Summary
Analyse af kontraktile egenskaber kemisk flået eller permeabiliserede, skelet muskelfibre tilbyder en kraftfuld middel til at vurdere muskelfunktion på niveau med det indre muskel celle. I denne artikel vil vi skitsere en gyldig og pålidelig teknik til at forberede og test permeabiliseres skelet muskelfibre in vitro.
Introduction
Den primære funktion af skeletmuskulaturen er at generere kraft. Muskel kraft fremkaldes in vivo gennem en kompleks sekvens af hændelser, der omfatter motor nerve aktionspotentialer, neuromuskulære transmission, muscle fiber aktionspotentialer, frigivelse af intracellulært calcium, og aktivering af systemet med regulerings- og kontraktile proteiner. Fordi force generation er det endelige resultat af denne sekvens, kan et underskud i kraft være forårsaget af svigt i en eller flere af de enkelte trin. Et centralt attribut af permeabiliseret præparat fiber er, at det fjerner de fleste af de trin, der kræves for force generation in vivo, med kun de lovgivningsmæssige og kontraktile funktioner forbundet med myofibrillære apparat tilbage. Investigator forudsætter kontrol over leveringen af aktiverende calcium og energi (ATP), og bliver belønnet med et forenklet system, der tillader vurdering af de isolerede lovgivningsmæssige og kontraktile strukturer i deres oprindelige samarbejdenfiguration. Målinger af kraft ved hjælp af permeabiliserede skelet muskelfibre er således værdifulde, når de vurderer ændringer i muskelfunktion observeret in vivo. For eksempel har vi brugt denne teknik til at karakterisere den kraft produktionskapacitet af fibre fra myostatin mangelfuld mus 1 og vurdere årsagen til vedvarende muskelsvaghed udstillet efter kronisk rotator cuff tårer 2,3.
Moderne permeabiliseret fiber metodik kan spores tilbage til begyndelsen af indflydelsesrige studier 4,5 og er i øjeblikket i brug af en række forskningsgrupper. Selvom teknikker er blevet beskrevet i litteraturen, er de endnu ikke blevet præsenteret i videoformat. Målet med denne artikel er at illustrere en opdateret, gyldig og pålidelig teknik til måling af den maksimale kraft produktionskapacitet af enkelte fibre fra kemisk permeabiliserede skeletmuskulaturen prøver. For at opnå dette, en individuel fiber segment (henvist til heri som en ̶0; fiber ") er udvundet fra en præ-permeabiliseres bundt af fibre og anbringes i en eksperimentel kammer, der indeholder en afslappende løsning, det afgørende træk, som er en calciumkoncentration, der er <10 nM. Fiberen bliver derefter fastgjort ved den ene ende til en kraft-transducer og ved den anden ende til en længde-controller. Med fiberen holdes i en optimal sarkomer længde, overføres det til en aktiverende opløsning, der har en calciumkoncentration tilstrækkelig til at fremkalde maksimal aktivering og dermed maksimal isometrisk kontraktion kraft. Force data erhverves, opbevares og analyseres ved hjælp af en personlig computer.
Protocol
Alle procedurer, der involverer animalske eller mennesker bør udføres i overensstemmelse med de relevante retningslinjer, regler og reguleringsorganer. University of Michigan Komité for brug og pleje af dyr (UCUCA) og University of Michigan Medical Center Institutional Review Board godkendt alle dyr og mennesker, der er beskrevet i denne artikel.
1. Lav Dissecting og opbevaring Stock Solution
Bemærk: De endelige mængder er angivet i de følgende instruktioner kan skaleres op eller ned efter ønske.
- I en 1000 ml bægerglas tilsættes 800 ml deioniseret vand (ASTM type 1). Fastholdelse af en blid opsigt, tilsæt alle forbindelserne anført i tabel 1 til deioniseret vand og give dem mulighed for at opløse.
Forbindelse Ønsket Konc. (M) Formel Vægt (g / mol) Tilføj til 1 L (g) </ Tr>K-propionat 0.250 112,17 28,040 Imidazol 0,040 68,08 2,720 EGTA 0,010 380,40 3.800 MgCl2 • 6H 2 O 0,004 203,31 0,813
Tabel 1: dissekere og opbevaring lager løsningskomponenter.
- Bring til et slutvolumen på 1000 ml med deioniseret vand. Bemærk, at det er unødvendigt til pH løsningen på dette tidspunkt. Opbevar stamopløsningen ved 4 ° C.
2. Lav Storage Solution
- At gøre 200 ml storage opløsning, begynder med 100 ml dissekere og opbevaring stamopløsning i et 250 ml bægerglas. Tilsæt tilstrækkeligt Na 2 H 2 ATP til at bringe den endelige adenosintriphosphat (ATP) fusions 2 mM. Bring til et endeligt volumen på 200 ml med glycerol. Juster til pH 7,00 med kaliumhydroxid (KOH). Opbevar opbevaring opløsningen ved -20 ° C.
Bemærk: På grund af den viskøse karakter af glycerol kan det være vanskeligt nøjagtigt at dispensere efter volumen. På grund af dette, vi typisk tilføje glycerol efter vægt (100 ml glycerol vejer ca. 126 g).
3. Foretag Dissecting Solution
- At gøre 200 ml dissekere opløsning, begynder med 100 ml dissekere og opbevaring stamopløsning i et 250 ml bægerglas.
- Tilføj tilstrækkelig Na 2 H 2 ATP til at bringe den endelige ATP-koncentration til 2 mM. Justering af pH til 7,00 med KOH. Bringe det endelige volumen til 200 ml med deioniseret vand. Portion i mængder på 2,5 ml og opbevares ved -80 ° C.
4. Gør dissekere Solution med Brij 58
Bemærk: Brij 58 er et ikke-ionisk detergent, der forstyrrer (permeabiliserer) lipiddobbeltlag.
<ol>5. Lav Test Solutions
Bemærk: Følgende er tilpasset fra Moisescu og Thieleczek 1978 (6). Se Diskussion for yderligere kommentarer til forberedelse test løsninger.
- Forbered tre separate 1.000 ml bægre mærket "Relaxing", "Pre-aktiverende" og "Aktivering". Der tilsættes 400 ml deioniseret vand til hvert bægerglas.
- Tilføj forbindelserne anført i tabel 2 til den passende bægerglas og derefter opvarme opløsningerne til mellem 70 ° C og 80 ° C. Oprethold en opløsning temperatur på 70-80 ° C i 30 minutter under stadig omrøring.
Bemærk: En temperatur på 70-80 ° C hjælper i elimination af kulsyre dannet ved omsætning af calciumcarbonat med EGTA i aktiverende opløsning. De afslappende løsning og pre-aktiverende løsninger behandles på samme måde som aktiverende løsning til at bevare sammenhængen.
| AFSLAPPENDE LØSNING | PRE-aktiverende LØSNING | AKTIVERING LØSNING | |||||
| Forbindelse | Formel Vægt (g / mol) | Ønskede koncentration (mM) | Nødvendig Masse (g) | Ønskede koncentration (mM) | Nødvendig Masse (g) | Ønskede koncentration (mM) | Nødvendig Masse (g) |
| HEPES (syre) | 238,30 | 90.0 | 10,724 | 90.0 | 10,724 | 90.00 | 10,724 |
| MgO | 40.31 | 10.3 | 0,208 | 8.5 | 0,171 | 8.12 | 0,164 |
| EGTA (syre) | 380,40 | 52,0 | 9,890 | 52.00 | 9,890 | ||
| HDTA (syre) | 348,36 | 50,0 | 8,709 | ||||
| CaCO 3 | 100,10 | 50.00 | 2,503 | ||||
Tabel 2: Relaxing, præ-aktiverende og aktiverende løsningskomponenter.
- Opløsningen afkøles til stuetemperatur og tilsæt tilstrækkeligt NaN3 / KOH at bringe den endelige NaN3 koncentration til 1 mM.
ADVARSEL: NaN 3 (natriumazid) er giftig. Der henvises til de kemiske MSDS før håndtering af dette kemikalie.- At gøre 100 ml 100 mM natriumazid opløsning tilsættes 0,65 g NaN3 til 10 ml 1 N KOH. Juster til et endeligt volumen på 100 ml med deioniseret vand.
- PH justeres til ca. 7,10 under anvendelse af KOH.
- Efter trin 5.4 tilsæt tilstrækkeligt Na 2 H 2 ATP for at bringe den endelige ATP-koncentration til 8 mM og tilstrækkelig Na 2 CRP at bringe den endelige kreatin phosophate (CRP) koncentration til 10 mM.
- Bringe hver opløsning til slutvolumenet på 500 ml ved anvendelse af deioniseret vand. Chill eller opvarme opløsningerne til den temperatur, hvor forsøg vil blive udført, derefter bruge KOH til at bringepH til 7,10 medens den temperatur.
- Tilføj afslappende opløsning til bægerglasset indeholdende præ-aktiverende opløsning, således at den endelige for-aktiverende opløsning er 1 del afslappende opløsning i 500 pre-aktiverende opløsning. Portion i mængder på 2,5 ml og opbevares ved -80 ° C.
6. Foretag Sutur Loops
- Begynd med en streng af ikke-steril USP 10-0 monofilament nylon sutur.
- Brug pincet til at oprette en løkke med streng efter det dobbelte overhånd knude teknik. Reducer knude i størrelse til ca. 750 um diameter. Loop diameter kan vurderes under mikroskopet ved hjælp okular stregglasset markeringer.
- Brug microdissecting saks til at fjerne overskydende sutur så kun cirklen og små (500 um) haler på hver side. Et eksempel på en færdig sløjfe er vist i figur 1.
- Gentag trin 6,2-6,3 indtil 4 brugbare loops er blevet foretaget. Opbevar sløjfer i en silikone elastomer-belagte PetrJeg parabol til fremtidig brug.
Bemærk: Der kræves fire sutur loops for hver testet fiber.
7. Bundle Sample
Bemærk: De følgende trin beskriver proceduren for at dissekere den oprindelige prøve i mindre eksperimentelle 'bundter', hvorfra enkelte fibre i sidste ende vil blive udtrukket og testet. På alle tidspunkter prøven skal behandles med omhu. Med henblik på denne beskrivelse, vil vejledningen blive givet som om investigator er højrehåndet.
- Få prøven af interesse og overføre den til anlægget, hvor dissektion vil finde sted.
Bemærk: Metoder til vævsbiopsi vil variere afhængigt af eksperimentel model og studie design. Hvor det er muligt, bør muskel perfusion opretholdes indtil det tidspunkt, hvor biopsi. - Hvis prøven skal overføres mellem høsten stedet og dissekere site, transportere det i et hætteglas indeholdende afkølet dissekere løsning mens opretholdt på is.
- Forbered en 5 cm siliconeelastomer-belagte petriskål med kølet dissekere løsning og 02:58 insekt montering stifter (100 um diameter, rustfrit stål).
- Overfør prøven til skålen. Sikres, at prøven forbliver nedsænket ved at tilføje mere dissekere løsning, hvis det er nødvendigt.
- Undersøg prøven under mikroskop og manipulere den til at tilpasse de langsgående akser af fibrene mod højre skulder af investigators (figur 2). Derefter forankre prøven i skålen ved at fastgøre i hjørnerne.
Bemærk: Gør brug af resterende bindevæv som forankring point på dette tidspunkt, da dette vil maksimere prøve brug og bevare fiber integritet. Bundtet kan pinned i svag spænding for at hjælpe med at definere inter-fiber marginer. - Med tangen i venstre side og de microdissecting saksen i den rigtige, begynder blidt dissekere et bundt langs de langsgående margener mellem fibre
Bemærk: Afhængigt af detssamlet længde, yderligere dissekere bundtet i talrige mindre bundter. - Sikre, at bundle dimensioner er ca. 0,5-1 mm i bredden og ≥3 mm i længden. Vurdere dimensionerne bruger et mikroskop med stregglas markeringer i okularet, eller ved at placere en lineal under fadet.
- Fjerne og kassere væv, der beskadiges af tang eller ben som følge af dissekere processen.
- Gentag processen, indtil et tilstrækkeligt antal bundter er blevet dissekeret, eller indtil prøven er opbrugt.
Bemærk: Antallet af bundter, der kan opnås, afhænger af mange faktorer, herunder størrelsen og tilstanden af den oprindelige prøve, morfologien af musklen, og dygtighed af investigator.
8. permeabiliserer Fibers
- Overfør bundterne fra dissekere opløsningen i et hætteglas indeholdende 2,5 ml frisk, kølet, dissekere løsning med den ikke-ioniske vaskemiddel "Brij 58 'tilføjet(0,5%, vægt / volumen). Der inkuberes på is i 30 minutter med lejlighedsvis, forsigtig omrøring. Sørg for, at bundterne forbliver neddykket hele inkubation.
- Ved afslutningen af de 30 minutters inkubation, overføre bundterne til et hætteglas indeholdende frisk dissekere opløsning (ingen Brij 58) og omrør forsigtigt og kortvarigt for at fjerne eventuelt resterende detergent.
9. Forbered Bundles for opbevaring
- Overfør bundterne til et hætteglas indeholdende afkølet opbevaring opløsning og inkuberes natten over ved 4 ° C.
10. Opbevar Bundles
- Den følgende dag fremstilles en opbevaringskasse, kunne modstå -80 ° C, med nok individuelle 0,5 ml skruelåg koniske rør til at rumme alle bundter opnået under dissekere processen (et bundt per rør). Hver konisk rør skal fyldes med 200-400 pi af frisk storageløsning.
- Overfør bundterne i de individuelt mærkede koniske rør. Sørg for, at pakken ikke sidder fast påsiden af koniske rør eller flyder på overfladen af opløsningen. Cap de koniske rør og opbevare prøverne ved -80 ° C indtil dagen for testning.
11. Forbered eksperimentelle enheder
Bemærk: Den brugerdefinerede Apparatet består af en fase, der huser en længde controller og krafttransducer, en bevægende kammer system og en 10X dissektion mikroskop. Installationer mikrometer drev muliggør præcis manipulering af vedhæftede fiber overflader. Laser diffraktionsmønstre anvendes til at estimere sarkomer længde. Data genereret under eksperimenter er optaget på en personlig computer. Se Figur 3 for kommenteret billeder af den eksperimentelle opsætning.
- Tø et hætteglas hver af den afslappende, præ-aktiverende og aktiverende løsninger og vedligeholde på is. Bemærk, at ATP og CRP er labile forbindelser, der bør bevares ved kolde temperaturer.
- Forbered mikroskopet, testapparat og tilhørende computer til brug. Fyld den første eksperimentelle kammer med afslappende opløsning. I vores apparat, det første kammer indeholder prismer, der tillader investigator at fotografere fiberen fra siden. Fyld den anden eksperimentelle kammer med præ-aktiverende opløsning, og den tredje med aktiverende opløsning.
- Justere temperaturen, således at i-kammer termometer displayet viser 15 ° C. Tråd to tilberedte sutur sløjfer onto rustfrit stål vedhæftede overflader, der strækker sig fra både kraft-transducer og længde-controller (figur 5A).
12. Uddrag permeabiliseres Single Fiber
- Tø en fiber bundt af interesse, og overføre til en silikone-elastomer-belagte petriskål med frisk, kølet afslappende løsning. Fastgør bundle med knappenåle i hver ende, og sikre, at det er neddykket.
- Under anvendelse af de pincet, gribe en fiber ved den ene ende og begynde jævnt ekstrahere den langs sin længdeakse.
Bemærk: Trykstyrke skade pående af fiberen forårsaget af tangen ikke er et problem på dette tidspunkt, da de kontraktile egenskaber i dette område ikke vil blive testet. Pleje bør imidlertid udvises forsigtighed ved ekstraktion fibre fra pakken, da adhæsioner mellem fibre og den ekstracellulære matrix kan resultere i stor spænding, i sidste ende fører til at strække-induceret skade. Bemærk, at en betydelig variation findes blandt muskler i hvilken grad fibrene klæber til det omgivende ekstracellulære matrix. Fibre, der mistænkes for at være blevet beskadiget af en sådan strækning skal kasseres. - Bruge et barberblad eller skalpel til at ændre en pipettespids, som vist i (figur 4). Indføre fiberen ind i spidsen sammen med en lille mængde afslappende opløsning. Overfør enkelt fiber fra silicone elastomer-belagte petriskål til den eksperimentelle kammer, der indeholder den afslappende løsning.
13. Mount Single Fiber
Bemærk: En trin-for-trin depictipå kan ses i figur 5.
- Retningsgivende forsigtigt med pincet, fjerne fiberen fra pipettespidsen og forankre den til længden-controller (til venstre) anvendelse af den første sutur sløjfe.
- Brug en enkelt, jævn bevægelse, når stramme løkken med pincet. Sikre, at en lige og modsat spænding påføres hver ende af suturen.
- Det første loop bør bindes omkring 1 mm til 2 mm fra enden af længden-controller fastgørelsesflade.
- Manipulere den anden ende af fiberen mod kraft-transducer (højre) og fastgør fiberen efter samme procedure. Fjerne overskydende sutur under anvendelse af de microdissecting saks (figur 5C).
- Placer fiberen under en lille mængde spænding ved at øge afstanden mellem længden-controller og kraft-transducer arme ved hjælp af x-koordinaten mikrometer drev (figur 3A).
- Tråd den anden sløjfe over det første og forankre fiberenved et punkt inden 0,2 mm fra enden af den kraft-transducer fastgørelsesflade (figur 5D).
- Fjerne overskydende sutur under anvendelse af de microdissecting saks.
- Fiberen fastgørelse proces kan resultere i tab af opløsning fra kammeret. Hvis det er nødvendigt, tilføje mere afslappende løsning for at sikre overfladen af opløsningen er flad (hverken konkave eller konvekse). En flad overflade er vigtig ved vurderingen sarkomeret længde ved hjælp af laser diffraktion.
- Juster fiber parallelt med sidevæggene i den eksperimentelle kammer ved at justere positionen af længde-controller i retningen af y-aksen.
- Kortlægge fiber ved hjælp af prismet sidebillede og justere positionen af længde-controller i retning af z-aksen, indtil fiberen er parallelt med gulvet af kammeret.
Bemærk: Positionering af fiberen parallelt med gulvet af kammeret kan ske uden chamber prismer ved at fokusere først på den ene ende af fiberen og thøne, uden at tilpasse mikroskop fokus, hvilket bringer den anden ende af fiberen i fokus ved hjælp af sin z-aksen mikrometer drev. - Hvis fiberen på nogen måde er forvredne, snoet eller beskadiget som følge af den stigende processen bør fiber kasseres og en ny fiber tilknyttet.
14. Set Optimal sarkomer Længde
- Når fiberen er justeret korrekt i kammeret, indsætte kalibrerede mål skærmen på den forreste del af mikroskopet og juster den over den første eksperimentelle kammer.
Bemærk: Målet Skærmen er kalibreret ved anvendelse af standard rist ligning, λ = SL sinθ, hvor SL er sarkomer længde, θ er diffraktionsvinklen mellem 0 ° og 1 ° diffrakterede bjælker og λ er bølgelængden af laseren. - Tænd laseren og justere placeringen af scenen, således at laseren passerer gennem midten af fiberen.
ADVARSEL: Koncentreret laserlys kan skade to syn. Forsøg aldrig at visualisere fiberen gennem mikroskopet, når laseren er tændt. - Positionere fiberen i forhold til laserstrålen at afbøje laserlyset og observere en trommen interferens på den kalibrerede mål skærmen (figur 6). Slukke lyset til at visualisere dette mønster tydeligere.
Bemærk: Hvis der med den korrekte placering af laserstrålen, er der ikke interferensmønster set antyder dette, at de myofibrillære komponenter af fiberen er unormale / beskadiget og at fiberen skal erstattes med en ny. - For at indstille sarkomer længde, øge eller mindske spændingen på fiberen ved hjælp af længde-controller x-aksen mikrometer drevet, indtil den ønskede afstand af diffrakterede lys observeres på målet skærmen.
Bemærk: Den optimale sarkomer længde af fiberen vil afhænge af den dyreart, hvorfra prøven blev opnået. En sarkomer længde på 2,7 um almindeligvis antages at være optimale, når æslersynge fibre fra humant væv 7,8. - Efter optimal sarkomer længde er indstillet, måle afstanden mellem de to inderste suturer. Dette opnås lettest ved anvendelse af digital udlæsning på mikrometer drev, der styrer x-aksen bevægelse af kammeret. Placer kammeret, således at den lodrette trådkorset af okularet er justeret på den inderste kant af inderste sutur og nul digital udlæsning på mikrometer-drevet.
- Oversætte scenen langs x-akse i forhold til mikroskopet, indtil den når den anden inderste sutur. Det digitale display angiver længden af fiberen. Denne værdi skal registreres som fiber længde, L f.
Bemærk: Det skal forstås, at afstanden mellem de to inderste suturer vil bestemme den funktionelle længde af kontraktile væv, der evalueres. Investigator bør stræbe efter konsekvens i denne dimension (dvs. L f) inden for enrække eksperimenter.
15. Skøn tværsnitsareal (CSA)
- Opretholde fiber ved Lf og bruge mikroskopmonteret kamera til at fange en stor forstørrelse billede af den centrale del af fiberen både fra oven og sidebilleder. Side view billeder kan indfanges ved hjælp af den prisme indlejret i den side af kammeret.
Bemærk: Når skiftende mellem top og sidebilleder er det vigtigt at bevæge mikroskopet kun i y-retningen for at sikre, at de to billeder er "i register", og viser derfor to forskellige visninger af det samme afsnit af fiberen. - Opnå målinger på dette tidspunkt at normalisere absolut kraft senere i undersøgelsen. Teknikkerne for opnåelse af disse målinger er beskrevet senere og illustreret i Figur 7A og 7B.
16. fremkalder Isometrisk Sammentrækning
Bemærk: Mens data genereres under disse forsøgs kan indsamles og fortolkes uden brug af en computer, software, der giver mulighed for erhvervelse, visning, lagring og analyse af kraften svarene er fordelagtig. Den brugerdefinerede LabVIEW software skabt af vores laboratorium tillader disse funktioner samt evnen til at designe 'motion tog', der styrer handlingen af længden-controller under et eksperiment.
- Bekræfter, at temperaturen af den afslappende, præ-aktiverende og aktiverende opløsninger er stabile ved 15 ° C.
- Brug kammeret kontrol software til at flytte fiber til kammer, der indeholder præ-aktiverende opløsning og inkuber der i 3 min.
Bemærk: pre-aktiverende opløsning svagt bufret for Ca2 +, hvilket resulterer i en meget hurtig aktivering og kraftudvikling ved indføring af fiberen til den aktiverende opløsning. - Med 10 sek tilbage i den præ-aktiverende opløsning og fiberlængden holdt ved L f, etablere en nul foRCE-niveau i den eksperimentelle rekord.
Bemærk: 'Find force Zero' bevægelse af længde-controlleren afslører kraft-transducer niveau, der svarer til nul kraft (dvs. fiberen bliver kortvarigt slæk som følge af bevægelsen). Passiv kraft er forskellen mellem at nul og kraften niveau lige før transduceren nulstilling bevægelse. - Ved afslutningen af 3 min, flytte fiber til kammer, der indeholder den aktiverende opløsning og lad maksimal isometrisk kraft at udvikle sig som vist ved et plateau i kraft, der indledes med en hurtig stigning.
- Efter at have nået maksimal isometrisk kraft, skal du bruge længde-controller til at identificere den kraft-transducer output, der svarer til nul kraft i kammeret, der indeholder aktiverende løsning.
Bemærk: Dette er nødvendigt, fordi den kraft-transducer output, der svarer til nul kraft er i almindelighed forskellige for hver opløsning fyldt kammer. - Efter opnåelse af en anden kraft plateau returnere fiber til kammer, der indeholder den afslappende løsning. Test er nu færdig. For at teste flere fibre i løbet af en session aspirat alle løsninger og tilføje nye, kølet løsninger.
Bemærk: Brenner s cykling protokoller bør overvejes, når fremkalde maksimal sammentrækninger over en længere periode. Denne protokol er blevet vist at bevare de strukturelle og mekaniske egenskaber i den maksimalt aktiverede fiber 9.
Representative Results
Sunde, kemisk permeabiliseret enkelte fibre skal vises ensartet form og har konsekvent riller afstand, når de ses under høj forstørrelse. Fibre, der er ufleksibel, når manipuleret med pincet eller har åbenlyse strukturelle skader skal kasseres.
Høj forstørrelse digitale billeder taget i løbet af trin 15 analyseres for 5 målinger parrede diameter langs midtersektionen af fiberen. Fiber CSA anslås antager en elliptisk tværsnit og midling 5 individuelle CSA målinger som vist i figur 7A. Figur 7B også tjener til at illustrere, hvordan fiber dimensioner i én visning kan være betydeligt anderledes i forhold til parrede dimensioner i den anden visning (dvs. på tværs sektioner er ikke i almindelighed rund).
Repræsentative kraft spor fra humane langsomme og hurtige fibre er vist i figur 8A og 8B, hhv. Voltage output af kraft-transducer er erhvervet under en test, og omdannet til at tvinge (mN) under anvendelse dataindsamlings- og analysesoftware (LabVIEW). Figur 9 illustrerer den fremgangsmåde, der anvendes til at vurdere maksimal aktiv kraft (F o), som beregnes ved at trække den kraft, der kræves for at opretholde fiber ved optimal sarkomer længde, mens i en afslappet tilstand (passiv kraft, F P) fra den største isometriske kraft udviklet under maksimal fiber aktivering (total kraft, F T). Da produktionen af den kraft-transducer, der svarer til nul kraft er i almindelighed forskellige for hver af de forskellige badning kamre, vi kort slække fiberen i både præ-aktiverende og aktiverende løsninger til at fange den nul-force niveau i eksperimentel rekord. Normalisering af maksimal aktiv kraft ved fiber CSA anvendes til at generere mere informativ værdi af specifik kraft (SF o). Fordi det tager højde for CSA fiberens, SF o
Typiske kendetegn for raske, voksne fibre fra Claflin et al. 2011 10 for menneskelige, Mendias et al. 2011 1 for mus og Gumucio et al. 2012 2 for rotte er beskrevet i tabel 3. Alle data præsenteres i tabel 3 blev genereret ved hjælp af teknikker beskrevet i denne artikel.
| Menneske (Vastus lateralis) | Mus (EDL) | Rat (Infraspinatus) | ||||
| Mand | Kvinde | Mand | Mand | |||
| Type 1 | Type 2a | Type 1 | Type 2a | (Ikke indtastet) | (Ikke indtastet) | |
| CSA (um 2) | 4880 - 6900 | 5270 - 8380 | 3870 - 5470 | 4010 - 5610 | 1850 - 3080 | 5290 - 8010 |
| Fo (mN) | 0,79-1,17 | 1,02-1,54 | Fra 0,64 til 0,97 | 0,71-1,07 | 0,14-0,25 | 0,55-0,97 |
| sF o (kPa) | 142-182 | 165-210 | 156-193 | 172-214 | 67-94 | 102-131 |
| n | 129 | 160 | 149 | 207 | 37 | 94 |
Tabel 3. Typiske kendetegn for sunde, voksne fibre fra human vastus lateralis 10, mus extensor digitorum longus 1 og rotte infraspinatus 2 muskler. Optimale sarkomeret længder blev sat til 2,7 um for humane fibre 7,8 og 2,5 um for både mus (36, 37) og rotte fibre (38). Eksperimentel L f intervaller (25 th og 75 th kvartiler) var 1,39-1,73 mm, 1,17-1,53 mm og 1,32 til 1,59 mm for mennesker, mus og rotter hhv. Intervaller vist angiver de 25 th og 75 th kvartiler og n er antallet af testede fibre.
De mest almindelige problemer under testen omfatter en sutur loop slip, hvilket resulterer i en kraft response med en "fangst", såsom den der er illustreret i figur 10A, og en delvis eller fuld tykkelse tåre af fiberen, hvilket resulterer i en kraft reaktion, der returnerer brat mod eller til (pause) nul, mens fiberen stadig fordybet i aktivering opløsning (figur 10B). Hvis der opstår en slip, tåre eller pause under et eksperiment, bør fiberen kasseres og data udelukket, selv om at opretholde en registrering af fiber fiaskoer kan også være oplysende 11. Et andet negativt udfald, der kan opstå, er det for tidlig aktivering af fiberen, mens i den præ-aktiverende opløsning (figur 10C). Delvis aktivering i for-aktiverende opløsning antyder signifikant krydskontamination (dvs. en utilsigtet stigning i calciumkoncentration i for-aktiverende brønd). I dette tilfælde bør alle bade aspireres og skylles godt med demineraliseret vand. Tørring af delende flader mellem kamrene er også henstilded da fugt eller kondens i disse områder kan føre til fugtspredende af løsning mellem bade. Beslutningen om at medtage eller udelukke data vil i sidste ende afhænge af den eksperimentelle fokus og bør derfor overvejes ved udformningen af undersøgelsen.
Figur 1: Sutur sløjfe (10-0 monofilament nylon sutur).
Figur 2:. Bundle dissektion Tang er i venstre hånd, mikrodissektions saks er i højre hånd. Røde linje viser den gunstige orientering af håndleddet og saks med de langsgående akser af fibrene.
Figur 3: (A) Test apparat med mærkede komponenter. (A) Eksperimentelle kamre med gennemsigtige bunde. (B) Længde-controller. (C) Kraft-transducer. (D) Lyskilde. (E) Længde-controller xyz mikrometer drev med digitalt display. (F) Stage mikrometer drev med digitalt display. (G) Kraft-transducer xyz mikrometer drev. (H) Platform for kalibreret laser-diffraktion target skærm. (I) Vibration isolation bord. (B) Nærbillede af de eksperimentelle kamre. (J) fastgørelse af rustfrit stål overflade strækker sig fra længde-controller. (K) fastgørelse af rustfrit stål overflade strækker sig fra kraft-transducer. (L) Side-view prisme. (M) Boliger til termoelektriske køling moduler. (N) termoelement til rapportering kammer temperature.
Figur 4: Modificeret 100 ul pipettespids bruges til at overføre fiber fra dissektion parabol til eksperimentel kammer.
Figur 5:. Montering enkelt fiber på eksperimentelle enheder (A) Tilberedte sutur loops skruet på rustfrit stål vedhæftede overflader. (B) Fiber overført til eksperimentel kammer. (C) Fiber forankret til rustfrit stål vedhæftede overflader ved første par af sutur sløjfer med overskydende sutur fjernet. (D) Andet par af sutur sløjfer gevind over toppen af første sutur loops og bundet på plads.
Figur 6: sarkomer længde vurderes ved projektion af et mønster laser interferens på en kalibreret target skærm (a) Laser kilde.. (B) Mirror. (C) Target skærm. (D) Laser interferensmønster.
Figur 7: (A) Bestemmelse af fiber tværsnitsareal ved optimal sarkomer længde (human = 2,7 um). Antages et elliptisk tværsnit, er CSA beregnes for hvert af fem steder langs fiberen midsection og gennemsnittet af de fem individuelle målinger rapporteres som fiber CSA. 2a repræsenterer ovenfra diameter og er en akse af ellipsen, 2b betegner sidebillede diameter og er den anden akse af ellipsen. (B) Repræsentative fiber billeder, der illustrerer hver af de fem målinger tilsvarende diameter taget i både top og side view.
Figur 8: Repræsentative kraft spor fra sunde menneske vastus lateralis muskelfibre (A) Type 1 fiber (CSA: 5710 um 2, F o: 0.89 mN og SF o: 156 kPa).. (B) Type 2a fiber (CSA: 9510 um 2, F o: 1.66 mN og SF o: 174 kPa). Fiber myosin tung kæde type blev bestemt ved anvendelse af elektroforetisk separation og sølv-farvningsteknikker 22.
OAD / 52695 / 52695fig9.jpg "/>
Figur 9: Beregning af maksimal aktiv kraft (F o) (a) Udvidet visning af fiber force respons under slæk-inducerende bevægelse af længde-controller indledt i pre-aktivering løsning.. F P er den kraft, der kræves for at opretholde en sarkomer længde på 2,7 um med fiberen i hvile. (B) Udvidet visning af længde-controller slack-inducerende bevægelse. Bemærk, at Fo = F T - F P.
Figur 10: (A) Sutur loop slip, fremgår af en "fange" i kraft spor i stigningen af kraft. Kontroller at være sikker loops er sikre, før du aktiverer fiberen. (B) Fiber pause under aktivering. Kan skyldes dårlig fiber integritet eller aggressiv fiber behandling under sutur loop stedling. (C) For tidlig partiel fiber aktivering på grund af forurening af præ-aktivering kammer med Ca2 +.
Discussion
Vurderinger af de kontraktile egenskaber af permeabiliserede enkelt skeletmuskel fibre anvendes til at undersøge muskelfunktionen hos en lang række forskellige sammenhænge. Eksempler omfatter undersøgelser, der har evalueret effekten af aldring 12, udøve 10,13,14, rumflyvning 15, skade 2,3,16, narkotika behandlinger 17,18, sygdom 19 og genetisk manipulation 20,21 om fiber struktur og funktion. På grund af evnen til direkte at vurdere den kontraktile udførelsen af myofibriller i deres native konfiguration, denne teknik giver en attraktiv platform at danne en forståelse af myofibrillar funktion fraværende af potentielt forstyrrende effekter, der er til stede, når neuromuskulær signaltransmission og excitation-induceret calciumfrigivelse er inkluderet i systemet, der undersøges. Desuden kan funktionel test af enkelte fibre anvendes til at supplere kontraktile proteinidentifikation resultater som demopnået ved immunhistokemi eller gelelektroforese + western blot 22.
En af de primære funktioner af skeletmuskler er at generere kraft. Følgelig sF o, et mål for den iboende kraft generere kapacitet af et kontraktile system er af stor interesse for muskel fysiologer. Pålidelige skøn SF o kræver præcise målinger af både fiber CSA og F o. Da fibre er generelt hverken cirkulær i tværsnit, og heller ikke ensartet i CSA langs deres længde, skal være meget omhyggelig, når estimering CSA. Til dette formål gennemføres målinger på flere steder langs længden af fiberen, og på hvert sted, fra to perspektiver adskilt af 90 °. Pålidelige målinger af F o kræver opmærksomhed på flere detaljer, herunder tegner sig for passiv kraft, justere sarkomeret længde for at maksimere overlap af tykke og tynde filamenter, ansætte en aktiverende løsning med en calciumkoncentration that resulterer i maksimale aktivering og fastholde den ønskede eksperimentelle temperatur, og opretholde optimale opbevaringsbetingelser (temperatur og varighed) af fibrene før dagen for eksperimentet.
Mens trinene her beskrive proceduren for evaluering af maksimal isometrisk kraft, er det ofte ønskeligt at vurdere andre vigtige funktionelle kvaliteter skelet muskelfibre. Dette kan opnås ved at udvide den eksperimentelle protokol til at omfatte yderligere mekaniske manipulationer af fiberen. For eksempel måling af den hastighed, hvormed fiberen forkorter mod en række forskellige belastninger tillader bestemmelse af den kraft-hastighed forhold, hvorfra kraft-automatisk og hastighed-magtforhold kan beregnes 10,23,24. Derudover kan hastigheden af ubelastet afkortning bestemmes ved anvendelse af den "slæk test" 25, som består af at anvende en serie af slack-inducerende afkortning trin og measuring den tid, som fiberen for at fjerne slækket. En anden kinetiske parameter, der ofte rapporteres, er k tr, hastighedskonstanten for force ombygningen efter en mekanisk forstyrrelse, som midlertidigt løsner alle crossbridges 26. Endelig er forholdet mellem calciumkoncentration og aktiv kraft generation (den "force-PCA forhold") ofte af interesse 18 og kan bestemmes ved at udsætte fiberen til en række opløsninger med calcium koncentrationer i området fra under tærsklen for at aktivere den kontraktile Systemet til dem tilstrækkelig til at fremkalde maksimal aktivering og derfor maksimale kraft (F o).
Om meget af det nævnte udstyr er nødvendig til vurdering enkelt fiber kontraktilitet, andet udstyr er ikke absolut nødvendigt. Længden-controller, for eksempel, er afgørende for enhver eksperimentel protokol, der kræver hurtig eller præcis forlængelse eller afkortning af fiberen,men er ikke absolut nødvendige for at vurdere maksimal isometrisk kraft (selv om en nul-force niveau i kraft rekord stadig skal identificeres ved nogle midler). Prismerne der tillader observation af fiberen fra siden, mens nyttige ved vurdering tværsnitsareal, er ikke absolut nødvendigt for at positionere fiberen i den eksperimentelle kammer. Endvidere alternative midler, for at udsætte fiberen til de forskellige eksperimentelle løsninger kunne anvendes, herunder udtænke en manuelt betjent system med kamre eller et enkelt kammer, der tillader hurtig fyldning og tømning af løsninger. Endelig, mens sub-fysiologiske eksperimentelle temperaturer, såsom 15 ° C almindeligvis anvendes til at forbedre reproducerbarheden af mekaniske målinger 1,2,3,5,8,12,17,27, er det muligt at generere gyldige data ved andre temperaturer 23 , 28 så længe virkningerne af temperaturen på opløsningsegenskaber (calcium-koncentration, pH, etc.) tages i betragtning. Præparaterne de test løsninger er blandt de mest kritiske aspekter af de permeabiliserede fiber teknikker beskrevet her. Overvejelser om løsning sammensætning er komplekse, og uden for rammerne af denne artikel. De er beskrevet i trin 5 i protokollen sektion løsninger er designet med vægt på hurtig aktivering af permeabiliseret fiber ved overførsel fra præ-aktivering til aktivering løsninger og samtidig opretholde en konstant ionstyrke, kationiske sammensætning, og osmolaritet 6,29. Andre tilgange til løsning sammensætning har været ansat bemærkelsesværdig succes ved andre forskningsgrupper og typisk gør brug af offentliggjorte bindende konstanter og beregningsværktøjer 27,30,31. Koncentrationerne af calciumioner i de forskellige aktiverende opløsninger er særlig vigtig i undersøgelser med submaksimal aktivering såsom kraft-PCA evalueringer. For forsøg, hvor fibrene er fuldt aktiveret, såsom de beskriverd her, koncentrationen calcium i aktiverende løsning typisk overstiger med en komfortabel margen, der kræves for at opnå maksimal kraft, hvilket gør den præcise viden mindre kritisk. Tilsætning af creatinphosphat er vigtig for buffering de intramyofibrillar ATP og ADP udsving, der ellers ville være forbundet med kontraktil aktivitet. Kreatinkinase er påkrævet for at katalysere phosphat overførsel fra kreatin phosphat til ADP. Under forsøgsbetingelser, der resulterer i høje ATP omsætningshastigheder, herunder arbejder ved høje temperaturer eller måling højhastighedstog afkortning i hurtige fibre 32, skal kreatinkinase tilsættes til opløsningen for at supplere den endogene kreatinkinase, der forbliver bundet til fiberen. Til mindre krævende eksperimentelle betingelser, ATP regenerering system er mindre kritisk 27.
Begrænsninger af permeabiliserede enkelt fiber teknik omfatter følgende. De data, der genereres af disse tests definererkontraktile egenskaber af den specifikke myofibrillære enhed, der var knyttet til den eksperimentelle apparatur. Derfor er dette indfanger kun en lille brøkdel af hele flercellede fiber fra hvilken segmentet blev opnået som på sin side udgør en lille brøkdel af det samlede antal fibre i musklen. Efterforskere bør derfor nøje overveje prøveudtagninger, som kræves for at støtte nogen konklusioner eksperimenterne. Derudover evaluere virkningen af en øvelse træning intervention fiber funktion forudsætter, at de evaluerede fibre faktisk blev rekrutteret i løbet af uddannelsen. Selvom protokollen forsøger at efterligne den naturlige intracellulære miljø af fiberen, sarcolemma permeabilisering processen er ikke-specifik og nødvendigvis giver opløselige intracellulære bestanddele til frit diffundere ind i badning løsninger. En yderligere konsekvens af membranens permeabilitet er en ændring i den osmotiske balance fremgår af en hævelse i fibervolumen 33. Denfiber hævelse øger afstanden mellem actin og myosin filamenter som medfører reduceret calcium følsomhed af myofilament systemet 34,35, men kan vendes ved indførelse af store, osmotisk aktive forbindelser 34. En sidste begrænsning at overveje, er en følge af den teknik, der anvendes til at fastgøre fibrene til den eksperimentelle enheder. Det kræver uvægerligt forvrider rumlige forhold i glødetråden system på og i nærheden af fastgørelsespunkterne, med at deltage funktionelle underskud. Specifikt regioner i fiberen ved og støder op til fastgørelsespunkterne funktionelt kompromitteret og dermed bidrage kunstig serie elasticitet til målesystemet.
Sammenfattende har vi beskrevet et middel til at vurdere den kraft-produktionskapacitet af kemisk permeabiliserede skeletmuskulatur fibre in vitro. Selvom fokus i denne artikel har været på vurderingen af maksimal isometrisk kraft generating kapacitet af humane skelet muskelfibre, kan den eksperimentelle tilgang ændres og udvides til at bestemme en række kinetiske parametre og relationer på tværs af en række arter, pattedyr eller på anden måde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene culture test tube with cap | Fisher Scientific | 14-956-3D | |
| 0.5 ml screw cap microcentrifuge | Fisher Scientific | 02-681-334 | |
| 0.5 ml microcentrifuge caps with o-ring | Fisher Scientific | 02-681-358 | |
| Microcentrifuge cryobox | Fisher Scientific | 5055-5005 | |
| pH meter | Mettler-Toledo | FE20 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
| Nonsterile-suture 10-0 monofilament | Ashaway Line Twine | S30002 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Forceps - Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microdissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | |
| Micrometer drives | Parker Hannifin | 3936M | |
| Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
| Temperature controller | Aplha Omega Instruments | Series 800 | |
| LabVIEW software | National Instruments | - | |
| Computer | Varied | - | |
| Chamber system | Aurora Scientific | 802D | |
| Length-controller | Aurora Scientific | 312C | |
| Force-transducer | Aurora Scientific | 403A | |
| Reagents | |||
| K-proprionate | TCI America | P0510 | |
| Imadizole | Sigma-Aldrich | I0125 | |
| MgCl2•6H20 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Brij 58 | Sigma-Aldrich | P5884 | |
| EGTA (acid) | Sigma-Aldrich | E0396 | |
| Na2H2ATP•0.56H2O | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| HEPES (acid) | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| MgO | Sigma-Aldrich | 529699 | |
| HDTA (acid) | TCI America | D2019 | |
| CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| KOH (1 N) | Sigma-Aldrich | 35113 | |
| HCL (1 N) | Sigma-Aldrich | 318949 | |
| Na2CrP•4H2O | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| pH 10 standard | Fisher Scientific | SB115 | |
| pH 7 standard | Fisher Scientific | SB107 | |
References
- Mendias, C. L., Kayupov, E., Bradley, J. R., Brooks, S. V., Claflin, D. R. Decreased specific force and power production of muscle fibers from myostatin-deficient mice are associated with a suppression of protein degradation. J Appl Physiol. 111 (1), 185-191 (2011).
- Gumucio, J. P., Davis, M. E., Bradley, J. R., Stafford, P. L., Schiffman, C. J., Lynch, E. B., Claflin, D. R., Bedi, A., Mendias, C. L. Rotator cuff tear reduces muscle fiber specific force production and induces macrophage accumulation and autophagy. J Orthop Res. 30 (12), 1963-1970 (2012).
- Mendias, C. L., Roche, S. M., Harning, J. A., Davis, M. E., Lynch, E. B., Sibilsky Enselman, E. r, Jacobson, J. A., Claflin, D. R., Calve, S., Bedi, A. Reduced muscle fiber force production and disrupted myofibril architecture in patients with chronic rotator cuff tears. J Shoulder Elbow Surg. 1 (4), 111-119 (2015).
- Moss, R. L. Sarcomere length-tension relations of frog skinned muscle fibres during calcium activation at short lengths. J Physiol. 292, 177-192 (1979).
- Chase, P. B., Kushmerick, M. J. Effects of pH on contraction of rabbit fast and slow skeletal muscle fibers. Biophys J. 53, 935-946 (1988).
- Moisescu, D. G., Thieleczek, R. Calcium and strontium concentration changes within skinned muscle preparations following a change in the external bathing solution. J Physiol. 275, 241-262 (1978).
- Walker, S. M., Schrodt, G. R. I Segment lengths and thin filament periods in skeletal muscle fibers of the Rhesus monkey and the human. Anat Rec. 178, 63-81 (1974).
- Gollapudi, S. K., Lin, D. C. Experimental determination of sarcomere force-length relationship in type-1 human skeletal muscle fibers. J Biomech. 42, 2011-2016 (2009).
- Brenner, B. Technique for stabilizing the striation pattern in maximally calcium-activated skinned rabbit psoas fibers. Biophys J. 41 (1), 99-102 (1983).
- Claflin, D. R., et al. Effects of high and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans. J Appl Physiol. 111, 1021-1030 (2011).
- Lynch, G. S., Faulkner, J. A., Brooks, S. V. Force deficits and breakage rates after single lengthening contractions of single fast fibers from unconditioned and conditioned muscles of young and old rats. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C249-C256 (2008).
- Frontera, W. R., Rodriguez Zayas, A., Rodriguez, N. Aging of human muscle: understanding sarcopenia at the single muscle cell level. Phys Med Rehabil Clin N Am. 23, 201-207 (2012).
- Malisoux, L., Francaux, M., Theisen, D. What do single-fiber studies tell us about exercise training. Med Sci Sports Exerc. 39 (7), 1051-1060 (2007).
- Widrick, J. L., Stelzer, J. E., Shoepe, T. C., Garner, D. P. Functional properties of human muscle fibers after short-term resistance exercise training. Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol. 238, 408-416 (2002).
- Trappe, S. Effects of spaceflight, simulated spaceflight and countermeasures on single muscle fiber physiology. J Gravit Physiol. 9 (1), 323-326 (2002).
- Malisoux, L., Jamart, C., Delplace, K., Nielens, H., Francaux, M., Thiesen, D. Effect of long-term muscle paralysis on human single fiber mechanics. J Appl Physiol. 102, 340-449 (2006).
- Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029. Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).
- Russell, A. J., et al. Activation of fast skeletal muscle troponin as a potential therapeutic approach for treating neuromuscular diseases. Nature Medicine. 18 (3), 352-356 (2012).
- Krivickas, L. S., Yang, J. I., Kim, S. K., Frontera, W. R. Skeletal muscle fiber function and rate of disease progression in amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 26, 636-643 (2002).
- Mendias, C. L., Marcin, J. E., Calerdon, D. R., Faulkner, J. A. Contractile properties of EDL and soleus muscles of myostatin-deficient mice. J Appl Physiol. 101, 898-905 (2006).
- Lynch, G. S., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Faulkner, J. A. Contraction-induced injury to single permeabilized muscle fibers from mdx, transgenic mdx and control mice. Am J Physiol Cell Physiol. 279, 1290-1294 (2000).
- Mizunoya, Q., Wakamatsu, J., Tatsumi, R., Ikeuchi, Y. Protocol for high-resolution separation of rodent myosin heavy chain isoforms in a mini-gel electrophoresis system. Anal Biochem. 377, 111-113 (2008).
- Hill, A. V. The heat of shortening and the dynamic constants of muscle. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 126, 136-195 (1938).
- Bottinelli, R., Canepari, M., Pellegrino, M. A., Reggiani, C. Force-velocity properties of human skeletal muscle fibres: myosin heavy chain isoform and temperature dependence. J Physiol. 495, 573-586 (1996).
- Edman, K. A. The velocity of unloaded shortening and its relation to sarcomere length and isometric force in vertebrate muscle fibres. J Physiol. 291, 143-159 (1979).
- Brenner, B., Eisenberg, E. Rate of force generation in muscle: Correlation with actomyosin ATPase activity in solution. PNAS. 83, 3542-3546 (1986).
- Moss, R. L. The effect of calcium on the maximum velocity of shortening in skinned skeletal muscle fibres of the rabbit. J. Muscle Res. Cell Motil. 3, 295-311 (1982).
- Pate, E., Wilson, G. J., Bhimani, M., Cooke, R. Temperature dependence of the inhibitory effects of orthovanadate on shortening velocity in fast skeletal muscle. Biophys J. 66, 1554-1562 (1994).
- Ashley, C. C., Moisescu, D. G. Effect of changing the composition of the bathing solutions upon the isometric tension-pCa relationship in bundles of crustacean myofibrils. J Physiol. 270, 627-652 (1977).
- Godt, R. E. Calcium-activated tension of skinned muscle fibers of the frog. Dependence on magnesium adenosine triphosphate concentration. J Gen Physiol. 63, 722-739 (1974).
- Fabiato, A., Fabiato, F. Calculator programs for computing the composition of the solutions containing multiple metals and ligands used for experiments in skinned skeletal muscle cells. Journal de Physiologie (Paris). 75, 463-505 (1979).
- Chase, P. B., Kushmerick, M. J. Effect of physiological ADP concentrations on contraction of single skinned fibers from rabbit fast and slow muscles). Am J Physiol. 268, C480-C489 (1995).
- Godt, R. E., Maughan, D. W. Swelling of skinned muscle fibers of the frog. Biophysical Journal. 19, 103-116 (1977).
- Kawai, M., Wray, J. S., Zhao, Y. The effect of lattice spacing change on cross-bridge kinetics in chemically skinned rabbit psoas muscle fibers. Biophys J. 64, 187-196 (1993).
- Millman, B. M. The filament lattice of striated muscle. Physiol Rev. 78 (2), 359-391 (1998).
- Edman, K. A. Contractile properties of mouse single muscle fibers, a comparison with amphibian muscle fibers. J Exp Biol. 208, 1905-1913 (2005).
- Phillips, S. K., Woledge, R. C. A comparison of isometric force, maximum power and isometric heat rate as a function of sarcomere length in mouse skeletal muscle. Pflügers Archiv. 420, 578-583 (1992).
- Stephenson, D. G., Williams, D. A. Effects of sarcomere length on the force-pCa relation in fast and slow-twitch skinned muscle fibres from the rat. J Physiol. 333, 637-653 (1982).
