Summary
Bu yazının üretimi, karakterizasyonu ve normal birincil insan özofagus fibroblast ve de-cellularized domuz iskele içinde ekilmiş skuamöz epitel hücrelerinden hazırlanan bir dokuya işlenmiş 3D özofagus yapı potansiyel kullanımlarını açıklar. Sonuçlar normal insan yemek borusunda benzer olgun tabakalı epitel oluşumunu göstermektedir.
Abstract
özofagus adenokarsinomu ve öncüsü, Barrett metaplazi hem görülme sıklığı, batı dünyasında hızla yükseliyor. Ayrıca özofagus adenokarsinomu genellikle son yıllarda hayatta kalma oranlarında çok az düzelme kötü prognoz vardır. Bunlar incelemek için zor koşullardır ve özofagus mukozasının bozuklukları araştırmak için uygun deneysel platformlarda eksikliği olmuştur.
İnsan yemek borusu mukozasına ait bir model, geleneksel 2D hücre kültür sistemleri farklı olarak, in vivo olarak, bu, hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerini tekrarlar ve normal insan benzer olgun, tabakalı epitel üreten MacNeil laboratuarda geliştirilmiştir Yemek borusu. Kısaca, model porcine'den türetilmiş bir hücresel olmayan yemek borusu iskele içinde yetiştirilen dönüştürülmemiş primer insan fibroblastları özofagus normal ve epitel hücreleri kullanır. Bu modelin immünohistokimyasal karakterizasyonuCK4, CK14, Ki67 tarafından ve involukrini boyama normal insan özofagus mukozasının histoloji uygun recapitulation göstermektedir.
Bu model, insan özofagus mukozasının sağlam, biyolojik ilgili deneysel bir model sunmaktadır. Kolayca farmakolojik ajanların etkinliği ve alkol, toksinler, yüksek sıcaklık veya gastro-özofageal refluxate bileşenleri gibi çevresel faktörlere maruz kalma etkisi de dahil olmak üzere araştırma bir dizi soru araştırmak için manipüle edilebilir. modeli aynı zamanda sağlayan geleneksel 2D hücre kültürü, diğerlerinin yanı sıra ile elde değil genişletilmiş kültür dönemleri kolaylaştırır, en fazla 20 gün süreyle ilgi ajana olgun bir epitel tekrarlanan maruz etkisinin incelenmesi. Ayrıca, bu tür yemek borusu tümörleri veya Barrett 'türetilmiş olanlar gibi hücre çizgileri, çeşitli, tümör invazyonu ve ilaç responsivene gibi süreçleri araştırmak için bir model içine dahil edilebilirBir biyolojik olarak daha uygun bir ortamda ss.
Introduction
Özofagus mukoza bağ dokusu, lamina propria tabakası üzerinde tabakalı, skuamöz epitel içerir ve yutulur çevresel stres karşılaşmaya ilk yerlerden biridir. Duodenogastro reflü özofagus kanserine dönüşme riski ile ilişkili Barrett metaplazi, patogenezinde kritik bir faktör ise beslenme toksinlere maruz kalma, özofagus skuamöz karsinom gelişiminde rol oynar. Özofagus karsinomlar İngiltere erkek ve özofagus adenokarsinomu 8 inci en sık görülen malign tümör hızla Batı dünyasında 1 artmaktadır vardır. Ayrıca,% 15 genel 5 yıllık sağkalım oranı ile hastalık prognozu küçük iyileşme olmamıştır. Sonuç olarak develo Bu özofagus epiteli üzerinde çevresel stres maruz kalma etkisini ve potansiyel katılımı araştırmak için deney platformlar için bir ihtiyaç vardırmetaplazi veya neoplazi pment.
Ölümsüzleştirilmiş veya tümör hücre çizgileri araştırmacılar bu in vitro stres epitel hücrelerinin tepkisini incelemek için izin birlikte, çoğalma kalır ve yemek borusu mukozasına en üst tabakalar bulunan olgun epitelyal hücrelere farklılaşmaları için başarısız. Ayrıca, zaten tümörogenez geçirmiş hücreler hatları çevresel faktörlere epitel içinde normal hücrelerin ilk tepkiler konusunda sadece sınırlı bilgi sağlayabilir; ve bu terapötik müdahale için potansiyel yüksek olabilir aşamasıdır. Son olarak, geleneksel bir hücre kültürü sistemleri epitelyal ve mezenkimal hücreler arasındaki ve in vivo doku içinde meydana bu hücrelerin ve çevredeki matris arasındaki potansiyel olarak önemli etkileşimlerin yakalamak için başarısız olur.
Hayvan modelleri özofagus epitheli tepkilerini incelemek için daha gerçekçi bir mikro sağlamakum ve gastro-özofageal reflü hastalığı 2 yapay indüksiyon dahil edebilirsiniz. Ancak bu modellerde çevre stres işlemek için daha zor olabilir ve onlar tamamen insan yemek borusu içinde yanıt temsil etmeyebilir.
Diğer deney, insan özofagus modelleri kollajen birincil hücreler, ölümsüzleştirilmiş hücreleri ya da tümör hücre hatları kullanan geliştirilmiştir veya kollajen / Matrigel, skafold ihtiva eden fibroblastlar 3,4 kombine edilmiştir. Bu yazıda anlatılan aselüler özofagus iskele yerine bu iskeleleri oluşturmak için daha az emek yoğun olduğunu ve bu organotipik modeller özellikle kollajen jel içine tümör hücre infiltrasyonu kolayca olabilir tümör invazyonu 5,6, çalışmada, yararlı bir araç sağlar gözlenmiştir. Bununla birlikte, bu kolajen jeli yerli olmayan mekanik özelliklere sahip ve belirli bir bazal membran ve appropriat içeren orijinal dokunun belirli özellikleri eksikliğie yüzey topoğrafyası. Bir kollajen jel iskele 7 kullanırken bu, örneğin, epitel ve iskele arasında yoksul yapışma sonuçlanan hücrelerin davranışını etkileyebilir. Sonuç olarak aselüler domuz özofagus iskele daha biyolojik gerçekçi iskele ve deneysel bir platform olarak kullanmak için böylece daha uygun olmanın avantajı ile geliştirilmiştir. Ayrıca, bu hücreler, bir çok-tabakalı epitelyum oluşturmak için, bu tür Het-1A ölümsüzleştirilmiş özofagus epitelyal hücre hatları, daha özofagus yapılarına birincil hücreler dahil, ancak tabakalandırmak veya 4,7,8 ayırt etmek için başarısız daha iyi olduğu gösterilmiştir .
Sonuç olarak, bu protokol daha önce doku mühendisliği deri ve oral mukoza 9,10 yapmak için MacNeil laboratuarda kullanılan bir yöntem ile ilgili uyarlanmıştır ve primer insan yemek borusu epitel hücreleri ve fibroblastlar ile birlikte, bir de-cellularized domuz özofagus iskele içermektedir olmuştur. ThiCK4, CK14, Ki67 ile ve lekeleme involukrini gösterildiği gibi protokolüne normal insan yemek borusunda benzer olgun, tabakalı epitel üretir. Ortaya çıkan model çevresel stres yanıtları incelemek için deneysel bir platform sağlar ve bileşenleri 11 refluxate tepki olarak özofagus epiteli gen ifadesi değişikliklerini araştırmak için etkin olarak kullanılmaktadır edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan özofagus hücreleri mide veya yemek borusu ameliyatı geçiren hastaların elde edilir. Doku araştırma amaçlı kullanılmak üzere Aydınlatılmış onam elde edilir ve doku uygun etik onayları (SSREC 165/03, İnsan Kaynakları Doku Bankası Lisansı 12.179) kapsamında anonim kullanılır.
İnsan Özofagus Epitel Hücreleri 1. İzolasyon
- : 1 oranında bir laminer akış başlığı içinde doku kültürü çalışan ve steril bir teknik kullanılarak, Dulbecco modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM) ve 3 Ham F12 karıştırılarak epitel kültür ortamı hazırlar (hacim: hacim). % 10 ekleme (hac / hac) FCS, 10 ng / ml, epidermal büyüme faktörü, 0.4 ug / ml hidrokortizon, 1.8 x 10 -4 M adenin, 5 ug / ml insülin, 5 ug / ml transferrin, 2 x 10 7 M triiyodotironin, 1 x 10 -10 M kolera toksin, 2 x 10 3 M glutamin, 100 IU / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, ve 0.625 ug / ml amfoterisin B
- Standardı,steril teknikler, T75 doku kültür şişesi içine 100 ug / ml streptomisin DMEM 11 mL,% 10 FCS, 2 x 10 3 M, L-glutamin, 100 IU / ml penisilin, ve 0.625 ug / ml amfoterisin B koydu. Aynı ortam içinde 1 ml, 1 x 10 6 öldürücü ışınlanmış fare 3T3 fibroblastlar 12 ekleyin ve bir% 5 CO2, nemli ortamda, 37 ° C'de gece boyunca inkübe edilir. Bu epitel hücreleri daha sonra kültür için bir besleyici tabaka üretecektir.
- Bir neşter kullanma ve histopatolog önerileri takip, gastrik veya özofageal cerrahi uygulanan hastalardan elde edilen özofagus skuamöz mukozasının hastalıksız arka plan bölgesinden doku yaklaşık 2 cm 2 numuneyi incelemek. Steril taşıyıcı ortam 50 ml'lik bir kap içinde laboratuara nakliye (PBS, 100 lU / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve 0.625 ug / ml amfoterisin B), oda sıcaklığında karıştırıldı.
- Bu noktada, taşıma doku depolamak4 ° C 'de (gece boyunca) en fazla 12 saat boyunca, orta, kolaylık sağlamak için; Onlar azalmış hücre canlılığı sonucu olarak, ancak daha uzun depolama süreleri kullanmayın.
- Laminer akış doku kültürü kaputu çalışan ve steril bir teknik kullanılarak, 5 dakika boyunca% 70 etanol içinde ıslatılarak bir bisturi bıçağını sterilize edin. Steril PBS ile durulayın.
- Steril bir Petri kabındaki doku yerleştirin ve 0.5 cm'lik şeritler halinde kesmek için neşter kullanabilirsiniz. % 0.1 5 ml Petri kabı PBS içinde tripsin (w / v), çanak kapağı yerleştirmek ve 37 ° C de 1 saat süreyle inkübe edin.
- Tripsin önleme Petri kabındaki dokuya FCS 5 ml. Şerit başına 1-2 dk çevreleyen ortama epitel hücreleri çıkarmak için steril forseps ile doku şeridi Holding, yavaşça neşter bıçağı ile epitel yüzeyi kazıyın. Kazınmış doku çıkarın ve bir kenara koyun. Tüm doku şeritleri için işlemi tekrarlayın.
- 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne ayrılmış epitel hücreleri ihtiva eden ortam toplamakve santrifüj (5 dakika, 200 xg). Süpernatantı dökün ve epitel ortam 12 ml pelet tekrar süspansiyon (adım 1.1 tarif edilmiştir).
- Dökün ve aşama 1.2'de hazırlanan T75 şişesi içinde besleyici hücre katmanından orta atın. % 5 CO2, nemli bir atmosferde 37 ° C'de bir şişeye, taze izole epitel hücreleri ihtiva eden bir hücre süspansiyonu ekleyin ve inkübasyona bir steril pipet kullanın.
- 24 saat sonra dökün ve aynı zamanda hücre artıkları içerir kültür ortamının, atın ve taze epitel ortam 12 ml ile değiştirin. % 5 CO2, nemli bir atmosferde 37 ° C'de inkübe devam edin. Koloniler önümüzdeki 24-48 saat boyunca görünmeye başlayacak ve standart bir ışık mikroskobu altında kültür balon yerleştirerek görülebilir. Geçirilerek kültür ortamı dökün ve taze ortam eşit hacimde her 2-3 gün ile değiştirin.
- Şişe,% 80 confluency, geçit hücreleri 13 ulaştığında. C bölmek1 bir oranda arşın: 5 modeli için hücre sayısını artırmak. Hücreleri Pasajlanması 24 saat önce epitel hücreleri alınacak her şişede ışınlanmış 3T3 hücrelerinin besleyici katmanları kurmak için adım 1.2 izleyin.
Not: geçitler 1 ve sadece 4 arasında aşağıda tarif özofagus modelinde epitel hücreleri kullanın.
İnsan Özofagus Fibroblastları 2. izolasyonu
- Bir laminer akış kabini çalışma ve steril tekniği kullanarak, adım 1.7'de kenara doku alır. Steril bir Petri kabındaki yerleştirin ve steril bir neşter bıçağı ile kesme yoluyla ince kıyma. (Ağırlık / hacim) bir çözeltisi, kollajenaz ve Petri kabı kapağı yerleştirmek ve 5% CO2 nemlendirilmiş bir atmosfer içinde gece boyunca 37 ° C'de inkübe% 0.5, 10 ml ekleyin.
- Dikkatli bir şekilde, 15 ml bir santrifüj tüpüne ve santrifüj (10 dakika, 200 x g) sindirmek transfer dökün ve süpernatan atılır ve fibroblast kültür ortamında (DMEM,% 10 FCS, 10 ml pelletini2 x 10 3 M L-glutamin / ml penisilin, 100 IU, 100 ug / ml streptomisin ve 0.625 ug / ml amfoterisin B).
- T75 şişesi içine süspansiyon yerleştirin ve% 5 CO2, nemli bir atmosferde 37 ° C'de inkübe edin. 24 saat sonra enkaz içeren ve taze fibroblast orta 12 ml yerini alacak ortamı, kapalı dökün. Hücre sayısının artırılması 5 oranında: bir 1 hücreleri bölme,% 80 konfluent 13 ulaştığında kültür ortamı, her 2-3 gün ve geçiş hücreleri değiştirin.
Not: pasajlar 4 ve sadece 10 arasında aşağıda açıklanan modelde fibroblast hücreleri kullanın.
De-cellularized Özofagus iskele 3. hazırlanması
- Gıda üretimi için kullanılan taze kesilmiş Landrace domuzlardan bir mezbahada sağlam domuz yemek borusu edinin. Tek özofagus yaklaşık 30 ayrı yapıları için yeterli iskeleleri sağlayacaktır.
Not: nedeniyle kapsamlı ve zaman coSterilizasyon protokolü gerekli nsuming, bu elde etmek ve tek seferde 10 yemek borusu, en az işlem normalde değer. - Hemen herhangi bir kirletici mikrobiyal yükü azaltmak için 5 dakika için% 10 povidon-iyot solüsyonu yaklaşık 150 ml içeren 180 ml'lik steril bir kap içinde, taze kesilmiş yemek borusu yerleştirin. / Ml streptomisin, 200 lU / ml penisilin, 200 ug ve 1.25 ug / ml amfoterisin B ihtiva eden steril PBS içinde, yaklaşık 100 ml içeren ikinci bir kap için yemek transfer
- Kabın kapağını takın ve oda sıcaklığında geri laboratuara yemek borusu, taşıma. İki ya da üç Bu özofagus-lar büyüklüğüne bağlı olarak, her bir kap içinde taşınabilmektedir.
- Laboratuvarda bir kez, mikrobiyal kontaminasyonu en aza indirmek için aseptik teknik kullanılarak bir laminer akış kaputu doku anlaştım. % 70 etanol içinde 5 dakika için nemlendirici ve steril PBS içinde durulama ile cımbız, makas ve neşterler sterilize edin.
- Es Koluophagus steril cımbız kullanarak. Makas kullanarak, uzunlamasına özofagus açık kesti. Steril PBS yaklaşık 100 ml içeren 180 ml steril pota yemek borusu yerleştirilmesi ve herhangi bir enkaz kaldırmak için hafifçe sallayarak doku durulayın.
- Liberal ile% 70 etanol püskürtülerek bir mantar diseksiyon kurulu temizleyin ve kurumasını bekleyin.
- Yönetim kurulu, mukoza yüzey en üstte üzerine yemek borusu dışarı pin, PBS gelen yemek borusu çıkarın ve steril iğneler kullanılarak. Steril cımbız ile özefagus bir ucunda mukozal yüzeyi kavrayın ve uzak kurulu çekin. Bu altta yatan submukozaya gelen mukozayı ayıracaktır.
- Ardından, diseksiyon mukoza uzak kaldırdı izin vermek ilerledikçe işaretçilerine kaldırarak, lamina propria boyunca uzunlamasına özofagus incelemek için steril bir neşter bıçak kullanın.
- Disseke mukozayı saklayın ve altta yatan submukozayı atın.
- Cut off ve t en yakın ve uzak 2 cm atmaksırasıyla, 7, bu alanda submukozal bezlerin daha fazla sayıda ve daha kalın bir lamina propria olarak orada da mukozayı.
- 5 cm 2 Kalan doku kesmek için bir neşter kullanın. Steril PBS yaklaşık 150 ml içeren bir 180 ml steril pota tüm kesim doku yerleştirin ve doku durulama hafifçe çalkalayın. Aynı anda en fazla beş özofagus-lar, işleme durumunda, bu için birden fazla kap ve takip eden üç adımları kullanmak gerekli olabilir.
- Steril cımbız kullanarak, 37 ° C'de 72 saat süre ile, 150, steril 1 M NaCl ml, 200 IU / ml penisilin, 200 ug / ml streptomisin ve 1.25 ug / ml amfoterisin B inkübe ihtiva eden bir 180 ml kap içine kesilmiş doku aktarın.
- 150 ml steril PBS içeren taze bir 180 ml'lik pota doku yerleştirin. epitel gözle görülür yatan dokudan ayrılması başlamış olacak. Yavaşça domuz yemek borusu ayrılmakta epitel steril forseps kullanarak ve atın soyun.
- Kalan t yerleştirintaze 180 ml'lik pota sorunu ve steril PBS 150 ml ekleyin. 5 dakika yıkama için yavaşça çalkalayın. PBS dökün ve taze PBS ile iki kez daha tekrarlayın.
- Oda sıcaklığında 24 saat süre ile, steril% 80, 400 ml (v / v) gliserol çözeltisi ihtiva eden 500 ml'lik bir cam şişeye tüm doku yerleştirin. Bir 24 saat daha, steril% 90 (h / h) gliserol çözeltisi, 400 ml aktarın.
- Kurutmak ve bazal membran bütünlüğünü korurken doku sterilize etmek için 4 ay, en az oda sıcaklığında steril% 100 gliserol çözeltisi, 400 ml saklayın.
Kültür Medya 4. Üretim
- Kültür ortamı içinde kullanılmak üzere şelat yeni doğmuş buzağı serumu hazırlayın.
- Cam 1 L'lik şişeye Chelex-100 100 g dökün ve deiyonize su ilave edilir. Kesin hacmin kritik öneme sahip değildir, ancak yeterli su Chelex toz kapsayacak şekilde eklenmelidir. Bir manyetik karıştırıcı ekleyin ve otoklavda (121 ° C için sterilize15 dakika).
- Şişe soğumasını bekleyin ve Chelex yerleşmek. Laminer akış kabininde, fazla su dökün yeni doğmuş dana serumu (NCS) ve 500 ml ilave edilir ve 4 ° C'de gece boyunca karışmaya bırakılmaktadır.
- Karıştırma durdurun ve Chelex bu 30 dakika kadar sürebilir, yerleşmek için izin verir. Laminer akış kabini içinde -20 ° C'de 10 mi alikotlar içinde Chelex ve mağaza bozmamaya özen göstererek, steril bir pipet kullanarak şelatlı serum süzün.
- Pro-proliferatif ile başlayarak ve pro-farklılaştırma formülasyonlar ile biten bir düzgün akış kabininde üç farklı ortam hazırlar.
- 1 oranında (hac: hac), 4 x 10 3 M L-glutamin, 0.5 ug / ml hidrokortizon, 1 x 10 -4 M O -phosphorylethanolamine, 2 x Bileşik orta hazırlayın bir 3 DMEM ve Hams F12 oluşan 10 -12 M triiyodotironin, 1.8 x 10 -4 M adenin, 1.88 x 10 3 M CaCl2, 4 x 10 -12 M progesteron, 10 ug / mlSulin, 10 ug / ml transferrin, 10 ng / ml selenyum, 1 x 10 3 M etanolamin ve% 0.1 (v / v) ile şelatlanmış NCS.
- % 0.1 (h / h) olmayan şelatlı NCS ile şelat serumu değiştirmek dışında bileşik ortamı I, burada tanımlanan kompozit Orta II hazırlayın.
- % 2 (hac / hac) olmayan şelatlı NCS Omit progesteron ve artış serum haricinde bileşik Orta II olarak Bileşik III orta hazırlayın.
İnsan Özofagus Mukoza Modelinin 5. Üretim
- Steril bir ortam sağlamak için aseptik teknik kullanılarak, bir laminer akış kaputu tüm çalışmaları gerçekleştirin. Steril PBS içinde yıkamadan önce, 5 dakika boyunca% 70 etanol içinde ıslatarak tüm araçları sterilize edin.
- Gerekirse bir gün önce, aselüler domuz özofagus iskele rehydrate. Her yapı hazırlanacak iskele tek parça gereklidir.
- Steril PBS 100 ml içeren bir pota domuz iskele doku yeri yeterli parçaları rehydrate, ajite ve 10 dakika bekletin. DecaPBS nt ve taze PBS ile değiştirin. Tüm gliserol izlerinin kaldırılmasını sağlamak için yıkama işlemini beş kez tekrarlayın.
- 37 ° C'de gece boyunca 100 ml DMEM içinde tekrar ıslatılabilir dokuyu inkübe etme ile iskele sterilite edin. Skafold, steril olduğu varsayılır inkübasyon döneminin sonunda, kültür ortamının rengi ya da bulanıklık ile herhangi bir değişiklik olursa. Sterilite onaylandıktan sonra, üstte bir 6 yuvalı plaka içine submukozal tarafı 5 cm2 hücresel olmayan iskele yerleştirin.
- Her iskele merkezi üzerine steril tıbbi sınıf paslanmaz çelik yüzük (iç çapı 10 mm, dış çapı 20 mm) yerleştirin ve yavaşça doku ile yeterli bir sızdırmazlık sağlamak için, steril forseps kullanarak bastırın.
- Bir hücre süspansiyonu üretmek için tripsin-EDTA kullanılarak 13 fibroblastlar Hasat. Bir hemositometre 14 kullanarak hücreleri sayın. Hücre süspansiyonu (10 dakika, 200 x g) santrifüj. Bir ÖDENEK içine hücre pelletinifibroblast ortamının te hacmi, ml başına 2.5 x 10 6 hücre bir son hücre sayısını üretir.
- Her bir halka içinde 5 x 10 5, insan yemek borusu fibroblastlar içeren fibroblast ortamının 0.2 ml, ekleyin. Fibroblast ortamının yaklaşık 2 ml halkanın dış çevresini boyayın. % 5 CO2, nemli bir atmosferde 37 ° C'de inkübe edilir.
- 24 saat sonra halkalar ve fibroblast orta kaldırmak ve skafold tamamen ortamına daldırılır sağlanması, her bir oyuğa taze fibroblast ortamının en az 5 ml ekleyin. % 5 CO2 içinde 37 ° C'de 1 hafta boyunca kültür, orta, her 2-3 gün yerine nemlendirilmiş bir atmosfer.
- 1 hafta sonra üst mukozal yüzeyi yerleştirerek, bir laminer sel kaput iskeleleri içeren 6 kuyu plakaları kaldırmak orta kaldırmak ve steril forseps kullanarak her iskele ters çevirin. Bu zaman noktası, gün 0 olarak adlandırılır.
- Merkezinde mukoza yüzeyi üzerinde çelik halkalar yerleştirinadım 5.4 gibi doku.
- Tripsinizasyonu 13 epitel hücrelerinin T75 balonlarına hazırlayın. PBS yıkama ve önceki tripsin-EDTA çözeltisi ilavesinden sonra, her bir şişeye, steril% 0.02 2 ml (ağırlık / hacim) EDTA çözeltisi ekleyin. 37 ° C'de 2 dakika süreyle inkübe edilir. Ekli epitel hücreleri bırakarak seçici i3T3 besleyici katmanını ayırmak için hafifçe şişeyi hafifçe vurun.
Not: Genellikle zaten önceki hafta modelinde dahil fibroblastlar epitel hücreleri maç hastaya pratik ya da gerekli değildir. - Besleyici katmanını içeren EDTA çözeltisi dökün ve epitel hücreleri 13 hasat tripsin-EDTA çözeltisi ilave edilir. Bir hemositometre 14 kullanarak hücreleri sayın. Hücre süspansiyonu (10 dakika, 200 x g) santrifüj. Ml başına 5 x 10 6 hücre nihai hücre sayımı üretmek üzere Bileşik Orta 1 uygun bir hacmi içine hücre pelletini.
- Içeren, Bileşik ortamı I, burada 0.2 ml ilave 1 x 1Halka içinde 0 6 epitel hücreleri,. Kompozit ortamı I, burada yaklaşık olarak 2 ml halkanın dış çevresini boyayın ve% 5 CO2, nemli bir atmosferde 37 ° C'de inkübatör içine yerleştirmeyi.
- 24 saat (Gün 1) Mesai yüzük ve orta kaldırmak ve taze Kompozit Orta I en az 5 ml ekleyin, iskeleleri tamamen batık sağlanması ve inkübatör dönmek. Daha 24 saat (Gün 2) Mesai orta kaldırmak ve yeniden iskeleleri tamamen batık ve inkübatör dönmek vardır sağlanması, Kompozit Orta II en az 5 ml ile değiştirilir.
- Gününde 4 yerde steril tıbbi sınıf paslanmaz çelik hasır ızgaralar, taze 6 kuyu tabak içine (2 cm uzunluk x 0,5 cm yüksekliğinde genişlik x 2 cm), yapının başına bir. Çelik ızgaralar, mukoza yüzey en üstte üst üzerine yapıları aktarmak için steril bir cımbız kullanın.
- Sıvı kompozit alt ulaşır, ancak yüzey şekilde yeterli Bileşik Orta III eklemehavaya maruz kalan, bu örnek, bir hava-sıvı ara yüzeyinde tutulmasını sağlar. iskele, oyuk hacmi ve paslanmaz çelik ızgara kesin bir yüksekliğe sahip kalınlığına bağlı olarak değişecektir gerekli ortamın tam hacmi.
- Deney gereksinimlerine bağlı olarak, 10 ila 20 gün sonra (gün 24 gün 14) için bir hava-sıvı ara yüzeyindeki kompozit koruyun. Taze ortam ile Kompozit Orta III değiştirin, her 2 ila 3 gün (Pazartesi, Çarşamba, Cuma kullanıcı dostu bir rejimdir).
Not: Bir hava-sıvı arayüzü (Gün 9), 5 gün sonra yapılan, yemek borusu epitelindeki çevre faktörlerinin etkisi deneylerde kullanılmak üzere yeterince olgun yemek borusu epitelindeki sahiptir. - Deneyin sonunda, daha fazla analizi kullanılmıştır için epitelden histolojik analiz ve immunohistokimyasal lekeleme 7 veya ekstrakt proteininin 15 ya da RNA 11,16 için yapıları tamirolduğunu. Gerekirse, hücre-dışı sinyal molekülleri 17 analizi için kıvamlandırılmış kültür ortamı muhafaza eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yazıda başarılı bir şekilde, insan yemek borusu epitelindeki kültürü 3D modellere, Şekil 1 'de şematik bir biçimde gösterilmiştir gerekli işlemi tarif etmektedir. Deneysel bir platform histolojik ve immünohistokimyasal çalışmalar normal insan özofagus skuamöz mukoza ile kültürlü dokuları karşılaştırılarak yapılmıştır gibi modelin uygunluğunu onaylamak için.
Tarif edilen yöntem ile üretilen epitel histolojik olarak değerlendirilmesi, hücre ince (5-10 tabakalar olsa, olgun, çok-tabakalı, çok katlı yassı epitel normal insan özofagus (Şekil 2A) ile gözlenen ile karşılaştırılabilir (Şekil 2B) göstermektedir 10 hücreleri övmek ve onlar yüzeyine doğru göç olarak sonuçta nukleussuz giderek olma ile) Normal yemek borusunda için 20 ile karşılaştırıldığında.
Çoğalması ve di kilit belirteçlerinin immünohistokimyasal karakterizasyonufferentiation modeli epitel mikroanatomisine normal insan yemek borusu epitelindeki benzer olduğunu göstermektedir. Karşılaştırılabilir Ki67 sentezleme bazal içindeki hücrelerin hemen bazal üstü katman (Şekil 3A ve 3B), bir alt-grup ile sınırlı boyama, yerli özofagus ve model epiteli gözlenmektedir. Bu hücrelerin en az% 10, genel olarak normal bir yemek borusu epitelindeki 18, proliferasyon markeri ekspresyonu, Ki67 göstermektedir bildirmektedir çalışmalara benzer. CK4 normalde katmanlı ve sütunlu epitel ifade ama CK14 bazal tabakada 19 sadece olumlu iken genellikle bazal tabakadan yoktur edilir. CK4 iki en bazal tabakalarında haricinde epitel boyunca gözlenen iken, normal ve model özofagus epitel her ikisinde de, CK14 taban katman (Şekil 3D ve 3E) tüm hücrelerde görülmektedir (Şekil 3G ve
Böyle Het-1A ölümsüz özofagus epitel hücreleri, primer özofagus epitel hücreleri yerine girişimleri, daha az başarılı olmuştur ve normal özofagus epiteli geçerli bir modeli üretmek vermedi. Bir çok-tabakalı epitel oluşturulmuştur; Ancak proliferatif işaretleyici Ki67 farklılaşma herhangi belirteçler için tespit hiçbir ifade ile epiteli (Şekil 3C) boyunca tespit edildi (Şekil 3F, 3I ve 3L), Het-1A hücrelerinin normal tabakalaşma veya hiçbir kanıt ile bir hiperproliferatif epitel üretilmiş belirten bu olgunlaşma.
Bununla birlikte, model olmuşturbaşarıyla özofagus adenokarsinomu (OE33) ya da skuamöz hücreli karsinom (OE21) hücreler ya birincil epitel hücrelerinin değiştirilmesi ile tümör hücrelerini birleştirmek için güncellenmiştir. Bu, farklı hücre hatları, bir dizi dahil boyunca ilerlemesinin değişik aşamalarında özofagus bir dizi bozukluğu araştıran kullanımını sağlayarak, modelin esnekliğini göstermektedir. Bu iki hücre çizgilerinden cevapları belirgin bir fark olduğu görülebilir. OE21 skuamöz karsinom hücreleri işlevsel hücre yapışma molekülleri yansıtması muhtemeldir epiteli (Şekil 4B) içindeki büyük yarıklar ile tanımlanmış bir san bir bölge (Şekil 4A) ve yapısının görünür bir epitel üretir. Hava / sıvı arayüzü (Şekil 4C), 2 hafta büyüdükten sonra, skafoldun bir incelmesi gibi gözle görülebilir iskele bozulması büyük bir miktarda, örnek sonuçları içinde OE33 adenokarsinoma hücreleri de dahil olmak üzere H + E analizi teyithücreleri (Şekil 4D) altındaki bölgede iskele kalınlığı belirgin bir azalma sağlar. Skafold dejenerasyonu fibroblastlar (Şekil 4E ve 4F) yokluğunda gözlemlenen değildir, çünkü bu, tümör hücreleri ve fibroblastlar arasındaki bir etkileşimin bir sonucu olduğu bir muhtemeldir. Bu eş melanom modelleri 21 fibroblastların varlığında ve yokluğunda tümör invazyonu benzer etkiler gözlenmiştir.
Şekil 1: yemek borusu mukozasına modelinde üretimini gösteren şematik diyagramı İnsan özofagus fibroblastlar skafoldun submukozal yüzeyi üzerine ekildi ve 7 gün süre ile kültüre edilir.. iskele, ters insan özofagus epitel hücreleri eklendi ve kültürlü 4 gün batık. konstrukt da 10 ila 20 için, bir hava-sıvı arayüzü yükseltilirys. Deney sonunda yapı gerektiği gibi daha fazla analiz geçirebilmektedir. rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. (A) normal insan özofagus epiteli ve insan özofagus mukozasının modelinde oluşturulan (B) özofagus epitelinin normal insan özofagus epiteli H + E analizi ile özofagus modelde üretilen epitel karşılaştırılması. Ölçek çubuğu 500 mikron olduğunu. rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Tümör hücre hatları dahil olanözofagus modeli. birincil epitel hücreleri, skuamöz karsinom hücre çizgisi, OE21 veya adenokarsinoma hücre hattı, OE33 ile ikame edilmiştir. Görüntüler (C) ile birlikte ya da (E) fibroblast yokluğunda, önce, kültür süresinin sonunda sabitlenmesi ya OE21 hücreleri (A) ya da OE33 hücreleri ile yapı göstermektedir. OE21 (B) ya da OE33 hücreleri ile (D) ya da (F) fibroblastlar olmamak üzere epitelyum, H + E boyama ile görselleştirilmektedir. Ölçek çubuğu 500 mikron olduğunu. rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda yemek borusu epitelindeki üzerine, çevresel stres maruz kalma etkisini incelemek için bir deney platform olarak kullanılmak için müsait biyolojik açıdan ilgili insan özofagus mukozal modeli üretimi ve karakterizasyonu açıklanmaktadır.
Bir insan özofagus mukoza modelinin başarılı üretimi için en kritik adımlar vardır: epitel hücrelerinin çoğunluğu proliferatif kalır ve zaten iskele bunları ekim öncesinde ayırt etmek başlamış değil sağlanması; bileşik için bir hava-sıvı arayüz muhafaza epitel doğru olgunlaşmasını sağlamak; uzatılmış kültür periyodu boyunca sterilitesini sürdürme.
Nedeniyle hücre izolasyonu için uygun insan dokusunun sınırlı miktarda doğrudan yapı iskelesi üzerinde ve buna bağlı olarak, bir hücre büyüme pH taze izole edilmiş hücreler tohum tek bir doku numunesini yeterli hücreleri elde etmek için, genel olarak mümkün değildirHücreler, standart 2B hücre kültür koşullarında yetiştirilen burada ase gereklidir. Bu hücreler, bu süre içinde çoğalma kalmasını sağlamak için önemlidir. Bu kültürler, tam konfluent ulaşmasına izin hiçbir zaman sağlayarak, sadece geçit 4'e kadar modelinde hücreleri kullanılarak ve dikkatli bir şekilde hücre morfolojisi izlenerek elde edilir. Böylece hücreler kendi ayırt edici proliferatif çokgen morfoloji ve proliferatif epitel hücreleri yerine ayırt başladı kültürlerde gözlemlenen daha yaygın görünüm sıkı "Arnavut kaldırımı" kaldırım gibi görünüm özelliklerini muhafaza edilmelidir. ikinci kritik aşaması, hücre kültür ortamı hava-sıvı arayüzü aynı zamanda kendisi de su altında değildir yapının en üst yüzeyine kültürleri kaldırmak için kullanılan paslanmaz çelik ızgaralar üst yüzeyini kaplayan sağlanması ile kontrol edilir. de-cellularized üretilirken Üçüncü adım genişletilmiş sterilizasyon protokolüne sıkı sıkıya bağlı kalmanın bağlıdırdomuz iskele ve süreç boyunca iyi steril tekniği kullanılması.
Bizim sonuçlarımız primer insan özofagus hücreleri normal, olgun, tabakalı epitel üretmek için gerekli olduğunu göstermektedir. Ölümsüzleştirilmiş hücre hattı kullanılmış ise, insan yemek borusu epitel türetilmiş olsa hücreler çoğalma kaldı ve olgun bir tabakalı epitel oluşturulması için ayırt etmek için başarısız oldu. Elde edilen epitel modelinde kullanım için ölümsüzleştirilmiş hücre soyu, Het-1A müsait olmama durumunu gösteren normal epitel için tatmin edici bir model olarak kullanılması mümkün değildir. Bununla birlikte bu tür yemek borusu tümörleri veya Barrett 'türetilmiş olanlar gibi diğer hücre çizgileri modele dahil edilebilir ya da, tümör ilerlemesi, invazyon ve farmakolojik maddelere yanıt çalışma için modeller üretmek için bir ya da birincil epitel hücrelerine ek olarak, bir yer.
Deneyler özofagus modeli s kullanılarak yapılabiliryutma veya reflü sırasında, pulsatil olayları ayrık yemek borusunun poz imulate. Bu arka arkaya test edilecek bileşik (ler) ihtiva eden kültür ortamı içinde yapıları daldırılması ve bir hava-sıvı arayüz yapısı dönmeden önce PBS içinde yıkama ile elde edilir. pozlama süreleri ve frekans kültürü bir hava-sıvı arayüzünde devam etmesine izin verirken epitel tabakası, çevresel faktör (ler) maruz sağlanması, simüle edilen işlemi yansıtacak şekilde modifiye edilebilir. Bu yöntem modeli 11 gün 11 günde iki kez 10 dakika süreyle özel bir gastro-özofageal reflü bileşenlerine maruz kalmış, normal özofagus epiteli üzerinde reflü etkisini araştırmak için bizim laboratuvarda kullanılan olmuştur. Alternatif yapılar, kültür ortamında, bu bileşikler de dahil olmak üzere çevresel stres sürekli seviyelerine maruz kalabilir. Bununla birlikte, epitel yana epithe için bir hava-sıvı arayüzü için açık olmalıdırLium olgun ve uygun 7 ayırt etmek için, sürekli olarak bir kültür ortamı içinde yapıları daldırın mümkün değildir. Sonuç olarak, stres maruziyeti, sadece elde edilen sonuçların alaka sınırlayabilir bu deneylerde, submukozal yüzeyi üzerinden olacaktır.
teknik, nispeten emek yoğun ve dolayısıyla bileşiklerin nispeten sınırlı sayıda taranması için daha uygundur. Deneysel platform olarak modeli kullanılarak Sonuç olarak, bu ilk kez burada tarif edilen 11 daha fazla fizyolojik olarak uygun özofagus modeli kullanılarak daha da analiz öncesi koşulları sınırlı sayıda tespit etmek geleneksel bir hücre kültürü teknikleri kullanılarak ön çalışmalar yapmak için uygundur. Immünohistokimyasal analiz Buna ek olarak da, çevresel stres maruz kalma aşağıdaki epitel gen ifadesi profilinde değişiklikleri incelemek mümkün olmuştur. Bu el e ayrılmasından elde edildipithelium, RNA ayıklanması ve cDNA dönüştürerek gen ifadesi 11 profilleri elde etmek için mikroarray tarafından genler ifade ve analiz ediliyor izole etmek. Bu şekilde bir deney platform olarak modelden mevcut bilgileri artırmak mümkün olmuştur. Gastro-özofageal refluksta simüle maruz kaldıktan sonra epitel gen tanımlama profili erken değişiklikler önerilmiştir ve bu sonuçlardan yeni alanlar Barrett metaplazi, OAC 11 metaplastik ön gelişiminin önlenmesinde daha fazla araştırma için önerilmiştir. Model, aynı zamanda Kuzey benek analizi 16 kullanılarak Western blot analizi, 15 ve gen ekspresyonu gibi yöntemler kullanılarak protein ifadesini incelemek için kullanılabilir. Hücre-dışı sinyal molekülleri Ayrıca çalışmalar, kültür ortamında 17 gerçekleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz özofagus doku örnekleri ve işimizin destek kazanmakta yardım ettikleri için, Sayın Roger Ackroyd, Bay Andrew Wyman ve Bay Chris Stoddard, Sheffield Öğretim Hastaneleri NHS Foundation Trust de Danışmanı Cerrahlar müteşekkiriz. Biz modele tümör hücre hatları içeren yaptığı yardım için Ashraful Haque teşekkür ederiz. Biz minnetle Bardhan Araştırma ve Eğitim Vakfı (BRET) ve Yorkshire Kanser Araştırmaları (YCR) hibe tarafından bu çalışma için maddi destek kabul etmiş sayılırsınız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | BD Biosciences | 215240 | Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilize. Warm in 37 °C water bath before use. |
| DMEM | Labtech | LM-D1112 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F12 | Labtech | LM-H1236 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Foetal Calf Serum | Labtech | FB-1090 | |
| Epidermal Growth Factor | R+D Systems | 236-EG-200 | Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS |
| Hydorcortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2767 | Prepare 10 mg/ml solution in 0.01 M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilize before use |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | Prepare stock solution in water |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Brand name Fungizone |
| PBS | Oxoid | BR0014 | Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilize |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| Povidone-iodine solution | Ecolab | 10830E | Brand name Videne |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| Newborn calf serum | Gibco | 26010074 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use use |
| O-phosphorylethanolamine | Sigma-Aldrich | P0503 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Lonza | 17-838Z | Used for composite media preparation |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA 0.02% solution | Sigma-Aldrich | E8008 | Warm in 37 °C water bath before use |
| T75 culture flask | VWR | 734-2313 | |
| 50 ml centrifuge tube | Fisher | 11819650 | |
| 15 ml universal tube | SLS | SLS7504 | |
| 180 ml pot | VWR | 216-2603 | |
| Petri dish | SLS | 150350 | |
| 6 well plate | VWR | 734-2323 | |
| stainless steel rings | Manufactured in house - medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm | ||
| steel mesh grids | Manufactured in house - sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2 cm (w) x 2 cm (d) x 0.5 cm (h) | ||
| ki67 | Novocastra | KI67-MM1-L-CE | Clone MM1. Use at 1:100. |
| CK4 | Abcam | ab9004 | Clone 6B10. Use at 1:200. |
| CK14 | Novocastra | LL002-L-CE | Clone LL002. Use at 1:200. |
| Involucrin | Novocastra | INV | Clone SY5. Use at 1:100. |
| OE21 | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| OE33 | Sigma-Aldrich | 96070808 | |
| Het-1A | ATCC-LGC | CRL-2692 | |
| Mouse 3T3 fibroblasts | ATCC-LGC | CRL-1658 | previously growth arrested by irradiation (60 Gy) |
References
- Pera, M., Manterola, C., Vidal, O., Grande, L. Epidemiology of esophageal adenocarcinoma. J. Surg. Oncol. 92 (3), 151-159 (2005).
- Manea, G. S., Lupusoru, C., Caruntu, I. D. Experimental study on the effect of bile, and bile and hydrochloric acid mixture on the esophageal mucosa. Rom. J. Morphol. Embryol. 50 (1), 61-66 (2009).
- Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 278 (3), 1824-1830 (2003).
- Underwood, T. J., et al. A comparison of primary oesophageal squamous epithelial cells with HET-1A in organotypic culture. Biol. Cell. 102 (12), 635-644 (2010).
- Nystrom, M. L., et al. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J. Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Okawa, T., et al. The functional interplay between EGFR overexpression, hTERT activation, and p53 mutation in esophageal epithelial cells with activation of stromal fibroblasts induces tumor development, invasion, and differentiation. Genes & Development. 21 (21), 2788-2803 (2007).
- Green, N., et al. The development and characterization of an organotypic tissue-engineered human esophageal mucosal model. Tissue Eng Part A. 16 (3), 1053-1064 (2010).
- Harada, H., et al. Telomerase induces immortalization of human esophageal keratinocytes without p16INK4a inactivation. Mol. Cancer Res. 1 (10), 729-738 (2003).
- Bhargava, S., Chapple, C. R., Bullock, A. J., Layton, C., MacNeil, S. Tissue-engineered buccal mucosa for substitution urethroplasty. BJU. Int. 93 (6), 807-811 (2004).
- Ralston, D. R., et al. Keratinocytes contract human dermal extracellular matrix and reduce soluble fibronectin production by fibroblasts in a skin composite model. Br. J. Plast. Surg. 50 (6), 408-415 (1997).
- Green, N. H., et al. Pulsatile exposure to simulated reflux leads to changes in gene expression in a 3D model of oesophageal mucosa. Int. J. Exp. Pathol. 95 (3), 216-228 (2014).
- Wang, C. S., et al. Selective culture of epithelial cells from primary breast carcinomas using irradiated 3T3 cells as feeder layer. Pathol. Res. Pract. 197 (3), 175-181 (2001).
- Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. J. Vis. Exp. (16), e755 (2008).
- Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2014).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N. Am. J. Med. Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat. Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Morgan, E., et al. Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clin. Immunol. 110 (3), 252-266 (2004).
- Xu, M., et al. The abnormal expression of retinoic acid receptor-beta, p 53 and Ki67 protein in normal, premalignant and malignant esophageal tissues. World J. Gastroenterol. 8 (2), 200-202 (2002).
- Moll, R., Divo, M., Langbein, L. The human keratins: biology and pathology. Histochem. Cell Biol. 129 (6), 705-733 (2008).
- Rice, R. H., Green, H. Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions. Cell. 18 (3), 681-694 (1979).
- Eves, P., et al. Melanoma invasion in reconstructed human skin is influenced by skin cells - investigation of the role of proteolytic enzymes. Clin. Exp. Metastasis. 20 (8), 685-700 (2003).
