Summary
تصف هذه المخطوطة إنتاج وتوصيف والاستخدامات المحتملة لالأنسجة المهندسة 3D بناء المريء المعدة من المريء الطبيعية الأولية الخلايا الليفية والخلايا البشرية الظهارية الحرشفية المصنفة ضمن سقالة دي cellularized الخنازير. أظهرت النتائج وتشكيل ظهارة طبقية ناضجة مماثلة إلى المريء الإنسان العادي.
Abstract
وقوع كل من غدية المريء والسلائف، حؤول باريت، ترتفع بسرعة في العالم الغربي. وعلاوة على ذلك غدية المريء عموما لديها سوء التشخيص، مع تحسن طفيف في معدلات البقاء على قيد الحياة في السنوات الأخيرة. هذه هي ظروف صعبة للدراسة، وكان هناك نقص في منصات التجريبية المناسبة لتحقيق اضطرابات في الغشاء المخاطي المريء.
وقد تم تطوير نموذج الغشاء المخاطي المريء البشري في المختبر ماكنيل الذي، على عكس الأنظمة خلية ثقافة 2D التقليدية، يلخص خلية خلية وخلية مصفوفة التفاعلات الموجودة في الجسم الحي وينتج ناضجة، ظهارة طبقية مماثلة لتلك التي للإنسان العادي المريء. لفترة وجيزة، ونموذج يستخدم خلايا غير طبيعية تحولت الخلايا الليفية المريء الإنسان الأساسية والظهارية نمت داخل ديكي سقالة المريء المشتقة من الخنازير. توصيف المناعى لهذا النموذجبواسطة CK4، CK14، Ki67 وinvolucrin تلطيخ يوضح خلاصة المناسب للأنسجة المخاطية المريء الإنسان العادي.
يوفر هذا النموذج نموذج قوي، بيولوجيا التجريبية من الغشاء المخاطي المريء البشري. يمكن بسهولة أن يتم التلاعب بها لتحقيق عدد من الأسئلة البحثية بما في ذلك فعالية كلاء الدوائية وتأثير التعرض للعوامل البيئية مثل الكحول والسموم، وارتفاع في درجة الحرارة أو مكونات refluxate المعدي المريئي. يسهل هذا النموذج أيضا فترات ممتدة الثقافة لا يمكن تحقيقها مع خلية ثقافة 2D التقليدية، مما يتيح، في جملة أمور، ودراسة تأثير التعرض المتكرر للظهارة ناضجة لوكيل لمصلحة لمدة تصل إلى 20 يوما. وعلاوة على ذلك، ومجموعة متنوعة من خطوط الخلايا، مثل تلك المستمدة من أورام المريء أو حؤول باريت، يمكن إدراجها في النموذج للتحقيق في عمليات مثل غزو الورم وresponsivene المخدراتSS في بيئة أكثر ملاءمة من الناحية البيولوجية.
Introduction
ويتكون الغشاء المخاطي المريء والطبقية، ظهارة الحرشفية فوق طبقة من النسيج الضام، الصفيحة المخصوصة، ويعد واحدا من المواقع الأولى لمواجهة الضغوطات البيئية بلعها. هو متورط التعرض للسموم الغذائية في تطور سرطان المريء الحرشفية، بينما-duodenogastro المريء الجزر هو العامل الحاسم في التسبب في حؤول باريت، الذي يرتبط مع زيادة خطر تطور الى غدية المريء. سرطان المريء هي الورم الخبيث الأكثر شيوعا ال 8 في الذكور UK وغدية المريء يتزايد بسرعة في العالم الغربي 1. وعلاوة على ذلك، كان هناك تحسن طفيف في تشخيص المرض، مع معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات الإجمالي حوالي 15٪. ونتيجة لذلك هناك حاجة لمنصات التجريبية للتحقيق في تأثير التعرض للضغوطات البيئية على هذا ظهارة المريء ومشاركتها المحتملة في development من حؤول أو الأورام.
على الرغم من خطوط الخلايا خلد أو ورم تسمح للباحثين لدراسة استجابة الخلايا الظهارية لهذه الضغوطات في المختبر، إلا أنها تظل التكاثري وتفشل في التمايز إلى خلايا الظهارية ناضجة وجدت على الطبقات العليا من الغشاء المخاطي المريء. وعلاوة على ذلك، وخطوط الخلايا التي خضعت بالفعل تكون الأورام قد توفر معلومات محدودة فقط بشأن الاستجابات الأولية من الخلايا الطبيعية داخل الظهارة إلى العوامل البيئية؛ وهذه هي المرحلة عندما إمكانية التدخل العلاجي قد تكون أعلى. أخيرا، تفشل نظم زراعة الخلايا التقليدية للقبض على التفاعلات المهمة المحتملة بين الخلايا الظهارية والوسيطة وبين هذه الخلايا والمصفوفة المحيطة التي تحدث داخل أنسجة في الجسم الحي.
النماذج الحيوانية توفر المكروية أكثر واقعية لدراسة ردود epitheli المريءأم ويمكن أن تتضمن تحريض الاصطناعي لل-مرض الجزر المعدي المريئي (2). لكن يمكن أن يكون أكثر تحديا لمعالجة الضغوطات البيئية في هذه النماذج وأنها قد لا تمثل تماما على رد في غضون المريء البشري.
وقد وضعت نماذج تجريبية المريء الإنسان الأخرى التي تستخدم الخلايا الأولية، وخلايا خلدت أو خطوط الخلايا السرطانية على الكولاجين، أو الجمع بين الكولاجين / Matrigel، سقالة التي تحتوي على الخلايا الليفية 3،4. أنها أقل كثافة عمالية لتوليد هذه الاطر من سقالة المريء ديكي وصفها في هذه المخطوطة، وهذه النماذج عضوي النمط توفر أداة مفيدة، ولا سيما في دراسة غزو الورم 5،6، حيث تسلل الخلايا السرطانية في هلام الكولاجين يمكن أن يكون بسهولة لوحظ. ولكن هذه المواد الهلامية الكولاجين لها خصائص ميكانيكية غير الأصلية وتفتقر إلى ميزات معينة من الأنسجة الأصلية، بما في ذلك الغشاء القاعدي محددة وappropriatالبريد تضاريس السطح. هذا يمكن أن تؤثر على سلوك الخلايا الناتجة، على سبيل المثال، التصاق فقرا بين الظهارة وسقالة عند استخدام الكولاجين هلام سقالة 7. ونتيجة لذلك تم تطوير سقالة المريء الخنازير ديكي، مع ميزة كونها سقالة أكثر واقعية من الناحية البيولوجية، وبالتالي أكثر ملاءمة للاستخدام كمنصة التجريبية. وقد تبين أيضا أنه من الأفضل أن دمج الخلايا الأولية في بنيات المريء من خطوط الخلايا الظهارية خلد المريء، مثل هيت-1A، لأن هذه الخلايا تشكل ظهارة متعددة الطبقات لكنه يفشل في تطبق أو تمييز 4،7،8 .
ونتيجة لذلك، تم تكييف هذا البروتوكول من طريقة مستخدمة بالفعل في المختبر ماكنيل لصنع الأنسجة المهندسة الجلد والغشاء المخاطي للفم 9،10 ويشتمل على الخنازير سقالة دي cellularized المريء جنبا إلى جنب مع خلايا المريء الإنسان الأساسية الظهارية والخلايا الليفية. ثيالصورة بروتوكول ينتج ناضجة، ظهارة طبقية، مماثلة لتلك التي من المريء الإنسان العادي كما يتبين من CK4، CK14، Ki67 وinvolucrin تلطيخ. يوفر النموذج الناتج منصة تجريبية لدراسة الردود على الضغوطات البيئية، واستخدمت على نحو فعال لتحقيق تغييرات في التعبير الجيني في الظهارة المريء ردا على refluxate مكونات 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ويتم الحصول على خلايا المريء الإنسان من المرضى الذين يخضعون لعملية جراحية في المعدة أو المريء. يتم الحصول على الموافقة المسبقة للأنسجة لاستخدامها لأغراض البحث، والأنسجة المستخدمة مجهول تحت الموافقات الأخلاقية المناسبة (SSREC 165/03، الأنسجة البحوث الإنسانية البنك رخصة 12179).
1. عزل خلايا الإنسان الظهارية المريء
- العمل في تدفق الصفحي غطاء نسيج الثقافة وباستخدام تقنية معقمة، وإعداد مستنبت الظهارية عن طريق خلط المتوسطة Dulbecco لتعديل النسر (DMEM) وF12 هام في 3: 1 نسبة (ت: ت). إضافة 10٪ (ت / ت) FCS، 10 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة، 0.4 ميكروغرام / مل الهيدروكورتيزون، 1.8 × 10 -4 M الأدنين، 5 ميكروغرام / مل الأنسولين، 5 ميكروغرام / مل ترانسفيرين، 2 × 10 -7 M ثلاثي يودوثيرونين، 1 × 10 -10 M الكوليرا السم، 2 × 10 -3 M الجلوتامين، و 100 وحدة دولية / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و0.625 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B.
- استخدام معيارتقنيات معقمة، ووضع 11 مل من DMEM، و 10٪ FCS، 2 × 10 -3 M L-الجلوتامين، و 100 وحدة دولية / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و0.625 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B في قارورة الثقافة الأنسجة T75. إضافة 1 × 10 6 المشع القاتلة الماوس 3T3 الخلايا الليفية 12 في 1 مل من نفس المتوسطة واحتضان ليلا 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2، جو مرطب. هذا وسوف تنتج طبقة المغذية للثقافة اللاحقة من الخلايا الظهارية.
- باستخدام مشرط وبناء على توصيات من اختصاصي الهيستوباثولوجيا، تشريح لحوالي 2 سم 2 عينة من نسيج المنطقة الخلفية خالية من مرض الغشاء المخاطي الحرشفية المريء تم الحصول عليها من المرضى الذين يخضعون لعملية جراحية في المعدة أو المريء. النقل إلى المختبر في حاوية 50 مل من المتوسط النقل معقم (PBS 100 وحدة دولية / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل و 0.625 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B) في درجة حرارة الغرفة.
- في هذه المرحلة، وتخزين الأنسجة في النقلمتوسطة لمدة تصل إلى 12 ساعة (بين عشية وضحاها) في 4 درجات مئوية، لمدة الراحة. ولكن لا تستخدم فترات التخزين لفترات أطول كما أنها تؤدي إلى انخفاض بقاء الخلية.
- العمل في تدفق الصفحي غطاء نسيج الثقافة وباستخدام تقنية معقمة، تعقيم شفرة مشرط عن طريق نقع في الايثانول 70٪ لمدة 5 دقائق. شطف في برنامج تلفزيوني العقيمة.
- وضع الأنسجة في طبق بتري معقمة واستخدام مشرط لقطع عليه إلى 0.5 سم شرائح. إضافة 5 مل من 0.1٪ (ث / ت) التربسين في برنامج تلفزيوني على طبق بيتري، ووضع غطاء على طبق واحتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية.
- إضافة 5 مل من FCS إلى الأنسجة في طبق بيتري لمنع التربسين. عقد الشريط من الأنسجة مع ملقط معقم، كشط بلطف على سطح الظهارية مع شفرة مشرط لمدة 1-2 دقيقة لكل قطاع لإزالة الخلايا الظهارية في الوسط المحيط. إزالة الأنسجة كشط وتوضع جانبا. تكرار هذه العملية لجميع شرائح الأنسجة.
- جمع المتوسطة التي تحتوي على الخلايا الظهارية منفصلة في أنبوب الطرد المركزي 15 ملوأجهزة الطرد المركزي (5 دقائق، 200 x ج). تخلصي من طاف و resuspend بيليه في 12 مل من المتوسط الظهارية (موضح في الخطوة 1.1).
- تخلصي وتجاهل المتوسطة من طبقة الخلايا المغذية في قارورة T75 أعدت في الخطوة 1.2. استخدام ماصة معقمة لإضافة تعليق الخلية التي تحتوي على الخلايا الظهارية المعزولة حديثا إلى القارورة واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2، جو مرطب.
- بعد 24 ساعة من أجل الخروج والتخلص من ثقافة المتوسط، والتي سوف تحتوي أيضا على الحطام الخلية، واستبدالها مع 12 مل من المتوسط الظهارية الطازجة. مواصلة احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2، جو مرطب. وسوف تبدأ المستعمرات لتظهر مدى 24-48 ساعة القادمة، ويمكن مشاهدتها من خلال وضع قارورة الثقافة تحت المجهر ضوء معيار. تخلصي من مستنبت المستهلك واستبدالها مع حجم مساو من متوسطة جديدة كل 2-3 أيام.
- مرة واحدة وصلت القارورة 80٪ confluency، والمرور على الخلايا 13. تقسيم جملتعلمي اللغة اإلنكليزية في نسبة 1: 5 لزيادة أعداد الخلايا لاستخدامها في النموذج. اتبع الخطوة 1.2 لإنشاء طبقات المغذية من المشع 3T3 الخلايا في كل قارورة من شأنها أن تلقي الخلايا الظهارية 24 ساعة قبل الركض الخلايا.
ملاحظة: استخدام الخلايا الظهارية في نموذج المريء هو موضح أدناه بين المقاطع 1 و 4 فقط.
2. عزل المريء الخلايا الليفية الإنسان
- العمل في مجلس الوزراء تدفق الصفحي واستخدام تقنية معقمة، واتخاذ الأنسجة جانبا في الخطوة 1.7. وضع في طبق بتري معقمة واللحم المفروم ناعما من قبل تقطيع بشفرة مشرط معقم. إضافة 10 مل من 0.5٪ (ث / ت) كولاجيناز حل ووضع غطاء على طبق بيتري واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل في 5٪ CO 2، جو مرطب.
- نقل الملخص إلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي (10 دقيقة، 200 x ج)، بعناية صب قبالة وتجاهل طاف و resuspend بيليه في 10 مل من ثقافة الخلايا الليفية المتوسطة (DMEM 10٪ FCS، 2 × 10 -3 M L-الجلوتامين، و 100 وحدة دولية / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و0.625 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B).
- ضع تعليق في قارورة T75 واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2، جو مرطب. بعد 24 ساعة تخلصي من المتوسط، والتي سوف تحتوي على الحطام واستبدالها مع 12 مل من المتوسط الخلايا الليفية الطازجة. استبدال الثقافة المتوسطة كل 2-3 أيام وخلايا مرور بمجرد أن وصلت إلى 80٪ confluency 13، تقسيم الخلايا في نسبة 1: 5 لزيادة أعداد الخلايا.
ملاحظة: استخدام الخلايا الليفية في النموذج المبين أدناه بين الممرات 4 و 10 فقط.
3. إعداد المريء سقالة دي cellularized-
- الحصول على حالها الخنازير للمريء في مسلخ من سلالة الخنازير المذبوحة الطازجة التي تستخدم لإنتاج الغذاء. واحد المريء واحد يوفر السقالات كافية لحوالي 30 بنيات منفصلة.
ملاحظة: نظرا للرئيسين واسعة النطاق والوقتnsuming بروتوكول التعقيم المطلوبة، فمن عادة يستحق الحصول على وتجهيز ما لا يقل عن 10 مريء في وقت واحد. - المكان على الفور المريء رفعه حديثا الى 180 مل وعاء العقيمة التي تحتوي على ما يقرب من 150 مل من 10٪ محلول البوفيدون اليود لمدة 5 دقائق للحد من أي الميكروبات الملوثة. نقل المريء إلى وعاء ثان تحتوي على ما يقرب من 100 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة التي تحتوي على 200 وحدة دولية / مل البنسلين، 200 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و 1.25 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B.
- استبدال الغطاء عن الحاوية ونقل للمريء مرة أخرى إلى المختبر في درجة حرارة الغرفة. يمكن نقلها اثنين أو ثلاثة للمريء في كل حاوية، وهذا يتوقف حجمها.
- مرة واحدة في المختبر، والتعامل مع الأنسجة في غطاء تدفق الصفحي باستخدام تقنية العقيم للحد من التلوث الميكروبي. تعقيم ملاقط ومقصات وشفرات المشرط عن طريق نقع لمدة 5 دقائق في 70٪ من الإيثانول، والشطف في برنامج تلفزيوني العقيمة.
- التعامل مع وفاقophagus باستخدام الملقط معقمة. باستخدام مقص، وقطع مفتوحة المريء طوليا. شطف الأنسجة عن طريق وضع المريء إلى 180 مل وعاء العقيمة التي تحتوي على ما يقرب من 100 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة ويهز بلطف لإزالة أي حطام.
- تنظيف لوحة تشريح الفلين عن طريق رش تحرري مع الايثانول 70٪ والسماح ليجف.
- إزالة المريء من برنامج تلفزيوني، واستخدام الإبر المعقمة، دبوس من المريء على متن الطائرة، تحتل مركز الصدارة سطح الغشاء المخاطي. فهم سطح الغشاء المخاطي في واحدة من نهاية المريء مع ملاقط معقمة وسحب بعيدا من المجلس. وهذا فصل الغشاء المخاطي من تحت المخاطية الأساسية.
- ثم، استخدم شفرة مشرط معقم لتشريح المريء طوليا على امتداد الصفيحة المخصوصة، وإزالة المسامير كما تقدم تشريح للسماح الغشاء المخاطي لأن يرفع بعيدا.
- الإبقاء على الغشاء المخاطي تشريح وتجاهل مخاطية الأساسية.
- قطع وتجاهل معظم الداني والقاصي سم 2 رانه الغشاء المخاطي كما أن هناك عدد أكبر من الغدد تحت المخاطية وأكثر سمكا الصفيحة المخصوصة في تلك المناطق، على التوالي 7.
- استخدام مشرط لقطع الأنسجة المتبقية إلى 5 سم 2. إخضاع جميع الأنسجة خفض إلى 180 مل وعاء العقيمة التي تحتوي على ما يقرب من 150 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة وتستنهض الهمم بلطف لشطف الأنسجة. إذا تجهيز أكثر من خمسة مريء في وقت واحد قد يكون من الضروري استخدام الأواني متعددة لهذا والخطوات اللاحقة الثلاثة.
- استخدام ملاقط معقمة، ونقل الأنسجة قطع في وعاء 180 مل تحتوي على 150 مل من معقم 1 M كلوريد الصوديوم، و 200 وحدة دولية / مل البنسلين، 200 ميكروغرام / الستربتومايسين مل و 1.25 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B. احتضان لمدة 72 ساعة على 37 درجة مئوية.
- وضع النسيج في وعاء 180 مل الطازجة التي تحتوي على 150 مل PBS العقيمة. وبدأت ظهارة لفصل واضح من الأنسجة الكامنة وراءها. قشر بلطف ظهارة فصل من المريء خنزير باستخدام ملقط معقم وتجاهل.
- ضع ر المتبقيةالمسألة في وعاء 180 مل جديدة وإضافة 150 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة. تستنهض الهمم برفق لمدة 5 دقائق لغسل. تخلصي من برنامج تلفزيوني وتكرار مزيد من مرتين مع برنامج تلفزيوني جديد.
- إخضاع جميع الأنسجة في زجاجة 500 مل تحتوي على 400 مل من العقيمة 80٪ (V / V) حل الجلسرين لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. نقل إلى 400 مل من العقيمة 90٪ (V / V) حل الجلسرين لمدة 24 ساعة أخرى.
- تخزين في 400 مل من معقم 100٪ الحل الجلسرين في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 4 أشهر ليذوى وتعقيم الأنسجة مع الحفاظ على سلامة الغشاء القاعدي.
4. إنتاج وسائل الإعلام الثقافة
- إعداد بالكلاب مصل العجل لاستخدامها في مستنبت.
- صب 100 غرام من Chelex 100 إلى L زجاجة 1 وإضافة الماء غير المتأينة. حجم الدقيق ليست حرجة ولكن يجب إضافة ما يكفي من المياه لتغطية مسحوق Chelex. إضافة محرك مغناطيسي وتعقيم بواسطة التعقيم (121 درجة مئوية لمدة15 دقيقة).
- السماح للزجاجة لتبرد وChelex لتسوية. في مجلس الوزراء تدفق الصفحي تخلصي من الماء الزائد، إضافة 500 مل من مصل العجل الوليد (NCS) وتترك لاثارة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- وقف اثارة والسماح للChelex إلى تسوية، وهذا يمكن أن يستغرق فترة تصل الى 30 دقيقة. في مجلس الوزراء تدفق الصفحي صب المصل بالكلاب باستخدام ماصة معقمة، مع الحرص على عدم تعكير صفو Chelex، وتخزينها في 10 مل aliquots في -20 ° C.
- إعداد ثلاث وسائل الإعلام المختلفة في مجلس الوزراء تدفق الصفحي، بدءا المؤيدة للالتكاثري وتنتهي مع تركيبات الموالية للdifferentiative.
- إعداد المركب المتوسطة I تتألف من DMEM وحماس F12 في نسبة 3: 1 (ت: V)، 4 × 10 -3 M L-الجلوتامين، 0.5 ميكروغرام / مل الهيدروكورتيزون، 1 × 10 -4 M O -phosphorylethanolamine، 2 × 10 -12 M ثلاثي يودوثيرونين، 1.8 × 10 -4 M الأدنين، 1.88 × 10 -3 M CaCl 2، 4 × 10 -12 M البروجسترون، 10 ميكروغرام / مل فيsulin، 10 ميكروغرام / مل ترانسفيرين، 10 نانوغرام / مل السيلينيوم، 1 × 10 -3 M ايثانول و 0.1٪ (V / V) بالكلاب NCS.
- إعداد المركب المتوسطة II كما المركب المتوسطة I باستثناء استبدال المصل بالكلاب بنسبة 0.1٪ (V / V) NCS غير بالكلاب.
- إعداد المركب متوسط III كما المركب المتوسطة II باستثناء البروجسترون حذف وزيادة المصل إلى 2٪ (V / V) NCS غير بالكلاب.
5. الإنتاج من المريء الغشاء المخاطي نموذج الإنسان
- أداء جميع الأعمال في غطاء تدفق الصفحي، وذلك باستخدام تقنية العقيم للحفاظ على بيئة معقمة. تعقيم جميع الأدوات التي تمرغ في الايثانول 70٪ لمدة 5 دقائق، قبل الشطف في برنامج تلفزيوني العقيمة.
- قبل يوم واحد هو مطلوب منها، ترطيب سقالة المريء الخنازير ديكي. مطلوب قطعة واحدة من سقالة لكل بناء لتكون مستعدة.
- لترطيب المكان الأنسجة قطع كافية من سقالة الخنازير في وعاء يحتوي على 100 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة، تستنهض الهمم وينقع لمدة 10 دقيقة. عشاريالإقليم الشمالي في برنامج تلفزيوني واستبدالها مع برنامج تلفزيوني جديد. تكرار عملية غسل خمس مرات لضمان إزالة كل آثار الجلسرين.
- اختبار العقم السقالة التي يحتضنها الأنسجة ممهى بين عشية وضحاها في 100 مل من DMEM عند 37 درجة مئوية. إذا كان هناك أي تغيير في اللون أو تعكر من مستنبت في نهاية فترة الحضانة يفترض السقالة أن تكون معقمة. مرة واحدة وقد تم تأكيد العقم، ضع 5 سم 2 اخلوي السقالة إلى لوحة 6 جيدا، والجانب العلوي تحت المخاطية.
- وضع معقمة الطبية الصف حلقة من الصلب المقاوم للصدأ (الداخلية قطرها 10 مم، 20 مم القطر الخارجي) على مركز كل سقالة واضغط برفق باستخدام ملقط معقم، لضمان وجود ختم كافية مع الأنسجة.
- حصاد الخلايا الليفية باستخدام التربسين EDTA-13 لإنتاج تعليق خلية. عد الخلايا باستخدام haemocytometer 14. الطرد المركزي تعليق خلية (10 دقيقة، 200 x ج). resuspend الكرية الخلية إلى appropriaحجم الشركة المصرية للاتصالات من الخلايا الليفية المتوسطة لإنتاج خلايا النهائي من 2.5 × 10 6 خلايا لكل مل.
- إضافة 0.2 مل من الخلايا الليفية المتوسطة، تحتوي على 5 × 10 5 الخلايا الليفية المريء الإنسان، في كل حلقة. إغراق المنطقة المحيطة خارج الحلبة مع ما يقرب من 2 مل من الخلايا الليفية المتوسطة. احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2، جو مرطب.
- بعد 24 ساعة إزالة الحلقات والخلايا الليفية المتوسطة وإضافة 5 مل على الأقل من المتوسطة الليفية جديدة إلى كل بئر، وضمان أن السقالة ويغرقها في المتوسط. الثقافة ل1 أسبوع، عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2، جو مرطب استبدال المتوسط كل 2-3 أيام.
- بعد 1 أسبوع إزالة لوحات بشكل جيد 6 تحتوي على السقالات لفيضان هود الصفحي، وإزالة المتوسطة وعكس كل سقالة باستخدام ملقط معقم، وضع على سطح الغشاء المخاطي العلوي. ويشار إلى هذه النقطة الوقت لكما يوم 0.
- وضع حلقات الصلب على سطح الغشاء المخاطي في وسطالأنسجة كما في الخطوة 5.4.
- إعداد قوارير T75 من الخلايا الظهارية للtrypsinization 13. بعد PBS غسل وقبل إضافة محلول التربسين-EDTA، إضافة 2 مل من العقيمة 0.02٪ (وزن / حجم) حل EDTA لكل قارورة. احتضان لمدة 2 دقيقة عند 37 ° C. اضغط على قارورة برفق لفصل انتقائي الطبقة المغذية i3T3 بينما يترك الخلايا الظهارية المرفقة.
ملاحظة: ومن المسلم به عموما ليس من العملي أو الضروري لمريض تطابق الخلايا الظهارية إلى الخلايا الليفية أدرجت بالفعل في النموذج الأسبوع السابق. - تخلصي من حل EDTA تحتوي على طبقة المغذية وإضافة الحل التربسين-EDTA لحصاد الخلايا الظهارية 13. عد الخلايا باستخدام haemocytometer 14. الطرد المركزي تعليق خلية (10 دقيقة، 200 x ج). resuspend الكرية الخلية إلى حجم مناسب من المركب المتوسطة 1 لإنتاج خلايا النهائي من 5 × 10 6 خلايا لكل مل.
- إضافة 0.2 مل من المركب المتوسطة I، التي تحتوي على 1 × 10 6 خلايا الظهارية، داخل الحلبة. إغراق المنطقة المحيطة خارج الحلبة مع ما يقرب من 2 مل من المركب المتوسطة الأول ووضع بنيات في حاضنة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2، جو مرطب.
- بعد 24 ساعة (يوم 1) إزالة حلقات والمتوسطة وإضافة 5 مل على الأقل من جديد مركب متوسط I، وضمان مغمورة تماما السقالات والعودة إلى الحاضنة. بعد 24 ساعة أخرى (اليوم 2) إزالة المتوسطة واستبدالها مع 5 مل على الأقل من مركب متوسط II، مرة أخرى ضمان وغرقت بالكامل السقالات والعودة إلى الحاضنة.
- في يوم 4 المكان الصف الطبية المعقمة الفولاذ المقاوم للصدأ شبكات سلكية (2 سم × 2 سم × 0.5 سم ارتفاع)، في 6 لوحات جيدا جديدة، واحدة لكل بناء. استخدام ملاقط معقمة لنقل يبني على الجزء العلوي من شبكات الصلب، والغشاء المخاطي العلوي السطح.
- إضافة ما يكفي من مركب متوسط III بحيث يصل السائل الجانب السفلي من المركبة، ولكن السطحمعرضة للهواء، وهذا يضمن أن يتم الحفاظ على العينة في واجهة الهواء السائل. حجم الدقيق المتوسطة المطلوبة سوف تختلف تبعا لسمك السقالة، وحجم البئر وارتفاع الدقيق للشبكة الفولاذ المقاوم للصدأ.
- الحفاظ على المركبة في واجهة الهواء السائل لمدة تتراوح بين 10 و 20 يوما (يوم 14 إلى يوم 24)، تبعا لمتطلبات التجربة. استبدال مركب متوسط III مع متوسطة جديدة كل 2 إلى 3 أيام (الاثنين والأربعاء والجمعة هو نظام سهل الاستعمال).
ملاحظة: بعد 5 أيام على واجهة الهواء السائل (يوم 9) ويبني لها ظهارة المريء ناضجة بما فيه الكفاية لاستخدامها في تجارب على تأثير العوامل البيئية على ظهارة المريء. - في نهاية التجربة، وتحديد بنيات للتحليل النسيجي وتلطيخ المناعى 7، أو استخراج البروتين 15 أو RNA 11،16 من ظهارة لمزيد من ANALYSهو. إذا لزم الأمر، الإبقاء على مستنبت مكيفة لتحليل الخلية الجزيئات يشير 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تصف هذه المخطوطة العملية المطلوبة، كما هو موضح في الشكل التخطيطي في الشكل 1، إلى ثقافة 3D نماذج من ظهارة المريء الإنسان بنجاح. لتأكيد مدى ملاءمة هذا النموذج بوصفه اتخذت لالنسيجية منصة تجريبية ودراسات مقارنة المناعى أنسجة مثقف مع العادي البشري مخاطية المريء الحرشفية.
تقييم النسيجي للظهارة التي تنتجها الطريقة الموصوفة يظهر نضجا، متعدد الطبقات، طبقية ظهارة الحرشفية (الشكل 2B) وهو مشابه لتلك التي لوحظت مع العادي البشري المريء (الشكل 2A)، وإن كان أرق (5-10 طبقات من الخلايا مقارنة مع 10-20 لالمريء العادي)، مع الخلايا تصبح تدريجيا تملق وعديم النواة في نهاية المطاف كما تهاجر نحو السطح.
توصيف المناعى من علامات رئيسية الانتشار وديfferentiation إثبات أن التشريح المجهري للظهارة نموذج مشابه لظهارة المريء الإنسان العادي. ويلاحظ التعبير Ki67 مماثل في كل من المريء الأصلي وظهارة النموذج، مع تلطيخ تقتصر على مجموعة فرعية من الخلايا داخل القاعدية وطبقات suprabasal فورا (أرقام 3A و 3B). هذا هو مماثل للدراسات التي تفيد بأن أقل من 10٪ من الخلايا تظهر عادة التعبير عن علامة الانتشار، Ki67، في الظهارة المريء العادية 18. وأعرب عن CK4 عادة في ظهائر الطبقية وعمودية ولكن عموما غائبا عن الطبقات القاعدية بينما CK14 هو إيجابي فقط في الطبقة القاعدية 19. في كل من ظهائر المريء العادية والنموذج، لوحظ CK14 في جميع الخلايا في الطبقة القاعدية (أرقام 3D و3E)، في حين لوحظ CK4 في جميع أنحاء ظهارة باستثناء اثنين من طبقات أكثر القاعدية (أرقام الجيل الثالث 3G و
محاولات لتحل محل الخلايا الظهارية المريء الأولية مع الخلايا الظهارية المريء مخلد، مثل هيت-1A، كانت أقل نجاحا، ولم تنتج نموذجا صالحا للظهارة المريء العادية. وقد تم تشكيل لظهارة متعددة الطبقات. ولكن تم الكشف عن علامة التكاثري Ki67 في جميع أنحاء ظهارة (الشكل 3C) مع عدم وجود التعبير الكشف عن أية علامات التمايز (أرقام 3F، 3I و3L)، مشيرا إلى أن الخلايا هيت-1A أنتجت ظهارة hyperproliferative مع عدم وجود دليل على الطبقات العادية أو النضج.
ومع ذلك، فقد كان نموذجاتعديل بنجاح لدمج خلايا الورم عن طريق استبدال الخلايا الظهارية الأولية مع أي غدية المريء (OE33) أو سرطان الحرشفية (OE21) الخلايا. هذا يدل على مرونة نموذج، مما يتيح استخدامه في التحقيق في مجموعة من اضطرابات المريء في مراحل مختلفة من التطور من خلال إدراج عدد من خطوط مختلفة من الخلايا. ويمكن أن نرى أن هناك فرقا ملحوظا في الردود من هذه السطور اثنين من خلية. OE21 الخلايا الحرشفية سرطان تنتج لظهارة مرئية على بناء كمنطقة الصفراء تعريف الشكل (4A) شقوقا كبيرة داخل ظهارة (الشكل 4B)، يحتمل أن تعكس اختلال جزيئات التصاق الخلية. بما في ذلك خلايا غدية OE33 ضمن نتائج النموذج في كمية كبيرة من تدهور سقالة، مرئية بالعين كما ترقق السقالة بعد نمو 2 أسابيع في واجهة الهواء / السائل (الشكل 4C)، وأكد في تحليل H + E كماخفض واضح في سمك سقالة في المنطقة دون الخلايا (الشكل 4D). وهذا هو المرجح أن يكون نتيجة للتفاعل بين الخلايا السرطانية والخلايا الليفية، لأن عدم مراعاة انحطاط سقالة في غياب الخلايا الليفية (أرقام 4E و4F). وقد لاحظنا آثار مماثلة على غزو الورم في حضور وغياب الخلايا الليفية في نماذج سرطان الجلد ما يعادل 21.
الشكل 1: رسم تخطيطي يظهر إنتاج نموذج الغشاء المخاطي المريء هي المصنفة الخلايا الليفية المريء الإنسان على سطح تحت المخاطية من السقالة ومثقف لمدة 7 أيام. هو مقلوب السقالة، الخلايا الظهارية المريء الإنسان المضافة والمغمورة تربيتها لمدة 4 أيام. يتم رفع بناء على واجهة الهواء السائل لمدة تتراوح بين 10 و 20 دايس. في نهاية التجربة التركيبة يمكن أن يخضع لمزيد من التحليل على النحو المطلوب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مقارنة ظهارة المنتجة في نموذج المريء مع وضعها الطبيعي ظهارة المريء الإنسان H + E تحليل (A) طبيعية ظهارة المريء الإنسان و(B) ظهارة المريء تشكلت في نموذج الغشاء المخاطي المريء البشري. شريط المقياس هو 500 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4: إدراج خطوط الخلايا السرطانية داخلنموذج المريء. تم استبدال الخلايا الظهارية الأولية من خلال خط الحرشفية الخلايا السرطانية، OE21، أو خط خلية غدية، OE33. تظهر الصور على بناء مع الخلايا OE21 (A) أو خلايا OE33 إما بالاشتراك مع (C) أو في حالة عدم وجود (E) الخلايا الليفية، قبل تحديد في نهاية الفترة الثقافة. وتصور الظهارة بما في ذلك OE21 (B) أو خلايا OE33 مع (D) أو بدون (F) الليفية التي كتبها H + E تلطيخ. شريط المقياس هو 500 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تصف هذه المخطوطة إنتاج وتوصيف المريء البشري نموذج الغشاء المخاطي بيولوجيا مناسبة لاستخدامها بوصفها منصة تجريبية لدراسة تأثير التعرض للالضغوطات البيئية على ظهارة المريء.
الخطوات الأكثر أهمية لإنتاج الناجح لنموذج الغشاء المخاطي المريء البشري هي: ضمان أن الغالبية العظمى من الخلايا الظهارية تبقى التكاثري ولم تبدأ بالفعل في التفريق قبل البذر لهم على منصة الاعدام. الحفاظ على واجهة الهواء السائل للمركب للتأكد من النضج الصحيح للظهارة. الحفاظ على عقم طوال الفترة الممتدة الثقافة.
نظرا لكميات محدودة من أنسجة البشرية المتاحة لعزل خلية أنه ليس من الممكن عموما للحصول على خلايا كافية من عينة الأنسجة واحدة على البذور الخلايا المعزولة حديثا مباشرة على منصة الاعدام وبالتالي درجة الحموضة توسيع الخليةمطلوب بورصة عمان حيث تزرع الخلايا في 2D الظروف ثقافة الخلية القياسية. من المهم للتأكد من أن الخلايا لا تزال التكاثري خلال هذه الفترة. ويتحقق ذلك عن طريق ضمان أن يتم السماح للثقافات أبدا للوصول إلى confluency الكامل، وذلك باستخدام الخلايا في نموذج فقط ما يصل الى مرور 4 ومراقبة بعناية مورفولوجيا الخلايا. وهكذا الخلايا يجب أن يحتفظ مميزة مورفولوجيا المضلع التكاثري وضيق "حصاة كبيرة" مثل الرصيف ظهور سمة من الخلايا الظهارية التكاثري بدلا من مظهر أكثر انتشارا لوحظ في الثقافات التي بدأت في التفريق. يتم التحكم في الخطوة الثانية الحاسمة من خلال ضمان أن مستنبت الخليوي ويغطي السطح العلوي للشبكات الفولاذ المقاوم للصدأ المستخدمة لرفع الثقافات إلى واجهة الهواء السائل ولكن على السطح العلوي للبناء لا المغمورة نفسها. والخطوة الثالثة هي تعتمد على الالتزام الصارم بروتوكول التعقيم الموسع عند إنتاج اجتثاث cellularizedسقالة الخنزير واستخدام تقنية معقمة جيدة طوال العملية.
نتائجنا تظهر ان هناك حاجة خلايا المريء الإنسان الأساسية لإنتاج طبيعية وناضجة، ظهارة طبقية. إذا تم استخدام خط الخلية خلده، وإن كانت مستمدة من ظهارة المريء الإنسان، ظلت الخلايا التكاثري وفشلت في التفريق لتشكيل ظهارة طبقية ناضجة. لا يمكن استخدام ظهارة الناتجة نموذجا مرضيا للظهارة العادية، مما يدل على عدم ملاءمة خط الخلية خلد هيت-1A للاستخدام في النموذج. ومع ذلك خطوط الخلايا الأخرى مثل تلك المستمدة من أورام المريء أو حؤول باريت يمكن إدراجها في النموذج إما في مكان أو بالإضافة إلى الخلايا الظهارية الأولية لإنتاج نماذج لدراسة تطور الورم، والغزو وردا على وكلاء الدوائية.
تجارب يمكن تنفيذها باستخدام نموذج المريء إلى simulate تعرض المريء إلى المتقطعة، أحداث نابض أثناء البلع أو ارتجاع. ويتحقق ذلك عن طريق غمر مرارا البناءات في مستنبت يحتوي على مركب (ق) لفحصها والشطف في برنامج تلفزيوني قبل أن تعود بناء على واجهة الهواء السائل. مرات التعرض والتردد ويمكن تعديلها لتعكس عملية يجري محاكاة، وضمان أن تتعرض الطبقة الطلائية إلى العامل البيئي (الصورة) بينما يسمح للثقافة أن يستمر في واجهة الهواء السائل. وقد استخدم هذا الأسلوب في مختبرنا للتحقيق في تأثير ارتجاع المريء على ظهارة العادية، حيث تعرضت النموذج لمكونات الجزر المعدي المريئي محددة لمدة 10 دقيقة مرتين في اليوم لمدة 11 يوما (11). بدلا من بنيات يمكن أن تتعرض لمستويات مستمرة من الضغوطات البيئية بما في ذلك هذه المركبات في مستنبت. ومع ذلك، منذ ظهارة يجب أن يتعرض إلى واجهة الهواء السائل لepithelium حتى تنضج والتفريق بشكل صحيح 7، فمن غير الممكن أن يغرق بشكل مستمر البناءات في مستنبت. وبالتالي، فإن التعرض للإجهاد يكون فقط عن طريق السطح تحت المخاطية في هذه التجارب، التي قد تحد من أهمية النتائج التي تم الحصول عليها.
هذه التقنية هي عمالة كثيفة نسبيا، وبالتالي هي أكثر ملاءمة لفحص عدد محدود نسبيا من المركبات. ونتيجة لذلك، عند استخدام هذا النموذج بوصفه منصة تجريبية، فمن المناسب لأداء أول الدراسات الأولية باستخدام تقنيات زراعة الخلايا التقليدية لتحديد عدد محدود من الظروف قبل إجراء مزيد من التحليل باستخدام نموذج المريء أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية وصفها هنا 11. بالإضافة إلى تحليل المناعى فقد كان أيضا من الممكن دراسة التغيرات في الظهارية الشخصي التعبير الجيني بعد التعرض لالضغوطات البيئية. وقد تحقق ذلك من خلال تجريد يدويا بعيدا هpithelium، واستخراج الحمض النووي الريبي وتحويلها إلى [كدنا لعزل الجينات التي أعرب عنها وتحليلها بواسطة ميكروأري للحصول على أنماط التغير الجيني 11. وبهذه الطريقة أصبح من الممكن لزيادة المعلومات المتاحة عن النموذج باعتباره منصة تجريبية. وقد تم اقتراح تغييرات مبكرة في الظهارية الشخصي التعبير الجيني بعد التعرض لمحاكاة الجزر المعدي المريئي، ومن هذه النتائج تم اقتراح مجالات جديدة لمزيد من التحقيق في الوقاية من تطور حؤول باريت، والسلائف استحالي إلى OAC 11. ويمكن أيضا أن تستخدم نموذج لدراسة البروتين التعبير باستخدام أساليب مثل تحليل لطخة غربية 15 و التعبير الجيني باستخدام تحليل الشمالي لطخة 16. يمكن أن يؤديها الدراسات فضلا عن ذلك فإن الجزيئات يشير الى خارج الخلية على مستنبت 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
ونحن ممتنون للسيد روجر أكرويد، السيد أندرو وايمان والسيد كريس ستودارد، مستشار الجراحون في شيفيلد المستشفيات التعليمية NHS مؤسسة ترست، لمساعدتهم في الحصول على عينات الأنسجة المريء ودعمهم لعملنا. نشكر أشرف انعام الحق لمساعدته دمج خطوط الخلايا السرطانية في النموذج. نحن نعترف بامتنان الدعم المالي لهذه الدراسة من المنح المقدمة من باردهان البحوث والتعليم الثقة (BRET) ويوركشاير أبحاث السرطان (YCR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | BD Biosciences | 215240 | Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilize. Warm in 37 °C water bath before use. |
| DMEM | Labtech | LM-D1112 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F12 | Labtech | LM-H1236 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Foetal Calf Serum | Labtech | FB-1090 | |
| Epidermal Growth Factor | R+D Systems | 236-EG-200 | Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS |
| Hydorcortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2767 | Prepare 10 mg/ml solution in 0.01 M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilize before use |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | Prepare stock solution in water |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Brand name Fungizone |
| PBS | Oxoid | BR0014 | Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilize |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| Povidone-iodine solution | Ecolab | 10830E | Brand name Videne |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| Newborn calf serum | Gibco | 26010074 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use use |
| O-phosphorylethanolamine | Sigma-Aldrich | P0503 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Lonza | 17-838Z | Used for composite media preparation |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA 0.02% solution | Sigma-Aldrich | E8008 | Warm in 37 °C water bath before use |
| T75 culture flask | VWR | 734-2313 | |
| 50 ml centrifuge tube | Fisher | 11819650 | |
| 15 ml universal tube | SLS | SLS7504 | |
| 180 ml pot | VWR | 216-2603 | |
| Petri dish | SLS | 150350 | |
| 6 well plate | VWR | 734-2323 | |
| stainless steel rings | Manufactured in house - medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm | ||
| steel mesh grids | Manufactured in house - sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2 cm (w) x 2 cm (d) x 0.5 cm (h) | ||
| ki67 | Novocastra | KI67-MM1-L-CE | Clone MM1. Use at 1:100. |
| CK4 | Abcam | ab9004 | Clone 6B10. Use at 1:200. |
| CK14 | Novocastra | LL002-L-CE | Clone LL002. Use at 1:200. |
| Involucrin | Novocastra | INV | Clone SY5. Use at 1:100. |
| OE21 | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| OE33 | Sigma-Aldrich | 96070808 | |
| Het-1A | ATCC-LGC | CRL-2692 | |
| Mouse 3T3 fibroblasts | ATCC-LGC | CRL-1658 | previously growth arrested by irradiation (60 Gy) |
References
- Pera, M., Manterola, C., Vidal, O., Grande, L. Epidemiology of esophageal adenocarcinoma. J. Surg. Oncol. 92 (3), 151-159 (2005).
- Manea, G. S., Lupusoru, C., Caruntu, I. D. Experimental study on the effect of bile, and bile and hydrochloric acid mixture on the esophageal mucosa. Rom. J. Morphol. Embryol. 50 (1), 61-66 (2009).
- Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 278 (3), 1824-1830 (2003).
- Underwood, T. J., et al. A comparison of primary oesophageal squamous epithelial cells with HET-1A in organotypic culture. Biol. Cell. 102 (12), 635-644 (2010).
- Nystrom, M. L., et al. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J. Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Okawa, T., et al. The functional interplay between EGFR overexpression, hTERT activation, and p53 mutation in esophageal epithelial cells with activation of stromal fibroblasts induces tumor development, invasion, and differentiation. Genes & Development. 21 (21), 2788-2803 (2007).
- Green, N., et al. The development and characterization of an organotypic tissue-engineered human esophageal mucosal model. Tissue Eng Part A. 16 (3), 1053-1064 (2010).
- Harada, H., et al. Telomerase induces immortalization of human esophageal keratinocytes without p16INK4a inactivation. Mol. Cancer Res. 1 (10), 729-738 (2003).
- Bhargava, S., Chapple, C. R., Bullock, A. J., Layton, C., MacNeil, S. Tissue-engineered buccal mucosa for substitution urethroplasty. BJU. Int. 93 (6), 807-811 (2004).
- Ralston, D. R., et al. Keratinocytes contract human dermal extracellular matrix and reduce soluble fibronectin production by fibroblasts in a skin composite model. Br. J. Plast. Surg. 50 (6), 408-415 (1997).
- Green, N. H., et al. Pulsatile exposure to simulated reflux leads to changes in gene expression in a 3D model of oesophageal mucosa. Int. J. Exp. Pathol. 95 (3), 216-228 (2014).
- Wang, C. S., et al. Selective culture of epithelial cells from primary breast carcinomas using irradiated 3T3 cells as feeder layer. Pathol. Res. Pract. 197 (3), 175-181 (2001).
- Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. J. Vis. Exp. (16), e755 (2008).
- Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2014).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N. Am. J. Med. Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat. Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Morgan, E., et al. Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clin. Immunol. 110 (3), 252-266 (2004).
- Xu, M., et al. The abnormal expression of retinoic acid receptor-beta, p 53 and Ki67 protein in normal, premalignant and malignant esophageal tissues. World J. Gastroenterol. 8 (2), 200-202 (2002).
- Moll, R., Divo, M., Langbein, L. The human keratins: biology and pathology. Histochem. Cell Biol. 129 (6), 705-733 (2008).
- Rice, R. H., Green, H. Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions. Cell. 18 (3), 681-694 (1979).
- Eves, P., et al. Melanoma invasion in reconstructed human skin is influenced by skin cells - investigation of the role of proteolytic enzymes. Clin. Exp. Metastasis. 20 (8), 685-700 (2003).
