Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Production, la caractérisation et utilisations potentielles d'un humain de l'oesophage muqueux modèle 3D de l'ingénierie tissulaire

Published: May 18, 2015 doi: 10.3791/52693
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Materials Science and Engineering, University of Sheffield, 2Department of Oncology and Insigneo Institute for in silico Medicine, University of Sheffield, 3Department of Histopathology, Sheffield Teaching Hospitals NHS Foundation Trust

Summary

Ce manuscrit décrit la production, la caractérisation et les utilisations potentielles d'une ingénierie tissulaire de construction de l'œsophage 3D préparé à partir de fibroblastes humains primaires normale de l'œsophage et les cellules épithéliales squameuses ensemencées dans un échafaudage porcine de-cellularisée. Les résultats mettent en évidence la formation d'un épithélium stratifié mûr similaire à l'oesophage humain normal.

Abstract

L'incidence à la fois de l'adénocarcinome oesophagien et son précurseur, métaplasie de Barrett, augmentent rapidement dans le monde occidental. En outre adénocarcinome oesophagien a généralement un mauvais pronostic, avec peu d'amélioration dans les taux de survie au cours des dernières années. Ces conditions sont difficiles à étudier et il ya eu un manque de plates-formes expérimentales appropriées pour enquêter sur les troubles de la muqueuse œsophagienne.

Un modèle de la muqueuse de l'oesophage humain a été développé dans le laboratoire MacNeil qui, à la différence des systèmes de culture de cellules 2D conventionnelles, récapitule les interactions cellule-cellule et cellule-matrice présents in vivo et produit un mature, épithélium stratifié semblable à celui de l'être humain normal œsophage. En résumé, le modèle utilise des cellules non transformées normales de fibroblastes primaires humains de l'œsophage et epitheliales cultivées dans un échafaud oesophagien acellulaire dérivée de porc. La caractérisation immunohistochimique de ce modèlepar CK4, CK14, Ki67 et involucrine coloration montre récapitulation approprié de l'histologie de la muqueuse de l'œsophage humain normal.

Ce modèle fournit un robuste modèle expérimental, biologiquement pertinente de la muqueuse œsophagienne humaine. Il peut facilement être manipulée pour enquêter sur un certain nombre de questions de recherche, y compris l'efficacité des agents pharmacologiques et l'impact de l'exposition à des facteurs environnementaux tels que l'alcool, les toxines, à haute température ou des composants de produit de reflux gastro-oesophagien. Le modèle facilite également les périodes de culture prolongées pas réalisables avec la culture cellulaire classique en 2D, permettant, entre autres, l'étude de l'impact de l'exposition répétée d'un épithélium mature pour l'agent d'intérêt pour un maximum de 20 jours. En outre, une variété de lignées cellulaires, telles que celles dérivées de tumeurs de l'oesophage ou métaplasie de Barrett, peut être incorporé dans le modèle pour étudier des processus tels que l'invasion tumorale et le médicament responsiveness dans un environnement plus biologiquement pertinente.

Introduction

La muqueuse de l'œsophage comprend, un épithélium malpighien-dessus d'une couche de tissu conjonctif, la lamina propria, et est l'un des premiers sites à rencontrer facteurs de stress environnementaux ingérés. L'exposition à des toxines alimentaires est impliqué dans le développement du carcinome épidermoïde de l'oesophage, tandis que duodenogastro-oesophagien reflux est un facteur critique dans la pathogenèse de la métaplasie de Barrett, qui est associé à un risque accru de progression de l'adénocarcinome de l'oesophage. Cancer de l'œsophage sont la 8 ème tumeur maligne la plus fréquente chez les hommes au Royaume-Uni et l'adénocarcinome oesophagien augmente rapidement dans le monde occidental 1. En outre, il ya eu peu d'amélioration dans le pronostic de la maladie, avec un taux de survie globale à 5 ans de l'ordre de 15%. Par conséquent, il existe un besoin pour des plates-formes expérimentales pour étudier l'impact de l'exposition aux facteurs de stress environnementaux sur cette épithélium oesophagien et leur implication potentielle dans le développement de la métaplasie ou néoplasie.

Bien que des lignées cellulaires immortalisées ou tumorales permettent aux chercheurs d'étudier la réponse des cellules épithéliales à ces facteurs de stress in vitro, ils restent proliferative et ne parviennent pas à se différencier en cellules épithéliales matures présents sur les couches supérieures de la muqueuse de l'oesophage. En outre, les lignées cellulaires qui ont déjà subi la tumorigenèse peuvent fournir que des informations limitées concernant les réponses initiales de cellules normales dans l'épithélium à des facteurs environnementaux; et ceci est l'étape où le potentiel pour une intervention thérapeutique peut être plus élevé. Enfin, les systèmes de culture cellulaire classiques ne parviennent pas à saisir les interactions potentiellement importantes entre les cellules epitheliales et mésenchymateuses et entre ces cellules et la matrice environnante qui se produisent dans les tissus in vivo.

Des modèles animaux fournissent un micro-environnement plus réaliste pour l'étude des réponses des epitheli oesophagienum et peut incorporer l'induction artificielle de reflux gastro-oesophagien maladie 2. Toutefois, il peut être plus difficile à manipuler les facteurs de stress environnementaux dans ces modèles et ils ne peuvent pas représenter pleinement la réponse dans l'œsophage humain.

D'autres modèles expérimentaux œsophagienne humains ont été développés qui utilisent des cellules primaires, des cellules immortalisées ou des lignées de cellules tumorales sur un collagène, le collagène ou combiné / Matrigel, échafaud contenant des fibroblastes 3,4. Il est moins de travail pour générer ces échafaudages que l'échafaud de l'œsophage acellulaire décrit dans ce manuscrit, et ces modèles organotypiques fournir un outil utile, en particulier dans l'étude de l'invasion tumorale 5,6, où l'infiltration des cellules tumorales dans le gel du collagène peut être facilement observée. Toutefois, ces gels de collagène ont des propriétés mécaniques non-indigènes et manquent certaines caractéristiques du tissu d'origine, y compris une membrane basale spécifique et le appropriate topographie de la surface. Cela peut influencer le comportement des cellules résultant, par exemple, l'adhésion plus pauvres entre l'épithélium et échafaudage lors de l'utilisation d'un échafaudage de collagène gel 7. En conséquence, l'échafaudage de l'œsophage porcine acellulaire a été développé, avec l'avantage d'être un échafaudage biologiquement plus réaliste et donc plus appropriée pour une utilisation comme une plate-forme expérimentale. Il a également été montré qu'il est préférable d'incorporer des cellules primaires dans les produits d'assemblage de l'œsophage que des lignées cellulaires immortalisées épithéliales de l'œsophage, tels que Het-1A, étant donné que ces cellules forment un épithélium multicouches mais ne parviennent pas à stratifier ou 4,7,8 différencier .

Par conséquent, ce protocole a été adapté à partir d'une méthode déjà utilisée dans le laboratoire pour la fabrication de tissus MacNeil peau ingénierie et la muqueuse buccale 9,10 et intègre un échafaudage oesophagien porcine de-cellularisée combinée avec des cellules humaines oesophagiennes épithéliales et les fibroblastes primaires. This protocole produit, un épithélium stratifié mature, similaire à celle de l'oesophage humain normal comme démontré par CK4, CK14, Ki67 et involucrine coloration. Le modèle qui en résulte fournit une plate-forme expérimentale pour étudier les réponses aux facteurs de stress environnementaux, et a été utilisé efficacement pour étudier les changements dans l'expression des gènes dans l'épithélium de l'œsophage en réponse à reflué composants 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Cellules de l'œsophage de l'homme sont obtenus chez des patients subissant une chirurgie gastrique ou oesophagien. Le consentement éclairé est obtenu pour le tissu à être utilisé à des fins de recherche, et le tissu utilisé de manière anonyme sous les approbations éthiques appropriées (SSREC 165/03, la banque de tissus humains à la recherche de licence 12179).

1. Isolement des cellules épithéliales humaines de l'oesophage

  1. Travailler dans un écoulement laminaire hotte de culture tissulaire et en utilisant une technique stérile, préparer le milieu de culture épithéliale en mélangeant le milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) et le F12 de Ham dans un rapport 3: 1 (v: v). Ajouter 10% (v / v) de SVF, 10 ng / ml de facteur de croissance épidermique, 0,4 ug / ml d'hydrocortisone, 1,8 x 10 -4 M d'adénine, 5 ug / ml d'insuline, 5 pg / ml de transferrine, 2 x 10 -7 M triiodothyronine, 1 x 10 -10 M toxine cholérique, 2 x 10 -3 M glutamine, 100 UI / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine, et 0,625 pg / ml d'amphotéricine B.
  2. En utilisant la normetechniques stériles, mis 11 ml de DMEM, FCS à 10%, 2 x 10 -3 M de L-glutamine, 100 UI / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine, et 0,625 pg / ml d'amphotéricine B dans un ballon de culture de tissu T75. Ajouter 1 x 10 6 irradiées de façon létale fibroblastes 3T3 de souris 12 dans 1 ml du même milieu et on incube pendant une nuit à 37 ° C dans un CO 2, atmosphère humidifiée à 5%. Ceci va produire une couche nourricière pour la culture ultérieure des cellules épithéliales.
  3. Avec un scalpel et en suivant les recommandations d'un pathologiste, disséquer une participation d'environ 2 cm 2 échantillon de tissu de la région de fond sans maladie de la muqueuse de l'œsophage épidermoïde obtenu à partir de patients subissant une chirurgie gastrique ou oesophagien. Le transport au laboratoire dans un récipient de 50 ml de milieu de transport stérile (PBS 100 UI / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine et de 0,625 pg / ml d'amphotéricine B) à la température ambiante.
  4. À ce stade, stocker le tissu dans le transportmoyen pour un maximum de 12 heures (une nuit) à 4 ° C, pour plus de commodité; toutefois, ne pas utiliser des périodes de stockage plus longues tels qu'ils résultent de la viabilité cellulaire réduite.
  5. Travailler dans un écoulement laminaire hotte de culture tissulaire et en utilisant une technique stérile, stériliser une lame de scalpel par trempage dans l'éthanol à 70% pendant 5 min. Rincer dans du PBS stérile.
  6. Placez le tissu dans une boîte de Pétri stérile et utilisez le scalpel pour couper en bandes de 0,5 cm. Ajouter 5 ml de 0,1% (p / v) de trypsine dans du PBS à la boîte de Petri, placer le couvercle sur la boîte et incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
  7. Ajouter 5 ml de FCS au tissu dans la boîte de Pétri pour inhiber la trypsine. Maintien de la bande de tissu avec des pinces stériles, grattez délicatement la surface épithéliale avec la lame de bistouri pendant 1-2 min par bande pour enlever les cellules épithéliales dans le milieu environnant. Retirer le tissu gratté et mettre de côté. Répétez le processus pour toutes les bandes de tissu.
  8. Recueillir le milieu contenant les cellules épithéliales isolées dans un tube de centrifugeuse de 15 mlet centrifugation (5 min, 200 x g). Verser le surnageant et remettre en suspension le culot dans 12 ml de milieu épithéliale (décrit à l'étape 1.1).
  9. Décanter et éliminer le milieu de la couche de cellules nourricières dans le flacon T75 préparé à l'étape 1.2. Utiliser une pipette stérile à ajouter la suspension de cellules contenant les cellules épithéliales fraîchement isolés dans le ballon et incuber à 37 ° C dans un 5% de CO 2, atmosphère humidifiée.
  10. Après 24 h verser et jeter le milieu de culture, qui contiendra également les débris cellulaires, et les remplacer par 12 ml de milieu épithéliale frais. Continuer l'incubation à 37 ° C dans un CO 2, atmosphère humidifiée à 5%. Colonies vont commencer à apparaître au cours du prochain de 24 à 48 h et peuvent être consultés en plaçant le ballon de culture sous un microscope optique standard. Décanter le milieu de culture usé et le remplacer par un volume égal de milieu frais tous les 2 à 3 jours.
  11. Une fois que le ballon a atteint 80% de confluence, les cellules 13 passage. Diviser le caunes dans un rapport de 1: 5 pour augmenter le nombre de cellules à utiliser dans le modèle. Suivez l'étape 1.2 d'établir des couches nourricières de cellules 3T3 irradiés dans chaque flacon qui recevra cellules épithéliales 24 heures avant repiquage des cellules.
    Remarque: Utilisez les cellules épithéliales dans le modèle de l'œsophage décrit ci-dessous entre les passages 1 et 4 seulement.

2. Isolement de l'oesophage fibroblastes humains

  1. Travailler dans une hotte à flux laminaire et en utilisant une technique stérile, prélever le tissu mis de côté à l'étape 1.7. Placez-les dans une boîte de Pétri stérile et émincer finement en coupant avec une lame de scalpel stérile. Ajouter 10 ml de 0,5% (p / v) collagénase Une solution et placez le couvercle sur la boîte de Pétri et incuber à 37 ° C pendant la nuit dans un CO 2, l'atmosphère 5% humidifié.
  2. Transférer le condensé d'un tube et centrifuger (10 min, 200 xg) 15 ml centrifugeuse, versez délicatement et jeter le surnageant et remettre le culot dans 10 ml de milieu de culture des fibroblastes (DMEM 10% FCS, 2 x 10 -3 M de L-glutamine, 100 UI / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine, et 0,625 pg / ml d'amphotéricine B).
  3. Placer la suspension dans un flacon T75 et incuber à 37 ° C dans un CO 2, atmosphère humidifiée à 5%. Après 24 h verser le milieu, qui contiendra les débris et les remplacer par 12 ml de milieu de fibroblastes frais. Remplacer le milieu de culture tous les 2 à 3 jours et les cellules de passage une fois qu'ils ont atteint 80% de confluence 13, le fractionnement des cellules dans un rapport de 1: 5 à augmenter le nombre de cellules.
    Remarque: Les cellules de fibroblastes dans le modèle décrit ci-dessous entre les passages 4 et 10 seulement.

3. Préparation de l'oesophage Échafaudages De-cellularisé

  1. Obtenir intacte porcine oesophages dans un abattoir de porcs Landrace fraîchement abattus qui sont utilisés pour la production alimentaire. Un oesophage unique fournira échafaudages suffisantes pour environ 30 constructions séparées.
    Remarque: En raison de la co vaste et le tempsnsuming protocole de stérilisation requis, il est normalement une valeur de l'obtention et du traitement d'un minimum de 10 œsophage à la fois.
  2. Placer immédiatement l'œsophage fraîchement excisées dans un pot stérile de 180 ml contenant environ 150 ml de solution de povidone-iode à 10% pendant 5 min à réduire toute charge microbienne contaminante. Transfert de l'oesophage à un deuxième pot contenant environ 100 ml de PBS stérile contenant 200 UI / ml de pénicilline, 200 ug / ml de streptomycine et 1,25 pg / ml d'amphotéricine B.
    1. Remettre le couvercle sur le conteneur et transporter l'œsophage au laboratoire à la température ambiante. Deux ou trois œsophage peuvent être transportées dans chaque conteneur, en fonction de leur taille.
  3. Une fois au laboratoire, traiter le tissu dans une hotte à flux laminaire en utilisant une technique aseptique pour minimiser la contamination microbienne. Stériliser pince à épiler, ciseaux et lames de scalpel par trempage pendant 5 min dans 70% d'éthanol et de rinçage dans du PBS stérile.
  4. Manipulez les esophagus l'aide de pinces stériles. En utilisant les ciseaux, couper l'œsophage ouvert longitudinalement. Rincez le tissu en plaçant l'œsophage dans un pot stérile de 180 ml contenant environ 100 ml de PBS stérile et secouant doucement pour enlever les débris.
  5. Nettoyer une planche de dissection de liège par pulvérisation généreusement avec 70% d'éthanol et laisser sécher.
  6. Retirer l'œsophage de la PBS, et l'utilisation d'aiguilles stériles, épingler sur l'oesophage sur la carte, la muqueuse supérieure de surface. Saisissez la surface de la muqueuse à une extrémité de l'oesophage avec pinces stériles et se détache de la carte. Cela séparer la muqueuse de la sous-muqueuse sous-jacente.
    1. Ensuite, utilisez une lame de scalpel stérile à disséquer l'œsophage longitudinalement le long de la lamina propria, enlever broches comme la dissection progresse pour permettre la muqueuse d'être soulevé loin.
  7. Conserver la muqueuse disséqué et jetez la sous-muqueuse sous-jacente.
  8. Couper et jeter les plus proximales et distales 2 cm de til muqueuse comme il ya un plus grand nombre de glandes sous-muqueuses et une lamina propria plus épais dans ces domaines, respectivement 7.
  9. Utiliser un scalpel pour couper le tissu restant dans 5 cm 2. Placez tous les tissus de coupe dans un pot stérile de 180 ml contenant environ 150 ml de PBS stérile et agiter doucement afin de rincer le tissu. Si le traitement de plus de cinq oesophages à un moment il peut être nécessaire d'utiliser plusieurs pots pour cette et les trois étapes suivantes.
  10. En utilisant des pinces stériles, transférer le tissu coupé dans un pot de 180 ml contenant 150 ml de 1 M stérile de NaCl, 200 UI / ml de pénicilline, 200 ug / ml de streptomycine et 1,25 pg / ml d'amphotéricine B. incuber pendant 72 heures à 37 ° C.
  11. Placez le tissu dans un nouveau pot de 180 ml contenant 150 ml de PBS stérile. L'épithélium aura commencé à séparer visiblement du tissu sous-jacent. Retire délicatement l'épithélium détacher de l'oesophage de porc en utilisant des pinces stériles et le jeter.
    1. Placez le restant tquestion dans un 180 ml pot fraîche et ajouter 150 ml de PBS stérile. Agiter doucement pendant 5 min pour se laver. Décanter le PBS et répéter encore deux fois avec PBS frais.
  12. Passer tous les tissus dans une bouteille en verre de 500 ml contenant 400 ml stérile de 80% (v / v) de glycerol pendant 24 heures à température ambiante. Transférer dans 400 ml stérile de 90% (v / v) de glycerol pendant encore 24 h.
  13. Conserver dans 400 ml de solution de glycerol à 100% stérile à la température ambiante pendant au moins 4 mois à déshydrater et stériliser le tissu tout en préservant l'intégrité de la membrane basale.

4. La production de la Culture, des Médias

  1. Préparation du sérum de veau nouveau-né chélaté pour une utilisation dans le milieu de culture.
    1. Versez 100 g de Chelex 100 dans un verre bouteille de 1 L et ajouter de l'eau déminéralisée. Le volume exact est pas critique, mais suffisamment d'eau doit être ajoutée pour couvrir la poudre Chelex. Ajouter un agitateur magnétique et stériliser à l'autoclave (121 ° C pendant15 min).
    2. Laisser la bouteille à refroidir et le Chelex à régler. Dans une hotte à flux laminaire versez l'excès d'eau, ajouter 500 ml de sérum de veau nouveau-né (NCS) et laisser agiter durant la nuit à 4 ° C.
    3. Arrêtez de remuer et laisser le Chelex à régler, ce qui peut prendre jusqu'à 30 minutes. Dans une hotte à flux laminaire décanter le sérum chélaté utilisant une pipette stérile, en prenant soin de ne pas perturber le Chelex, et stocker dans portions de 10 ml à -20 ° C.
  2. Préparer trois médias différents dans une hotte à flux laminaire, en commençant par pro-proliférative et se terminant avec des formulations pro-différenciation.
    1. Préparer composite moyen I est constitué de DMEM et F12 de Hams dans un rapport 3: 1 (v: v), 4 x 10 -3 M L-glutamine, 0,5 pg / ml hydrocortisone, 1 x 10 -4 M O -phosphorylethanolamine, 2 x 10 -12 M de triiodothyronine, 1,8 x 10 -4 M d'adénine, 1,88 x 10 -3 M CaCl 2, 4 x 10 -12 M progestérone, 10 ug / ml dans dusulin, 10 pg / ml transferrine, 10 ng / ml de sélénium, 1 x 10 -3 M d'éthanolamine et 0,1% (v / v) chélaté NCS.
    2. Préparer composite moyen II Composite moyen I, sauf remplacer le sérum chélaté avec 0,1% (v / v) non-chélaté NCS.
    3. Préparer Composite Moyen III Composite moyen II, sauf progestérone omettre et de l'augmentation du sérum à 2% (v / v) non-chélaté NCS.

5. Production de l'oesophage humain muqueuse Modèle

  1. Effectuer tous les travaux dans une hotte à flux laminaire, en utilisant une technique aseptique pour maintenir un environnement stérile. Stériliser l'ensemble des outils par trempage dans de l'éthanol 70% pendant 5 minutes, avant de rincer dans du PBS stérile.
  2. La veille, il est nécessaire, à réhydrater l'échafaud oesophagien porcine acellulaire. Une pièce d'échafaudage est nécessaire pour chaque construction à être préparé.
    1. Pour réhydrater le lieu de tissus pièces suffisantes d'échafaudage porcine dans un pot contenant 100 ml de PBS stérile, agiter et laisser tremper pendant 10 min. Decant le PBS et le remplacer par du PBS frais. Répéter le processus de lavage cinq fois pour assurer l'élimination de toutes les traces de glycerol.
  3. Testez la stérilité de l'échafaudage en incubant le tissu réhydraté nuit dans 100 ml de DMEM à 37 ° C. Si il n'y a pas de changement de la couleur ou la turbidité du milieu de culture à la fin de la période d'incubation de l'échafaudage est supposé être stérile. Une fois la stérilité a été confirmée, placez le 5 cm 2 acellulaire échafaudage dans une plaque à 6 puits, côté sous-muqueuse supérieure.
  4. Placez un anneau stérile de qualité médicale en acier inoxydable (diamètre intérieur 10 mm, diamètre extérieur 20 mm) sur le centre de chaque échafaudage et appuyez doucement à l'aide de pinces stériles, afin d'assurer une bonne étanchéité avec le tissu.
  5. Récolter les fibroblastes à l'aide de trypsine-EDTA pour produire une 13 suspension de cellules. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre 14. Centrifuger la suspension de cellules (10 min, 200 x g). Remettre en suspension le culot cellulaire dans un appropriée.Boîtete volume du milieu de fibroblastes pour produire un compte final de cellules de 2,5 x 10 6 cellules par ml.
  6. Ajouter 0,2 ml de milieu de fibroblastes, contenant 5 x 10 5 fibroblastes humains de l'œsophage, au sein de chaque anneau. Inonder la zone autour de l'extérieur de l'anneau avec environ 2 ml de milieu de fibroblastes. Incuber à 37 ° C dans un CO 2, atmosphère humidifiée à 5%.
  7. Après 24 h éliminer le milieu des anneaux et des fibroblastes et d'ajouter au moins 5 ml de milieu de fibroblastes frais pour chaque puits, veiller à ce que l'échafaudage est totalement immergé dans le milieu. Culture pendant 1 semaine à 37 ° C dans un 5% de CO 2, atmosphère humidifiée remplaçant le milieu toutes les 2 à 3 jours.
  8. Après 1 semaine enlever les plaques de 6 puits contenant les échafaudages à une hotte d'inondation laminaire, retirez le support et inverser chaque échafaudage à l'aide de pinces stériles, placer plus haut la surface de la muqueuse. Ce point de temps est désigné comme jour 0.
  9. Placer les bagues en acier sur la surface de la muqueuse dans le centre dele tissu comme dans l'étape 5.4.
  10. Préparer les flacons T75 de cellules epitheliales 13 de traitement à la trypsine. Après le lavage PBS et avant l'addition de solution de trypsine-EDTA, ajouter 2 ml de solution stérile à 0,02% (p / v) de solution d'EDTA à chaque flacon. Incuber pendant 2 min à 37 ° C. Appuyez sur le flacon doucement pour détacher sélectivement la couche d'alimentation i3T3 tout en laissant les cellules épithéliales attachés.
    Remarque: Il est généralement pas pratique ou nécessaire au patient correspondent aux cellules épithéliales des fibroblastes déjà intégrées dans le modèle de la semaine précédente.
  11. Décanter la solution d'EDTA contenant la couche d'alimentation et ajouter la solution de trypsine-EDTA pour récolter les cellules épithéliales 13. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre 14. Centrifuger la suspension de cellules (10 min, 200 x g). Remettre en suspension le culot cellulaire dans un volume approprié d'une moyenne composite afin de produire un compte final de cellules de 5 x 10 6 cellules par ml.
  12. Ajouter 0,2 ml de composite moyen I, contenant 1 x 10 6 cellules épithéliales, au sein de l'anneau. Inonder la zone autour de l'extérieur de l'anneau avec environ 2 ml d'Composite moyen I et placer les constructions dans l'incubateur à 37 ° C dans un 5% de CO 2, atmosphère humidifiée.
  13. Après 24 heures (Jour 1) supprimer les anneaux et moyen et ajouter au moins 5 ml de frais composite moyen I, assurant que les échafaudages sont entièrement immergés et revenir à l'incubateur. Après encore 24 heures (Jour 2) éliminer le milieu et remplacés par au moins 5 ml de composite moyen II, à nouveau assurer les échafaudages sont entièrement immergés et retournent dans l'incubateur.
  14. Au jour 4 Conseil de qualité médicale stérile grilles à mailles en acier inoxydable (2 cm de large x 2 cm de long x 0,5 cm de hauteur), dans des plaques à 6 puits frais, par une construction. Utiliser des pinces stériles pour transférer les produits d'assemblage sur la partie supérieure des grilles en acier, de surface la plus élevée de la muqueuse.
    1. Ajouter suffisamment de composé III moyenne de sorte que le liquide atteigne la face inférieure du composite, mais la surface estexposée à l'air, ce qui assure que l'échantillon est maintenu à une interface air-liquide. Le volume exact de fluide requis variera en fonction de l'épaisseur de l'échafaudage, le volume du puits et la hauteur précise de la grille en acier inoxydable.
  15. Maintenir les composites à une interface air-liquide pendant entre 10 et 20 jours (jour 14 au jour 24), en fonction des exigences de l'expérience. Remplacez le composite moyen III avec un milieu frais tous les 2 à 3 jours (lundi, mercredi, le vendredi est un régime conviviale).
    Remarque: Après 5 jours à l'interface air-liquide (Jour 9) les constructions ont un épithélium oesophagien suffisamment mûr pour être utilisés dans des expériences de l'impact des facteurs environnementaux sur l'épithélium de l'œsophage.
  16. A la fin de l'expérience, les produits d'assemblage pour fixer l'analyse histologique et la coloration immunohistochimique 7, ou d'une protéine 15 de l'extrait ou de l'ARN à partir de l'épithélium 11,16 pour plus analysest. Si nécessaire, maintenir le milieu de culture conditionné pour l'analyse de molécules de signalisation extracellulaire 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ce manuscrit décrit le processus requis, indiqué sous forme schématique à la figure 1, à la culture des modèles 3D de l'épithélium oesophagien humaine succès. Pour confirmer la pertinence du modèle en tant que plate-forme histologique expérimental et des études immunohistochimiques ont été réalisées en comparant les tissus cultivés avec muqueuse épidermoïde de l'oesophage humain normal.

Évaluation histologique de l'épithélium produite par le procédé décrit présente une mature, à couches multiples, l'épithélium pavimenteux stratifié (figure 2B) qui est comparable à celle observée avec l'œsophage humain (figure 2A) normal, bien que plus minces (5 à 10 couches de cellules par rapport à 10 à 20 pour l'œsophage normal), avec les cellules devenant progressivement plus plat et finalement nucléaire est lors de leur migration vers la surface.

La caractérisation immunohistochimique des marqueurs clés de prolifération et de differentiation démontrent que le modèle de la microanatomie épithélium est similaire à l'épithélium d'oesophage humain normal. Ki67 expression comparable est observée à la fois dans l'oesophage natif et le modèle épithélium, avec une coloration limitée à un sous-ensemble de cellules au sein de la base et des couches suprabasales immédiatement (figures 3A et 3B). Ceci est analogue aux études qui rapportent que moins de 10% des cellules présentent généralement l'expression du marqueur de prolifération, Ki67, dans l'épithélium oesophagien 18 normale. CK4 est normalement exprimée dans l'épithélium stratifié et cylindrique, mais est généralement absente dans les couches basales tout CK14 est seul point positif dans la couche basale 19. Dans les deux cas l'épithélium normal et l'œsophage modèle, CK14 est observée dans toutes les cellules de la couche basale (figures 3D et 3E), tandis que CK4 est observé tout au long de l'épithélium à l'exception des deux couches les plus basales (figures 3G et 20. Encore une fois à la fois le tissu oesophagien humain normal et le modèle épithélium spectacle qui reflète cette coloration (figures 3J et 3K).

Les tentatives faites pour remplacer les cellules épithéliales de l'œsophage avec les cellules épithéliales primaires oesophagiennes immortalisées, telles que Het-1A, étaient moins efficaces et ne pas produire un modèle valide de l'épithélium oesophagien normal. Un épithélium multicouche a été formé; cependant le marqueur de prolifération Ki67 a été détectée tout au long de l'épithélium (figure 3C) sans expression détectée pour tous les marqueurs de différenciation (figures 3F, 3I et 3L), indiquant que les cellules Het-1A produit un épithélium hyperprolifératif sans aucun signe de stratification normale ou maturation.

Cependant, le modèle a étémodifié avec succès d'incorporer des cellules tumorales par le remplacement des cellules épithéliales primaires avec soit un adénocarcinome œsophagien (OE33) ou des cellules de carcinome squameux (OE21). Ceci démontre la flexibilité du modèle, ce qui permet son utilisation dans une enquête sur une gamme de troubles de l'œsophage à différents stades de progression par l'inclusion d'un certain nombre de différentes lignées cellulaires. On peut voir qu'il existe une nette différence dans les réponses de ces deux lignées cellulaires. OE21 cellules de carcinome épidermoïde produit un épithélium visible sur la construction en tant que région définie jaune (figure 4A) avec de grandes fissures au sein de l'épithélium (figure 4B), susceptibles de refléter dysfonctionnelles molécules d'adhésion cellulaire. Y compris OE33 cellules d'adénocarcinome dans les résultats du modèle dans une grande quantité de la dégradation de l'échafaudage, visible par l'œil comme un amincissement de l'échafaud après une croissance de 2 semaines à l'interface air / liquide (figure 4C) et confirmé dans l'analyse H + E commeune réduction évidente de l'épaisseur de l'échafaudage dans la région au-dessous des cellules (Figure 4D). Ceci est un risque d'être un résultat d'une interaction entre les cellules tumorales et les fibroblastes, car la dégénérescence de l'échafaudage est pas observée en l'absence de fibroblastes (Figures 4E et 4F). Nous avons observé des effets similaires sur l'invasion tumorale en présence et en absence de fibroblastes dans des modèles de mélanome 21 équivalents.

Figure 1
Figure 1: Schéma de principe montrant la production du modèle de la muqueuse oesophagienne de l'oesophage fibroblastes humaines sont ensemencées sur la surface de sous-muqueuse de l'échafaudage et mises en culture pendant 7 jours.. L'échafaudage est inversé, les cellules épithéliales de l'œsophage humain ajoutées et mises en culture submergée durant 4 jours. Le produit d'assemblage est porté à une interface air-liquide pour entre 10 et 20 days. À la fin de l'expérience, la construction peut subir une analyse plus approfondie que nécessaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de la figure.

Figure 2
Figure 2: Comparaison de l'épithélium oesophagien produit dans le modèle d'épithélium d'oesophage humain normaux H + E analyse de (A) épithélium d'oesophage humain normal et (B) épithélium oesophagien formé dans le modèle de la muqueuse de l'oesophage humain.. La barre d'échelle est de 500 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de la figure.

Figure 3
(A - C), CK14 (D, E), CK4 (G, H) et la coloration involucrine (J, K). La barre d'échelle est de 200 um. (Ce chiffre a été modifié 7.) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de la figure.

Figure 4
Figure 4: La mise en place de lignes de cellules tumorales à l'intérieurle modèle de l'œsophage. Les cellules épithéliales primaires ont été remplacées par la ligne à cellules squameuses de carcinome, OE21, ou la lignée cellulaire d'adénocarcinome, OE33. Les images montrent la construction avec les cellules OE21 (A) ou de cellules OE33, soit en conjonction avec (C) ou en l'absence de fibroblastes (E), avant la fixation à la fin de la période de culture. L'épithélium y compris la OE21 (B) ou avec des cellules OE33 (D) ou sans (F) des fibroblastes sont visualisées par coloration H + E. La barre d'échelle est de 500 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de la figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ce manuscrit décrit la production et la caractérisation d'un modèle de la muqueuse oesophagienne humaine biologiquement pertinente peut être utilisé comme une plate-forme expérimentale pour étudier l'impact de l'exposition aux facteurs de stress environnementaux sur l'épithélium de l'œsophage.

Les étapes les plus critiques pour la production réussie d'un modèle de la muqueuse de l'œsophage humain sont: veiller à ce que la majorité des cellules épithéliales restent proliférative et n'a pas déjà commencé à différencier avant de les ensemencer sur l'échafaud; le maintien d'une interface air-liquide pour le composite pour assurer la maturation correcte de l'épithélium; le maintien de la stérilité au long de la période de culture prolongée.

En raison des quantités limitées de tissus humains disponibles pour l'isolement de cellules, il est généralement pas possible d'obtenir suffisamment de cellules à partir d'un échantillon de tissu unique pour ensemencer des cellules fraîchement isolées directement sur l'échafaudage et par conséquent un pH d'expansion cellulairease est nécessaire lorsque les cellules sont cultivées dans des conditions de culture cellulaire 2D standard. Il est important de veiller à ce que les cellules restent proliférative au cours de cette période. Ce résultat est obtenu en faisant en sorte que les cultures ne sont jamais autorisés à atteindre la confluence complet, en utilisant des cellules dans le modèle seulement jusqu'à passage 4 et un contrôle précis de la morphologie cellulaire. Ainsi, les cellules doivent conserver leur morphologie polygonale proliférative distinctif et l'étanche "pavés" aspect caractéristique de la chaussée comme des cellules épithéliales prolifératives plutôt que l'aspect plus diffus observé dans les cultures qui ont commencé à se différencier. La seconde étape critique est commandée en faisant en sorte que le milieu de culture de cellules recouvre la surface supérieure des grilles en acier inoxydable utilisés pour soulever les cultures à l'interface air-liquide, mais la surface supérieure de la construction elle-même est non immergé. La troisième étape dépend strict respect du protocole de stérilisation prolongée lors de la production de l'cellularisée-échafaud porcine et l'utilisation de la bonne technique stérile au long du processus.

Nos résultats montrent que les cellules humaines primaires oesophagiennes sont nécessaires pour produire un, mature, épithélium stratifié normale. Si une lignée cellulaire immortalisée a été utilisé, bien que provenant de l'épithélium d'oesophage humain, les cellules sont restées proliferative et ont échoué à se différencier pour former un épithélium stratifié mature. L'épithélium résultant ne peut pas être utilisée en tant que modèle satisfaisante pour l'épithélium normal, ce qui démontre l'inadéquation de la lignée cellulaire immortalisée Het-1A destiné à être utilisé dans le modèle. Toutefois, d'autres lignées cellulaires telles que celles dérivées de tumeurs de l'oesophage ou métaplasie de Barrett peuvent être incorporés dans le modèle soit à la place ou en plus des cellules épithéliales primaires pour produire des modèles pour l'étude de la progression tumorale, l'invasion et la réponse aux agents pharmacologiques.

Les expériences peuvent être effectuées en utilisant le modèle de l'oesophage de l'artimulate l'exposition de l'œsophage à des événements discrets, pulsatiles lors de la déglutition ou de reflux. Ceci est réalisé en immergeant les produits d'assemblage à plusieurs reprises dans un milieu de culture contenant le composé (s) à tester et un rinçage dans du PBS avant de retourner le produit d'assemblage à une interface air-liquide. Les temps d'exposition et la fréquence peuvent être modifiés pour refléter le processus en cours de simulation, en veillant à ce que la couche épithéliale est exposée au facteur (s) de l'environnement tout en permettant la culture de continuer à l'interface air-liquide. Cette méthode a été utilisée dans notre laboratoire pour étudier l'impact de reflux sur l'épithélium oesophagien normal, où le modèle a été exposé à des composants spécifiques de reflux gastro-oesophagien pendant 10 minutes deux fois par jour pendant 11 jours 11. En variante, les constructions peuvent être exposés à des niveaux continus des facteurs de stress environnementaux par l'inclusion de ces composés dans le milieu de culture. Cependant, comme l'épithélium doit être exposé à une interface air-liquide pour la épithéliumlium de mûrir et de se différencier correctement 7, il est impossible de plonger en permanence les constructions dans le milieu de culture. Par conséquent, l'exposition au facteur de stress ne sera par la surface de la sous-muqueuse dans ces expériences, qui peuvent limiter la pertinence des résultats obtenus.

La technique est relativement beaucoup de travail et est donc mieux adapté à la projection du nombre relativement limité de composés. En conséquence, lorsqu'on utilise le modèle comme une plate-forme expérimentale, il convient d'abord effectuer des études préliminaires en utilisant des techniques de culture cellulaire classiques pour identifier un nombre limité de conditions préalables à une analyse plus poussée à l'aide du modèle plus physiologiquement pertinente de l'œsophage décrit ici 11. En plus de l'analyse immunohistochimique il a également été possible d'examiner les changements dans le profil d'expression génique de l'épithélium après une exposition à des facteurs de stress environnementaux. Ceci a été réalisé en dépouillant manuellement la distance epithelium, l'extraction de l'ARN et de la convertir en ADNc pour isoler les gènes étant exprimés et l'analyse par microréseau d'obtenir des profils d'expression de gène 11. De cette manière, il a été possible d'augmenter les informations disponibles à partir du modèle de plate-forme expérimentale. Les premiers changements dans le profil d'expression génique épithéliale suivants exposition simulée au reflux gastro-oesophagien ont été proposées et à partir de ces résultats de nouveaux domaines ont été suggérées pour complément d'enquête dans la prévention du développement de Barrett métaplasie, le précurseur métaplasique au CPO 11. Le modèle peut également être utilisé pour étudier l'expression des protéines en utilisant des méthodes telles que l'analyse Western blot et 15 l'expression du gène en utilisant une analyse par transfert de Northern 16. Par ailleurs les études de molécules de signalisation extracellulaire peuvent être effectuées sur le 17 milieu de culture.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs ont rien à révéler.

Acknowledgments

Nous sommes reconnaissants à M. Roger Ackroyd, M. Andrew Wyman et M. Chris Stoddard, Consultant chirurgiens à Sheffield Teaching Hospitals NHS Foundation Trust, pour leur aide dans l'acquisition des échantillons de tissus de l'oesophage et leur soutien de notre travail. Nous remercions Ashraful Haque pour son aide incorporant des lignes de cellules tumorales dans le modèle. Nous reconnaissons avec gratitude le soutien financier pour cette étude par des subventions de la recherche et de l'Education Trust Bardhan (de BRET) et recherche sur le cancer Yorkshire (YCR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypsin BD Biosciences 215240 Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilize. Warm in 37 °C water bath before use.
DMEM Labtech LM-D1112 Warm in 37 °C water bath before use
Ham's F12 Labtech LM-H1236 Warm in 37 °C water bath before use
Foetal Calf Serum Labtech FB-1090
Epidermal Growth Factor R+D Systems 236-EG-200 Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS
Hydorcortisone Sigma-Aldrich H0396 Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use
Adenine Sigma-Aldrich A2786 Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use
Insulin Sigma-Aldrich I2767 Prepare 10 mg/ml solution in 0.01 M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilize before use
Transferrin Sigma-Aldrich T2036 Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use
Triiodothyronine Sigma-Aldrich T2752 Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use
Cholera toxin Sigma-Aldrich C8052 Prepare stock solution in water
L-Glutamine Sigma-Aldrich G7513
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P0781
Amphotericin B Gibco 15290-026 Brand name Fungizone
PBS Oxoid BR0014 Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilize
Collagenase A Roche 10103578001
Povidone-iodine solution Ecolab 10830E Brand name Videne
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Chelex 100 Sigma-Aldrich C7901
Newborn calf serum Gibco 26010074
Progesterone Sigma-Aldrich P8783 Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use
Ethanolamine Sigma-Aldrich E9508 Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0888 Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use use
O-phosphorylethanolamine Sigma-Aldrich P0503 Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use
ITS (insulin, transferrin, selenium) Lonza 17-838Z Used for composite media preparation
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T3924 Warm in 37 °C water bath before use
EDTA 0.02% solution Sigma-Aldrich E8008 Warm in 37 °C water bath before use
T75 culture flask VWR 734-2313
50 ml centrifuge tube Fisher 11819650
15 ml universal tube SLS SLS7504
180 ml pot VWR 216-2603
Petri dish SLS 150350
6 well plate VWR 734-2323
stainless steel rings Manufactured in house - medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm
steel mesh grids Manufactured in house - sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2 cm (w) x 2 cm (d) x 0.5 cm (h)
ki67 Novocastra KI67-MM1-L-CE Clone MM1. Use at 1:100.
CK4 Abcam ab9004 Clone 6B10. Use at 1:200.
CK14 Novocastra LL002-L-CE Clone LL002. Use at 1:200.
Involucrin Novocastra INV Clone SY5. Use at 1:100.
OE21 Sigma-Aldrich 96062201
OE33 Sigma-Aldrich 96070808
Het-1A ATCC-LGC CRL-2692
Mouse 3T3 fibroblasts ATCC-LGC CRL-1658 previously growth arrested by irradiation (60 Gy)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pera, M., Manterola, C., Vidal, O., Grande, L. Epidemiology of esophageal adenocarcinoma. J. Surg. Oncol. 92 (3), 151-159 (2005).
  2. Manea, G. S., Lupusoru, C., Caruntu, I. D. Experimental study on the effect of bile, and bile and hydrochloric acid mixture on the esophageal mucosa. Rom. J. Morphol. Embryol. 50 (1), 61-66 (2009).
  3. Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 278 (3), 1824-1830 (2003).
  4. Underwood, T. J., et al. A comparison of primary oesophageal squamous epithelial cells with HET-1A in organotypic culture. Biol. Cell. 102 (12), 635-644 (2010).
  5. Nystrom, M. L., et al. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J. Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
  6. Okawa, T., et al. The functional interplay between EGFR overexpression, hTERT activation, and p53 mutation in esophageal epithelial cells with activation of stromal fibroblasts induces tumor development, invasion, and differentiation. Genes & Development. 21 (21), 2788-2803 (2007).
  7. Green, N., et al. The development and characterization of an organotypic tissue-engineered human esophageal mucosal model. Tissue Eng Part A. 16 (3), 1053-1064 (2010).
  8. Harada, H., et al. Telomerase induces immortalization of human esophageal keratinocytes without p16INK4a inactivation. Mol. Cancer Res. 1 (10), 729-738 (2003).
  9. Bhargava, S., Chapple, C. R., Bullock, A. J., Layton, C., MacNeil, S. Tissue-engineered buccal mucosa for substitution urethroplasty. BJU. Int. 93 (6), 807-811 (2004).
  10. Ralston, D. R., et al. Keratinocytes contract human dermal extracellular matrix and reduce soluble fibronectin production by fibroblasts in a skin composite model. Br. J. Plast. Surg. 50 (6), 408-415 (1997).
  11. Green, N. H., et al. Pulsatile exposure to simulated reflux leads to changes in gene expression in a 3D model of oesophageal mucosa. Int. J. Exp. Pathol. 95 (3), 216-228 (2014).
  12. Wang, C. S., et al. Selective culture of epithelial cells from primary breast carcinomas using irradiated 3T3 cells as feeder layer. Pathol. Res. Pract. 197 (3), 175-181 (2001).
  13. Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. J. Vis. Exp. (16), e755 (2008).
  14. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2014).
  15. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N. Am. J. Med. Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  16. Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat. Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
  17. Morgan, E., et al. Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clin. Immunol. 110 (3), 252-266 (2004).
  18. Xu, M., et al. The abnormal expression of retinoic acid receptor-beta, p 53 and Ki67 protein in normal, premalignant and malignant esophageal tissues. World J. Gastroenterol. 8 (2), 200-202 (2002).
  19. Moll, R., Divo, M., Langbein, L. The human keratins: biology and pathology. Histochem. Cell Biol. 129 (6), 705-733 (2008).
  20. Rice, R. H., Green, H. Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions. Cell. 18 (3), 681-694 (1979).
  21. Eves, P., et al. Melanoma invasion in reconstructed human skin is influenced by skin cells - investigation of the role of proteolytic enzymes. Clin. Exp. Metastasis. 20 (8), 685-700 (2003).

Tags

Bioengineering numéro 99 de l'œsophage de l'épithélium l'ingénierie tissulaire construction 3D cancer de l'œsophage métaplasie de Barrett
Production, la caractérisation et utilisations potentielles d'un humain de l'oesophage muqueux modèle 3D de l'ingénierie tissulaire
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Green, N. H., Corfe, B. M., Bury, J. … More

Green, N. H., Corfe, B. M., Bury, J. P., MacNeil, S. Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model. J. Vis. Exp. (99), e52693, doi:10.3791/52693 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter