Summary
Este manuscrito descreve a produção, caracterização e usos potenciais de uma engenharia de tecidos construção de esôfago 3D preparado a partir de fibroblastos de esôfago normais primária humana e células epiteliais escamosas semeadas dentro de um andaime porcino de-celularizado. Os resultados demonstram a formação de um epitélio estratificado maduro semelhante ao esófago humano normal.
Abstract
A incidência de ambos adenocarcinoma de esôfago e seu precursor, metaplasia de Barrett, estão a aumentar rapidamente no mundo ocidental. Adenocarcinoma de esôfago, além disso, geralmente tem um prognóstico pobre, com pouca melhora nas taxas de sobrevivência nos últimos anos. Estas são condições difíceis de estudar e tem havido uma falta de plataformas experimentais adequadas para investigar perturbações da mucosa esofágica.
Um modelo da mucosa esofágica humano foi desenvolvido no laboratório MacNeil que, ao contrário dos sistemas convencionais de cultura de células em 2D, recapitula as interacções célula-célula e célula-matriz presentes in vivo e produz, um epitélio estratificado maduro semelhante ao do ser humano normal esófago. Em resumo, o modelo utiliza células não transformadas fibroblastos humanos primários esofágicas epiteliais normais e cultivadas dentro de um andaime esofágica acelular derivada de porcino. Caracterização imuno-histoquímica desse modelopor CK4, CK14, Ki67 e involucrin coloração demonstra recapitulação adequada da histologia da mucosa do esôfago humano normal.
Este modelo fornece um modelo experimental robusto, biologicamente relevante da mucosa do esôfago humano. Ele pode ser facilmente manipulado para investigar um certo número de perguntas de investigação, incluindo a eficácia dos agentes farmacológicos e o impacto da exposição a factores ambientais tais como o álcool, toxinas, temperatura elevada ou de componentes do refluxo gastro-esofágico. O modelo também facilita a períodos prolongados de cultura não realizáveis com a cultura de células em 2D convencional, permitindo, nomeadamente, o estudo dos efeitos da exposição repetida de um epitélio madura para o agente de interesse para até 20 dias. Além disso, uma variedade de linhas celulares, tais como as derivadas de tumores esofágicos ou metaplasia de Barrett, pode ser incorporado no modelo para investigar processos tais como a invasão do tumor e droga responsiveness em um ambiente mais biologicamente relevante.
Introduction
A mucosa esofágica compreende um epitélio estratificado, escamoso acima de uma camada de tecido conjuntivo, a lâmina, e é um dos primeiros locais para encontrar factores de stress ambientais ingeridos. A exposição a toxinas dieta está implicada no desenvolvimento de carcinoma escamoso esofágico, enquanto o refluxo duodenogastro-esofágica é um factor crítico na patogénese de metaplasia de Barrett, o qual está associado com um maior risco de progressão para adenocarcinoma esofágico. Carcinomas de esôfago são o 8º tumor maligno mais comum no Reino Unido machos e adenocarcinoma de esôfago está a aumentar rapidamente no mundo ocidental 1. Além disso, houve pouca melhora no prognóstico da doença, com uma taxa de sobrevida global em 5 anos de cerca de 15%. Consequentemente, há uma necessidade de plataformas experimentais para investigar o impacto da exposição a estressores ambientais sobre este epitélio esofágico e seu potencial envolvimento no desenvolvimento de metaplasia ou neoplasia.
Embora as linhas de células imortalizadas ou de tumor permitir que os investigadores a estudar a resposta de células epiteliais para estes factores de stress in vitro, eles permanecem proliferativa e não conseguem diferenciar-se em células epiteliais maduras encontradas nas camadas superiores da mucosa esofágica. Além disso, linhas de células que já tenham sido submetidos a tumorigénese pode fornecer informação limitada sobre as respostas iniciais de células normais dentro do epitélio a factores ambientais; e esta é a fase em que o potencial para intervenção terapêutica pode ser mais elevada. Finalmente, sistemas de cultura celular convencionais não conseguem capturar as interacções potencialmente importantes entre as células epiteliais e mesenquimais e entre estas células e a matriz circundante que ocorrem dentro de tecidos in vivo.
Modelos animais proporcionam um microambiente mais realista para estudar as respostas do epitheli esofágicahum e pode incorporar a indução artificial da doença do refluxo gastro-esofágico 2. No entanto, pode ser mais difícil de manipular os estressores ambientais nesses modelos e eles podem não representar plenamente a resposta dentro do esôfago humano.
Outros modelos experimentais esofágicas humanos têm sido desenvolvidos que utilizam células primárias imortalizadas, células ou linhas celulares de tumor em um colagénio, ou combinado colagénio / Matrigel, andaime contendo fibroblastos 3,4. É menos trabalho intensivo para gerar estes andaimes do que o andaime esofágica acelular descrito neste manuscrito, e estes modelos organotípicas proporcionam uma ferramenta útil, especialmente no estudo de invasão tumoral 5,6, onde a infiltração de células tumorais no gel de colagénio pode ser prontamente observado. Contudo, estes géis de colagénio tem propriedades mecânicas não nativas e não têm certas características do tecido original, incluindo uma membrana basal específico e o appropriate superfície topografia. Este pode influenciar o comportamento das células, resultando em, por exemplo, adesão pobre entre o epitélio e andaime quando utilizando um gel de colagénio 7 andaime. Como consequência, o andaime esofágica porcino acelular foi desenvolvido, com a vantagem de ser um andaime biologicamente mais realista e, portanto, mais adequada para o uso como uma plataforma experimental. Também tem sido demonstrado que é melhor para incorporar células primárias para as construções esofágicas do que as linhas celulares imortalizadas esofágicas epiteliais, tais como Het-1A, uma vez que estas células formam um epitélio de múltiplas camadas, mas não conseguem diferenciar ou estratificar 4,7,8 .
Por conseguinte, este protocolo foi adaptado a partir de um método já em uso no laboratório MacNeil para fazer o tecido da pele e mucosa oral engenharia 9,10 e incorpora um andaime de esôfago porcino de-celularizado combinado com células humanas primárias do esôfago epiteliais e fibroblastos. This protocolo produz, um epitélio estratificado maduro, semelhante ao do esófago humano normal como demonstrado por CK4, CK14, Ki67 e involucrina coloração. O modelo resultante proporciona uma plataforma experimental para estudar as respostas a factores de stress ambientais, e tem sido utilizada eficazmente para estudar alterações na expressão do gene no epitélio esofágico em resposta ao material refluído componentes 11.
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Protocol
Células do esôfago humanos são obtidos a partir de pacientes submetidos à cirurgia gástrica ou esofágica. O consentimento informado é obtido para o tecido a ser usado para fins de pesquisa, eo tecido usado de forma anônima sob as aprovações éticas adequadas (SSREC 165/03, Tissue Research Humano Banco Licence 12179).
1. Isolamento de esôfago humano células epiteliais
- Trabalhando em fluxo laminar capuz de cultura de tecidos e utilizando uma técnica estéril, preparar o meio de cultura epitelial através da mistura de meio de Eagle modificado por Dulbecco (MEMD) e F12 de Ham na proporção de 3: 1 (v: v). Adiciona-se 10% (v / v) de FCS, factor de crescimento epidermal 10 ng / ml, 0,4 ug / ml de hidrocortisona, 1,8 x 10 ~ 4 M de adenina, 5 ug / ml de insulina, 5 ug / ml de transferrina, 2 x 10 -7 M tri-iodotironina, 1 x 10 -10 M a toxina da cólera, 2 x 10 -3 M glutamina, 100 UI / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 0,625 ug / ml de anfotericina B.
- Usando padrãotécnicas estéreis, colocar 11 ml de DMEM, 10% FCS, 2 x 10 -3 M de L-glutamina, 100 UI / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 0,625 ug / ml de anfotericina B num balão de cultura de tecidos T75. Adicionar 1 x 10 6 letalmente irradiados fibroblastos 3T3 de ratinho 12 em 1 ml do mesmo meio e incubar durante a noite a 37 ° C num CO 2, atmosfera humidificada de 5%. Isto produzirá uma camada alimentadora para a cultura subsequente de células epiteliais.
- Usando um bisturi e seguindo as recomendações de um histopathologist, dissecar um aproximadamente 2 cm2 amostra de tecido da região fundo livre de doença de mucosa epidermóide de esôfago obtidas a partir de pacientes submetidos à cirurgia gástrica ou esofágica. O transporte para o laboratório num recipiente de 50 ml de meio de transporte estéril (PBS 100 UI / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 0,625 ug / ml de anfotericina B) à temperatura ambiente.
- Neste ponto, armazenar o tecido no transportemédio de até 12 horas (durante a noite) a 4 ° C, por conveniência; no entanto, não usar períodos de armazenamento de mais tal como resultam da viabilidade celular reduzida.
- Trabalhando em fluxo laminar capuz de cultura de tecidos e utilizando uma técnica estéril, esterilizar uma lâmina de bisturi por imersão em etanol a 70% durante 5 min. Enxágüe em PBS estéril.
- Colocar o tecido de uma placa de Petri estéril e usar o bisturi para cortar em tiras de 0,5 centímetros. Adicionar 5 ml de 0,1% (w / v) de tripsina em PBS para a placa de Petri, colocar a tampa no prato e incubar durante 1 hora a 37 ° C.
- Adicionar 5 ml de FCS para o tecido no prato de Petri para inibir a tripsina. Segurando a tira de tecido com uma pinça estéril, raspe a superfície epitelial com a lâmina de bisturi para 1-2 min por tira para remover as células epiteliais para o meio circundante. Remover o tecido raspada e reserve. Repetir o processo para todas as tiras do tecido.
- Recolhe-se o meio contendo as células epiteliais desacopladas em um tubo de centrífuga de 15 mle centrifuga-se (5 min, 200 x g). Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 12 ml de meio epitelial (descrito no passo 1.1).
- Decantar e rejeitar o meio a partir da camada de células de alimentação no frasco T75 preparado no passo 1.2. Usar uma pipeta estéril para adicionar a suspensão de células contendo as células epiteliais isolada de fresco ao frasco e incubar a 37 ° C em 5% de CO 2, atmosfera humidificada.
- Após 24 h, deitar fora e deite fora o meio de cultura, que também irá conter os detritos celulares, e substituir com 12 ml de meio fresco epitelial. Continuar a incubação a 37 ° C num CO 2, atmosfera humidificada de 5%. Colônias vão começar a aparecer nos próximos 24 a 48 h e pode ser visto colocando o frasco de cultura sob um microscópio de luz padrão. Decantar o meio de cultura gasto e substitua com um volume igual de meio fresco a cada 2 a 3 dias.
- Uma vez que o balão tenha atingido 80% de confluência, as células de passagem 13. Dividir o cells em uma proporção de 1: 5 a aumentar o número de células utilizadas no modelo. Siga passo 1.2 para estabelecer camadas alimentadoras de células 3T3 irradiadas em cada balão que vai receber células epiteliais 24 h antes da passagem das células.
Nota: Utilize as células epiteliais no modelo de esôfago descrito abaixo entre as passagens 1 e apenas 4.
2. Isolamento de esofágicas fibroblastos humanos
- Trabalhando em uma câmara de fluxo laminar e usando técnica estéril, tomar o tecido retiradas no passo 1.7. Coloque em uma placa de Petri estéril e pique finamente por cortar com uma lâmina de bisturi estéril. Adicionar 10 ml de 0,5% (w / v) de colagenase A solução e colocar a tampa no prato de Petri e incubar a 37 ° C durante a noite num CO 2, atmosfera humidificada de 5%.
- Transferir a digest para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugar (10 min, 200 x g), cuidadosamente, deitar fora e deite fora o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de meio de cultura de fibroblastos (DMEM 10% de FCS, 2 x 10 -3 M de L-glutamina, 100 UI / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 0,625 ug / ml de anfotericina B).
- Colocar a suspensão para um frasco T75 e incubar a 37 ° C num CO 2, atmosfera humidificada de 5%. Após 24 h, deitar fora o suporte, que vai conter os detritos e substituir por 12 ml de meio fresco de fibroblastos. Substituir o meio de cultura a cada 2 a 3 dias e as células de passagem, uma vez que tenham atingido 80% de confluência 13, dividindo as células numa proporção de 1: 5 para aumentar os números de células.
Nota: Utilize as células de fibroblastos no modelo descrito a seguir entre as passagens 4 e apenas 10.
3. Preparação do De-celularizado esofágico Andaime
- Obter esófagos suína intacta em um abatedouro de suínos da raça Landrace recém abatidos que são utilizados para a produção de alimentos. Uma esôfago único irá fornecer andaimes suficientes para cerca de 30 construções separadas.
Nota: Devido à extensa e hora consuming protocolo de esterilização necessário, é normalmente vale obtenção e processamento de um mínimo de 10 esófagos de uma só vez. - Colocar imediatamente o esófago recentemente excisada para um vaso estéril de 180 ml contendo aproximadamente 150 ml de solução de povidona-iodo a 10% durante 5 minutos para reduzir a carga microbiana de qualquer contaminação. Transferir o esófago para um segundo vaso contendo aproximadamente 100 ml de PBS estéril contendo 200 UI / ml de penicilina, 200 ug / ml de estreptomicina, e 1,25 ug / ml de anfotericina B.
- Colocar a tampa sobre o recipiente e transportar o esófagos de volta ao laboratório à temperatura ambiente. Dois ou três esófagos pode ser transportado em cada recipiente, em função do seu tamanho.
- Uma vez no laboratório, tratar o tecido de uma câmara de fluxo laminar utilizando uma técnica asséptica para minimizar a contaminação microbiana. Esterilizar pinças, tesouras e lâminas de bisturi por imersão durante 5 min em etanol a 70%, e lavagem em PBS estéril.
- Lidar com as esophagus usando uma pinça estéreis. Usando a tesoura, corte o esôfago aberto longitudinalmente. Lavar o tecido, colocando o esôfago em um pote estéril de 180 ml contendo aproximadamente 100 ml de PBS estéril e balançando suavemente para remover quaisquer detritos.
- Limpe uma placa de dissecção cortiça pulverizando generosamente com etanol 70% e deixe secar.
- Remover o esôfago do PBS, e utilizando agulhas estéreis, o pino para fora do esôfago em cima da prancha, mais elevada superfície da mucosa. Agarrar a superfície da mucosa, numa extremidade do esófago com pinças estéreis e puxar para fora da placa. Isto irá separar a mucosa da submucosa subjacente.
- Em seguida, use uma lâmina de bisturi estéril para dissecar o esôfago longitudinalmente ao longo da lâmina própria, remoção de pinos como a dissecção progride para permitir que a mucosa a ser levantada.
- Reter a mucosa dissecada e descartar a submucosa subjacente.
- Cortar e descartar as mais proximais e distais dois centímetros de tele mucosa, há um maior número de glândulas submucosas e uma lâmina mais espessa nas zonas, respectivamente 7.
- Usar um bisturi para cortar o tecido restante em de 5 cm2. Colocar todo o tecido cortado em um vaso estéril de 180 ml contendo aproximadamente 150 ml de PBS estéril e agitar suavemente para enxaguar o tecido. Se o processamento de mais de cinco esôfago em um tempo que pode ser necessário usar vários vasos para esta e as três etapas seguintes.
- Usando pinças estéreis, transferir o tecido cortado em um vaso de 180 ml contendo 150 ml de 1 M estéril de NaCl, 200 UI / ml de penicilina, 200 ug / ml de estreptomicina e 1,25 ng / ml de anfotericina B. incubar durante 72 horas a 37 ° C.
- Coloque o tecido em um pote de 180 ml fresco contendo 150 ml de PBS estéril. O epitélio terá começado a separar visivelmente a partir do tecido subjacente. Descascar delicadamente o epitélio desanexação do esôfago porco usando uma pinça estéril e descarte.
- Inserir o restante tquestão em uma jarra de 180 ml e adicionar 150 ml de PBS estéril. Agitar suavemente durante 5 minutos para lavar. Deitar fora o PBS e repetir mais duas vezes com PBS fresco.
- Colocar todo o tecido dentro de uma garrafa de vidro de 500 ml contendo 400 ml de estéril 80% (v / v) de solução de glicerol durante 24 horas à temperatura ambiente. Transferir para 400 ml de estéril 90% (v / v) de solução de glicerol durante mais 24 h.
- Armazenar em 400 ml de solução de glicerol a 100% estéril à temperatura ambiente durante um mínimo de 4 meses para desidratar e esterilizar o tecido ao mesmo tempo preservando a integridade da membrana basal.
4. Produção da Cultura Mídia
- Prepare quelado de soro de vitelo recém-nascido para a utilização no meio de cultura.
- Despeje 100 g de Chelex 100 em uma garrafa de vidro de 1 L e adicionar água de-ionizada. O volume exacto não é crítica, mas deve ser suficiente água adicionada para cobrir o pó Chelex. Adicionar um agitador magnético e esterilizar em autoclave (121 ° C durante15 min).
- Deixar a garrafa arrefecer e o Chelex a assentar. Em uma câmara de fluxo laminar, deitar fora o excesso de água, adicionar 500 ml de soro de vitelo recém-nascido (NCS) e deixar a agitar durante a noite a 4 ° C.
- Pare de mexer e deixe o Chelex para resolver, isso pode levar até 30 min. Em uma câmara de fluxo laminar, decanta-se o soro quelada utilizando uma pipeta estéril, tendo cuidado para não perturbar o Chelex, e armazenar em 10 mL de alíquotas a -20 ° C.
- Prepare três meios diferentes numa câmara de fluxo laminar, começando com pró-proliferativa e terminando com formulações de pró-diferenciativas.
- Prepare Composição Meio I composto de Hams F12 e DMEM numa razão 3: 1 (v: v), 4 x 10 -3 M de L-glutamina, 0,5 ug / ml de hidrocortisona, 1 x 10 ~ 4 M O -phosphorylethanolamine, 2 x 10 -12 M triiodotironina, 1,8 x 10 ~ 4 M de adenina, 1,88 x 10 -3 M de CaCl2, 4 x 10 -12 M progesterona, 10? g / ml emsulin, 10 ug / ml de transferrina, 10 ng / ml de selénio, 1 x 10 -3 M de etanolamina e 0,1% (v / v) quelatado NCS.
- Prepare Composite Médio II como Composite Médio Eu exceto substituir soro quelatados com 0,1% (v / v) não-quelado NCS.
- Prepare Composite Médio III como Composite Médio II, excepto omitir progesterona e aumento sérico de 2% (v / v) não-quelado NCS.
5. Produção da Mucosa Modelo de esôfago humano
- Executar todo o trabalho em uma capela de fluxo laminar, utilizando uma técnica asséptica para manter um ambiente estéril. Esterilizar todas as ferramentas por imersão em etanol a 70% durante 5 min, antes da lavagem em PBS estéril.
- Um dia antes de ele é necessário, hidratar o andaime de esôfago suína acelular. Um pedaço de andaime é necessário para cada constructo a ser preparado.
- Para reidratar o lugar tecido peças suficientes de andaime suína em um pote contendo 100 ml de PBS estéril, agite e deixe de molho por 10 min. Decant o PBS e substituir com PBS fresco. Repetir o processo de lavagem cinco vezes para assegurar a remoção de todos os vestígios de glicerol.
- Testar a esterilidade andaime por incubação durante a noite o tecido re-hidratado em 100 ml de DMEM a 37 ° C. Se não houver mudança de cor ou a turvação do meio de cultura no final do período de incubação, o andaime é assumido ser estéril. Uma vez que a esterilidade foi confirmada, colocar de 5 cm 2 acelular andaime em uma placa de 6 poços, com o lado superior da submucosa.
- Coloque um anel estéril de grau médico de aço inoxidável (diâmetro interno 10 mm, 20 mm de diâmetro externo) para o centro de cada um andaime e pressionar suavemente para baixo usando fórceps estéreis, para assegurar uma vedação adequada com o tecido.
- Colher as fibroblastos utilizando tripsina-EDTA 13 para produzir uma suspensão de células. Contar as células usando um hemocitómetro 14. Centrifugar a suspensão de células (10 minutos, 200 x g). Ressuspender o sedimento de células em um appropriate o volume do meio de fibroblastos para produzir uma contagem celular final de 2,5 x 10 6 culas por ml.
- Adicionar 0,2 ml de meio de fibroblastos, contendo 5 x 10 5 fibroblastos humanos esôfago, dentro de cada anel. Inundar a área em torno do exterior do anel, com cerca de 2 ml de meio de fibroblastos. Incubar a 37 ° C num CO 2, atmosfera humidificada de 5%.
- Após 24 horas remover a anéis e fibroblastos meio e adicionar, pelo menos, 5 ml de meio de fibroblastos fresco a cada poço, assegurando que o andaime está totalmente imerso no meio. Cultura de uma semana, a 37 ° C em 5% de CO 2, atmosfera humidificada substituindo o meio a cada 2 a 3 dias.
- Depois de uma semana remover as placas de 6 poços contendo os andaimes para uma inundação capa laminar, remova a médio e inverter cada andaime usando uma pinça estéril, colocar a superfície da mucosa superior. Este ponto de tempo é referido como o dia 0.
- Colocar os anéis de aço sobre a superfície da mucosa no centro deo tecido como no passo 5.4.
- Preparar os balões T75 de células epiteliais para tripsiniza�o 13. Após a lavagem com PBS, e antes da adição de uma solução de tripsina-EDTA, adiciona-se 2 ml de solução estéril de 0,02% (w / v) de solução de EDTA a cada frasco. Incubar durante 2 min a 37 ° C. Toque suavemente o frasco para separar selectivamente a camada alimentadora i3T3 enquanto deixando as células epiteliais em anexo.
Nota: Geralmente, não é prático ou necessário para paciente corresponder as células epiteliais para os fibroblastos já incorporados no modelo da semana anterior. - Decantar a solução de EDTA contendo a camada de alimentação e adicionar solução de tripsina-EDTA a colheita das células epiteliais 13. Contar as células usando um hemocitómetro 14. Centrifugar a suspensão de células (10 minutos, 200 x g). Ressuspender o sedimento de células em um volume apropriado de composto Meio 1 para produzir uma contagem celular final de 5 x 10 6 culas por ml.
- Adicionar 0,2 ml de Meio I Composição, contendo 1 x 10 6 células epiteliais, dentro do anel. Inundar a área em torno do exterior do anel, com cerca de 2 ml de Meio I Composição e colocar as construções na incubadora a 37 ° C em 5% de CO 2, atmosfera humidificada.
- Após 24 h (Dia 1) remover os anéis e o meio e adicionar, pelo menos, 5 ml de fresco Composição Meio I, assegurando os andaimes são totalmente submersa e retornar para a incubadora. Após mais 24 h (Dia 2) remover o meio e substituída com, pelo menos, 5 ml de meio II Composição, assegurando novamente os andaimes são totalmente submersa e retornar para a incubadora.
- No dia 4 lugar grades de malha de aço inoxidável de grau médico estéril (2 cm de largura x 2 cm de comprimento x 0,5 cm de altura), em novas placas de 6 poços, um por construto. Use pinças estéreis para transferir as construções para o topo das redes de aço, no ponto mais alto da superfície da mucosa.
- Adicionar suficiente Médio Composto III, de modo que o líquido atinja a parte inferior do compósito, mas a superfície éexposto ao ar, o que garante que a amostra é mantida a uma interface ar-líquido. O volume exacto de meio necessária irá variar, dependendo da espessura do andaime, o volume do poço e a altura exacta da grelha de aço inoxidável.
- Manter os compósitos numa interface ar-líquido durante entre 10 e 20 dias (dia 14 ao dia 24), dependendo das necessidades da experiência. Substitua o Composite Médio III por meio fresco cada 2 a 3 dias (segunda-feira, quarta-feira, sexta-feira é um regime user-friendly).
Nota: Depois de 5 dias a uma interface ar-líquido (dia 9) as construções têm um epitélio esofágico suficientemente maduro para ser usado em experimentos do impacto dos factores ambientais sobre o epitélio esofágico. - No final da experiência, fixar as construções para análise histológica e coloração imuno-histoquímica 7, 15 ou extracto de proteína ou ARN 11,16 a partir do epitélio para mais analysé. Se necessário, reter o meio de cultura condicionado para análise de moléculas de sinalização extracelulares 17.
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Representative Results
Este manuscrito descreve o processo necessário, mostrado de forma esquemática na Figura 1, a cultura de modelos em 3D do epitélio humano esofágica com sucesso. Para confirmar a adequação do modelo como uma plataforma experimental histológica e imuno-histoquímica estudos foram realizados comparando com os tecidos cultivados mucosa escamosa esofágica humano normal.
A avaliação histológica do epitélio produzida pelo método descrito mostra um, de múltiplas camadas, epitélio escamoso estratificado maduro (Figura 2B), que é comparável com a observada com o esófago (Figura 2A) humana normal, apesar de mais finas (5 a 10 camadas de células em comparação com 10 a 20 para o esófago normal), com as células a tornar-se progressivamente planas e, finalmente, anuclear à medida que migram para a superfície.
Caracterização imuno-histoquímica de marcadores chave de proliferação e differentiation demonstrar que o microanatomy do epitélio modelo é similar ao epitélio esofágico humano normal. Expressão de Ki67 comparável é observada tanto no esófago nativo e o modelo de epitélio, com coloração restrito a um subconjunto de células, no estado basal e as camadas suprabasais imediatamente (Figuras 3A e 3B). Isto é análogo a estudos que relatam que menos de 10% das células em geral apresentam a expressão do marcador de proliferação, Ki67, no epitélio esofágico normal de 18. CK4 é normalmente expressa em epitélios estratificados e colunar, mas é geralmente ausente das camadas basais enquanto CK14 só é positivo na camada basal 19. Em ambos os epitélios esofágico normal e modelo, CK14 é observada em todas as células na camada basal (Figuras 3D e 3E) enquanto CK4 é observado durante todo o epitélio, excepto para as duas camadas mais basais (Figuras 3G e
As tentativas de substituir as células epiteliais esofágicas primárias com células epiteliais imortalizadas esofágicas, como Het-1A, foram menos bem sucedidos e não produzir um modelo válido do epitélio esofágico normal. Um epitélio de múltiplas camadas foi formado; no entanto, o marcador proliferativa de Ki67 foi detectada ao longo do epitélio (Figura 3C) com nenhuma expressão detectada por quaisquer marcadores de diferenciação (Figuras 3F, 3I e 3L), indicando que as células Het-1A produziu um epitélio hiperproliferativa com nenhuma evidência de estratificação normal ou maturação.
No entanto, o modelo tem sidomodificada com êxito para incorporar as células tumorais pela substituição de células epiteliais primárias ou com adenocarcinoma esofágico (OE33) ou carcinoma escamoso (OE21) células. Isto demonstra a flexibilidade do modelo, permitindo a sua utilização na investigação de uma gama de distúrbios esofágicos em diferentes fases da progressão através da inclusão de um número de diferentes linhagens de células. Pode ver-se que há uma diferença acentuada nas respostas a partir destas duas linhas celulares. OE21 células de carcinoma escamoso produz um epitélio visível na construção como uma região definida amarelo (Figura 4A) com grandes fendas dentro do epitélio (Figura 4B), susceptíveis de reflectir moléculas de adesão celular disfuncionais. Incluindo células de adenocarcinoma OE33 dentro do modelo resulta numa grande quantidade de degradação do andaime, visível a olho nu como um adelgaçamento do andaime após 2 semanas de crescimento na interface ar / líquido (Figura 4C) e confirmado em análises de 'H + E comouma redução óbvia na espessura do andaime na região abaixo das células (Figura 4D). Este é um provável ser um resultado de uma interacção entre as células de tumor e fibroblastos, uma vez que a degeneração de andaime não é observado na ausência de fibroblastos (Figuras 4E e 4F). Temos observado impactos semelhantes na invasão do tumor na presença e ausência de fibroblastos em modelos de melanoma 21 equivalentes.
Figura 1: Diagrama esquemático que mostra a produção do modelo a mucosa esofágica fibroblastos humanos são semeados esofágicas sobre a superfície da submucosa do andaime e cultivadas durante 7 dias.. O andaime é invertido, células epiteliais humanas esofágicas adicionado e cultivadas submersas durante 4 dias. A construção é levantada para uma interface ar-líquido para entre 10 e 20 days. Ao final do experimento, a construção pode sofrer uma análise mais aprofundada, conforme necessário. Por favor clique aqui para ver uma versão ampliada da figura.
Figura 2: Comparação do epitélio produzida em modelo esofágica com H + E análise de (A) esofágica epitélio humano normal e (B) epitélio esofágico formado no modelo da mucosa esofágica humano normal esofágica epitélio humano.. Barra de escala é de 500 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão ampliada da figura.
Figura 4: A inclusão de linhas de células tumorais dentroo modelo esofágica. As células epiteliais primárias foram substituídos pela linha de células de carcinoma epidermóide, OE21, ou a linha de células de adenocarcinoma, OE33. Imagens mostram a construção com as células OE21 (A) ou as células OE33 quer em conjunto com (C) ou na ausência de fibroblastos (E), antes da fixação no final do período de cultura. O epitélio incluindo o OE21 (B) ou células OE33 com (D) ou sem (F) fibroblastos são visualizados por coloração com H + E. Barra de escala é de 500 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão ampliada da figura.
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Discussion
Este manuscrito descreve a produção e caracterização de um modelo biologicamente relevante da mucosa esofágica humana adequada para utilização como uma plataforma experimental para estudar o impacto da exposição a factores de stress ambientais sobre o epitélio esofágico.
Os passos mais críticos para o sucesso da produção de um modelo da mucosa esofágica humano são: assegurando que a maior parte das células epiteliais permanecem proliferativa e não ter já começado a diferenciar antes de semear-los sobre o andaime; a manutenção de uma interface ar-líquido para o composto para assegurar a correcta maturação do epitélio; manter a esterilidade durante todo o período de cultura prolongada.
Devido às quantidades limitadas de tecido humano disponíveis para o isolamento de células que geralmente não é possível obter células suficientes a partir de uma única amostra de tecido para semear as células isoladas de fresco directamente sobre o andaime e, consequentemente, um pH de expansão celularase é necessário que as células são crescidas em condições padrão de cultura de células em 2D. É importante assegurar que as células permanecem proliferativa durante este período. Isto é conseguido por assegurar que as culturas não são permitidas para a confluência total, utilizando células do modelo apenas até à passagem 4 e monitorizar cuidadosamente a morfologia das células. Assim, as células devem manter a sua distinta morfologia poligonal proliferativa eo apertado "paralelepípedos" pavimento-como a aparência característica de células epiteliais proliferativas, em vez de a aparência mais difuso observado em culturas que começaram a se diferenciar. O segundo passo essencial é controlado assegurando que o meio de cultura celular cobre a superfície superior das grelhas de aço inoxidável usado para levantar as culturas para a interface ar-líquido, mas a superfície mais elevada da construção em si não é submerso. O terceiro passo é dependente de adesão estrita ao protocolo de esterilização estendida ao produzir o de-celularizadoandaime porcina e o uso de uma boa técnica estéril durante todo o processo.
Nossos resultados mostram que as células do esôfago humanos primários são necessários para produzir um maduro, epitélio normal, estratificada. Se foi utilizada uma linha celular imortalizada, embora derivado do epitélio esofágico humano, as células permaneceram proliferativa e não se diferenciou para formar um epitélio estratificado maduro. O epitélio resultante não pode ser utilizado como um modelo satisfatório para o epitélio normal, demonstrando a inadequação da linha celular imortalizada Het-1A para o uso no modelo. No entanto outras linhas celulares tais como as derivadas de tumores esofágicos ou metaplasia de Barrett podem ser incorporados no modelo, quer em lugar de ou em adição às células epiteliais primárias para produzir modelos para o estudo de progressão tumoral, invasão e a resposta a agentes farmacológicos.
As experiências podem ser realizadas utilizando o modelo esofágica a simulate a exposição do esôfago para eventos discretos, pulsátil durante a deglutição ou refluxo. Isto é conseguido através da submersão repetidamente as construções em meio de cultura contendo o composto (s) a ser testada e a lavagem em PBS, antes de retornar para a construção de uma interface ar-líquido. Os tempos de exposição e frequência pode ser modificada de modo a reflectir o processo ser simulado, assegurando que a camada epitelial é exposta ao factor ambiental (s) ao mesmo tempo permitindo a cultura prosseguir a uma interface ar-líquido. Este método tem sido utilizado no nosso laboratório para investigar o impacto de refluxo no esôfago epitélio normal, em que o modelo foi exposto a componentes específicos de refluxo gastro-esofágico, durante 10 minutos, duas vezes por dia durante 11 dias 11. Em alternativa, as construções podem ser expostos a níveis contínuos de factores de stress ambientais, incluindo esses compostos no meio de cultura. No entanto, uma vez que o epitélio deve ser exposto a uma interface ar-líquido para o Epítetoslium para amadurecer e diferenciar adequadamente 7, não é possível para submergir as construções continuamente no meio de cultura. Por conseguinte, a exposição ao estressor será apenas através da superfície da submucosa nestas experiências, o que pode limitar a relevância dos resultados obtidos.
A técnica é relativamente trabalhoso e, por conseguinte, é mais adequada para o rastreio de um número relativamente limitado de compostos. Como resultado, quando se utiliza o modelo como uma plataforma experimental, é conveniente em primeiro lugar efectuar estudos preliminares usando técnicas convencionais de cultura de células para identificar um número limitado de condições antes de prosseguir a análise utilizando o modelo mais fisiologicamente relevante esofágica aqui descrito 11. Além de análise imunohistoquímica também foi possível examinar as mudanças no perfil de expressão gênica epitelial após a exposição a estressores ambientais. Isto foi conseguido por stripping manualmente afastado o epithelium, extrair o RNA e convertê-lo para ADNc para isolar os genes a ser expressos e análise por microarranjo para se obter a expressão do gene 11 de perfis. Desta forma, tem sido possível aumentar a informação disponível a partir do modelo como uma plataforma experimental. As alterações precoces no perfil de expressão de genes epiteliais seguintes exposição simulada a refluxo gastro-esofágico têm sido propostos e a partir destes resultados novas áreas têm sido sugeridos para uma investigação mais aprofundada na prevenção do desenvolvimento de metaplasia de Barrett, o precursor metaplásico a 11 ACO. O modelo também poderia ser utilizado para estudar a expressão da proteína usando métodos tais como análise de Western blot 15 e a expressão do gene por meio de análise de mancha de Northern 16. Além disso os estudos de moléculas de sinalização extracelulares pode ser realizada no meio de cultura 17.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Estamos gratos ao Sr. Roger Ackroyd, o Sr. Andrew Wyman eo Sr. Chris Stoddard, Consultor Cirurgiões no Sheffield Teaching Hospitals NHS Foundation Trust, por sua ajuda na aquisição de amostras de tecido do esôfago e seu apoio de nosso trabalho. Agradecemos Ashraful Haque por sua ajuda incorporando linhas de células tumorais no modelo. Estamos gratos pela assistência financeira para este estudo por concessões do Bardhan Pesquisa e Ensino Trust (BRET) e Yorkshire Cancer Research (YCR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | BD Biosciences | 215240 | Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilize. Warm in 37 °C water bath before use. |
| DMEM | Labtech | LM-D1112 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F12 | Labtech | LM-H1236 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Foetal Calf Serum | Labtech | FB-1090 | |
| Epidermal Growth Factor | R+D Systems | 236-EG-200 | Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS |
| Hydorcortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2767 | Prepare 10 mg/ml solution in 0.01 M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilize before use |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | Prepare stock solution in water |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Brand name Fungizone |
| PBS | Oxoid | BR0014 | Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilize |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| Povidone-iodine solution | Ecolab | 10830E | Brand name Videne |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| Newborn calf serum | Gibco | 26010074 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use use |
| O-phosphorylethanolamine | Sigma-Aldrich | P0503 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Lonza | 17-838Z | Used for composite media preparation |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA 0.02% solution | Sigma-Aldrich | E8008 | Warm in 37 °C water bath before use |
| T75 culture flask | VWR | 734-2313 | |
| 50 ml centrifuge tube | Fisher | 11819650 | |
| 15 ml universal tube | SLS | SLS7504 | |
| 180 ml pot | VWR | 216-2603 | |
| Petri dish | SLS | 150350 | |
| 6 well plate | VWR | 734-2323 | |
| stainless steel rings | Manufactured in house - medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm | ||
| steel mesh grids | Manufactured in house - sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2 cm (w) x 2 cm (d) x 0.5 cm (h) | ||
| ki67 | Novocastra | KI67-MM1-L-CE | Clone MM1. Use at 1:100. |
| CK4 | Abcam | ab9004 | Clone 6B10. Use at 1:200. |
| CK14 | Novocastra | LL002-L-CE | Clone LL002. Use at 1:200. |
| Involucrin | Novocastra | INV | Clone SY5. Use at 1:100. |
| OE21 | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| OE33 | Sigma-Aldrich | 96070808 | |
| Het-1A | ATCC-LGC | CRL-2692 | |
| Mouse 3T3 fibroblasts | ATCC-LGC | CRL-1658 | previously growth arrested by irradiation (60 Gy) |
References
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