Summary
Detta manuskript beskriver framställning, karakterisering och potentiella användningsområdena för en vävnadsteknisk 3D matstrupen konstruktion framställd från normal primära humana matstrupen fibroblaster och skiv epitelceller seedade i en de-cellularized svin schavotten. Resultaten visar bildningen av en mogen stratifierat epitel liknande det normala mänskliga matstrupen.
Abstract
Förekomsten av både esofagusadenokarcinom och dess föregångare, Barretts Metaplasi, stiger snabbt i västvärlden. Vidare esofagusadenokarcinom har i allmänhet en dålig prognos, med liten förbättring i överlevnaden under senare år. Dessa är svåra förhållanden för att studera och det har varit brist på lämpliga experimentella plattformar för att undersöka sjukdomar i esofagus slemhinnan.
En modell av det mänskliga matstrupen slemhinnan har utvecklats i MacNeil laboratorium som, till skillnad från konventionella 2D cellodlingssystem, rekapitulerar cell-cell- och cell-matrix interaktioner närvarande in vivo och ger en mogen, stratifierat epitel som liknar den hos normala humana matstrupen. I korthet utnyttjar modellen icke-transforme normala primära humana matstrupen fibroblaster och epitelceller odlade i en svin härrörande acellulära matstrupen schavotten. Immunohistokemisk karakterisering av denna modellav CK4, CK14, Ki67 och involukrin färgning visar lämplig rekapitulation av histologi av den normala mänskliga esofagus slemhinna.
Denna modell ger en robust, biologiskt relevanta experimentell modell av det mänskliga esofagus slemhinnan. Det kan lätt manipuleras för att utreda ett antal forskningsfrågor, inklusive effekten av farmakologiska medel och effekterna av exponering för miljöfaktorer såsom alkohol, toxiner, hög temperatur eller mag-esofagus refluxate komponenter. Modellen underlättar också längre odlingsperioder som inte kan uppnås med konventionell 2D cellodling, som gör det möjligt, bland annat studier av effekterna av upprepad exponering av en mogen epitel till agenten av intresse för upp till 20 dagar. Vidare är en mängd olika cellinjer, såsom sådana härledda från esofageala tumörer eller Barretts Metaplasi, kan införlivas i modellen för att undersöka processer såsom tumörinvasion och drog responsiveness på ett mer biologiskt relevant miljö.
Introduction
Esofagus slemhinnan innefattar en skiktad, skivepitel ovanför ett skikt av bindväv, lamina propria, och är en av de första platserna att stöta intagna miljöpåverkande faktorer. Exponering för kost gifter är inblandad i utvecklingen av esofagus skivepitelcancer cancer, medan duodenogastro reflux är en kritisk faktor i patogenesen av Barretts Metaplasi, vilket är förenat med ökad risk för progression till esofagusadenokarcinom. Esofagus carcinom är de 8: e vanligaste maligna tumören i brittiska män och esofagusadenokarcinom ökar snabbt i västvärlden 1. Dessutom har det varit liten förbättring i sjukdomsprognos, med en total 5-års överlevnad på cirka 15%. Följaktligen finns det ett behov av experimentella plattformar för att undersöka effekterna av exponering för miljöpåverkande faktorer på denna matstrupen epitel och deras potentiella inblandning i development av metaplasi eller neoplasi.
Även odödliga eller tumörcellinjer tillåta forskare att studera svaret från epitelceller till dessa faktorer in vitro, förblir de proliferativa och misslyckas med att differentiera till de mogna epitelceller som finns på de översta skikten i esofagus slemhinnan. Dessutom kan cellinjer som redan har genomgått tumorigenes ger endast begränsad information om de första svaren från normala celler i epitelet till miljöfaktorer; och detta är det skede när potentialen för terapeutisk intervention kan vara högst. Slutligen, konventionella cellodlingssystem inte fånga de potentiellt viktiga samspelet mellan epiteliala och mesenkymala celler och mellan dessa celler och den omgivande matris som förekommer i vävnader in vivo.
Djurmodeller ger en mer realistisk mikromiljö för att studera svaren från esofagus epithelium och kan införliva den konstgjorda induktion av gastroesofageal refluxsjukdom 2. Men det kan vara svårare att manipulera miljöpåverkande faktorer i dessa modeller och de kan inte helt representativ för svar inom den mänskliga matstrupen.
Andra experimentella mänskliga matstrupen modeller har utvecklats som utnyttjar primära celler, odödliggjorda celler eller tumörcellinjer på en kollagen, eller kombinerad kollagen / Matrigel, byggnadsställning som innehåller fibroblaster 3,4. Det är mindre arbetskrävande att skapa dessa ställningar än acellulära matstrupen ställningen som beskrivs i detta manuskript, och dessa organotypiska modeller ger ett användbart verktyg, särskilt i studier av tumörinvasion 5,6, där tumörcellinfiltration i kollagengelen kan vara lätt observerats. Men dessa kollagengeler har främmande mekaniska egenskaper och saknar vissa funktioner i den ursprungliga vävnaden, inklusive en specifik basalmembranet och appropriate yttopografi. Detta kan påverka beteendet hos celler som resulterar i, till exempel, sämre vidhäftning mellan epitel och ställningen när du använder en kollagengel byggnadsställning 7. Som en följd det acellulära porcint esofageal scaffold utvecklades, med fördelen av att vara en mer biologiskt realistisk byggnadsställning och således mer lämpligt för användning som en experimentell plattform. Det har också visat sig att det är bättre att inkorporera primära celler in i esofagus konstruktionerna än immortaliserade esofagus epitelcellinjer, såsom Het-1A, eftersom dessa celler bildar en flerskiktad epitel men misslyckas med att skikta eller differentiera 4,7,8 .
Följaktligen har detta protokoll anpassats från en metod som redan används i MacNeil laboratorium för framställning av vävnadsteknisk huden och munslemhinnan 9,10 och innehåller en de-cellularized svin matstrupen byggnadsställning i kombination med primära humana esofagus epitelceller och fibroblaster. This-protokollet ger en mogen, stratifierat epitel, liknande den för den normala humana esofagus vilket framgår av CK4, CK14, Ki67 och involukrin färgning. Den resulterande modellen ger en experimentell plattform för att studera reaktioner på miljöfaktorer, och har använts på ett effektivt sätt för att undersöka förändringar i genuttryck i matstrupen epitel som svar på refluxate komponenter 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mänskliga esofagus celler erhålls från patienter som genomgår gastric eller matstrupen operation. Informerat samtycke erhålls för den vävnad som skall användas för forskningsändamål, och vävnaden används anonymt under lämpliga etiska godkännanden (SSREC 165/03, mänskliga forsknings Tissue Bank licens 12179).
1. Isolering av Human Esophageal epitelceller
- Att arbeta i ett laminärt flöde vävnadsodling huva och med användning av steril teknik, förbereda epiteliala odlingsmediet genom blandning Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) och Hams F12 i en 3: 1-förhållande (vol: vol). Lägg 10% (volym / volym) FCS, 10 ng / ml epidermal tillväxtfaktor, 0,4 | ig / ml hydrokortison, 1,8 x 10 -4 M adenin, 5 | j, g / ml insulin, 5 | ig / ml transferrin, 2 x 10 -7 M trijodtyronin, 1 x 10 -10 M koleratoxin, 2 x 10 -3 M glutamin, 100 lU / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin och 0,625 | ig / ml amfotericin B.
- Med användning av standardsterila tekniker, satte 11 ml DMEM, 10% FCS, 2 x 10 -3 M L-glutamin, 100 lU / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin och 0,625 | ig / ml amfotericin B i en T75-vävnadsodlingskolv. Lägg ett x 10 6 letalt bestrålade mus 3T3-fibroblaster 12 i 1 ml av samma medium och inkubera över natten vid 37 ° C i en 5% CO2, fuktig atmosfär. Detta kommer att producera ett matarskikt för efterföljande odling av epitelceller.
- Med hjälp av en skalpell och följa rekommendationerna från en histopathologist, dissekera en ca 2 cm 2 vävnadsprov från den sjukdomsfria bakgrund regionen esofagus skivepitelcancer slemhinna som erhållits från patienter som genomgår gastric eller matstrupen operation. Transport till laboratoriet i en 50 ml behållare av sterilt transportmedium (PBS 100 lU / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin och 0,625 | ig / ml amfotericin B) vid rumstemperatur.
- Vid denna punkt, lagra vävnaden i transportmedium för upp till 12 timmar (över natten) vid 4 ° C, för enkelhets skull; Men använd inte längre lagringstider som de resulterar i minskad cellviabilitet.
- Att arbeta i ett laminärt flöde vävnadsodling huva och med användning av steril teknik, sterilisera ett skalpellblad genom blötläggning i 70% etanol under 5 minuter. Skölj i steril PBS.
- Placera vävnaden i en steril petriskål och använda skalpell för att skära den i 0,5 cm remsor. Tillsätt 5 ml av 0,1% (vikt / volym) trypsin i PBS till petriskålen, placera locket på skålen och inkubera i 1 timme vid 37 ° C.
- Tillsätt 5 ml FCS till vävnaden i petriskålen för att hämma trypsinet. Håll remsan av vävnaden med steril pincett, försiktigt skrapa epitelytan med skalpellblad för 1-2 min per remsa för att avlägsna de epitelceller i det omgivande mediet. Ta bort skrapade vävnaden och ställ åt sidan. Upprepa processen för alla vävnadsremsor.
- Samla mediet innehållande de lösgjorda epitel-celler i ett 15 ml centrifugröroch centrifugera (5 min, 200 x g). Häll av vätskan och suspendera pelleten i 12 ml epitel medium (beskrivet i steg 1.1).
- Häll av och kassera mediet från matarcellskikt i T75-flaska framställd i steg 1,2. Använd en steril pipett för att lägga cellsuspensionen innehållande de nyligen isolerade epitelceller till kolven och inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2, fuktig atmosfär.
- Efter 24 timmar häll bort och kassera odlingsmedium, som också kommer att innehålla cellrester, och ersätt med 12 ml färskt epitel medium. Fortsätt inkubation vid 37 ° C i en 5% CO2, fuktig atmosfär. Kolonier kommer att börja synas under de kommande 24 till 48 timmar och kan ses genom att placera odlingskolv under ett standardljusmikroskop. Häll av det förbrukade odlingsmediet och ersätta med en lika stor volym av färskt medium var 2 till 3 dagar.
- När kolven har nått 80% konfluens, passagen cellerna 13. Split calnar i ett förhållande av 1: 5 för att öka cellantal för användning i modellen. Följ steg 1,2 för att fastställa matarskikt av bestrålade 3T3-celler i varje flaska som kommer att få epitelceller 24 timmar före passage cellerna.
Obs: Använd epitelceller i esofagus modell som beskrivs nedan mellan kanalerna 1 och endast 4.
2. Isolering av mänskliga Esophageal fibroblaster
- Att arbeta i ett laminärt flöde skåp och med steril teknik, ta vävnaden som avsatts i steg 1.7. Placera i en steril petriskål och färs fint genom att hugga med ett sterilt skalpellblad. Tillsätt 10 ml 0,5% (vikt / volym) kollagenas En lösning och placera locket på petriskål och inkubera vid 37 ° C över natten i en 5% CO2, fuktig atmosfär.
- Överför digere till en 15 ml centrifugrör och centrifugera (10 min, 200 x g), häll försiktigt av och kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 10 ml fibroblast-odlingsmedium (DMEM 10% FCS, 2 x 10 -3 M L-glutamin, 100 lU / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin och 0,625 | ig / ml amfotericin B).
- Placera suspension i en T75-flaska och inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2, fuktig atmosfär. Efter 24 timmar häll bort mediet, som kommer att innehålla skräp och ersätt med 12 ml färskt fibroblast medium. Byt odlingsmediet var 2 till 3 dagar och passageceller när de har nått 80% konfluens 13, dela upp cellerna i en 1: 5-förhållande för att öka cellantalet.
Obs: Använd fibroblastceller i den modell som beskrivs nedan mellan kanalerna 4 och bara 10.
3. Beredning av De-cellularized Esophageal Ställning
- Skaffa intakt porcint esophagi på ett slakteri från nyslaktade lantrassvin som används för livsmedelsproduktion. En enda matstrupen skall ge tillräckliga ställningar för cirka 30 separata konstruktioner.
OBS: På grund av den omfattande och tids consuming sterilisering protokoll krävs, är det normalt värt att erhålla och bearbeta minst 10 esophagi på en gång. - Placera omedelbart nyligen utskuren matstrupen till en 180 ml steril kruka innehållande ungefär 150 ml av 10% povidon-jod-lösning för 5 min för att minska eventuell kontaminerande mikrobiella belastningen. Överför matstrupen till en andra kruka innehållande ungefär 100 ml av steril PBS innehållande 200 lU / ml penicillin, 200 | ig / ml streptomycin och 1,25 | ig / ml amfotericin B.
- Sätt tillbaka locket på behållaren och transportera esophagi tillbaka till laboratoriet vid rumstemperatur. Två eller tre esophagi kan transporteras i varje behållare, beroende på deras storlek.
- Väl framme vid laboratoriet, hantera vävnad i en huv med laminärt flöde med användning av aseptisk teknik för att minimera mikrobiell kontamination. Sterilisera pincetter, saxar och skalpellblad genom blötläggning under 5 min i 70% etanol, och sköljning i steril PBS.
- Hantera esophagus användning av sterila pincetter. Med hjälp av sax, klippa öppen matstrupen längdled. Skölj vävnaden genom att placera matstrupen till en 180 ml steril kruka innehållande ungefär 100 ml av steril PBS och skaka försiktigt för att ta bort eventuellt skräp.
- Rengör en kork dissektion styrelse genom att spraya frikostigt med 70% etanol och låt torka.
- Ta matstrupen från PBS, och användning av sterila nålar, stift ut matstrupen på styrelsen, slemhinneytan uppåt. Ta tag i slemhinneytan i ena änden av matstrupen med sterila pincett och dra bort från brädet. Detta kommer att skilja slemhinnan från underliggande submucosan.
- Använd sedan en steril skalpell blad att dissekera matstrupen longitudinellt längs lamina propria, avlägsna stiften som dissektionen fortskrider för att möjliggöra en slemhinna som skall lyftas bort.
- Behåll dissekerade slemhinnan och kasta den underliggande submucosan.
- Skär bort och kasta de proximala och distala 2 cm than Mucosa eftersom det finns ett större antal submukosala körtlar och en tjockare lamina propria i dessa områden, respektive 7.
- Använd en skalpell för att skära återstående vävnad i 5 cm 2. Placera alla snittet vävnaden i en 180 ml steril potten innehåller ca 150 ml steril PBS och skaka försiktigt för att skölja vävnaden. Om bearbetning av mer än fem esophagi på en gång kan det vara nödvändigt att använda flera krukor för detta och de tre efterföljande steg.
- Med användning av sterila pincetter, överföra den avskurna vävnaden i en 180 ml kruka innehållande 150 ml steril 1 M NaCl, 200 lU / ml penicillin, 200 | ig / ml streptomycin och 1,25 | ig / ml amfotericin B. Inkubera under 72 h vid 37 ° C.
- Placera vävnaden i en ny 180 ml potten innehåller 150 ml steril PBS. Epitelet kommer att ha börjat att tydligt skilja från den underliggande vävnaden. Dra försiktigt det loss epitel från gris matstrupen med hjälp av steril pincett och kasta.
- Placera återstående tfrågan i en ny 180 ml kastrull och tillsätt 150 ml steril PBS. Skaka försiktigt under 5 minuter för att tvätta. Häll av PBS och upprepa ytterligare två gånger med färsk PBS.
- Placera alla vävnaden i en 500 ml glasflaska innehållande 400 ml av steril 80% (volym / volym) glycerol-lösning under 24 h vid rumstemperatur. Överför till 400 ml steril 90% (volym / volym) glycerollösning under ytterligare 24 timmar.
- Lagra i 400 ml steril 100% glycerollösning vid rumstemperatur under minst 4 månader att dehydratisera och sterilisera vävnad samtidigt som integriteten av basalmembranet.
4. Produktion av Kultur Media
- Förbered kelaterat serum från nyfödd kalv för användning i odlingsmediet.
- Häll 100 g av Chelex 100 i ett glas 1 L flaska och tillsätt avjoniserat vatten. Den exakta volymen är inte kritisk men tillräckligt med vatten måste tillsättas för att täcka Chelex pulvret. Lägg till en magnetisk omrörare och sterilisera i autoklav (121 ° C för15 min).
- Låt flaskan svalna och Chelex sedimentera. I ett skåp med laminärt flöde häll bort överflödigt vatten, tillsätt 500 ml serum från nyfödd kalv (NCS) och låt stå under omröring över natten vid 4 ° C.
- Sluta röra och låt Chelex att lösa detta kan ta upp till 30 minuter. I ett laminärt flöde skåp dekantera kelaterat serum med hjälp av en steril pipett noga med att inte störa Chelex, och förvara i 10 ml alikvoter vid -20 ° C.
- Förbered tre olika media i ett laminärt flöde skåp, som inleds med pro-proliferativ och slutar med pro-differentiativa formuleringar.
- Förbered Komposit Medium I består av DMEM och Hams F12 i en 3: 1-förhållande (vol: vol), 4 x 10 -3 M L-glutamin, 0,5 g / ml hydrokortison, 1 x 10 -4 M O -phosphorylethanolamine, 2 x 10 -12 M trijodtyronin, 1,8 x 10 -4 M adenin, 1,88 x 10 -3 M CaCl 2, 4 x 10 -12 M progesteron, 10 | ig / ml iSulin, 10 | ig / ml transferrin, 10 ng / ml selen, en x 10 -3 M etanolamin och 0,1% (volym / volym) kelaterat NCS.
- Förbered Komposit Medium II såsom Composite Medium I med undantag ersätta kelaterat serum med 0,1% (volym / volym) icke-kelaterad NCS.
- Förbered Composite Medium III Composite Medium II utom utelämna progesteron och öka serum till 2% (v / v) icke-kelaterad NCS.
5. Produktion av Human Esophageal Mucosa Modell
- Utför allt arbete i ett dragskåp med laminärt flöde, med användning av aseptisk teknik för att upprätthålla en steril miljö. Sterilisera alla verktyg genom blötläggning i 70% etanol under 5 minuter, före sköljning i steril PBS.
- Dagen innan det krävs, rehydrera acellulära svin matstrupen schavotten. En bit av byggnadsställning erfordras för varje konstruktion som skall framställas.
- För att rehydrera vävnads ställa tillräckliga delar av svin ställningen i en pott som innehåller 100 ml steril PBS, agitera och blöt i 10 minuter. Decant PBS och ersätta med färsk PBS. Upprepa tvättprocessen fem gånger för att säkerställa avlägsnande av alla glycerol spår.
- Testa ställningen sterilitet genom att inkubera den rehydratiserade vävnaden över natten i 100 ml DMEM vid 37 ° C. Om det inte finns någon förändring av färg eller grumlighet hos odlingsmediet vid slutet av inkubationsperioden ställningen antas vara sterila. När sterilitet har bekräftats, placera 5 cm 2 acellulärt byggnadsställning till en 6 brunnar, submukös sidan uppåt.
- Placera en steril medicinsk rostfritt stål ringen (inre diameter 10 mm, yttre diameter 20 mm) på mitten av varje byggnadsställning och tryck försiktigt nedåt med steril pincett, för att säkerställa en adekvat tätning med vävnaden.
- Skörda fibroblaster med användning av trypsin-EDTA-13 för att framställa en cellsuspension. Räkna celler med en hemocytometer 14. Centrifugera cellsuspensionen (10 min, 200 x g). Resuspendera cellpelleten i en appropriate volym av fibroblast-medium för att ge en slutlig cellantal av 2,5 x 10 6 celler per ml.
- Lägg 0,2 ml fibroblast-medium, innehållande 5 x 10 5 mänskliga matstrupen fibroblaster, inom varje ring. Svämma området runt utsidan av ringen med ca 2 ml fibroblast-medium. Inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2, fuktig atmosfär.
- Efter 24 timmar bort ringar och fibroblast-medium och tillsätt minst 5 ml färskt fibroblast medium till varje brunn, se till att ställningen är helt nedsänkt i medium. Kultur för en vecka, vid 37 ° C i en 5% CO2, fuktig atmosfär ersätta mediet var 2 till 3 dagar.
- Efter 1 vecka bort 6 brunnsplattor innehållande ställningar till ett laminärt översvämning huva, avlägsna mediet och vänd varje klätterställning med hjälp av steril pincett, placera slemhinneytan överst. Denna tidpunkt betecknas som dag 0.
- Placera stålringar på slemhinneytan i centrum avvävnaden som i steg 5.4.
- Förbered T75-kolvar av epitelceller för trypsinization 13. Efter PBS-tvättar och före tillsatsen av trypsin-EDTA-lösning, tillsätt 2 ml steril 0,02% (vikt / volym) EDTA-lösning till varje kolv. Inkubera under 2 minuter vid 37 ° C. Tryck kolven försiktigt för att selektivt ta bort i3T3 matarskikt medan epitelcellerna bifogas.
Obs: Det är i allmänhet inte praktiskt eller nödvändigt att patienten matcha epitelceller till fibroblaster som redan ingår i modellen föregående vecka. - Häll av EDTA-lösning innehållande matarskikt och till trypsin-EDTA-lösning för att skörda epitelcellerna 13. Räkna celler med en hemocytometer 14. Centrifugera cellsuspensionen (10 min, 200 x g). Resuspendera cellpelleten i en lämplig volym av Composite Medium 1 för framställning av en slutlig cellantal av 5 x 10 6 celler per ml.
- Lägg 0,2 ml Composite Medium I, innehållande 1 x 10 6 epitelceller, i ringen. Svämma området runt utsidan av ringen med ca 2 ml av komposit Medium I och placera konstruktionerna in i inkubator vid 37 ° C i en 5% CO2, fuktig atmosfär.
- Efter 24 timmar (dag 1) ta bort ringarna och medium och lägga till minst 5 ml färskt Composite Medium I, säkerställa stöden är helt under vatten och återgå till inkubatorn. Efter ytterligare 24 timmar (dag 2) avlägsna mediet och ersattes med minst 5 ml Composite Medium II, vilket ger garanterat stöden är helt under vatten och återgå till inkubatorn.
- På dag 4 plats steril medicinsk rostfritt stål mesh galler (2 cm breda x 2 cm långa x 0,5 cm hög), till färska 6 brunnsplattor, en per konstruktion. Använd sterila pincett för att överföra konstruktionerna på toppen av den galler stål, mukosal ytan överst.
- Tillsätt tillräckligt med Komposit Medium III så att vätskan når undersidan av kompositen, men ytan ärutsätts för luft, säkerställer detta att provet hålles vid en luft-vätske-gränssnittet. Den exakta volym medium som krävs kommer att variera beroende på tjockleken hos ställningen, volymen av brunnen och den exakta höjden av gallret av rostfritt stål.
- Bibehåll komposit vid en luft-vätske-gränssnittet under mellan 10 och 20 dagar (dag 14 till dag 24), beroende på kraven av experimentet. Byt Composite Medium III med färskt medium var 2 till 3 dagar (måndag, onsdag, fredag är ett användarvänligt regim).
Obs: Efter fem dagar på en luft-vätske-gränssnitt (Dag 9) konstruktionerna har en tillräckligt mogen matstrupen epitel som skall användas i experiment av effekterna av miljöfaktorer på matstrupen epitel. - Vid slutet av försöket, fastställa konstruktioner för histologisk analys och immunhistokemisk färgning 7, eller extraktprotein 15 eller RNA 11,16 från epitel för ytterligare analysär. Om så erfordras, behålla den konditionerade odlingsmedium för analys av extracellulära signalmolekyler 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta manuskript beskriver den process som krävs, visas i schematisk form i fig 1, att odla 3D-modeller av human esofagus epitel framgångsrikt. För att bekräfta lämpligheten av modellen som en experimentplattform histologiska och immunhistokemiska studier har gjorts att jämföra de odlade vävnader med normal human esofagus skivepitelcancer slemhinna.
Histologisk bedömning av epitelet som produceras genom metoden beskriven visar en mogen, flera lager, skiktat skivepitel (figur 2B) som är jämförbar med den som observerades med den normala humana esofagus (figur 2A), låt vara tunnare (5 till 10 skikt av celler jämfört med 10 till 20 för normal esofagus), med cellerna blir allt flackare och slutligen anuclear då de migrerar mot ytan.
Immunohistokemisk karakterisering av viktiga markörer för spridning och differentiation visar att mikroanatomi av modell epitelet liknar den normala humana esofagus epitel. Jämförbar Ki67 uttryck observeras i både den nativa matstrupen och modellen epitel, med färgning begränsad till en underuppsättning av celler i de basala och omedelbart suprabasala skikt (figurerna 3A och 3B). Detta är analogt med studier som rapporterar att mindre än 10% av cellerna visar i allmänhet expressionen av proliferationen markör, Ki67, i det normala esofageal epitelet 18. CK4 uttrycks normalt i stratifierat och kolonn epitel, men är i allmänhet frånvarande från basalskikten medan CK14 är bara positivt i basalskiktet 19. I både normala och modell esofagus epitel, är CK14 observerats i alla celler i basalskiktet (figurerna 3D och 3E) medan CK4 observeras hela epitelet med undantag för de två mest basala skikt (figurerna 3G och
Försök att ersätta de primära esofagus epitelceller med odödliga esofagus epitelceller, såsom Het-1A, var mindre lyckad och gav inte en giltig modell av den normala matstrupen epitel. En flerskiktad epitel bildades; men den proliferativa markör Ki67 upptäcktes under epitelet (Figur 3C) med inget uttryck detekterades för alla markörer för differentiering (figurerna 3F, 3i och 3L), vilket tyder på att de Het-1A celler producerade en hyperproliferativ epitel utan tecken på normal skiktning eller mognad.
Emellertid har modellen varitframgångsrikt modifierad för att införliva tumörceller genom att ersätta primära epitelceller med antingen esofagusadenokarcinom (OE33) eller skivepitelcancer cancer (OE21) celler. Detta visar flexibiliteten i modellen, så att dess användning i att undersöka en rad matstrupen störningar i olika stadier av utveckling genom att införa ett antal olika cellinjer. Det framgår att det finns en tydlig skillnad i svaren från dessa två cellinjer. OE21 skvamös karcinomceller alstrar en epitel synlig på konstruktionen som en definierad gula området (figur 4A) med stora klyftor inom epitelet (Figur 4B), som sannolikt kommer att återspegla dysfunktionella celladhesionsmolekyler. Inklusive OE33 adenokarcinomceller inom modellen resulterar i en stor mängd byggnadsställnings nedbrytning, synliga genom ögat som en förtunning av ställningen efter två veckors tillväxt vid luft / vätskegränsytan (figur 4C) och bekräftades i H + E-analys såsomen uppenbar minskning av tjockleken av byggnadsställningen i området under cellerna (Figur 4D). Detta är en trolig att vara ett resultat av en växelverkan mellan tumörceller och fibroblaster, eftersom ställningen degenerering inte observeras i frånvaro av fibroblaster (fig 4E och 4F). Vi har observerat liknande effekter på tumörinvasion i närvaro och frånvaro av fibroblaster i motsvarande melanommodeller 21.
Figur 1: Schematiskt diagram som visar produktionen av den esofageala slemhinnan modellen Human esofagus fibroblaster sås på submukosala ytan av byggnadsställningen och odlades under 7 dagar.. Ställningen är inverterad, humana esofagus epitelceller sattes och odlades under vatten i 4 dagar. Konstruktet höjes till en luft-vätske-gränssnittet under mellan 10 och 20 days. Vid slutet av experimentet kan konstruktionen genomgå ytterligare analys som krävs. Klicka här för att se en större version av bilden.
Figur 2: Jämförelse av epitel produceras i matstrupen modell med normal mänsklig matstrupen epitel H + E analys av (A) normalt humant esofagus epitel och (B) matstrupen epitel bildas i modellen av människans esofagus slemhinnan.. Skala bar är 500 pm. Klicka här för att se en större version av bilden.
Figur 4: Införandet av tumörcellinjer inomesofagus modellen. De primära epitelceller ersattes med skvamösa karcinom cellinjen, OE21 eller adenokarcinomcellinje, OE33. Bilderna visar konstruktionen med OE21-celler (A) eller OE33-celler antingen i samband med (C) eller i frånvaro av fibroblaster (E), före fastställande vid slutet av odlingsperioden. Epitelet inklusive OE21 (B) eller OE33-celler med (D) eller utan fibroblaster (F) kan göras synliga genom H + E-färgning. Skala bar är 500 pm. Klicka här för att se en större version av bilden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta manuskript beskriver produktion och karaktärisering av en biologiskt relevanta humana matstrupen mucosal modell som lämpar sig för användning som en experimentell plattform för att studera effekterna av exponering för miljöpåverkande faktorer på matstrupen epitel.
De mest kritiska stegen för en framgångsrik produktion av en mänsklig matstrupen mucosal modellen: att se till att majoriteten av de epitelceller förblir proliferativ och inte redan har börjat differentiera före sådd dem på schavotten, upprätthålla en luft-vätske-gränssnittet för komposit att säkerställa korrekt mognad av epitel; bibehålla sterilitet hela den förlängda odlingsperioden.
På grund av de begränsade mängder mänsklig vävnad som cellisolering är det i allmänhet inte möjligt att erhålla tillräckligt många celler från en enda vävnadsprov till utsäde nyisolerade celler direkt på ställningen och följaktligen en cellexpansion phASE krävs där cellerna odlas i standard 2D cellodlingsbetingelser. Det är viktigt att se till att cellerna förblir proliferativ under denna period. Detta uppnås genom att säkerställa att kulturerna aldrig tillåts nå full konfluens med användning av cellerna i modellen endast upp till passage 4 och noga övervaka cellmorfologin. Således celler bör behålla sin distinkta proliferativa polygonal morfologi och tight "kullersten" trottoar-liknande utseende egenskap av proliferativa epitelceller snarare än mer diffus utseende observerades i kulturer som har börjat differentiera. Det andra kritiska steget styrs genom att säkerställa att cellodlingsmediet täcker den övre ytan av gallren av rostfritt stål som används för att lyfta kulturerna till luft-vätskegränsytan men den översta ytan av konstruktionen i sig är inte nedsänkt. Det tredje steget är beroende av strikt följsamhet till den förlängda steriliseringsprotokoll vid framställning av de-cellularizedsvin ställningen och användning av god sterilteknik genom hela processen.
Våra resultat visar att primära humana esofagus celler krävs för att producera en normal, mogen, stratifierat epitel. Om en odödlig cellinje användes, om än från människo esofagus epitel, förblev cellerna proliferativ och misslyckats med att differentiera för att bilda en mogen stratifierat epitel. Den erhållna epitel kunde inte användas som en tillfredsställande modell för normalt epitel, vilket visar olämplighet av den immortaliserade cellinjen Het-1A för användning i modellen. Emellertid kan andra cellinjer såsom de som härrör från esofageala tumörer eller Barretts Metaplasi kan införlivas i modellen antingen i stället för eller förutom de primära epitelceller att producera modeller för studier av tumörprogression, invasion och svar på farmakologiska medel.
Experiment kan genomföras med användning esofagus modell för att simulate exponeringen av matstrupen till diskret, pulserande händelser under svälja eller reflux. Detta uppnås genom att upprepade gånger sänka ned konstrukten i odlingsmedium innehållande förening (ar) som skall testas och sköljning i PBS innan de återvänder konstruktionen till en luft-vätske-gränssnittet. De exponeringstider och tidsintervall kan modifieras för att återspegla den process som simuleras, vilket säkerställer att den epiteliala skiktet exponeras för miljöfaktor (er) samtidigt som odlingen fortsätta vid en luft-vätske-gränssnittet. Denna metod har använts i vårt laboratorium för att undersöka effekterna av reflux på den normala matstrupen epitel, där modellen utsattes för specifika gastroesofageal reflux komponenter i 10 minuter två gånger om dagen i 11 dagar 11. Alternativt konstruktionerna kan utsättas för kontinuerliga nivåer av miljöpåverkande faktorer genom att inkludera dessa föreningar i odlingsmediet. Eftersom epitel måste exponeras för en luft-vätske-gränssnittet för epithelium att mogna och differentiera korrekt 7, är det inte möjligt att kontinuerligt dränka konstrukten i odlingsmediet. Följaktligen kommer exponering för stressfaktorn enbart ske via det submukösa ytan i dessa experiment, vilket kan begränsa relevansen av erhållna resultat.
Tekniken är relativt arbetskrävande och därmed är bättre lämpad för screening av relativt begränsat antal föreningar. Som ett resultat, är det när du använder modellen som en experimentplattform lämpligt att först utföra förstudier användning av konventionella cellodlingsteknik för att identifiera ett begränsat antal villkor innan ytterligare analys med hjälp av mer fysiologiskt relevant matstrupen modell som beskrivs här 11. Förutom immunohistokemisk analys har det också varit möjligt att undersöka förändringar i epitel genuttryck profil efter exponering för miljöpåverkande faktorer. Detta uppnåddes genom att manuellt strippa bort epithelium, att utvinna RNA och omvandla den till cDNA isolera generna uttrycks och analysera genom microarray att erhålla genuttryck profiler 11. På detta sätt har det varit möjligt att öka den tillgängliga informationen från modellen som en experimentell plattform. Tidiga förändringar i epitel genuttryck profil efter simulerad exponering för gastroesofageal reflux har föreslagits och från dessa resultat nya områden har föreslagits för ytterligare utredning för att förhindra utvecklingen av Barretts Metaplasi, den metaplastisk gångaren till OAC 11. Modellen kan också användas för att studera proteinuttryck med användning av metoder såsom Western blot-analys 15 och genuttryck med användning av Northern blot-analys 16. Dessutom studier av extracellulära signalmolekyler skulle kunna utföras på odlingsmediet 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot Roger Ackroyd, Andrew Wyman och Chris Stoddard, konsult Kirurg Sheffield universitetssjukhus NHS Foundation Trust, för deras hjälp med att skaffa esofagus vävnadsprover och sitt stöd för vårt arbete. Vi tackar Ashraful Haque för hans hjälp som innehåller tumörcellinjer i modellen. Vi erkänner tacksamt finansiellt stöd för denna studie med bidrag från Bardhan Forskning och utbildning Trust (BRET) och Yorkshire cancerforskning (YCR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | BD Biosciences | 215240 | Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilize. Warm in 37 °C water bath before use. |
| DMEM | Labtech | LM-D1112 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F12 | Labtech | LM-H1236 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Foetal Calf Serum | Labtech | FB-1090 | |
| Epidermal Growth Factor | R+D Systems | 236-EG-200 | Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS |
| Hydorcortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2767 | Prepare 10 mg/ml solution in 0.01 M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilize before use |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | Prepare stock solution in water |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Brand name Fungizone |
| PBS | Oxoid | BR0014 | Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilize |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| Povidone-iodine solution | Ecolab | 10830E | Brand name Videne |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| Newborn calf serum | Gibco | 26010074 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use use |
| O-phosphorylethanolamine | Sigma-Aldrich | P0503 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Lonza | 17-838Z | Used for composite media preparation |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA 0.02% solution | Sigma-Aldrich | E8008 | Warm in 37 °C water bath before use |
| T75 culture flask | VWR | 734-2313 | |
| 50 ml centrifuge tube | Fisher | 11819650 | |
| 15 ml universal tube | SLS | SLS7504 | |
| 180 ml pot | VWR | 216-2603 | |
| Petri dish | SLS | 150350 | |
| 6 well plate | VWR | 734-2323 | |
| stainless steel rings | Manufactured in house - medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm | ||
| steel mesh grids | Manufactured in house - sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2 cm (w) x 2 cm (d) x 0.5 cm (h) | ||
| ki67 | Novocastra | KI67-MM1-L-CE | Clone MM1. Use at 1:100. |
| CK4 | Abcam | ab9004 | Clone 6B10. Use at 1:200. |
| CK14 | Novocastra | LL002-L-CE | Clone LL002. Use at 1:200. |
| Involucrin | Novocastra | INV | Clone SY5. Use at 1:100. |
| OE21 | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| OE33 | Sigma-Aldrich | 96070808 | |
| Het-1A | ATCC-LGC | CRL-2692 | |
| Mouse 3T3 fibroblasts | ATCC-LGC | CRL-1658 | previously growth arrested by irradiation (60 Gy) |
References
- Pera, M., Manterola, C., Vidal, O., Grande, L. Epidemiology of esophageal adenocarcinoma. J. Surg. Oncol. 92 (3), 151-159 (2005).
- Manea, G. S., Lupusoru, C., Caruntu, I. D. Experimental study on the effect of bile, and bile and hydrochloric acid mixture on the esophageal mucosa. Rom. J. Morphol. Embryol. 50 (1), 61-66 (2009).
- Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 278 (3), 1824-1830 (2003).
- Underwood, T. J., et al. A comparison of primary oesophageal squamous epithelial cells with HET-1A in organotypic culture. Biol. Cell. 102 (12), 635-644 (2010).
- Nystrom, M. L., et al. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J. Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Okawa, T., et al. The functional interplay between EGFR overexpression, hTERT activation, and p53 mutation in esophageal epithelial cells with activation of stromal fibroblasts induces tumor development, invasion, and differentiation. Genes & Development. 21 (21), 2788-2803 (2007).
- Green, N., et al. The development and characterization of an organotypic tissue-engineered human esophageal mucosal model. Tissue Eng Part A. 16 (3), 1053-1064 (2010).
- Harada, H., et al. Telomerase induces immortalization of human esophageal keratinocytes without p16INK4a inactivation. Mol. Cancer Res. 1 (10), 729-738 (2003).
- Bhargava, S., Chapple, C. R., Bullock, A. J., Layton, C., MacNeil, S. Tissue-engineered buccal mucosa for substitution urethroplasty. BJU. Int. 93 (6), 807-811 (2004).
- Ralston, D. R., et al. Keratinocytes contract human dermal extracellular matrix and reduce soluble fibronectin production by fibroblasts in a skin composite model. Br. J. Plast. Surg. 50 (6), 408-415 (1997).
- Green, N. H., et al. Pulsatile exposure to simulated reflux leads to changes in gene expression in a 3D model of oesophageal mucosa. Int. J. Exp. Pathol. 95 (3), 216-228 (2014).
- Wang, C. S., et al. Selective culture of epithelial cells from primary breast carcinomas using irradiated 3T3 cells as feeder layer. Pathol. Res. Pract. 197 (3), 175-181 (2001).
- Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. J. Vis. Exp. (16), e755 (2008).
- Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2014).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N. Am. J. Med. Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat. Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Morgan, E., et al. Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clin. Immunol. 110 (3), 252-266 (2004).
- Xu, M., et al. The abnormal expression of retinoic acid receptor-beta, p 53 and Ki67 protein in normal, premalignant and malignant esophageal tissues. World J. Gastroenterol. 8 (2), 200-202 (2002).
- Moll, R., Divo, M., Langbein, L. The human keratins: biology and pathology. Histochem. Cell Biol. 129 (6), 705-733 (2008).
- Rice, R. H., Green, H. Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions. Cell. 18 (3), 681-694 (1979).
- Eves, P., et al. Melanoma invasion in reconstructed human skin is influenced by skin cells - investigation of the role of proteolytic enzymes. Clin. Exp. Metastasis. 20 (8), 685-700 (2003).
