3 días y las células de paso una vez que han alcanzado 80% de confluencia 13, la división de las células en una proporción 1: 5 para aumentar el número de células.
    Nota: Utilice las células de fibroblastos en el modelo descrito a continuación entre los pasos 4 y sólo el 10.

3. Preparación de la cellularized-De esofágica Andamios

  1. Obtener esófagos porcina intacta en un matadero de cerdos Landrace recién sacrificados que se utilizan para la producción de alimentos. Uno esófago única proporcionará andamios suficientes para aproximadamente 30 construcciones independientes.
    Nota: Debido a la extensa y hora consuming requiere protocolo de esterilización, normalmente es digno de obtención y procesamiento de un mínimo de 10 esófagos a la vez.
  2. Colocar inmediatamente el esófago recién extirpado en una olla estéril 180 ml que contenía aproximadamente 150 ml de solución de povidona yodada 10% durante 5 min para reducir cualquier carga microbiana contaminante. Transferir el esófago a un segundo bote que contiene aproximadamente 100 ml de PBS estéril que contiene 200 IU / ml de penicilina, 200 mg / ml de estreptomicina y 1,25 mg / ml de anfotericina B.
    1. Vuelva a colocar la tapa sobre el recipiente y transportar el esófagos al laboratorio a temperatura ambiente. Dos o tres esófagos pueden ser transportados en cada recipiente, dependiendo de su tamaño.
  3. Una vez en el laboratorio, manipular el tejido en una campana de flujo laminar utilizando una técnica aséptica para minimizar la contaminación microbiana. Esterilizar pinzas, tijeras y hojas de bisturí por inmersión durante 5 min en etanol al 70%, y lavado en PBS estéril.
  4. Manejar los esophagus con unas pinzas estériles. Usando las tijeras, corte abierta longitudinalmente el esófago. Enjuague el tejido colocando el esófago en un bote estéril 180 ml que contenía aproximadamente 100 ml de PBS estéril y agitando suavemente para eliminar los residuos.
  5. Limpiar un tablero de corcho disección rociando etanol generosamente con 70% y dejar secar.
  6. Retire el esófago del PBS, y el uso de agujas estériles, precisar el esófago en el tablero, más alta superficie de la mucosa. Sujete la superficie de la mucosa en un extremo del esófago con pinzas estériles y alejarse de la junta. Esto separará la mucosa de la submucosa subyacente.
    1. A continuación, utilice una hoja de bisturí estéril para diseccionar el esófago longitudinalmente a lo largo de la lámina propia, quitando los alfileres a medida que la disección avanza para permitir que la mucosa que se levante de distancia.
  7. Conserve la mucosa diseccionado y deseche la submucosa subyacente.
  8. Corte y deseche las más proximales y distales 2 cm de tél mucosa ya que hay un mayor número de glándulas submucosas y una lámina propia más gruesa en esas zonas, respectivamente 7.
  9. Utilice un bisturí para cortar el tejido restante en 5 cm 2. Coloque todo el tejido cortado en una olla estéril 180 ml que contenía aproximadamente 150 ml de PBS estéril y agitar suavemente para enjuagar el tejido. Si el procesamiento de más de cinco esófagos a la vez puede ser necesario utilizar varias ollas de este y los tres pasos siguientes.
  10. Utilizando pinzas estériles, transferir el tejido cortado en una olla de 180 ml que contiene 150 ml de estéril M NaCl 1, 200 UI / ml de penicilina, 200 mg / ml estreptomicina y 1,25 mg / ml de anfotericina B. Incubar durante 72 horas a 37 ° C.
  11. Coloque el tejido en un bote de 180 ml fresco que contiene 150 ml de PBS estéril. El epitelio se han comenzado a separar visiblemente del tejido subyacente. Pelar suavemente el epitelio separar desde el esófago cerdo usando pinzas estériles y deseche.
    1. Coloque el restante ttema en un 180 ml olla fresca y añadir 150 ml de PBS estéril. Agite suavemente durante 5 min para lavar. Vierta el PBS y repetir dos veces más con PBS fresco.
  12. Colocar todo el tejido en una botella de vidrio de 500 ml que contiene 400 ml de estéril 80% (v / v) de solución de glicerol durante 24 horas a temperatura ambiente. Transferencia a 400 ml de estéril 90% (v / v) para una solución de glicerol 24 horas más.
  13. Almacenar en 400 ml de solución de glicerol al 100% estéril a temperatura ambiente durante un mínimo de 4 meses para deshidratar y esterilizar el tejido mientras que preserva la integridad de la membrana basal.

4. Producción de la Cultura de Medios

  1. Preparar suero de ternero recién nacido quelado para su uso en el medio de cultivo.
    1. Verter 100 g de Chelex 100 en una botella de vidrio de 1 L y añadir agua de-ionizada. El volumen exacto no es crítico pero suficiente agua debe añadirse para cubrir el polvo Chelex. Añadir un agitador magnético y esterilizar en autoclave (121 ° C durante15 min).
    2. Permita que la botella se enfríe y el Chelex se asiente. En una cabina de flujo laminar verter el exceso de agua, añadir 500 ml de suero de ternero recién nacido (NCS) y dejar agitar durante la noche a 4 ° C.
    3. Deja de agitar y permitir que el Chelex para resolver, esto puede tardar hasta 30 minutos. En una cabina de flujo laminar se decanta el suero quelado con una pipeta estéril, teniendo cuidado de no perturbar el Chelex, y almacenar en alícuotas de 10 ml a -20 ° C.
  2. Prepare tres medios diferentes en una cabina de flujo laminar, comenzando con la pro-proliferativa y terminando con formulaciones pro-diferenciadores.
    1. Preparar Composite Medio I compuesto por DMEM y Hams F12 en una proporción 3: 1 (v: v), 4 x 10 -3 M de L-glutamina, 0,5 mg / ml de hidrocortisona, 1 x 10 -4 M O -phosphorylethanolamine, 2 x 10 -12 M triyodotironina, 1,8 x 10 -4 M adenina, 1,88 x 10 -3 M CaCl 2, 4 x 10 -12 M progesterona, 10 mg / ml eninsulina, 10 mg / ml de transferrina, 10 ng / ml de selenio, 1 x 10 -3 M etanolamina y 0,1% (v / v) quelado NCS.
    2. Preparar Compuesto II como Medium Medium Compuesto I, excepto reemplazar el suero quelado con 0,1% (v / v) no quelados NCS.
    3. Preparar Composite Medium III como compuesto Medium II excepto progesterona omitir y aumento de suero a 2% (v / v) no quelados NCS.

5. La producción de la mucosa esofágica Modelo Humano

  1. Realizar todos los trabajos en una campana de flujo laminar, utilizando una técnica aséptica para mantener un ambiente estéril. Esterilizar todas las herramientas por inmersión en etanol al 70% durante 5 min, antes de enjuagar en PBS estéril.
  2. El día antes de que sea necesario, a rehidratar el andamio esofágico porcina acelular. Se requiere un pedazo de andamio para construir cada uno para estar preparados.
    1. Para rehidratar el lugar del tejido pedazos suficientes de andamio porcina en una olla que contiene 100 ml de PBS estéril, agitar y remojo durante 10 min. Decant el PBS y reemplazar con PBS fresco. Repita el proceso de lavado cinco veces para asegurar la eliminación de todo rastro de glicerol.
  3. Pruebe la esterilidad andamio incubando el tejido rehidratado durante la noche en 100 ml de DMEM a 37 ° C. Si no hay cambio en el color o turbidez del medio de cultivo al final del periodo de incubación el andamio se supone que es estéril. Una vez que se ha confirmado la esterilidad, coloque el 5 cm andamio 2 acelular en una placa de 6 pocillos, con el lado superior de la submucosa.
  4. Colocar un anillo de grado médico estéril de acero inoxidable (diámetro interno 10 mm, diámetro externo 20 mm) en el centro de cada andamio y presionar suavemente hacia abajo con pinzas estériles, para asegurar un sellado adecuado con el tejido.
  5. Cosecha de los fibroblastos usando tripsina-EDTA 13 para producir una suspensión celular. Contar las células utilizando un hemocitómetro 14. Centrifugar la suspensión de células (10 min, 200 xg). Resuspender el sedimento celular en una apropiaciónvolumen te de medio de fibroblastos para producir un recuento final de células de 2,5 x 10 6 células por ml.
  6. Añadir 0,2 ml de medio de fibroblastos, que contiene 5 x 10 5 fibroblastos esofágicas humanos, dentro de cada anillo. Inundar el área alrededor de la parte exterior del anillo con aproximadamente 2 ml de medio de fibroblastos. Se incuba a 37 ° C en un CO 2, ambiente humidificado 5%.
  7. Después de 24 hr eliminar el medio de anillos y de fibroblastos y añadir al menos 5 ml de medio de fibroblastos fresco a cada pocillo, asegurando que el andamio está totalmente sumergido en un medio. Cultura durante 1 semana, a 37 ° C en un 5% de CO 2, atmósfera húmeda reemplazando el medio cada 2 a 3 días.
  8. Después de 1 semana quitar las placas de 6 pocillos que contienen los andamios a una campana de inundación laminar, retire el medio e invertir cada andamio usando pinzas estériles, la colocación de la superficie de la mucosa hacia arriba. Este punto de tiempo se conoce como Día 0.
  9. Coloque los anillos de acero sobre la superficie de la mucosa en el centro deel tejido como en el paso 5.4.
  10. Preparar los frascos T75 de células epiteliales de tripsinización 13. Después de lavar el PBS y antes de la adición de solución de tripsina-EDTA, añadir 2 ml de solución estéril de 0,02% (w / v) solución de EDTA a cada matraz. Incubar durante 2 minutos a 37 ° C. Toque en el frasco suavemente para separar selectivamente la capa alimentadora i3T3 dejando las células epiteliales adjuntos.
    Nota: Por lo general, no es práctico o necesario a paciente coincide con las células epiteliales de los fibroblastos ya incorporadas en el modelo de la semana anterior.
  11. Retirar la solución de EDTA que contiene la capa de alimentación y añadir solución de tripsina-EDTA para cosechar las células epiteliales 13. Contar las células utilizando un hemocitómetro 14. Centrifugar la suspensión de células (10 min, 200 xg). Resuspender el sedimento celular en un volumen apropiado de Composite Medium 1 para producir un recuento final de células de 5 x 10 6 células por ml.
  12. Añadir 0,2 ml de compuesto medio I, que contiene 1 x 10 6 células epiteliales, dentro del anillo. Inundar el área alrededor de la parte exterior del anillo con aproximadamente 2 ml de compuesto medio I y colocar las construcciones en la incubadora a 37 ° C en un 5% de CO 2, atmósfera húmeda.
  13. Después de 24 horas (día 1) quitar los anillos y medio y agregar al menos 5 ml de Compuesto fresca Medio I, asegurando los andamios están completamente sumergidos y volver a la incubadora. Después de un 24 horas más (Día 2) eliminar el medio y se sustituye con al menos 5 ml de Compuesto Medio II, asegurando de nuevo los andamios están totalmente sumergidas y regresan a la incubadora.
  14. En el Día de grado médico estéril rejillas de malla de acero inoxidable 4 lugar (2 cm de ancho x 2 cm de largo x 0,5 cm de altura), en placas de 6 pocillos frescos, uno por cada constructo. Use pinzas estériles para transferir las construcciones en la parte superior de las rejillas de acero, superior superficie de la mucosa.
    1. Añadir suficiente Composite Medium III de manera que el líquido alcanza la parte inferior del compuesto, pero la superficie esexpuesta al aire, esto asegura que la muestra se mantiene a una interfase aire-líquido. El volumen exacto de medio requerida variará dependiendo del espesor del andamio, el volumen del pozo y la altura precisa de la rejilla de acero inoxidable.
  15. Mantener los materiales compuestos en una interfase aire-líquido para entre 10 y 20 días (día 14 a día 24), dependiendo de los requisitos del experimento. Sustituya el medio compuesto III con medio fresco cada 2 a 3 días (Lunes, Miércoles, Viernes es un régimen de fácil uso).
    Nota: Después de 5 días en una interfaz aire-líquido (día 9) las construcciones tienen un epitelio esofágico suficientemente maduro como para ser utilizado en los experimentos sobre el impacto de los factores ambientales en el epitelio esofágico.
  16. Al final del experimento, fijar los constructos para el análisis histológico y la tinción inmunohistoquímica 7, o extracto de proteína o ARN 11,16 15 desde el epitelio para más analyses. Si es necesario, retener el medio de cultivo acondicionado para el análisis de moléculas de señalización extracelular 17.

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Representative Results

Este manuscrito describe el proceso requerido, que se muestra en forma esquemática en la Figura 1, para cultivo de modelos 3D del epitelio esofágico humano con éxito. Para confirmar la idoneidad del modelo como una plataforma experimental histológico y estudios inmunohistoquímicos han llevado a cabo la comparación de los tejidos cultivados con mucosa escamosa esofágica humano normal.

Evaluación histológica del epitelio producido por el método descrito muestra una, de varias capas, epitelio escamoso estratificado maduro (Figura 2B), que es comparable a la observada con el esófago (Figura 2A) humano normal, aunque más delgadas (5 a 10 capas de células en comparación con 10 a 20 para el esófago normal), con las células convertirse en progresivamente más plano y en última instancia anuclear a medida que migran hacia la superficie.

Caracterización inmunohistoquímica de marcadores clave de proliferación y diferenciación demostrar que la microanatomía del modelo epitelio es similar al epitelio esofágico humano normal. Comparable expresión de Ki67 se observa tanto en el esófago nativo y el modelo de epitelio, con tinción restringida a un subconjunto de células dentro de la basal y capas inmediatamente suprabasales (Figuras 3A y 3B). Esto es análogo a los estudios que informan de que menos del 10% de las células en general, muestran expresión del marcador de proliferación, Ki67, en el epitelio normal del esófago 18. CK4 normalmente se expresa en el epitelio estratificado y columnar, pero es generalmente ausente de las capas basales mientras CK14 es único positivo en la capa basal 19. En tanto el epitelio esofágico normal y modelo, CK14 se observa en todas las células en la capa basal (Figuras 3D y 3E), mientras que CK4 se observa en todo el epitelio a excepción de las dos capas más basales (Figuras 3G y 20. Una vez más tanto el tejido esofágico humano normal y el espectáculo tinción modelo de epitelio que refleja esto (Figuras 3J y 3K).

Los intentos de reemplazar las células epiteliales primarias de esófago con células epiteliales del esófago inmortalizadas, como Het-1A, tuvieron menos éxito y no ha dado ningún modelo válido del epitelio esofágico normal. Se formó un epitelio de múltiples capas; sin embargo, el marcador de proliferación Ki67 se detectó a lo largo del epitelio (Figura 3C) con ninguna expresión detectado por cualquier marcadores de diferenciación (Figuras 3F, 3I y 3L), indicando que las células Het-1A produjeron un epitelio hiperproliferativo sin evidencia de estratificación normal o maduración.

Sin embargo, el modelo ha sidomodificado para incorporar con éxito las células tumorales por la sustitución de las células epiteliales primarias, ya sea con adenocarcinoma esofágico (OE33) o células de carcinoma escamoso (OE21). Esto demuestra la flexibilidad del modelo, lo que permite su uso en la investigación de una serie de trastornos esofágicos en diferentes etapas de progresión a través de la inclusión de un número de diferentes líneas celulares. Se puede observar que existe una marcada diferencia en las respuestas de estas dos líneas celulares. Células de carcinoma escamoso OE21 produce un epitelio visible en el constructo como una región definida amarillo (Figura 4A) con grandes hendiduras en el epitelio (figura 4B), probablemente para reflejar las moléculas de adhesión de células disfuncionales. Incluyendo células de adenocarcinoma OE33 dentro de los resultados del modelo en una gran cantidad de degradación de andamio, visible por el ojo como un adelgazamiento de la andamio después de 2 semanas de crecimiento en la interfase aire / líquido (Figura 4C) y confirmado en el análisis de H + E comouna reducción evidente en el espesor del andamio en la región por debajo de las células (Figura 4D). Esta es una probable que sea un resultado de una interacción entre las células tumorales y fibroblastos, ya que la degeneración andamio no se observa en ausencia de fibroblastos (Figuras 4E y 4F). Hemos observado impactos similares en la invasión tumoral en presencia y en ausencia de fibroblastos en los modelos de melanoma equivalentes 21.

Figura 1
Figura 1: Diagrama esquemático que muestra la producción del modelo mucosa esofágica fibroblastos esofágicas Humanos se siembran sobre la superficie submucosa del andamio y se cultivaron durante 7 días.. El andamio se invierte, las células epiteliales del esófago humanos añaden y se cultivaron sumergidas durante 4 días. El constructo se eleva a una interfaz aire-líquido para entre 10 y 20 days. Al final del experimento, la construcción puede someterse a un análisis adicional según sea necesario. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.

Figura 2
Figura 2: Comparación de epitelio producido en el modelo de esófago normal, con epitelio esofágico humano H + E análisis de (A) epitelio esofágico humano normal y (B) epitelio esofágico formado en el modelo de la mucosa del esófago humano.. La barra de escala es de 500 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.

Figura 3
(A - C), CK14 (D, E), CK4 (G, H) y involucrina tinción (J, K). La barra de escala es de 200 micras. (Esta cifra se ha modificado. 7) Haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.

Figura 4
Figura 4: La inclusión de líneas de células tumorales dentro deel modelo de esófago. Las células epiteliales primarias fueron reemplazados por la línea celular de carcinoma escamoso, OE21, o la línea celular de adenocarcinoma, OE33. Las imágenes muestran la construcción con las células OE21 (A) o células OE33 ya sea en conjunción con (C) o en ausencia de fibroblastos (E), antes de la fijación al final del periodo de cultivo. Los epitelios incluyendo el OE21 (B) o células OE33 con (D) o sin (F) Los fibroblastos son visualizados por tinción H + E. La barra de escala es de 500 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.

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Discussion

Este manuscrito describe la producción y caracterización de un modelo de la mucosa esofágica humana biológicamente relevante adecuado para uso como una plataforma experimental para estudiar el impacto de la exposición a factores de estrés ambientales en el epitelio esofágico.

Los pasos más críticos para el éxito de la producción de un modelo de la mucosa esofágica humana son: asegurar que la mayoría de las células epiteliales permanecen proliferativa y no lo ha comenzado a diferenciar antes de la siembra de ellos en el cadalso; el mantenimiento de una interfase aire-líquido para el material compuesto para asegurar la correcta maduración del epitelio; mantener la esterilidad durante todo el período de cultivo prolongado.

Debido a las cantidades limitadas de tejido humano disponibles para el aislamiento de células que generalmente no es posible obtener células suficientes partir de una única muestra de tejido para sembrar células recién aisladas directamente sobre el andamio y, en consecuencia un pH expansión celularase se requiere que las células se cultivan en condiciones de cultivo celular en 2D estándar. Es importante asegurar que las células permanecen proliferativa durante este período. Esto se logra garantizando que los cultivos no se les permite alcanzar la plena confluencia, el uso de células en el modelo sólo hasta el paso 4 y controlando cuidadosamente la morfología celular. Por lo tanto las células deben conservar su distintivo morfología poligonal proliferativa y el apretado "adoquines"-pavimento como aspecto característico de las células epiteliales proliferativas en lugar de la apariencia más difusa observada en los cultivos que han comenzado a diferenciarse. El segundo paso crítico es controlado por asegurar que el medio de cultivo celular cubre la superficie superior de las rejillas de acero inoxidable usados ​​para levantar las culturas a la interfaz aire-líquido, pero la superficie más superior de la construcción en sí no está sumergido. El tercer paso depende de la estricta adherencia al protocolo de esterilización extendida cuando la producción de la de-cellularizedandamio porcino y el uso de una buena técnica estéril durante todo el proceso.

Nuestros resultados muestran que se requieren células esofágicas humanas primarias para producir un maduro, epitelio normal, estratificada. Si se usó una línea celular inmortalizada, aunque derivado del epitelio esofágico humano, las células se mantuvieron proliferativa y no pudieron diferenciarse para formar un epitelio estratificado maduro. El epitelio resultante no podría ser utilizado como un modelo satisfactorio para el epitelio normal, lo que demuestra la falta de idoneidad de la línea celular inmortalizada Het-1A para su uso en el modelo. Sin embargo otras líneas celulares, tales como las derivadas de tumores de esófago o metaplasia de Barrett se pueden incorporar en el modelo, ya sea en lugar de o en adición a las células epiteliales primarias para producir modelos para el estudio de la progresión tumoral, la invasión y la respuesta a los agentes farmacológicos.

Los experimentos se pueden realizar usando el modelo esofágico para simulate la exposición del esófago al discretos, eventos pulsátiles durante la deglución o el reflujo. Esto se logra sumergiendo repetidamente las construcciones en medio de cultivo que contiene el compuesto (s) a ser probado y lavado en PBS antes de devolver el constructo a una interfaz aire-líquido. Los tiempos de exposición y la frecuencia pueden ser modificados para reflejar el proceso que se está simulando, asegurando que la capa epitelial se expone al factor ambiental (s) permitiendo al mismo tiempo la cultura para continuar en una interfase aire-líquido. Este método ha sido utilizado en nuestro laboratorio para investigar el impacto de reflujo en el epitelio normal del esófago, donde el modelo fue expuesto a componentes específicos reflujo gastro-esofágico durante 10 minutos dos veces al día durante 11 días 11. Alternativamente, las construcciones pueden estar expuestos a niveles continuos de estresores ambientales mediante la inclusión de estos compuestos en el medio de cultivo. Sin embargo, ya que el epitelio debe ser expuesta a una interfaz aire-líquido para la epitheLium madure y diferenciar adecuadamente 7, no es posible sumergir continuamente las construcciones en el medio de cultivo. En consecuencia, la exposición al factor de estrés sólo será a través de la superficie de la submucosa en estos experimentos, que pueden limitar la relevancia de los resultados obtenidos.

La técnica es relativamente mucha mano de obra y por lo tanto es más adecuado para la proyección de un número relativamente limitado de compuestos. Como resultado, cuando se utiliza el modelo como una plataforma experimental, es apropiado para llevar a cabo primero estudios preliminares utilizando técnicas de cultivo celular convencionales para identificar un número limitado de condiciones antes de su posterior análisis utilizando el modelo de esófago más fisiológicamente relevante aquí descrito 11. Además del análisis inmunohistoquímico también ha sido posible examinar los cambios en el perfil de expresión de genes epiteliales tras la exposición a factores de estrés ambientales. Esto se logró por extracción de la distancia manualmente epithelium, extraer el ARN y la conversión a ADNc para aislar los genes que se expresan y el análisis por microarray para obtener perfiles de expresión génica 11. De esta manera, ha sido posible aumentar la información disponible a partir del modelo como una plataforma experimental. Se han propuesto cambios tempranos en el perfil de expresión génica epitelial después de la exposición simulada a reflujo gastro-esofágico y a partir de estos resultados se han sugerido nuevas áreas de investigación más a fondo en la prevención del desarrollo de metaplasia de Barrett, el precursor metaplásico a OAC 11. El modelo también podría ser utilizado para estudiar la expresión de proteínas utilizando métodos tales como análisis de transferencia de Western 15 y la expresión génica usando análisis de transferencia Northern 16. Por otra parte estudios de moléculas de señalización extracelular se podrían realizar en el medio de cultivo 17.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Estamos muy agradecidos con el Sr. Roger Ackroyd, el Sr. Andrew Wyman y el Sr. Chris Stoddard, Consultor cirujanos en Sheffield Teaching Hospitals NHS Foundation Trust, por su ayuda en la adquisición de las muestras de tejido del esófago y su apoyo a nuestro trabajo. Agradecemos Ashraful Haque por su ayuda que incorpora líneas de células tumorales en el modelo. Agradecemos el apoyo financiero para este estudio por las subvenciones del Bardhan Investigación y Educación Trust (BRET) y Yorkshire Cancer Research (YCR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypsin BD Biosciences 215240 Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilize. Warm in 37 °C water bath before use.
DMEM Labtech LM-D1112 Warm in 37 °C water bath before use
Ham's F12 Labtech LM-H1236 Warm in 37 °C water bath before use
Foetal Calf Serum Labtech FB-1090
Epidermal Growth Factor R+D Systems 236-EG-200 Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS
Hydorcortisone Sigma-Aldrich H0396 Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use
Adenine Sigma-Aldrich A2786 Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use
Insulin Sigma-Aldrich I2767 Prepare 10 mg/ml solution in 0.01 M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilize before use
Transferrin Sigma-Aldrich T2036 Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use
Triiodothyronine Sigma-Aldrich T2752 Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use
Cholera toxin Sigma-Aldrich C8052 Prepare stock solution in water
L-Glutamine Sigma-Aldrich G7513
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P0781
Amphotericin B Gibco 15290-026 Brand name Fungizone
PBS Oxoid BR0014 Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilize
Collagenase A Roche 10103578001
Povidone-iodine solution Ecolab 10830E Brand name Videne
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Chelex 100 Sigma-Aldrich C7901
Newborn calf serum Gibco 26010074
Progesterone Sigma-Aldrich P8783 Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use
Ethanolamine Sigma-Aldrich E9508 Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0888 Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use use
O-phosphorylethanolamine Sigma-Aldrich P0503 Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use
ITS (insulin, transferrin, selenium) Lonza 17-838Z Used for composite media preparation
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T3924 Warm in 37 °C water bath before use
EDTA 0.02% solution Sigma-Aldrich E8008 Warm in 37 °C water bath before use
T75 culture flask VWR 734-2313
50 ml centrifuge tube Fisher 11819650
15 ml universal tube SLS SLS7504
180 ml pot VWR 216-2603
Petri dish SLS 150350
6 well plate VWR 734-2323
stainless steel rings Manufactured in house - medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm
steel mesh grids Manufactured in house - sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2 cm (w) x 2 cm (d) x 0.5 cm (h)
ki67 Novocastra KI67-MM1-L-CE Clone MM1. Use at 1:100.
CK4 Abcam ab9004 Clone 6B10. Use at 1:200.
CK14 Novocastra LL002-L-CE Clone LL002. Use at 1:200.
Involucrin Novocastra INV Clone SY5. Use at 1:100.
OE21 Sigma-Aldrich 96062201
OE33 Sigma-Aldrich 96070808
Het-1A ATCC-LGC CRL-2692
Mouse 3T3 fibroblasts ATCC-LGC CRL-1658 previously growth arrested by irradiation (60 Gy)

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References

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Green, N. H., Corfe, B. M., Bury, J. More

Green, N. H., Corfe, B. M., Bury, J. P., MacNeil, S. Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model. J. Vis. Exp. (99), e52693, doi:10.3791/52693 (2015).

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