Summary
이 원고는 생산, 특성화 및 일반 차 인간의 식도 섬유 아세포와 드 cellularized 돼지 비계 내에서 시드 편평 상피 세포로부터 제조 된 조직 설계 3D 식도 구조의 사용 가능성에 대해 설명합니다. 결과 정상적인 인간 식도 유사한 성숙한 상피 성층의 형성을 입증한다.
Abstract
식도 선암과 그 전구체, 바렛 화생 모두의 발생 빈도는 서구 세계에 급속하게 증가하고있다. 또한 식도 선암은 일반적으로 최근 몇 년 동안 생존율에 약간의 개선 불량한 예후를 가진다. 이러한 연구하기 어려운 조건이며, 식도 점막의 질환을 연구에 적합한 실험 플랫폼의 부족이었다.
인간 식도 점막의 모델은 종래의 2 차원 세포 배양 시스템과 달리, 생체 내에 존재하는 세포 - 세포 및 세포 - 기질 상호 작용을 정확하게 되풀이하고 정상인과 동일한 성숙 성층 상피를 생산 맥닐 실험실에서 개발 된 식도. 간략하게, 모델은 돼지 유래의 무 세포 골격 식도 내에 성장 비 형질 전환 인간 식도 차 정상 섬유 아세포 및 상피 세포를 이용한다. 이 모델의 면역 조직 화학적 특성CK4, CK14, 사료된다 의해 involucrin 염색은 정상적인 인간의 식도 점막의 조직 학적 적절한 재현부을 보여줍니다.
이 모델은 인간의 식도 점막의 강력한 생물학적 관련 실험 모델을 제공합니다. 그것은 쉽게되는 약물의 유효성과 같은 알코올, 독소, 고온 또는 위식 refluxate 성분으로서 환경 인자에 대한 노출의 영향을 포함한 연구 문제의 수를 조사하기 위해 조작 될 수있다. 모델도 가능 기존의 2 차원 세포 배양, 특히와 달성하지 확장 문화 기간을 촉진, 최대 20 일 동안 관심의 에이전트에 성숙한 상피의 반복 노출의 영향에 대한 연구. 또한, 이러한 식도 종양인지 바렛 화생로부터 유도 된 것과 같은 세포주의 다양한, 종양 침윤 및 약물 responsivene 같은 과정을 조사하기 위해 모델에 통합 될 수있다더 생물학적으로 관련 환경에서 SS.
Introduction
식도 점막은 결합 조직, 점막 고유 층 위의 층상 편평 상피 세포를 포함하고, 섭취 한 환경 스트레스가 발생하는 최초의 사이트 중 하나입니다. duodenogastro - 식도 역류 식도 선암종으로 진행 위험의 증가와 연관되어 바레트 화생의 발병 기전에 중요한 요소 인 반면,식이 성 독소 노출이 식도 편평 세포 암종의 발달에 관여한다. 식도 암은 영국 남성과 식도 선암에서 8 번째 가장 일반적인 악성 종양이 빠르게 서방 세계 1 증가하고 있습니다. 또한, 약 15 %의 5 년 생존율과 질환 예후 작은 개선이 있었다. 결과적으로이 develo의 식도 상피의 환경 스트레스에 대한 노출의 영향과 잠재적 관련을 조사하는 실험 플랫폼에 대한 필요성이 존재상피화 생 또는 신 생물의 pment.
불멸화 또는 종양 세포주가 시험 관내 연구는 이러한 스트레스에 대한 상피 세포의 반응을 연구 할 수 있지만, 이들은 증식 남아 식도 점막의 최상층에있는 성숙한 상피 세포로 분화하는 데 실패한다. 또한, 이미 종양을받은 세포 라인은 환경 요인 상피 내에 정상 세포의 초기 반응에 관한 제한된 정보를 제공 할 수있다; 이는 치료 적 개입 가능성이 가장 높을 수도 단계이다. 마지막으로, 통상의 세포 배양 시스템은 상피 및 간엽 세포와 생체 내에서의 조직 내에서 발생하는 이들 세포와 주변 매트릭스 사이의 중요한 상호 작용을 잠재적으로 캡처하지 못한다.
동물 모델은 식도 epitheli의 반응을 연구보다 현실적인 미세 환경을 제공 할UM 및 위식도 역류 질환 (2)의 인공 유도를 포함 할 수있다. 그러나이 모델에서 환경 스트레스를 조작하는 것이 더 어려울 수 있습니다 그들은 완전히 인간의 식도 내에서 응답을 대표하지 않을 수 있습니다.
다른 실험 인간 식도 모델은 콜라겐에 일차 세포, 불멸화 세포 또는 종양 세포주를 이용하는이 개발, 또는 콜라겐 / 마트 리겔, 골격 함유 섬유 아세포 3,4- 결합되었다. 그것은이 원고에 기재된 무 세포 식도 지지체보다 이들 골격을 생성 덜 노동 집약적이며, 이들의 Organotypic 모델은 특히 콜라겐 겔에 종양 세포 침투를 용이하게 할 수있다 종양 침윤 5,6의 연구에 유용한 도구를 제공한다 관찰했다. 그러나 이러한 콜라겐 겔 비원 기계적 특성을 가지고 특정 기저막 및 appropriat 포함한 원래 조직의 특정 기능을 결여전자 표면 지형. 콜라겐 겔 지지체 (7)를 사용할 때, 예를 들면, 상피와 지지체 간의 열악한 부착을 초래 셀들의 동작에 영향을 미칠 수있다. 결과적으로 무 세포 돼지 식도 비계 더 생물학적으로 실제와 비계 실험 플랫폼으로서 사용하기에 따라서 더 적절하다는 장점과 함께 개발되었다. 그것은 또한 이들 세포는 다층 상피를 형성하기 때문에, 이러한 헷-1A와 같은 불멸화 식도 상피 세포주보다 식도 제물로 일차 전지를 포함하지만, 계층화 또는 4,7,8 차별화 실패 좋다고 보여왔다 .
따라서,이 프로토콜은 이미 조직 설계 피부와 구강 점막 9,10를 만들기위한 맥닐 실험실에서 사용하는 방법에서 적응 및 기본 인간의 식도 상피 세포와 섬유 아세포와 함께 드 cellularized 돼지 식도 발판을 통합하고있다. 티CK4, CK14, 사료된다 의해 염색 involucrin 있듯이 S 프로토콜은 정상적인 인간 식도 유사한 성숙 성층 상피 세포를 생성한다. 결과 모델은 환경 스트레스에 대한 반응을 연구하는 실험 플랫폼을 제공하고, 구성 요소 (11)에 응답 refluxate 식도 상피 세포에서의 유전자 발현의 변화를 조사하기 위해 효과적으로 사용되어왔다.
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Protocol
인간의 식도 세포는 위 또는 식도 수술을받은 환자에서 얻을 수 있습니다. 조직은 연구 목적을 위해 사용될 수 있도록 동의 수득하고, 조직은 적절한 윤리적 승인 (SSREC 165/03, 인간 연구 조직 은행 라이선스 12,179)하에 익명 사용.
인간의 식도 상피 세포의 분리 (1)
- : 1 비율 층류 조직 문화 후드에서 작업 및 무균 기술을 사용하여, 둘 베코의 수정 이글의 중간 (DMEM)과 3 햄의 F12 혼합하여 상피 세포 배양 배지를 준비 (절 : V). 10 % 추가 (v / v)의 FCS, 10 ng / ml의 상피 세포 성장 인자, 0.4 μg의 / ㎖ 하이드로 코르티손, 1.8 × 10-4 M 아데닌, 5 μg의 / ㎖ 인슐린, 5 μg의 / ㎖ 트랜스페린, 2 × 10-7 M 트리 요오 도티 로닌, 1 × 10 -10 M 콜레라 독소, 2 × 10 -3 M 글루타민, 100 IU / ml의 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 및 0.625 μg의 / ㎖ 암포 테리 신 B를
- 표준을 사용하여무균 기법, T75 조직 배양 플라스크에 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 DMEM 11 ㎖, 10 % FCS, 2 × 10-3 M L- 글루타민, 100 IU / ml의 페니실린, 및 0.625 μg의 / ml의 암포 테리 신 B 넣어. 동일한 배지 1 ㎖를 1 × 106 치사량 조사 마우스 3T3 섬유 아세포 (12)를 추가하고, 5 % CO 2의 가습 분위기에서 37 ℃에서 밤새 배양한다. 이 상피 세포의 후속 문화에 대한 피더 레이어를 생성합니다.
- 메스를 사용하고 histopathologist의 권고에 따라, 위 또는 식도 수술을받은 환자에서 얻은 식도 편평 상피 점막의 무병 배경 영역에서 조직의 약 2cm 2 샘플을 해부하다. 멸균 전송 매체의 50 mL의 용기에 실험실에 전송 (PBS 100 IU / ml의 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 및 0.625 μg의 / ml의 암포 테리 신 B)을 실온에서.
- 이 시점에서, 전송에서 티슈를 저장할4 ° C에서 (밤새) 최대 12 시간 동안 매체의 편의를 위해; 그들은 감소 세포 생존을 초래할 그러나 더 이상 저장 기간을 사용하지 마십시오.
- 층류 조직 배양 후드에서 작업 무균 기술을 사용하여, 5 분 동안 70 % 에탄올에 담가 메스 블레이드 살균. 멸균 PBS로 씻어.
- 멸균 페트리 접시에 조직을두고 0.5 cm의 스트립으로 잘라 메스를 사용합니다. 0.1 %의 5 ML을 추가 페트리 접시에 PBS에 트립신 (/ V W), 접시에 뚜껑을 배치하고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다.
- 트립신을 억제하는 페트리 접시에 조직에 FCS 5 mL를 추가합니다. 스트립 당 1 ~ 2 분 주변 매질로 상피 세포를 제거하는 살균 집게로 조직의 스트립을 잡고 조심스럽게 메스 블레이드와 상피 표면을 긁어. 스크랩 한 조직을 제거하고 따로 설정합니다. 모든 조직 스트립의 과정을 반복합니다.
- 15 mL의 원심 분리 튜브에 상피 세포를 포함하는 배지를 수집원심 분리 (5 분, 200 XG). 상층 액을 붓고 상피 매체의 12 ml의에서 펠렛을 재현 탁 (단계 1.1에서 설명).
- 붓고 단계 1.2에서 제조 한 T75 플라스크에 피더 세포층에서 매체를 폐기. 5 % CO 2의 가습 분위기에서 37 ℃에서 플라스크에 갓 절연 상피 세포를 포함하는 세포 현탁액을 추가 배양 멸균 피펫을 사용한다.
- 24 시간 후 부어도 세포 파편을 포함 배지를 버리고, 신선한 상피 매체의 12 ㎖로 대체합니다. 5 % CO 2의 가습 분위기에서 37 ℃에서 배양을 계속. 식민지는 다음 24-48 시간에 걸쳐 나타날 시작하고 표준 광 현미경 문화 플라스크를 배치하여 볼 수 있습니다. 폐 배지를 붓고 신선한 매체의 동일한 볼륨 모든 2~3일로 교체.
- 플라스크를 80 % 컨 플루, 통로 (13)를 세포에 도달하면. C 분할(1)의 비율의 ELL : 5 모델에서 사용하기 위해 세포 수를 증가한다. 세포를 계대에 24 시간 이전에 상피 세포를 수신 할 각 플라스크에 조사 3T3 세포의 피더 층을 설정하는 단계 1.2를 따릅니다.
참고 : 통로 1 만 4 사이에 아래에 설명 된 식도 모델에서 상피 세포를 사용합니다.
인간의 식도 섬유 아세포 2. 분리
- 층류 캐비닛 작업과 멸균 기술을 이용하여, 단계 1.7에 따로 조직을 가지고. 멸균 페트리 접시에 넣고 멸균 메스 블레이드 도마에 의해 미세하게 말하다. (V / W) 솔루션을 콜라와 페트리 접시에 뚜껑을 배치하고 5 % CO 2, 가습 분위기에서 하룻밤 37 ℃에서 부화 0.5 %의 10 ML을 추가합니다.
- 조심스럽게, 15 mL의 원심 분리기 튜브와 원심 분리기 (10 분, 200 XG)에 다이제스트를 전송 부어 상층 액을 버리고 섬유 아세포 배양 배지 (DMEM 10 % FCS 10ml에 펠렛을 재현 탁, 2 × 10-3 M의 L 글루타민 / ㎖ 페니실린 100 IU, 100 μg의 / ml의 스트렙토 마이신, 및 0.625 μg의 / ml의 암포 테리 신 B).
- T75 플라스크에 현탁액을 놓고 5 % CO 2, 가습 분위기에서 37 ° C에서 품어. 24 시간 후 파편을 포함하고 신선한 섬유 아세포 매체의 12 ㎖로 대체 할 매체를 부어. 세포 수를 증가시키기 위해 5 비율 : 그들은 하나의 셀을 분할, 80 % 컨 플루 (13)에 도달 한 후 배양 배지마다 2~3일 및 통로 세포를 교체합니다.
주 : 통로 4와 10 사이 후술 모델에서 섬유 아세포를 사용한다.
드 - cellularized 식도 비계 3. 준비
- 식량 생산에 사용되는 갓 도살 랜드 레이스 돼지에서 도살장에서 그대로 돼지의 esophagi를 얻습니다. 하나의 단일 식도는 약 30 별도의 구조에 대한 충분한 발판을 제공 할 것입니다.
참고 : 인해 광범위하고 시간이 공동으로멸균 프로토콜이 필요 nsuming, 그것을 획득하고 한번에 10 esophagi의 최소 처리 통상 가치가있다. - 즉시 임의의 미생물 오염 부하를 줄이기 위해 5 분 동안 10 % 포비돈 - 요오드 용액을 약 150 ㎖을 함유하는 180 ㎖의 멸균 냄비에 갓 절제 식도를 배치했다. / ㎖ 스트렙토 마이신 200 IU / ml의 페니실린, 200 μg의 및 1.25 μg의 / ml의 암포 테리 신 B를 포함하는 멸균 PBS 약 100 ㎖를 함유하는 제 냄비 식도 전송
- 용기에 뚜껑을 교체하고, 실온에서 다시 실험실로 esophagi을 운반 할 것. 두 개 또는 세 개의 esophagi는 자신의 크기에 따라, 각각의 용기에 이송 할 수있다.
- 실험실 한번에, 미생물 오염을 최소화하기 위해 무균 기술을 사용하여 층류 후드에서 조직을 처리한다. 70 % 에탄올에 5 분간 침지하고, 멸균 PBS에 세척하여 핀셋, 가위와 메스 블레이드를 소독.
- ES를 처리ophagus 멸균 핀셋을 사용하여. 가위를 사용하여, 길이 방향으로 식도를 오픈. 멸균 PBS 약 100 ㎖을 함유하는 180 ㎖의 멸균 냄비에 식도를 배치하고 이물질을 제거하기 위해 부드럽게 흔들어 조직을 헹군다.
- 자유주의와 70 % 에탄올을 분사하여 코르크 해부 보드를 깨끗하고 건조하게 할 수 있습니다.
- 보드, 점막 표면의 최상부에 식도를 핀, PBS에서 식도를 제거하고 멸균 된 바늘을 사용. 멸균 핀셋 식도의 한쪽 끝에서 점막 표면을 잡고 멀리 보드에서 빼냅니다. 이 기본 점막하에서 점막을 분리합니다.
- 그리고,이 점막 해부 떨어져 상승 될 수 있도록 진행에 따라 핀을 제거하는, 점막 고유 따라 길이 방향 식도 해부 멸균 메스 블레이드를 사용한다.
- 해부 점막을 유지하고 기본 점막하을 폐기합니다.
- 잘라 및 T의 가장 근위부와 원위부 2cm를 폐기각각 7 그 지역에서 점막하 동맥의 큰 번호와 두꺼운 점막 고유 층이있는 한 그는 점막.
- 5cm (2)에 남아있는 조직을 잘라 메스를 사용합니다. 멸균 PBS의 약 150 ㎖를 포함하는 180 ml의 멸균 냄비에 모든 컷 조직을두고 조직을 씻어 부드럽게 교반. 한 번에 둘 이상의 다섯 esophagi 처리하면이 여러 냄비와 세 후속 단계를 사용하는 것이 필요할 수있다.
- 무균 핀셋을 사용하여, 37 ° C에서 72 시간 동안 150 멸균 1 M의 NaCl ㎖, 200 IU / ml의 페니실린, 200 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 및 1.25 μg의 / ml의 암포 테리 B. 인큐베이션을 함유하는 180 mL의 냄비로 절단 조직을 전송.
- 150 ml의 멸균 PBS를 포함하는 신선한 180 ml의 냄비에 조직을 놓습니다. 상피는 눈에 띄게 기본 조직에서 분리하기 시작합니다. 조심스럽게 돼지 식도에서 분리 상피 멸균 집게를 사용하고 폐기 껍질.
- 나머지 T를 배치신선한 180 ML의 냄비에 문제 및 멸균 PBS 150 ㎖를 추가합니다. 5 분 세척을 위해 부드럽게 저어. PBS를 붓고 신선한 PBS로 추가 두 번 반복합니다.
- 실온에서 24 시간 동안 살균 한 80 %의 400 ㎖ (v / v)의 글리세린을 함유하는 용액 500 ml의 유리 병에 모든 조직을 놓는다. 추가 24 시간 동안 멸균 90 % (V / V) 글리세롤 용액 400ml를 갈아.
- 탈수 및 기저막의 무결성을 유지하면서 조직을 멸균 4 개월 이상 상온에서 살균을 100 % 글리세롤 용액 400 ㎖에 보관.
문화 미디어 4. 생산
- 배양 배지에 사용하기 위해 킬레이트 신생아 송아지 혈청을 준비한다.
- 유리 1 리터 병에 Chelex (100) 100g을 붓고 탈 이온수를 추가합니다. 정확한 부피는 중요하지 않지만 충분한 물 Chelex 분말을 덮도록 첨가되어야한다. 자석 교반기를 추가하고 고압 증기 멸균 (121 ° C의에 의해 소독15 분).
- 병을 식히와 Chelex가 정착. 층류 캐비닛, 여분의 물을 부어 신생아 혈청 (NCS)의 500 mL로 추가하고 4 ℃에서 밤새 교반 둡니다.
- 교반 중지하고 Chelex이 30 분까지 걸릴 수 있습니다, 정착 할 수 있습니다. 층류 캐비닛에 -20 ℃에서 10 ㎖ 분량 씩 Chelex 및 저장을 방해하지 않도록주의하면서, 멸균 피펫을 사용하여 킬레이트 혈청 캔트.
- 프로 증식으로 시작하여 프로 differentiative 제제로 끝나는, 층류 캐비닛에 세 가지 다른 미디어를 준비합니다.
- 1 비율 (V : V), 4 × 10-3 M의 L- 글루타민, 0.5 μg의 / ㎖ 하이드로 코르티손, 1 × 10 -4 M O를 -phosphorylethanolamine, 2 × 복합 미디어를 준비 나는 3 DMEM과 햄 F12 구성 10 -12 M의 트리 요오 도티 로닌, 1.8 × 10 -4 M 아데닌, 1.88 × 10 -3 M 염화칼슘 2, 4 × 10 -12 M 프로게스테론, 10 ㎍ / ㎖의에sulin, 10 μg의 / ㎖ 트랜스페린, 10 NG / ㎖ 셀레늄, 1 × 10 -3 M 에탄올 아민과 0.1 % (v / v)의 킬레이트 NCS.
- 0.1 % (v / v)의 비 킬레이트 NCS와 킬레이트 혈청 교체를 제외하고 복합 매체 나 같은 복합 중간 II를 준비합니다.
- 2 % (v / v)의 비 킬레이트 NCS에 생략 프로게스테론과 증가 혈청을 제외하고 복합 중간 II와 같은 복합 매체 III를 준비합니다.
인간의 식도 점막 모델 5. 생산
- 멸균 환경을 유지하기 위해 무균 기술을 사용하여, 층류 후드에서 모든 작업을 수행한다. 멸균 PBS로 세척하기 전에 5 분 동안 70 % 에탄올에 담가 모든 도구를 소독.
- 이 요구되기 전에 날, 무 세포 돼지 식도 발판을 재수. 각각의 구조가 준비하는 발판의 한 조각이 필요합니다.
- 멸균 PBS 100 ㎖을 함유하는 냄비에 돼지 지지체의 조직 장소 충분한 개 재수, 교반하고 10 분 동안 담가. 데카PBS를 NT 및 신선한 PBS로 교체합니다. 모든 글리세롤 흔적의 제거를 보장하기 위해 세척 과정을 다섯 번 반복한다.
- 37 ℃에서 하룻밤 DMEM 100 mL에 재수 조직을 배양하여 발판 불임을 테스트합니다. 지지체는 멸균 것으로 가정 배양 종료 시점 배지 색깔 또는 탁도에 아무런 변화가 없다면. 불임이 확인되면, 맨, 6 웰 플레이트에 점막하 측 5cm 2 무 세포 지지체를 배치합니다.
- 각 발판의 중심에 멸균 의료용 스테인레스 스틸 링 (내경 10mm, 외경 20mm)를 놓고 부드럽게 조직과 적절한 밀봉을 보장하기 위해, 멸균 집게를 사용 누르십시오.
- 세포 현탁액을 제조 트립신 EDTA-13을 사용하여 섬유 아세포 수확. 혈구 (14)를 사용하여 세포를 계산합니다. 세포 현탁액 (10 분, 200 XG)를 원심 분리기. appropria으로 세포 펠렛을 재현 탁섬유 아세포 배지의 부피는 TE 용액 당 2.5 × 106 세포의 최종 세포 수를 생성한다.
- 각각의 링에서, 5 × 10 5 인간의 식도 섬유 아 세포를 포함하는 섬유 아세포 매체의 0.2 ml에 추가합니다. 섬유 아세포 배지의 약 2 ㎖로 링의 외부 주위 영역 홍수. 5 % CO 2의 가습 분위기에서 37 ℃에서 인큐베이션.
- 24 시간 후 고리와 섬유 아세포 배지를 제거하고 지지체 완전히 매질에 침지 보장 각 웰에 신선한 아세포 매체의 적어도 5 mL를 추가한다. 5 % CO 2에서 37 ℃에서 1 주간 배양, 매체마다 2~3일 교체 가습 분위기.
- 일주 후 맨 점막 표면을 배치, 층류 홍수 후드에 비계를 포함하는 6 웰 플레이트를 제거 매체를 제거하고 살균 집게를 사용하여 각 발판을 반전. 이 시점은 0 일째로 지칭된다.
- 중앙의 점막 표면에 스틸 링을 배치단계 5.4에서와 같이 조직.
- 트립신 13 상피 세포의 T75 플라스크를 준비합니다. PBS 세척 전에 트립신 EDTA 용액을 첨가 한 후, 각각의 플라스크에 멸균 0.02 %의 2 ㎖ (w / v)의 EDTA 용액을 추가한다. 37 ℃에서 2 분 동안 품어. 첨부 된 상피 세포를 유지하면서 선택적으로 i3T3 세포층을 분리 부드럽게 플라스크를 누릅니다.
참고 : 일반적으로 이미 지난 주 모델에 통합 된 섬유 아세포에 상피 세포와 일치하는 환자에게 실제적인 또는 필요가 없습니다. - 세포층을 함유 EDTA 용액을 붓고 13 상피 세포 수확 트립신 EDTA 용액을 추가한다. 혈구 (14)를 사용하여 세포를 계산합니다. 세포 현탁액 (10 분, 200 XG)를 원심 분리기. 용액 당 5 × 106 세포의 최종 세포 수를 생산하는 복합 매체 (1)의 적절한 양으로 세포 펠렛을 재현 탁.
- 포함하는 복합 중간 나는 0.2 ML을 추가 1 × 1링 내에서 0 ~ 6 상피 세포. 복합 중간 나는 약 2 mL를 링의 외부 주변 지역 홍수와 5 % CO 2, 가습 분위기에서 37 ° C에서 인큐베이터에 구조를 놓습니다.
- 24 시간 (1 일) 후 링과 매체를 제거하고 신선한 복합 중간 나는 적어도 5 mL를 추가, 비계가 완전히 침수되는 보장하고 인큐베이터로 돌아갑니다. 또 24 시간 (2 일) 후 매체를 제거하고 다시 비계가 완전히 침수 및 인큐베이터로 돌아된다 보장, 복합 매체 II의 적어도 5 ㎖로 대체했다.
- 날 4 곳 멸균 의료용 스테인레스 스틸 메쉬 그리드 신선한 6 웰 플레이트에 (2cm 길이 X 0.5 cm 높이 x 세로 2cm), 구조 당 하나. 강철 격자, 점막 표면 맨의 상단에 구조를 전송하는 멸균 핀셋을 사용합니다.
- 복합 액체의 아래쪽에 도달하지만, 표면이되도록 충분한 중간 복합 III 추가공기에 노출, 이것은 샘플이 공기 - 액체 계면에서 유지되는 것을 보장한다. 지지체, 웰의 부피 및 스테인레스 그리드의 정확한 높이의 두께에 따라 달라질 필요 매체의 정확한 볼륨.
- 실험의 조건에 따라, 10 및 20 일 사이에 (주 24 주 14)에 대한 공기 - 액체 계면에서 합성을 유지한다. 신선한 매체와 복합 매체 III를 교체 모든 2~3일 (월요일, 수요일, 금요일 사용자 친화적 인 정권이다).
주 : 공기 - 액체 계면 (9 일)에서 5 일 후 구조물이 식도 상피의 환경 적 요인의 영향을 실험에 사용하기에 충분히 성숙 식도 상피있다. - 실험의 끝에, 상기 분석가 대한 상피에서 조직 학적 분석 및 면역 조직 화학 염색 7 또는 추출물 단백질 15 또는 RNA 11,16위한 구조를 해결이다. 필요한 경우 세포 외 신호 전달 분자 (17)의 분석 조건 배지를 유지한다.
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Representative Results
이 원고 성공적 인간 식도 상피의 배양 3D 모델로,도 1에 개략적 인 형태로 도시 필요한 프로세스를 설명한다. 실험 플랫폼 조직 학적 및 면역 조직 화학적 연구는 정상적인 인간의 식도 편평 점막으로 배양 조직을 비교 수행 된 같은 모델의 적합성을 확인합니다.
기재된 방법에 의해 제조 된 상피 조직 학적 평가는 세포의 더 얇은 (5 내지 10 층이라도 성숙, 다층, 층화 편평 상피 정상적인 인간 식도 (도 2A)에서 관찰되는 것과 유사한 것이다 (도 2b)를 보여준다 10 세포 아부 그들은 표면쪽으로 이동 anuclear 궁극적으로 점진적으로되고,)에 대한 정상적인 식도 (20)와 비교했다.
증식과 디 키 마커의 면역 조직 화학적 특성fferentiation 모델 상피 microanatomy는 정상적인 인간 식도 상피와 유사 함을 입증. 필적 사료된다 식은 기저 세포 내에서 바로 suprabasal 층 (도 3a 및 3b)의 서브 세트로 제한하여 염색, 네이티브 식도 상피 모델 모두에서 관찰되었다. 이것은 세포의 10 % 이하가 일반적으로 정상적인 식도 상피 (18)에, 증식 마커의 발현을 보여 사료된다보고 연구와 유사하다. CK4는 일반적으로 계층화와 원주 상피로 표현하지만, CK14은 기초 층 (19) 만 긍정적 인 반면 일반적으로 기저 층에 결석입니다. CK4 두 가장 기초 층을 제외한 상피 통하여 관찰하면서 정상적인 식도 상피 및 모델 모두에서, CK14는 기저층 (도 3D 및 3E)의 모든 세포에서 관찰된다 (도 3G 및
같은 헷-1A로 불멸화 식도 상피 세포와 기본 식도 상피 세포를 대체하는 시도, 덜 성공했다 정상 식도 상피의 올바른 모델을 생성하지 않았다. 다층 상피 형성 하였다; 그러나 증식 마커 사료된다 차별화의 마커 검출없이 식을 상피 (그림 3C)를 통해 검출되었다 (그림 3 층, 3I 및 3L)는 헷-1A 세포는 정상 계층화 또는 증거와 증식 상피 세포를 생산 나타내는 것을 성숙.
그러나, 모델왔다성공적으로 식도 선암 (OE33) 또는 편평 암종 (OE21) 세포 중 하나와 차 상피 세포의 교체에 의해 종양 세포를 포함하도록 수정. 이것은 다른 세포주 번호의 포함을 통해 진행의 다른 단계에서 식도 질환의 범위를 조사에서의 사용을 가능 모델의 유연성을 보여준다. 이들 두 세포주에서 반응에 현저한 차이가 있음을 알 수있다. OE21 편평 암종 세포 기능 장애 세포 접착 분자를 반영 할 가능성이 상피 (도 4B) 내의 큰 갈라진 틈과 황색 영역 정의 (도 4a)와 같은 구조에 보이는 상피를 생성한다. 공기 / 액체 계면 (도 4C)에 2 주 성장 후 지지체의 박막화 등의 눈으로 볼 지지체 저하 다량의 모델 결과 내의 OE33 선암 세포를 포함하고 H + E 분석 등으로 확인할세포 (그림 4D) 아래 지역에서 발판의 두께에 명백한 감소. 골격 변성 섬유 아세포 (도 4E 및 4F)의 부재하에 관찰되지 않기 때문에, 이것은 종양 세포 및 섬유 아세포와의 상호 작용의 결과로 보인다. 우리는 동등한 흑색 종 모델 (21)의 섬유 아 세포의 유무에 종양 침윤에 유사한 영향을 관찰했다.
그림 1 : 식도 점막 모델의 생산을 보여주는 개략도 인간의 식도 섬유 아 세포가 지지체의 점막 표면에 접종하고 7 일간 배양한다.. 지지체는, 반전 인간 식도 상피 세포에 첨가하고, 배양 4 일 동안 침수. 구조체는 DA 10 내지 20 공기 - 액체 계면까지 상승YS. 실험의 끝에서 구조가 필요한 경우 추가 분석을받을 수 있습니다. 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. () 정상적인 인간의 식도 상피 세포 및 인간의 식도 점막의 모델 형성 (B) 식도 상피의 정상적인 인간의 식도 상피 H + E를 분석 식도 모델에서 생산 된 상피 세포의 비교. 스케일 바는 500 μm의입니다. 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4 : 종양 세포주 내 포함식도 모델. 일차 상피 편평 세포 암종 세포주 OE21 또는 선암 세포주, OE33 대체되었다. 이미지 (C)와 함께 또는 (E) 섬유 아세포의 부재 전에 배양 기간이 끝날 때까지 고정 어느 OE21 세포 (A) 또는 OE33 세포 구조를 보여준다. OE21 (B) 또는 OE33 세포 (D) 또는 (F)의 섬유 아세포를 포함하지 않고 상피는 H + E 염색으로 가시화된다. 스케일 바는 500 μm의입니다. 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 원고는 식도 상피시의 환경 스트레스에 대한 노출의 영향을 연구하는 실험 플랫폼으로 사용하기에 적합한, 생물학적으로 중요한 인간 식도 점막 모델의 제조 및 특성을 설명한다.
인간 식도 점막 모델의 성공적인 제조를위한 가장 중요한 단계는 다음과 상피 세포의 대부분이 남아 증식 이미 지지체에이를 파종하기 전에 구별하기 시작되지 않았 음을 보장; 합성을 위해 공기 - 액체 계면을 유지하는 상피의 정확한 성숙을 보장하는 단계; 연장 된 기간 동안 배양 무균 유지.
때문에 세포 분리에 사용할 수 인체 조직의 제한된 양에 직접 발판에 결과적으로 세포 확장 산도 갓 고립 된 세포를 시드하는 하나의 조직 샘플에서 충분한 세포를 얻기 위해 일반적으로 가능하지 않다세포를 표준 2D 세포 배양 조건에서 배양되는 경우 ASE가 필요하다. 이는 세포가이 기간 동안 증식을 유지하는 것이 중요하다. 이것은, 배양액 전체 포화 상태에 도달하도록 적이되도록 보장 오직 통로 (4)까지의 셀 모델을 이용하여 조심스럽게 세포 형태를 모니터링함으로써 이루어진다. 따라서 세포는 자신의 특유의 증식 다각형 형태와 증식 상피 세포보다는 분화하기 시작했다 문화에서 관찰 된 더 확산 모양의 단단한 "조약돌"포장 도로와 같은 모양의 특성을 유지해야한다. 초 임계 공정은 세포 배양 배지는 공기 - 액체 계면되지만 자체가 잠겨 있지 않은 구조의 최상부 표면에 배양 물을 들어 올리는 데 사용 스테인레스 그리드의 상부 표면을 덮는 것을 보장함으로써 제어된다. 디 cellularized를 제조 할 때 세 번째 단계는 연장 된 멸균 프로토콜 엄격한 고수에 의존돼지 비계와 프로세스 전반 좋은 무균 기술의 사용.
우리의 결과는 기본 인간의 식도 세포가 정상, 성숙, 층상 상피 세포를 생산하는 데 필요한 것으로 나타났다. 불멸화 세포주가 사용 된 경우 인간 식도 상피로부터 유래이라도, 세포 증식 및 유지 성숙한 상피 성층을 형성하기 위해 구별하지 못했다. 얻어진 상피 모델에 사용하는 불멸화 세포주 헷-1A의 부적합을 보여주는, 정상적인 상피에 대한 양호한 모델로서 사용될 수 없었다. 그러나 이러한 식도 종양인지 바렛 화생로부터 유도 된 것과 같은 다른 세포주가 모델에 통합 될 수 어느 종양 진행, 침윤 및 약리학 적 제제에 대한 반응 연구를위한 모델을 생성하기 위해 또는 일차 상피 세포 이외에 대신.
실험 모델의 식도로를 사용하여 수행 될 수있다삼키는 또는 역류 동안, 타악기 이벤트 이산하는 식도의 노출을 imulate. 이것은 반복 시험 될 화합물 (들)을 함유하는 배지에서 구조를 침지하고 공기 - 액체 계면에 구조체를 리턴하기 전에 PBS로 세척함으로써 달성된다. 노출 시간 및 주파수 배양 공기 - 액체 계면에서 계속시키면서 상피 층은 환경 적 요인 (들)에 노출되는 것을 보장하는, 시뮬레이션되는 프로세스를 반영하도록 수정 될 수있다. 이 방법은 모델 십일일 11 일 2 회 10 분 동안 특정 위식도 역류 성분에 노출 정상적인 식도 상피, 환류에 미치는 영향을 조사하기 위해 실험에 사용되었다. 대안 적 구조는 배지에서 이들 화합물을 포함함으로써 환경 스트레스의 연속적인 레벨로 노출 될 수있다. 그러나, 상피 이후 epithe위한 공기 - 액체 계면에 노출되어야lium 성숙 적절 7을 구별하기 위해, 연속적 배지에서 구성체 잠수함하는 것은 불가능하다. 그 결과, 스트레스에 대한 노출은 얻어진 결과의 관련성을 제한 할 수있다 이러한 실험에서 점막 표면을 경유 할 것이다.
이 기술은 비교적 노동 집약적이며, 따라서 화합물의 상대적으로 제한된 수의 스크리닝에 더 적합하다. 실험적인 플랫폼 모델을 사용하면 결과적으로, 먼저 여기 11 바와 이상의 생리 학적으로 관련 식도 모델을 이용하여 추가 분석에 선행 조건의 제한된 수를 식별하는 기존의 세포 배양 기술을 사용하여 예비 연구를 수행하는 것이 적절하다. 면역 조직 화학적 분석에 더하여 또한, 환경 스트레스에 노출 된 후 상피 유전자 발현 프로파일의 변화를 조사 할 수있다. 이것은 수동 전자를 벗겨함으로써 달성되었다pithelium는, RNA를 추출하여 cDNA를로 변환하는 유전자 발현이 11 프로필 수득하여 마이크로 어레이 유전자 발현 분석 및 되를 분리. 이러한 방식은 실험적 플랫폼 모델에서 사용할 수있는 정보를 증가시킬 수있다. 위식도 환류 모의 노출 후 상피 유전자 발현 프로파일의 초기 변화가 제안되었으며, 이러한 결과로부터 새로운 영역 바렛 화생, OAC 11 화생 전구체의 개발의 예방에 추가 조사를 위해 제안되어왔다. 모델은 또한 노던 블롯 분석을 이용하여 16 웨스턴 블롯 분석 15 및 유전자 발현 같은 방법을 이용하여 단백질 발현을 연구하기 위해 사용될 수있다. 세포 외 신호 전달 분자의 연구는 또한 배양 배지 (17)상에서 수행 될 수있다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는 식도 조직 샘플 및 우리의 작업의지지를 획득 그들의 도움 씨 로저 애크로이드 씨 앤드류 와이 먼 씨 크리스 스토 다드, 셰필드 교육 병원 NHS 재단 트러스트에서 컨설턴트 외과 의사에 감사하고 있습니다. 우리는 모델로 종양 세포 라인을 통합 그의 도움을 Ashraful Haque 씨 감사합니다. 우리는 감사 Bardhan 연구 및 교육 신탁 (브렛)와 요크셔 암 연구 (YCR)에서 보조금이 연구에 대한 재정 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | BD Biosciences | 215240 | Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilize. Warm in 37 °C water bath before use. |
| DMEM | Labtech | LM-D1112 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F12 | Labtech | LM-H1236 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Foetal Calf Serum | Labtech | FB-1090 | |
| Epidermal Growth Factor | R+D Systems | 236-EG-200 | Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS |
| Hydorcortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2767 | Prepare 10 mg/ml solution in 0.01 M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilize before use |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | Prepare stock solution in water |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Brand name Fungizone |
| PBS | Oxoid | BR0014 | Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilize |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| Povidone-iodine solution | Ecolab | 10830E | Brand name Videne |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| Newborn calf serum | Gibco | 26010074 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use use |
| O-phosphorylethanolamine | Sigma-Aldrich | P0503 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Lonza | 17-838Z | Used for composite media preparation |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA 0.02% solution | Sigma-Aldrich | E8008 | Warm in 37 °C water bath before use |
| T75 culture flask | VWR | 734-2313 | |
| 50 ml centrifuge tube | Fisher | 11819650 | |
| 15 ml universal tube | SLS | SLS7504 | |
| 180 ml pot | VWR | 216-2603 | |
| Petri dish | SLS | 150350 | |
| 6 well plate | VWR | 734-2323 | |
| stainless steel rings | Manufactured in house - medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm | ||
| steel mesh grids | Manufactured in house - sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2 cm (w) x 2 cm (d) x 0.5 cm (h) | ||
| ki67 | Novocastra | KI67-MM1-L-CE | Clone MM1. Use at 1:100. |
| CK4 | Abcam | ab9004 | Clone 6B10. Use at 1:200. |
| CK14 | Novocastra | LL002-L-CE | Clone LL002. Use at 1:200. |
| Involucrin | Novocastra | INV | Clone SY5. Use at 1:100. |
| OE21 | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| OE33 | Sigma-Aldrich | 96070808 | |
| Het-1A | ATCC-LGC | CRL-2692 | |
| Mouse 3T3 fibroblasts | ATCC-LGC | CRL-1658 | previously growth arrested by irradiation (60 Gy) |
References
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