Introduction
תאי גזע mesenchymal (MSCs) לשחק תפקיד מרכזי ברפואת רגנרטיבית והנדסת רקמות. הם יכולים להגר, להתמיין לסוגי תאים שונים 1 ונקלט, אשר הופך אותם למועמדים אידיאליים עבור טיפולי אוטולוגי 2,3. בזמן האחרון, ניסויים קליניים באמצעות MSCs לתיקון עצם וסחוס, שתל לעומת מחלה מארח או מחלת לב הושקו 4. ניתן לקצור MSCs אלה מרקמת חוט או שומן הטבור אבל תוצאות המבטיחות ביותר התקבלו מתאי גזע שמקורם במח עצם 5.
רכס הכסל מאפשר לאסוף כמות ניכרת של מח עצם ולכן משמש כאתר עיקרי של שאיפה 6. עם זאת, איכות לשאוב יורדת עם עלייה בנפח של מח עצם נסוג. בעוד 5 מיליליטר הראשון של לשאוב מח עצם מכיל תאי גזע באיכות גבוהה, נסיגה של נפחים גדולים יותר מובילה לדילול של לשאוב עם f דם ההיקפיROM עצם כלי הדם מאוד 7. בגלל megakaryocytes וטסיות הדם הנוכחיים, aspirates מח עצם נוטה קרישה, תרופות נגד קרישת דם, אלא אם כן נמצאים בשימוש. אבל אפילו עם תרופות נגד קרישת דם, קרישים עלולים להתרחש.
במח עצם, תאי גזע מייצגים רק חלק קטן מבריכת התא הכוללת 8 וצריכים להיות מורחב בתרבות עבור רוב הנדסת רקמות או יישומים טיפוליים 4. האיכות של תרבות כזו תלויה במידה רבה בברכת התא הראשונית, כלומר., גיוון ומוצא גבוה מספר 9. מספרים נמוכים של תאי גזע מנסיגות יכולים להיות מוסברים בחלקו על ידי השתנות תורם. מצד השני, MSCs מדגימות באיכות נמוכות דורש זמן רב יותר בתרבות ובpassaging הוארך להגיע למספר הרצוי של תאים. בכל מקרה, passaging המורחב הוא מקור להזדקנות תא ויכול להוביל לאובדן של בידול פוטנציאל 10. לכן, מותאם פרוטוקולים שיכולים למקסם y תאIELD ולמנוע מהשפעות מזיקות צריכה להיות מפותחות 11,12.
כשהתחלנו לעבוד עם MSCs כלבים, שהיינו נדהמתי לראות שעל שלושה בארבע דגימות מח עצם כלבי קרישים, ואילו דגימות קורשים למרבה המזל אדם (אחד מכל עשר) היו שכיחות פחות. מצד השני זה לא היה מפתיע, שנצפינו תשואות נמוכות בהרבה של תאי גזע מדגימות שנקרשו. כדי לפתור את הבעיה החוזרת של דגימות קורשים, שפיתחנו הפרוטוקול באמצעות האוריקינאז תרופת thrombolytic במקום דגימה מחדש.
טיפולים הטרומבוליטיות יכולים לנטרל מצבי מסכני חיים כגון חסימה של כלי דם גורמים התקף לב, שבץ או תסחיפים בגלל קרישה לא רצויה. הם עובדים על ידי פירוק של קרישים דרך מחשוף האנזימטית של הפיברין על ידי מפעילי פלסמין ופלסמינוגן האנזימטית. למרות השימוש הרחב לטיפול בחולים, רק מעט מאוד פרסומים קיימים שפעילות thrombolytic מנוצלתעבור יישומי מעבדה כדי להציל דגימות קורשות, בעיקר מתמקד לימפוציטים. בשינה 1987, Niku et al. תיארתי את השימוש בstreptokinase להמסת קרישי דם וכתוצאה מכך לימפוציטים תפקודיים 13 וארבע שנים מאוחר יותר, De Vis et al. הרחיב את השימוש בstreptokinase לבודד תאי סרטן דם מהדם ומח עצם עבור יישומי הזרימה cytometric 14. פרסום האחרון יותר מצביע על השימוש בAlteplase לאבחון הסרטן 15. תוך שימוש באותה הגישה האנזימטית, הפרוטוקול שלנו מתמקד בבידוד של מח עצם צורת multipotent MSCs לספק כלי לחוקרים בתחום תאי גזע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: aspirates מח עצם אנושי מפסגת הכסל נאסף ממתורמים באישור ועדת האתיקה של לוצרן. aspirates מח עצם לכלבים מפסגת הכסל נאסף עם consent.Human של בעל כלב (כ. 20 מיליליטר) וכלבים (כ. 10 מיליליטר) aspirates מח עצם היו אנטי-קרוש על ידי תוספת של 15 מיליליטר של 3.8% נתרן ציטרט מייד לאחר נסיגה בחדר הניתוח. הדגימות הועברו לסביבת המעבדה לעיבוד באותו היום כמו נסוג.
1. הכנת האוריקינאז (לפני 1 st שימוש)
- מחדש האוריקינאז באמצעות תמיסת מלח סטרילית פוספט (PBS) על פי הוראות היצרן: הוסף 10 מיליליטר PBS לבקבוק המחיצה-כניסה באמצעות מזרק 10 מיליליטר. להמס את החומר היבש על ידי מתערבל להשיג 50,000 יחידות הזרקה (U) לכל מיליליטר.
- הכן 500 aliquots μl (25,000 U כל אחת) ליםצינורות terile. חנות aliquots -20 ° C ולהשתמש בו בעת צורך במשך לפחות 6 חודשים.
2. שלבי הכנה של (לפני כל מח עצם טיפול)
- להפשיר aliquot של האוריקינאז אחד (25,000 U) ללשאוב מח עצם קורש (כרכים לשאוב עד 25 מיליליטר טופלו בהצלחה באמצעות aliquot יחיד של 25,000 U).
- מחממים מים באמבטיה או רועד חממה עד 37 מעלות צלזיוס.
3. אנזימתי Digest של קריש
- לבצע את כל העבודה בממשלת זרימה למינרית בטיחות ביולוגית כדי למנוע זיהום חיידקים של דגימות מח העצם במהלך עיבוד. כאשר עובדים עם חומר אנושי שעלולים להיות מדבק, השימוש בכפפות מגן, כמו גם טיפול זהיר מומלצת.
- מניחים מסננת 100 מיקרומטר תא על גבי שפופרת 50 מיליליטר סטרילי. יוצקים בזהירות את לשאוב מח עצם דרך מסננת התא, הטיה המסננת או מסתובב חומר הקריש. השתמש טיפ pipet סטרילי לזרימה טובה יותר באמצעות רשת המסנן.
הערה: הימנע מכל דילול של הקריש, למשל, על ידי שטיפת הקריש עם PBS. האוריקינאז פועל באופן עקיף ודורש מרכיבי הסרום (כלומר., פלסמינוגן) מהביופסיה לתקציר יעיל. תוך המשך התהליך עם חומר הקריש, התסנין יכול להיות כל הזמן בRT עד לשימוש נוסף בשלב 3.6. - להעביר את חומר קריש מח עצם לתוך צלחת תרבית תאים ריקה באמצעות מלקחיים סטרילית. חותך את הפסולת לחתיכות קטנות של כ 2 מ"מ 3 באמצעות אזמל סטרילי.
- העבר את החתיכות הקטנות של הקריש לתוך צינור תגובה 50 מיליליטר באמצעות המלקחיים סטרילית. ודא שיש לו את הקריש הטחון מראה רטוב. אם זה נראה יבש, להשתמש בחלק מהתסנין מהצעד 3.1 כדי ללחלח.
- Triturate הקריש על ידי pipetting למעלה ולמטה במשך 5 פעמים באמצעות pipet microtiter 5 מיליליטר. להוסיף aliquot 1 של האוריקינאז למדגם. דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס או באמבט מים או בחממה רועדת (בעדינות).
- Triturate ידי pipetting מעלה ומטה במשך 5 פעמים באמצעות pipet 5 מיליליטר. לבצע שלב זה בקבינט בטיחות ביולוגי. דגירה של 30 דקות נוספות על 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, triturate שוב 5 פעמים באמצעות pipet 5 מיליליטר. לעבור על מסננת תא 100 מיקרומטר טרי לברכה עם התסנין משלב 3.2.
- צנטריפוגה ההשעיה התא בטמפרטורת הסביבה של 10 דקות ב 500 x גרם. בטל supernatant. להשעות מחדש את התא גלולה בתקשורת כמפורט להלן או בהתאם לנוהל הסטנדרטי של המעבדה שלך לתרבות הרחבת MSC.
4. מתזמן תרבות תאי הרחבה וצלחות CFU
- Resuspend התאים (בהיקף של אריתרוציטים ותאי mononuclear) ב 50 מיליליטר של מדיום בסיסי: Alpha-ממ בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS), 100 U / ml פניצילין, 100 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין ו -2.5 מ"ג / מיליליטר amphotericin B . ספירת התאים 01:10 מדוללים בפתרון Trypan הכחול באמצעות chambe נויבאוארr.
- צלחת התאים בצלוחיות תרבית תאים בצפיפות של 5 x 10 7 תאים / 2 סנטימטר ודגירה בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס. אם זמין, להשתמש חוסר חמצן תנאים (5% חמצן). לשליטה assay CFU, צלחת 10 9 תאים בצלחת תרבית תאים של 10 סנטימטרים קוטר.
- לאחר 3 ימים של תרבות, תאי גזע mesenchymal מחוברים לצלחת תרבית תאים בזמן שתאים אחרים יישארו בהשעיה. לשנות את התקשורת עם מדיום בסיסי בתוספת 5 ng / ml גורם בסיסי צמיחת פיברובלסטים (bFGF). לשליטה assay CFU, טיפול בצלחת תרבית התאים באופן דומה.
- תמשיך תרבית תאים עבור הסכום כולל של 2 שבועות, החלפת מדיה שלוש פעמים בשבוע. אם תאים יעלו על 80% confluency, לפצל על ידי trypsinization. לשליטה assay CFU, להחליף את התקשורת באופן דומה, אך לא לפצל את התאים לקורס של השבועות.
5. Giemsa כתם לAssay CFU
- הכן 10 מיליליטר של Giemsa-פתרון לכל צלחת: דילאוטה פתרון המניות (7.6 גר '/ ליטר Giemsa בגליצרול: מתנול) 1:10 ב מים סטריליים (תמיד להכין דילול עבודה טרי).
- הסר את המדיה מצלחת תרבית תאים ולשטוף את התאים עם PBS. להיות מאוד precautious בעת החלת נוזל לצלחת פטרי ולהימנע משטיפה מהתאים.
- תקן תאים במתנול הטהור במשך 5 דקות בRT. מחק את מתנול. הוסף את Giemsa-הפתרון ודגירה של 60 דקות בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס.
- לשטוף פעמיים עם PBS. אוויר יבש ראש הצלחת ראשון על מגבת נייר. ספירת המושבות באופן ידני. זו מושגת הטובה ביותר באמצעות עט סימון על גביו של הצלחת.
6. בידול MSC
- בידול MSCs כלבים
הערה: MSCs כלבים הובדל לchondrogenic, osteogenic ושושלות adipogenic על ידי גירוי עם המדיה המתאימה לארבעה שבועות. - ל בידול Adipogenic, MSCs התרבות בmonolayer ב 4 x 10 5 ceLLS / 2 סנטימטר לסירוגין שני תנאי תרבות שונים כדלקמן;
- תרבות בתקשורת תחזוקת adipogenesis מכילה DMEM + Glutamax, FBS 3%, 100 יחידות / מיליליטר פניצילין, 100 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין, 2.5 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin B ו -170 מ"מ אינסולין.
- תרבות בתקשורת גרימת adipogenesis עם מדיום תחזוקה בתוספת FBS 3%, 5% בסרום ארנבת, dexamethasone 1 מיקרומטר, 500 מיקרומטר 3-isobutyl-1-methylxanthine, 33 מיקרומטר ביוטין, 5 מיקרומטר rosiglitazone ו -17 מיקרומטר pantothenate 16.
- להתענג טיפות שומנים על ידי צביעה עם השמן האדום-O. בקצרה, לתקן תאים עם פורמלדהיד 10%, לשטוף עם PBS ואת הכתם עם O האדום נפט 0.35% בisopropanol.
- לתרבות בידול osteogenic MSCs בmonolayer בשעה 7 x 10 3 תאים / 2 סנטימטר ולעורר בפעולות הבאות:
- מתקדם DMEM (GIBCO) + Glutamax, FBS 5%, 100 יחידות / מיליליטר פניצילין, 100 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין, 2.5 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin B, 501; חומצה אסקורבית L-M 2-פוספט, 10 SS-glycerophosphate מ"מ ו -100 ננומטר dexamethasone.
- זהה את פיקדונות מינרליזציה על ידי כתם פון Kossa (5% אגנו 3). בקצרה, לתקן את התאים עם פורמלדהיד 10%, לשטוף עם PBS ואת כתם עם 5% אגנו 3 במים מזוקקים.
- בידול Chondrogenic
- קוביות Cut (3 מ"מ לכל צד) מהתקן רפואי ספוג בצורה, היוו מאני lyophilized סוג קולגן, ומשמשות כחומר פיגום לתמוך תאים 17.
- MSCs זרע בחלק העליון של הקוביות בריכוז של 4 x 10 6 תאים / מיליליטר (~ 70,000 תאים / קובייה).
- לפני התוספת של תקשורת, לאפשר לתאים לדבוק בקוביות למשך 30 דקות.
- לשמור על מבני MSC-קולגן בתקשורת chondrogenic בהיקף של DMEM / F12 + Glutamax, FBS 2.5%, 100 יחידות / מיליליטר פניצילין, 100 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין, 2.5 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin B, 40 ng / ml dexamethasone, 50 מיקרוגרם / מיליליטר אסקורבית החומצה 2-פוספט,50 מיקרוגרם L-פרולין / מיליליטר, 1x אינסולין-transferrin-סלניום X, ו- 10 ng / ml הפיכת גורם-β1 צמיחה.
- השתמש בכתמי כחולי alcian לדמיין הצטברות של proteoglycans בסעיפי מבנים. בקצרה, להכתים את החלקים O / N עם 0.4% הכחולים alcian מומסים בH 0.01% 2 SO 4 ו0.5m hydrochloride guanidine. בשלב הבא, לשטוף את החלקים נשטפו למשך 30 דקות ב -40% DMSO ו0.05M MgCl 2. תאים היו counterstained עם אדום מהיר גרעיני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
העובדות כי 74% מהדגימות מח עצם כלבים (n = 54) הכילו קרישים כאשר הם הגיעו למעבדה (איור 1 א) זה יחד עם ירידה בתשואות MSC מדגימות אלה, גרמו לנו להאמין שמספר לא מבוטל של MSCs היה לכוד בתוך קרישים . ואכן, DAPI כתם פשוט של חומר קריש מחולק מאשר את הנוכחות של תאי בעלי גרעין בצפיפות גבוהה (איור 1). זה סופו של דבר מוביל למספרים נמוכים של תאי גזע זמינים לתרבות התרחבות, אשר מופעלים עלינו לפתח את הפרוטוקול באמצעות האוריקינאז. בדרך כלל קרישים נעלמים כמעט לחלוטין בעת החלת הפרוטוקול שלנו. עם זאת, במהלך פיתוח שיטה שהתייחסנו לשאלה של קריש לעכל באופן שיטתי על ידי שקילה לפני ואחרי לעכל. ניסויים אלה גילו כי השאריות לא מעוכלות היו 15% (כלב) או 9% (אנושיים) של משקל הקריש הראשוני (איור 2 א).
תכונה אופיינית של מח עצם נגזרת תאי הגזע היאbility לדבוק מנות תרבית תאים. חוקרים לעשות שימוש במאפיין זה כדי לבחור עבור MSCs. כתוצאה מכך, מושבה להרכיב assay מאפשרת להעריך את האיכות של בריכת התא בצורה פשוטה, כמותי ואמינה. במעבדה שלנו, assay להרכיב המושבה המתוארת במסמך זה כבר מיושם באופן שיגרתי לכל דגימות מח עצם מעובד (גם הלא-קרשו אלה). זה אפשר לנו להשתמש assay כקריטריון עיקרי לקביעת היעילות של האוריקינאז לעכל. כדי לאפשר השוואה ישירה, תאים מהמדגם filtrates קורש (כלומר כאילו דגימות קורשים היו רק מסוננות אבל לא טופלו אנזימים) ומתעכלות קרישים היו זורעים על 10 מנות נפרדות סנטימטר ואחרי דגירה של שבועיים. כאשר חזותי יחידות מושבה להרכיב (CFU) עם הצביעה גימזה (כפי שמוצג באיור 2), שנצפינו 3.8 פעמים יותר CFU מתגובות האוריקינאז של דגימות כלבים מאשר מfiltrates הראשוני המתאים (איור 2 ג). Although פחות בולט, דגימות אנושיות במגמה דומה עם 1.6 לקפל יותר CFU מדגימות שטופלו, המאשרת את התאמתו של הפרוטוקול. ואכן, הצלחות של קריש מתעכל מאוירות בשורה הנכונה באיור 2 מתאימות לתוצאה האופיינית ראתה לדוגמה נקוותה. עם זאת, וריאציה תורם עלולה לגרום בקלות מספרי CFU ממחצית להכפיל של מה שמתואר.
אם ניקח את המושבה בגודל כמדד לאיכות בריכת תא, יותר בינוני (2-5 מ"מ) וגדול (> 5 מ"מ) מושבות הופיעו על צלחות זרע מקרישים לעומת CFU מfiltrates (איור 2 ג). זה בדרך כלל מצביע על כך שתאי גזע לגדול בדרך כלל לאחר טיפול האוריקינאז. גם במצטבר, ההשוואה של דגימות כלבים מתעכלים (n = 21) לדגימות ללא קריש (n = 7) הניב מספרים דומים של MSCs הכולל של דגימות שטופלו, למרות שוריאציה בין-מדגם גדול נצפתה בשל האוכלוסייה הטרוגנית התורם (איור2D).
כמבחן פונקציונלי אחרון של התאמה, אנחנו מושרה התמיינות של תאי גזע שמקורם דגימות מח העצם מתעכלים. יישומים בטיפולים בתאי גזע עצמיים מבוססים על בידול MSC לסחוס, עצם או רקמת שומן או אוטוקריני MSC איתות 18. יכולים להיות מונחים תאים לנתיב הרצוי של בידול על ידי בחירת תנאי התרבות המתאימות לבידול adipogenic 19, בידול osteogenic 20 או שושלת chondrogenic 17. לפיכך, אנו השוואת MSCs מקריש מח עצם לתאי גזע שמקורם דגימת מוח עצם unclotted. לאחר ארבעה שבועות בתרבות, ניתן היה להבחין MSCs לכל שלוש שושלות שהוזכרו לעיל. זה נבדק בהיסטולוגיה עם פון Kossa (לשושלת osteogenic), שמן האדום O (adipogenic) וAlcian הכחול stainings (chondrogenic), לא מראה הבדלים בכיתה של בידול בין הקבוצות ( 
קרישי איור 1. מוח עצם. אחוז דגימות כלבים ומח עצם האנושי במדינה הקרוש באופן חלקי עם הגעה (). יתר על כן, מצאנו כי תשואות MSC מדגימות שנקרשו היו מאוד מופחתות בשל מספר גבוה של תאים הלכודים בתוך קרישים. מספר גבוה של תאי בעלי הגרעין נמצא בתוך קרישים כפי שהודגם על ידי DAPI המכתים של cryosection מקריש עצם כלבי מח (B). בר סולם מייצג 200 מיקרומטר. 
איור 2. בידוד של MSCs מקרישי מח העצם מתעכלים עם האוריקינאז. (א) בדרך כלל, קרישי מח עצם נעלמים כמעט לחלוטין על האוריקינאז לעכל.על פיתוח שיטה, אנו הערכנו משקולות קריש לכלבים (n = 5, ממוצע ± SD, ** p ≤0.01) ודגימות אנושיות (n = 3, מתכוון ± SD = לא p המשמעותי ns, = 0.10) שהופחתו בתוקף על האוריקינאז לעכל. Assay CFU פשוט (B) יכול לשמש ככלי אינפורמטיבי להערכת האיכות של הכנת MSC. כדי להעריך את יעילותם של סיכומים, assay CFU בוצע עבור filtrates וקרישים מתעכלים מaspirates מח עצם בנפרד. אחרי שבועיים בתרבות, 10 צלחות שליטת סנטימטר הוכתמו Giemsa וCFU נספר. Assay אישר כי מספר גבוה של CFU יכול להשתחרר מהקריש על ידי האוריקינאז לעכל ולהישאר פונקציונלי. זה אושר גם על ידי התדר הגבוה של מושבות גדולות (ברמת חטיבה:.> 5 מ"מ בשחור, 2-5 מ"מ בצבע אפור כהה ו< 2 מ"מ בצבע אפור בהיר ברים שגיאה מייצגים SD של CFU הכולל (n = 5 לכלב , תמונת n = 3 לאדם, ** p ≤0.01, ns = לא משמעותי, p = 0.17). (C)ים מצלחות צבעוניים Giemsa לאשר את התוצאות מוצגות. הצלחות מוצגות לקריש מתעכל מתאימות לתוצאה אופיינית לדגימת מוח העצם מתעכל - עם זאת, מספרים יכולים להשתנות במידה רבה בשל השתנות תורם. (ד) בסכום, החלת האוריקינאז לעכל פרוטוקול (= 21 n) תוצאות בסך הכל תשואות MSC להשוות אחרי תרבות ההתרחבות באופן טבעי קריש דוגמיות חינם (n = 7, ממוצע ± SD). ניתוח סטטיסטי לכל איור 2 בוצע באמצעות -test t של הסטודנט. 
השוואת איור 3. פוטנציאל התמיינות של מתעכל לעומת דגימות מקורי unclotted. MSCs כלבים מבודדים ממח העצם קורש שטופל בהאוריקינאז (שורה העליונה) ומח עצם unclotted (בשורה תחתונה) נבדלה בפנוטיפ osteogenic ומוכתם על ידי פון Kossa (בר =200 מיקרומטר), פנוטיפ adipogenic היה מוכתם ב שמן האדום O (בר = 100 מיקרומטר; בריבועי ההגדלה גדולה יותר של vacuoles שומן), ואילו chondrogenesis נחשף על ידי צביעה הכחולה Alcian (בר = 100 מיקרומטר; counterstaining אדום מהר גרעיני). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
באופן שגרתי אנו דוגמים מח עצם בזמן שהמטופל עובר ניתוח (במקרה שלנו בעיקר ניתוח בעמוד השדרה), עם היתרון שיש לו רק קצת עבודה נוספת שבוצעה על ידי אנשים בחדר הניתוח. למרות שהדגימות מעורבבות עם נתרן ציטרט מייד לאחר נסיגה, דגימות רבות היו קרשו באופן חלקי, כאשר הם הגיעו למעבדה לעיבוד. בשלב זה, דגימה מחדש להחליף דגימות קרושנה תהיה התערבות נוספת נפרדת שחייב שוב הרדמה מקומית או כללית 6. זה מחייב את נכונותם של שני אנשי צוות הקליניים והתורם לתרום וצורכת הרבה משאבים 21.
כאן אנו מספקים פרוטוקול המשתמש האוריקינאז אנושי רקומביננטי על דגימות מח עצם קורשים לבודד תאי גזע multipotent. אנו יכולים להוכיח כי טיפול האוריקינאז אינו פוגע בתאים ופוטנציאל ההתמיינות נשמר. הפרוטוקולקצר שכן הוא מאריך עיבוד מדגם רק בכ -1 שעה וחצי בהשוואה לדגימות unclotted בעוד מניב בריכות תא דומה. עד כה, פרוטוקול זה יושם בהצלחה בקרישי מח עצם מאנשים וכלבים שונים באמצעות האוריקינאז מכמה מגרשים והוכיח הצלחה חזקה ושחזור. מלבד זאת, האוריקינאז פועל בעקיפין באמצעות הפעלה של מדגם-פנימי פלסמינוגן. משמעות הדבר הוא כי תגובת האוריקינאז דורשת הפלזמה הסביבה. לכן unadvisable להציג צעדים של שטיפת קריש או כאחד עם למשל, PBS. זה היה לדלל את הסביבה בסרום ולגרום להאטה משמעותית של התגובה האנזימטית.
ההחלטה להשתמש בהאוריקינאז לשיטה שלנו ולא אחר תרופת thrombolytic הייתה טריוויאלי: פיתחנו את הפרוטוקול המבוסס על תרופת thrombolytic זמינה בבית המרקחת בבית החולים שלנו. לקבוצות מחקר אחרות זה עשוי להיות קל יותר ולכן להשתמש רקמות typדואר plasminogen activator (כלומר., מוצר סמים שונה כמו alteplase, reteplase או tenecteplase) אם האוריקינאז אינו זמין. עם זאת, הבדלים שעשויים להיות חשובים בין התרופות קיימות: שלא כמו מפעילי plasminogen רקמות סוג, האוריקינאז יכול לגרום להפעלת תא ושגשוג כאשר חייב קולט האוריקינאז סוג activator plasminogen (uPAR) 22. על הכריכה, מפלי איתות תאיים מופעלים שמובילות לנדידת תאים והתרבות. במצב פיסיולוגי זה נתמך גם על ידי הפרשת metalloproteinases מטריצה על ידי תאים פעילים. עם זאת, במערכת שלנו, האוריקינאז מדולל והוסר בהדרגה על תרבות התרחבות בלי להראות השפעות מזיקות. ובכל זאת, ביחס לשימוש המיועד של MSCs המבודד, את התאמתו של כל אחד מסמי thrombolytic צריכה להיקבע בנפרד.
בדרך כלל, במינונים גבוהים לקריש מהיר ושלם לעכל מומלץ miמזער בחירה לא רצויה במהלך עיבוד קריש. מחקרים ראויים לציון, רבים קודמים שימשו streptokinase חיידקים לעכל קרישי דם ומח עצם 13,14. עם זאת, תרופה זו עלולה לעורר הפעלה ותגובה של המערכת החיסונית, אשר עשוי להיות חסרון עיקרי במיוחד כאשר יישום של תאים לחולים מיועד לא רצויות.
לפיכך, אנו סבורים כי הפרוטוקול שלנו לא רק לעזור לחוקרים ואנשי מקצוע רפואיים כדי לחסוך זמן ולצמצם עלויות. באמצעות האוריקינאז - תרופה אנזימטית אושרה ללא antigenicity הידוע - אולי אפילו לספק כלי רב ערך עבור מעבדות מחקר translational רבות מכוונים לשימוש טיפולי של הכנות MSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basal Medium Components | |||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I | |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I | |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 | |
| Adipogenic Medium Components | |||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 | |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 | |
| Pantothenate | Sigma | P5155 | |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 | |
| Osteogenic Medium Components | |||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 | |
| Chondrogenic Medium Components | |||
| Biopad - sponge shaped medical device | Euroresearch | ||
| L-proline | Sigma | P5607 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 | |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 | |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 | |
| Generic | |||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 | |
| PBS | Applichem | 964.9100 | |
| Urokinase | Medac | 1976826 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 | |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 | |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 | |
| Consumables | |||
| 50 ml reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| 10 ml syringe | Braun | 4606108V | |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 | |
| 1.7 ml Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C | |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 | |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 | |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 | |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 | |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 | |
| cell culture flask - Flask T300 | TPP | 90301 | |
| Equipment | |||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 | |
| water bath | Memmert | 1305.0377 | |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea | |
| microscope | Olympus | CKX41 | |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 | |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
References
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).
- Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy. N Engl J Med. 361 (15), e28 (2009).
- Cuthbert, R., et al. Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use. Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).
- Veyrat-Masson, R., et al. Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy. Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).
- Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).
- Bertolo, A., et al. An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies. Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 7, 14 (2006).
- Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. Isolation of lymphocytes from clotted blood. J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).
- De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow. J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).
- St Antoine, A., et al. Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses. Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).
- Kisiel, A. H., et al. Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum. Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).
- Bertolo, A., et al. Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells. Eur Spine J. 21, Suppl 6. S826-S838 (2012).
- Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. Stem cells: insights into the secretome. Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).
- Benvenuti, S., et al. Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells. J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).
- Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).
- Patel, A. Tissue banking for research--bench to bedside and back--myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era. Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).
- Smith, H. W., Marshall, C. J. Regulation of cell signalling by uPAR. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).
