Summary
تحليل خصائص مقلص من البشرة كيميائيا، أو permeabilized، ألياف العضلات الهيكلية يوفر وسيلة قوية يمكن من خلالها تقييم وظيفة العضلات على مستوى الخلية عضلة واحدة. في هذه المادة ونحن الخطوط العريضة لتقنية صحيحة وموثوقة لإعداد واختبار permeabilized ألياف العضلات الهيكلية في المختبر.
Introduction
الوظيفة الأساسية للعضلات الهيكل العظمي هو لتوليد القوة. وأثارت قوة العضلات في الجسم الحي من خلال سلسلة معقدة من الأحداث التي تشمل إمكانات عمل العصب المحرك وناقل الحركة العصبية والعضلية، إمكانات العمل ألياف العضلات، وإطلاق سراح الكالسيوم داخل الخلايا، وتفعيل نظام البروتينات التنظيمية ومقلص. لأن جيل القوة هو النتيجة النهائية لهذا التسلسل، ويمكن أن يكون سبب عجزا في القوة من جانب فشل واحد أو أكثر من الخطوات الفردية. والسمة الأساسية لإعداد الألياف permeabilized هو أنه يزيل معظم الخطوات المطلوبة لتوليد القوة في الجسم الحي، فقط مع المهام التنظيمية ومقلص المرتبطة جهاز myofibrillar المتبقي. المحقق يفترض السيطرة على تسليم تفعيل الكالسيوم والطاقة (ATP)، ويكافأ مع نظام مبسط يسمح تقييم الهياكل التنظيمية ومقلص المعزولة في التعاون وطنهمnfiguration. قياسات القوة باستخدام ألياف العضلات الهيكلية permeabilized بالتالي فهي قيمة عند تقييم التغيرات في وظائف العضلات التي لوحظت في الجسم الحي. على سبيل المثال، وقد استخدمنا هذه التقنية لتميز القدرة على توليد القوة من الألياف من myostatin نقص الفئران 1 وتقييم أسباب ضعف العضلات المستمر عرضت التالية الدوار المزمن الدموع صفعة 2،3.
يمكن تتبع منهجية الألياف permeabilized الحديثة لدراسات مؤثرة مبكرة 4،5 و هو حاليا قيد الاستخدام من قبل عدد من المجموعات البحثية. على الرغم من وصفت التقنيات في الأدب، وأنها لم يتم تقديمها حتى الآن في شكل شريط فيديو. الهدف من هذه المقالة هو لتوضيح، تقنية صحيحة وموثوقة تحديث لقياس القدرة القصوى لتوليد قوة من الألياف واحدة من permeabilized كيميائيا عينات العضلات والهيكل العظمي. لتحقيق ذلك، وهو جزء من الألياف الفردية (المشار إليها هنا باعتبارها ̶0؛ الألياف ") يستخرج من حزمة permeabilized مسبقا من الالياف وضعت في غرفة تجريبية تحتوي على حل الاسترخاء، والسمة المميزة منها هو تركيز الكالسيوم الذي هو <10 نانومتر. ثم يتم إرفاق الألياف في نهاية واحدة إلى قوة محول وعلى الطرف الآخر إلى وحدة تحكم طول. مع الألياف التي عقدت في طول قسيم عضلي الأمثل، ويتم نقله إلى حل تفعيل يحتوي على تركيز الكالسيوم الكافي لانتزاع أقصى تفعيل وبالتالي أقصى قوة تقلص متساوي القياس. يتم الحصول على بيانات القوى وتخزينها وتحليلها باستخدام جهاز كمبيوتر شخصي.
Protocol
يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات التي تجرى على الحيوان أو الإنسان وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة، واللوائح، والهيئات التنظيمية. جامعة ميشيغان اللجنة على استخدام ورعاية الحيوانات (UCUCA) وجامعة ميشيغان المركز الطبي جنة المراجعة المؤسساتية الموافقة على جميع الحيوانات والإنسان الإجراءات الموضحة في هذه المقالة.
1. جعل تشريح وتخزين محلول المخزون
ملاحظة: وحدات التخزين النهائي المحدد في التعليمات التالية يمكن زيادتها إلى أعلى أو أسفل كما تريد.
- في دورق 1000 مل إضافة 800 مل من الماء منزوع الأيونات (ASTM نوع 1). الحفاظ على تحريك لطيف، إضافة كافة المركبات المدرجة في الجدول 1 إلى الماء منزوع الأيونات والسماح لهم حل.
مركب المطلوب اضرب. (M) صيغة الوزن (ز / مول) أضف إلى 1 L (ز) </ tr>K-بروبيونات 0.250 112.17 28،040 إميدازول 0.040 68.08 2.720 EGTA 0.010 380.40 3.800 MgCl 2 • 6H 2 O 0.004 203.31 0.813
الجدول 1: تشريح وتخزين محلول المخزون المكونات.
- جلب إلى الحجم النهائي من 1000 مل مع الماء منزوع الأيونات. لاحظ أنه لا لزوم لها لدرجة الحموضة الحل في هذا الوقت. تخزين الحل السهم عند 4 درجات مئوية.
2. جعل حل التخزين
- لجعل 200 مل من محلول التخزين، وتبدأ مع 100 مل من تشريح وحل سهم التخزين في كوب 250 مل. إضافة ما يكفي من نا 2 H 2 ATP لجلب الأدينوزين النهائيثلاثي الفوسفات (ATP) والتركيز على 2 مم. جلب إلى الحجم النهائي من 200 مل مع الجلسرين. ضبط درجة الحموضة إلى 7.00 مع هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH). تخزين حلول التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
ملاحظة: نظرا لطبيعة لزجة من الجلسرين أنه يمكن أن يكون من الصعب الاستغناء بدقة من حيث الحجم. وبسبب هذا، ونحن عادة إضافة الجلسرين وزنا (100 مل من الجلسرين تزن حوالي 126 غرام).
3. جعل تشريح الحل
- لجعل 200 مل من تشريح الحل، تبدأ مع 100 مل من تشريح وتخزين محلول المخزون في كوب 250 مل.
- إضافة ما يكفي من نا 2 H 2 ATP لتحقيق تركيز ATP النهائي ل2 مم. ضبط درجة الحموضة إلى 7.00 مع KOH. جلب الحجم النهائي إلى 200 مل مع الماء منزوع الأيونات. قسامة في حجم 2.5 مل وتخزينها في -80 ° C.
4. جعل تشريح الحل مع بريج 58
ملاحظة: بريج 58 هو المنظفات غير الأيونية أن يعطل (permeabilizes) طبقات ثنائية الدهون.
<رأ>5. جعل اختبار حلول
ملاحظة: وفيما يلي مقتبس من Moisescu وThieleczek 1978 (6). انظر مناقشة لتعليقات إضافية على إعداد حلول الاختبارات.
- إعداد ثلاثة منفصلة 1000 مل الأكواب وصفت "الاسترخاء"، "قبل تفعيل" و "تنشيط". إضافة 400 مل من الماء منزوع الأيونات إلى كل كوب.
- إضافة المركبات مبين في الجدول رقم 2 إلى الدورق المناسب ومن ثم تسخين الحلول إلى ما بين 70 درجة مئوية و 80 درجة مئوية. الحفاظ على درجة حرارة المحلول من 70-80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع التحريك المستمر.
ملاحظة: عند درجة حرارة 70-80 ° C يساعد في elimiأمة من حمض الكربونيك شكلت من خلال تفاعل كربونات الكالسيوم مع EGTA في حل تفعيل. يتم التعامل مع الاسترخاء حلول حل وقبل تفعيل بنفس الطريقة التي يعامل بها حل تفعيل للحفاظ على التناسق.
| SOLUTION الاسترخاء | PRE-تفعيل SOLUTION | بتفعيل SOLUTION | |||||
| مركب | صيغة الوزن (ز / مول) | تركيز المطلوب (ملم) | مطلوب كتلة (ز) | تركيز المطلوب (ملم) | مطلوب كتلة (ز) | تركيز المطلوب (ملم) | مطلوب كتلة (ز) |
| HEPES (حمض) | 238.30 | 90.0 | 10،724 | 90.0 | 10،724 | 90.00 | 10،724 |
| أهداب الشوق | 40.31 | 10.3 | 0،208 | 8.5 | 0،171 | 8.12 | 0،164 |
| EGTA (حمض) | 380.40 | 52.0 | 9.890 | 52.00 | 9.890 | ||
| HDTA (حمض) | 348.36 | 50.0 | 8،709 | ||||
| كربونات الكالسيوم 3 | 100.10 | 50.00 | 2،503 | ||||
الجدول 2: إعادةlaxing، قبل تفعيل وتنشيط مكونات الحل.
- تبريد حل لدرجة حرارة الغرفة وإضافة ما يكفي نان 3 / KOH لجلب النهائي تركيز نان 3 إلى 1 ملم.
تنبيه: نان 3 (أزيد الصوديوم) مادة سامة. الرجوع إلى MSDS الكيميائية قبل التعامل مع هذه المادة الكيميائية.- لجعل 100 مل من 100 ملي حل أزيد الصوديوم، إضافة 0،65 غرام من نان 3-10 مل من 1 N KOH. التكيف مع الحجم النهائي من 100 مل مع الماء منزوع الأيونات.
- ضبط درجة الحموضة إلى حوالي 7.10 باستخدام KOH.
- بعد الخطوة 5.4 تضيف كافية نا 2 H 2 ATP لإعادة تركيز ATP النهائي إلى 8 ملي ويكفي نا 2 بروتين سي التفاعلي لجلب الكرياتين phosophate النهائي (CRP) والتركيز على 10 ملي.
- جلب كل حل للحجم النهائي من 500 مل باستخدام الماء منزوع الأيونات. البرد أو الحرارة الحلول لدرجة الحرارة التي سيتم تنفيذ التجارب، ثم استخدم KOH لجلبالرقم الهيدروجيني إلى 7.10 مع الحفاظ على درجة الحرارة تلك.
- إضافة الاسترخاء حل لدورق يحتوي على الحل قبل تفعيل مثل هذا الحل النهائي قبل تفعيل هي جزء 1 الاسترخاء حل في 500 حل تفعيل مسبقا. قسامة في حجم 2.5 مل وتخزينها في -80 ° C.
6. جعل خياطة الحلقات
- بادئ ذي بدء حبلا من غير معقمة USP 10-0 النايلون حيدة خياطة.
- استخدام ملقط لخلق حلقة مع حبلا باستخدام تقنية عقدة الذراع مزدوجة. خفض عقدة في حجم ما يقرب من 750 ميكرون القطر. ويمكن تقييم قطرها حلقة تحت المجهر باستخدام علامات العدسة graticule.
- استخدام microdissecting المقص لإزالة خياطة الزائدة ولم يتبق سوى حلقة والصغيرة (500 ميكرون) ذيول على أي من الجانبين. ويرد مثال من حلقة النهائية في الشكل 1.
- كرر الخطوات بذلت 6،2-6،3 حتى 4 حلقات قابلة للاستخدام. متجر حلقات في سيليكون مطلي المطاط الصناعي بيترط طبق لاستخدامها في المستقبل.
ملاحظة: يرجى ملء أربعة حلقات خياطة لكل الألياف اختبارها.
7. حزمة عينة
ملاحظة: تصف الخطوات التالية إجراء تشريح العينة الأصلية إلى "حزم" التجريبية أصغر من التي في نهاية المطاف سوف يتم استخراج الألياف واحدة واختبارها. في جميع الأوقات ينبغي أن يعامل العينة بعناية. لغرض هذا الوصف، وستعطى تعليمات وكأن المحقق هو اليد اليمنى.
- الحصول على عينة من الفائدة وتحويلها إلى مرفق حيث تشريح ستجرى.
ملاحظة: سوف طرق خزعة الأنسجة تختلف تبعا لنموذج تجريبي وتصميم الدراسة. حيثما كان ذلك ممكنا، ينبغي الحفاظ نضح العضلات حتى ذلك الوقت من الخزعة. - إذا كانت العينة على أن يتم تحويلها بين موقع الحصاد وموقع تشريح، نقله في قنينة تحتوي على حل تشريح المبرد في حين حافظت على الجليد.
- إعداد طبق بتري مطلي المطاط الصناعي-5 سم سيليكون مع حل تشريح المبردة و2-3 دبابيس تصاعد الحشرات (100 ميكرون القطر، والفولاذ المقاوم للصدأ).
- نقل العينة إلى الطبق. تأكد من أن العينة لا تزال مغمورة عن طريق إضافة المزيد حل تشريح إذا لزم الأمر.
- تفقد العينة تحت المجهر والتلاعب به لتحقيق المواءمة بين محاور طولية من الألياف تجاه الكتف الأيمن من المحقق (الشكل 2). ثم ترسيخ العينة إلى الطبق تعلق في الزوايا.
ملاحظة: الاستفادة من أي نوع من الأنسجة الضامة المتبقية في ترسيخ نقاط في هذا الوقت لأن هذا سوف تعظيم استخدام عينة والحفاظ على سلامة الألياف. قد علقت حزمة التوتر طفيف للمساعدة في تحديد هوامش بين الألياف. - مع ملقط في اليد اليسرى ومقص microdissecting في الحق، تبدأ تشريح بلطف ربطة على طول هوامش الطولية بين ألياف
ملاحظة: اعتمادا على لطول العام، مما زاد من تشريح حزمة في العديد من حزم أصغر. - تأكد من أن أبعاد حزمة تقيس حوالي 0.5-1 ملم في العرض و≥3 ملم في الطول. تقييم الأبعاد باستخدام مجهر مع علامات graticule في العدسة، أو عن طريق وضع مسطرة تحت الطبق.
- إزالة وتجاهل أي نوع من الأنسجة التي تضررت من ملقط أو دبابيس نتيجة لعملية تشريح.
- كرر العملية حتى تم تشريح عدد كاف من حزم أو حتى قد استنفدت العينة.
ملاحظة: عدد الحزم التي يمكن الحصول عليها سوف تعتمد على العديد من العوامل بما في ذلك حجم وحالة من العينة الأولية، والتشكل من العضلات، ومهارة المحقق.
8. ألياف Permeabilize
- وأضاف نقل حزم من حل تشريح في قارورة تحتوي على 2.5 مل من الطازجة والمبردة، تشريح حل مع المنظفات غير الأيونية "بريج 58 '(0.5٪، ث / ت). احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة مع بعض الأحيان، الإثارة لطيف. تأكد من أن حزم تظل مغمورة في جميع أنحاء الحضانة.
- في نهاية الحضانة 30 دقيقة، ونقل حزم إلى قارورة تحتوي على حل تشريح الطازجة (لا بريج 58) وتستنهض الهمم بلطف لفترة وجيزة لإزالة أي مواد التنظيف المتبقية.
9. إعداد حزم للتخزين
- نقل حزم إلى قارورة تحتوي على حلول التخزين المبردة واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
10. تخزين حزم
- في اليوم التالي، وإعداد مربع التخزين، وقادرة على تحمل -80 ° C، مع ما يكفي من الفردية 0.5 مل المسمار غطاء أنابيب مخروطية لاستيعاب جميع الباقات التي تم الحصول عليها خلال عملية تشريح (حزمة واحدة في أنبوب). ينبغي أن تملأ كل أنبوب مخروطي مع 200-400 ميكرولتر من حل تخزين جديدة.
- نقل حزم في أنابيب مخروطية وصفت بشكل فردي. تأكد من أن حزمة لا تمسكجانب من أنبوب مخروطي أو تطفو على السطح من الحل. تتويج الأنابيب المخروطية وتخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى يوم الاختبار.
11. إعداد جهاز التجريبي
ملاحظة: يتكون الجهاز مخصص للمرحلة التي تضم وحدة تحكم طول وقوة محول، نظام الغرفة المتحركة والمجهر تشريح 10X. منشآت محرك ميكرومتر تسمح للتلاعب الدقيق للأسطح مرفق الألياف. وتستخدم أنماط الحيود ليزر لتقدير طول قسيم عضلي. يتم تسجيل البيانات التي تم إنشاؤها خلال التجريب على جهاز كمبيوتر شخصي. انظر الشكل 3 للصور المشروح للانشاء التجريبية.
- ذوبان الجليد قارورة واحدة كل من الاسترخاء، قبل تفعيل والحلول تفعيل والحفاظ على الجليد. لاحظ أن ATP وبروتين سي التفاعلي هي مركبات عطوب التي ينبغي الحفاظ على درجات الحرارة الباردة.
- إعداد المجهر، وأجهزة الاختبار والكمبيوتر المرتبطة للاستخدام. ملء الغرفة التجريبية الأولى مع الاسترخاء الحل. في جهازنا، الغرفة الأولى تحتوي على المناشير التي تسمح للمحقق لتصوير الألياف من الجانب. ملء الغرفة التجريبية الثانية مع الحل قبل تفعيل والثالث مع تفعيل الحل.
- ضبط درجة الحرارة بحيث مقياس الحرارة في غرفة يقرأ 15 ° C. موضوع حلقتين خياطة مستعدة على الأسطح غير القابل للصدأ الصلب المرفق تمتد من كلا قوة محول وطول وحدة تحكم (الشكل 5A).
12. استخراج Permeabilized واحد من الألياف
- ذوبان الجليد حزمة الألياف المصالح، ونقل إلى طبق بتري مطلي المطاط الصناعي السيليكون مع الطازجة والمبردة حل الاسترخاء. تأمين حزمة مع دبابيس على حد سواء، وضمان المغمورة ذلك.
- باستخدام ملقط، فهم الألياف في نهاية واحدة والبدء في استخراج بسلاسة على طول محورها الطولي.
ملاحظة: تلف الضاغط لنهاية الألياف التي تسببها ملقط ليست مصدر قلق في هذا الوقت منذ لن يتم اختبار خصائص مقلص في هذا المجال. ومع ذلك، ينبغي توخي الحذر عند استخراج الألياف من حزمة منذ الالتصاقات بين الألياف والمصفوفة خارج الخلية قد يؤدي إلى التوتر المفرط، مما يؤدي في نهاية المطاف الأضرار التي يسببها تمتد ل. لاحظ أن تفاوت كبير بين وجود العضلات في الدرجة التي الألياف تلتزم المصفوفة خارج الخلية المحيطة بها. يجب التخلص من الألياف التي يشتبه أنها تضررت من هذا القبيل تمتد. - استخدام شفرة حلاقة أو مشرط لتعديل طرف الماصة كما هو موضح في (الشكل 4). إدخال الألياف إلى طرف جنبا إلى جنب مع كمية صغيرة من الاسترخاء الحل. نقل واحد من الألياف من طبق بتري مطلي المطاط الصناعي السيليكون إلى الغرفة التجريبية التي تحتوي على حل الاسترخاء.
13. جبل واحد من الألياف
ملاحظة: A depicti خطوة بخطوةويمكن الاطلاع على في الشكل (5).
- توجيه بلطف مع ملقط، وإزالة الألياف من طرف الماصة وتثبيته على وحدة تحكم طول (يسار) باستخدام أول حلقة خياطة.
- استخدام واحد، والحركة السلسة عندما تشديد حلقة مع ملقط. ضمان أن التوتر على قدم المساواة والعكس هو تطبيقها على حد سواء من خياطة.
- يجب أن يتم ربط الحلقة الأولى حوالي 1 ملم إلى 2 ملم من نهاية السطح مرفق طول وحدة تحكم.
- التعامل مع الطرف الآخر من الألياف تجاه قوة محول (يمين) وتأمين الألياف باستخدام نفس الإجراء. إزالة خياطة الزائدة باستخدام مقص microdissecting (الشكل 5C).
- وضع الألياف تحت كمية صغيرة من التوتر من خلال زيادة المسافة بين طول وحدة تحكم وقوة محول الأسلحة باستخدام الأشعة تنسيق محرك ميكرومتر (الشكل 3A).
- كاتب الموضوع الحلقة الثانية أكثر من الأولى وترسيخ الأليافعند نقطة ضمن 0.2 ملم من نهاية سطح المرفق قوة محول (الشكل 5D).
- إزالة خياطة الزائدة باستخدام مقص microdissecting.
- عملية مرفق الألياف يمكن أن يؤدي إلى فقدان حل من الغرفة. إذا لزم الأمر، إضافة حل أكثر استرخاء لضمان السطح من الحل هو مسطحة (لا مقعرة ولا محدبة). A سطح مستو مهم عند تقييم طول قسيم عضلي باستخدام حيود الليزر.
- محاذاة بالتوازي الألياف إلى الجوانب من الغرفة التجريبية عن طريق ضبط الموقف للتحكم طول في اتجاه المحور الصادي.
- مسح الألياف باستخدام عرض الجانب المنشور وضبط الموقف للتحكم طول في اتجاه محور Z حتى الألياف موازية لأرضية الغرفة.
ملاحظة: وضعية موازية الألياف إلى أرضية الغرفة ويمكن تحقيق ذلك من دون رشة عمل الغرفة من خلال التركيز أولا على واحدة من نهاية الألياف ورالدجاجة، من دون ضبط التركيز المجهر، ليصل الطرف الآخر من الألياف إلى التركيز باستخدام برنامجها ميكرومتر ض محور. - إذا كانت الألياف بأي شكل من الأشكال ملوي، الملتوية أو أضرار نتيجة لعملية التركيب، يجب التخلص من الألياف والألياف الجديد المرفقة.
14. تعيين الأمثل قسيم عضلي طول
- عندما تم تنسيق الألياف بشكل صحيح داخل الغرفة، إدراج الشاشة الهدف معايرة على الجانب الأمامي من المجهر ومحاذاته على الحجرة التجريبية الأولى.
ملاحظة: يتم معايرة الشاشة الهدف باستخدام معادلة صريف القياسية، λ = SL sinθ، حيث SL هو طول قسيم عضلي، θ هي الزاوية الحيود بين 0 ° و 1 ° الحزم diffracted وλ هو الطول الموجي لليزر. - بدوره على الليزر وضبط الموقف من المرحلة مثل أن الليزر يمر عبر وسط الألياف.
تنبيه: تتركز ضوء الليزر يمكن أن يلحق ضررا رس البصر. أبدا محاولة لتصور الألياف من خلال المجهر عندما الليزر على. - وضع الألياف مع الاحترام لشعاع الليزر إلى حيد الضوء ضوء الليزر ومراقبة وطقطق تدخل على الشاشة الهدف معايرة (الشكل 6). إطفاء الأنوار لتصور هذا النمط أكثر وضوحا.
ملاحظة: إذا، مع تحديد المواقع الصحيحة من شعاع الليزر، وينظر إلى أي نمط التدخل، وهذا يشير إلى أن مكونات myofibrillar من الألياف غير طبيعية / التالفة، وأنه ينبغي استبدال الألياف مع واحدة جديدة. - لضبط قسيم عضلي الطول، زيادة أو نقصان التوتر على الألياف باستخدام وحدة تحكم طول محور س محرك ميكرومتر حتى لوحظ التباعد المطلوب من ضوء diffracted على الشاشة الهدف.
ملاحظة: إن طول قسيم عضلي الأمثل من الألياف تعتمد على أنواع من الحيوانات التي تم الحصول على عينة. ويفترض عادة بطول قسيم عضلي من 2.7 ميكرون ليكون أفضل عندما الحميرالغناء الألياف من 7،8 الأنسجة البشرية. - بعد أن تم تعيين الأمثل طول قسيم عضلي، وقياس المسافة بين اثنين من الغرز الأعمق. ويتم إنجاز هذا أكثر سهولة باستخدام قراءات رقمية على القرص ميكرومتر التي تسيطر على الحركة محور س للغرفة. ضع دائرة على ان يكون الشعر عبر الرأسي للالعدسة يتم محاذاة على الحدود الداخلية للخياطة الأعمق وصفر قراءات رقمية على القرص ميكرون.
- ترجمة المرحلة على طول محور س نسبة إلى المجهر حتى وصلت إلى خياطة الأعمق أخرى. فإن العرض الرقمي يشير إلى طول الألياف. يجب أن تسجل هذه القيمة كما طول الألياف، L و.
ملاحظة: يجب أن يكون مفهوما أن المسافة بين اثنين من الغرز الأعمق ستحدد طول الوظيفي للأنسجة مقلص يجري تقييمها. المحقق أن يسعى جاهدا من أجل التناسق في هذا البعد (أي L و) ضمنسلسلة من التجارب.
15. تقدير مستعرضة المنطقة (CSA)
- الحفاظ على الألياف في L و واستخدام الكاميرا محمولة على المجهر لالتقاط صورة التكبير عالية من الجزء المركزي من الألياف من كل من أعلى والآراء الجانب. عرض الصور الجانبية يمكن الحصول عليها باستخدام منظار جزءا لا يتجزأ في جانب من الغرفة.
ملاحظة: عندما يتحول بين أعلى والآراء الجانب المهم لتحريك المجهر فقط في ص الاتجاه لضمان أن الصورتين هي "في السجل"، وبالتالي تظهر رأيين مختلفين من نفس القسم من الألياف. - الحصول على القياسات في هذا الوقت لتطبيع القوة المطلقة في وقت لاحق في الدراسة. ووصف تقنيات للحصول على هذه القياسات في وقت لاحق ويتضح في أرقام 7A و7B.
16. حصول انكماش متساوي القياس
ملاحظة: على الرغم من البيانات التي تولدت خلال هذه التجربةالصورة يمكن جمعها وتفسيرها دون استخدام الحاسوب والبرمجيات التي تسمح لاقتناء وعرض وتخزين وتحليل الردود القوة هو مفيد. برنامج ابفيف مخصصة تم إنشاؤها بواسطة مختبرنا يسمح لهذه الوظائف، فضلا عن القدرة على تصميم "القطارات الحركة" التي تحكم عمل للتحكم طول خلال التجربة.
- تأكد من أن درجة حرارة الاسترخاء، قبل تفعيل والحلول تفعيل مستقرة عند 15 درجة مئوية.
- استخدام برنامج حاسوبي لمراقبة الغرفة لتحريك الألياف إلى الغرفة التي تحتوي على الحل قبل تفعيل واحتضان هناك لمدة 3 دقائق.
ملاحظة: يتم تخزينها مؤقتا الحل قبل تفعيل ضعيفة ل Ca 2+، مما أدى إلى تفعيل وقوة التطور السريع جدا على إدخال الألياف إلى حل تفعيل. - مع 10 ثانية المتبقية في الحل قبل تفعيل وطول الألياف الحفاظ على L و، إنشاء صفر FOمستوى RCE في السجل التجريبي.
ملاحظة: الحركة 'البحث عن قوة صفر "للتحكم طول تكشف عن مستوى قوة محول الذي يتوافق مع قوة صفر (أي الألياف يصبح لفترة وجيزة الركود نتيجة للحركة). قوة السلبي هو الفرق بين أن الصفر ومستوى القوة فقط قبل حركة-التصفير محول. - في نهاية 3 دقيقة، نقل الألياف إلى الغرفة التي تحتوي على الحل تفعيل والسماح أقصى قوة متساوي القياس لتطوير كما يتضح من هضبة الجولان في القوة التي تسبقها ارتفاعا سريعا.
- بعد أن بلغ أقصى قوة متساوي القياس، استخدام وحدة تحكم طول لتحديد الناتج قوة محول الذي يتوافق مع قوة صفر في غرفة تحتوي على الحل تفعيل.
ملاحظة: هذا أمر ضروري لإخراج قوة محول الذي يتوافق مع قوة الصفر، بصفة عامة، مختلفة عن كل غرفة مليئة الحل. - وبعد التوصل إلى القوة الثانية ررateau، والعودة الألياف إلى الغرفة التي تحتوي على حل الاسترخاء. اختبار اكتمل الآن. لاختبار الألياف متعددة خلال أي نضح دورة واحدة كل الحلول وإضافة حلول جديدة المبرد.
ملاحظة: ينبغي النظر في بروتوكولات الدراجات برينر عندما انتزاع تقلصات القصوى على مدى فترة طويلة من الزمن. وقد تبين أن هذا البروتوكول للحفاظ على الخصائص الهيكلية والميكانيكية في الألياف تفعيلها الحد الأقصى 9.
Representative Results
يجب أن تظهر، والألياف واحدة permeabilized كيميائيا صحية موحدة في الشكل ويكون التباعد العتابي ثابت عندما ينظر تحت التكبير عالية. يجب التخلص من الألياف التي هي مرنة عندما يتلاعب مع ملقط أو لديك أضرار هيكلية واضحة.
ويتم تحليل الصور الرقمية عالية التكبير التي اتخذت خلال الخطوة 15 لمدة 5 قياسات قطرها يقترن طول القسم الوسطي من الألياف. ويقدر الألياف CSA بافتراض أن المقطع العرضي بيضاوي الشكل ويبلغ متوسطها 5 القياسات CSA الفردية كما هو مبين في الشكل 7A. يقدم الشكل 7B أيضا لتوضيح كيفية أبعاد الألياف في عرض واحد يمكن أن تكون مختلفة بشكل ملحوظ مقارنة مع أبعاد المقترنة في الرأي الآخر (أي العابرة لل أقسام ليست، بصفة عامة، وإيابا).
وتظهر آثار قوة تمثيلية من الألياف البطيئة والسريعة الإنسان في أرقام 8A و8B، على التوالي. الفولتويكتسب الناتج (ه) من قوة محول خلال اختبار وتحويلها إلى قوة (MN) باستخدام الحصول على البيانات وبرامج التحليل (ابفيف) الشكل 9 يوضح النهج المستخدمة لتقييم أقصى درجات القوة النشطة (F س)، والذي يحسب بطرح القوة المطلوبة للحفاظ على الألياف في الأمثل طول قسيم عضلي بينما في حالة استرخاء (قوة سلبية، F P)، من أعظم قوة متساوي القياس المتقدمة خلال تفعيل الألياف القصوى (القوة الكلية، F T). منذ إخراج قوة محول الذي يتوافق مع قوة الصفر، بصفة عامة، مختلفة عن كل دائرة من الدوائر الاستحمام مختلفة، ونحن نتهاون لفترة وجيزة الألياف في كل من مرحلة ما قبل تفعيل وتنشيط حلول للقبض على مستوى الصفر القوة في سجل التجريبي. يستخدم تطبيع أقصى قوة نشطة من جانب الألياف CSA لتوليد المزيد من القيمة الإعلامية للقوة معينة (SF س). لأنه يأخذ في الاعتبار CSA من الألياف، SF س
الخصائص المميزة للأصحاء، والألياف الكبار من في Claflin وآخرون. 2011 10 للإنسان، Mendias وآخرون. 2011 1 للماوس وGumucio وآخرون 2012 2 لالفئران هي مفصلة في الجدول 3 جميع البيانات الواردة في الجدول رقم 3 تم إنشاؤها باستخدام التقنيات الموضحة في هذه المقالة.
| بشري (الوحشية المتسعة) | فأر (EDL) | فأر (الشوكة) | ||||
| ذكر | أنثى | ذكر | ذكر | |||
| نوع 1 | نوع 2A | نوع 1 | نوع 2A | (وليس كتابتها) | (وليس كتابتها) | |
| CSA (ميكرون 2) | 4880 - 6900 | 5270 - 8380 | 3870 - 5470 | 4010 - 5610 | 1850 - 3080 | 5290 - 8010 |
| F س (MN) | 0،79-1،17 | 1،02-1،54 | 0،64-0،97 | 0،71-1،07 | 0،14-0،25 | 0،55-0،97 |
| SF س (باسكال) | 142-182 | 165-210 | 156-193 | 172-214 | 67-94 | 102-131 |
| ن | 129 | 160 | 149 | 207 | 37 | 94 |
الجدول 3. الخصائص النموذجية لصحية، والألياف الكبار من المتسعة الوحشية البشري 10، والماوس باسطة إبهام اليد 1 و 2 الفئران الشوكة العضلات. ومن المقرر أطوال قسيم عضلي الأمثل عند 2.7 ميكرون للألياف الإنسان 7،8 و 2.5 ميكرون لكل من الماوس (36، 37) والألياف الفئران (38). وكانت نطاقات التجريبية L و (25 و 75 الربعية عشر) 1،39-1،73 مم، 1،17-1،53 مم و1،32-1،59 مم للإنسان، والماوس والفئران على التوالي. نطاقات معروضة تشير إلى 25 و 75 تشرين الربعية وN هو عدد من الألياف التي تم اختبارها.
أكثر المشاكل شيوعا شهدت خلال الاختبارات تضم زلة حلقة خياطة، مما يؤدي الى رد و القوةه مع "الصيد" مثل هذا موضح في الشكل رقم 10A، والمسيل للدموع سمك الكامل أو الجزئي من الألياف، مما يؤدي الى رد فعل القوة التي يعود فجأة نحو أو إلى (كسر) صفر في حين لا تزال مغمورة الألياف في تفعيل الحل (الشكل 10B). إذا كان زلة، المسيل للدموع أو كسر يحدث خلال التجربة، يجب التخلص من الألياف والبيانات استبعاد، على الرغم من الاحتفاظ بسجل للفشل الألياف ويمكن أيضا أن تكون مفيدة لل11. ومن النتائج السلبية التي قد تواجهها هي تفعيل المبكرة من الألياف بينما في تفعيل ما قبل الحل (الشكل 10C). تفعيل جزئي في حل ما قبل تفعيل يوحي التلوث عبر الآبار كبير (أي زيادة غير مقصودة في تركيز الكالسيوم في مرحلة ما قبل تفعيل جيدا). في هذه الحالة، يجب أن يستنشق عن الحمامات وتشطف جيدا بالماء منزوع الأيونات. تجفيف الأسطح الفاصلة بين المجلسين هو أيضا recommenدائرة التنمية الاقتصادية كما الرطوبة أو التكثيف في هذه المناطق قد يؤدي إلى فتل من حل بين الحمامات. قرار إدراج أو استبعاد والبيانات تعتمد في نهاية المطاف على التركيز التجريبية وبالتالي ينبغي أخذها في الاعتبار عند تصميم هذه الدراسة.
الشكل 1: حلقة خياطة (10-0 حيدة النايلون خياطة).
الشكل 2: تشريح حزمة الملقط هي في اليد اليسرى، مقص تسليخ مجهري هي في اليد اليمنى. خط أحمر يشير إلى اتجاه ايجابي في الرسغ ومقص مع محاور طولية من الألياف.
الشكل (3): (A) جهاز اختبار مع مكونات المسمى. (أ) غرف التجريبية مع قيعان شفافة. (ب) طول وحدة تحكم. (ج) قوة-محول. (د) مصدر الضوء. (ه) طول تحكم XYZ محرك ميكرومتر مع العرض الرقمي. (و) محرك المرحلة ميكرومتر مع العرض الرقمي. (ز) قوات محول محرك XYZ ميكرون. (ح) منهاج معايرة الليزر حيود الشاشة الهدف. (ط) اهتزاز العزلة الجدول. (B) عرض عن قرب دائرة من الدوائر التجريبية. السطح (ي) الفولاذ المقاوم للصدأ المرفق تمتد من وحدة تحكم طول. السطح (ك) الفولاذ المقاوم للصدأ المرفق تمتد من قوة محول. (ل) الجانبية الرأي المنشور. (م) الإسكان للوحدات التبريد الحرارية. (ن) الحرارية للإبلاغ غرفة الشركة المصرية للاتصالاتmperature.
الرقم 4: التعديل 100 ميكرولتر طرف الماصة تستخدم لنقل الألياف من طبق تشريح لغرفة التجريبية.
الرقم 5: تركيب الألياف واحد على جهاز تجريبي (A) حلقات خياطة محضرة مترابطة على الفولاذ المقاوم للصدأ الأسطح المرفق. (B) الألياف نقله إلى الغرفة التجريبية. (C) الألياف ترتكز على الفولاذ المقاوم للصدأ الأسطح المرفق من قبل الزوج الأول من الحلقات خياطة مع خياطة الزائدة إزالتها. (D) الزوج الثاني من الحلقات خياطة الخيوط فوق الجزء العلوي من الحلقات خياطة الأولى، وتعادل في المكان.
الشكل (6): يتم تقييم طول قسيم عضلي قبل إسقاط نمط التدخل ليزر على شاشة الهدف معايرة (أ) مصدر الليزر. (ب) مرآة. (ج) شاشة الهدف. نمط التدخل (د) ليزر.
الرقم 7: (A) تحديد منطقة الألياف مستعرضة في الأمثل طول قسيم عضلي (2.7 ميكرون البشرية =). بافتراض أن بيضاوي الشكل المقطع العرضي، ويتم احتساب CSA لكل من خمسة مواقع على طول القسم الوسطي من الألياف ومتوسط القياسات الفردية خمسة وكما ذكرت الألياف CSA. يمثل 2A كبار قطرها نظر وغير محور واحد من القطع الناقص، 2B يمثل عرض الجانب القطر وهي محور آخر من القطع الناقص. (B) وصور الألياف التمثيلية التي توضح كل من قياسات قطرها خمسة المقابلة التي اتخذت في كل وجهة نظر العلوي والجانب.
الرقم 8: آثار القوة التمثيلية من المتسعة الإنسان السليم الوحشية الألياف العضلية (A) اكتب 1 الألياف (CSA: 5710 ميكرون 2، F س: 0.89 مليون وسادس س: 156 كيلو باسكال). (B) نوع من الألياف 2A (CSA: 9510 ميكرون 2، F س: 1.66 مليون وسادس س: 174 كيلو باسكال). تم تحديد الألياف ميوسين نوع السلسلة الثقيلة من خلال استخدام الفصل الكهربي والفضة تلطيخ تقنيات 22.
OAD / 52695 / 52695fig9.jpg "/>
الرقم 9: حساب أقصى درجات القوة النشطة (F س) (أ) عرض الموسع للاستجابة قوة الألياف أثناء الحركة الذي يحفز الركود طول تحكم شرع في حل تفعيل ما قبل. F P هي القوة اللازمة للحفاظ على طول قسيم عضلي من 2.7 ميكرون مع الألياف في بقية. (ب) عرض الموسع للطول وحدة تحكم يحفز الركود الحركة. لاحظ أن F س = F T - F P.
الرقم 10: (A) خياطة حلقة الانزلاق، ويتضح من "الصيد" في قوة التتبع أثناء صعود القوة. تحقق من أن تكون الحلقات المؤكد آمنة قبل تفعيل الألياف. (B) كسر الألياف أثناء التنشيط. قد يكون بسبب ضعف سلامة الألياف أو العلاج الألياف العدوانية أثناء خياطة مكان حلقةمنة. (C) من السابق لأوانه تفعيل الألياف جزئي بسبب تلوث دائرة ما قبل التنشيط مع الكالسيوم 2+.
Discussion
وتستخدم التقييمات من خصائص مقلص من ألياف العضلات الهيكلية permeabilized واحدة للتحقيق في وظيفة العضلات في طائفة واسعة من السياقات. ومن الأمثلة على ذلك الدراسات التي قيمت آثار الشيخوخة 12، وممارسة 10،13،14، ورحلات الفضاء 15، وإصابة 2،3،16، العلاج بالعقاقير 17،18، 19 المرض والتلاعب الجيني 20،21 على بنية الألياف وظيفة. يرجع ذلك إلى القدرة على تقييم مباشر على أداء مقلص من اللييفات العضلية في شكلها الأصلي، وتوفر هذه التقنية منصة جذابة من خلالها تشكيل فهم myofibrillar ظيفة غائبة من آثار محتملة التباس أن تكون موجودة عند نقل الإشارات العصبية والعضلية وإطلاق الكالسيوم الناجم عن الإثارة تم تضمينها في نظام قيد الدراسة. وعلاوة على ذلك، اختبار وظيفي من الألياف واحدة يمكن أن تستخدم لتكمل نتائج تحديد البروتين مقلص مثل تلكالتي تم الحصول عليها من خلال المناعية أو هلام الكهربائي + البقعة الغربية 22.
واحدة من الوظائف الأساسية للعضلات الهيكل العظمي هو لتوليد القوة. ونتيجة لذلك SF س، وهو مقياس لقدرة توليد القوة الجوهرية للنظام مقلص، هو من مصلحة كبيرة للفسيولوجي العضلات. تتطلب تقديرات موثوقة لSF س مقاييس دقيقة لكل من الليف CSA وF س. منذ الألياف هي، بشكل عام، لا التعميم في المقطع العرضي، ولا موحدة في CSA طول امتدادها، ينبغي الحرص الشديد عند تقدير CSA. تحقيقا لهذه الغاية، يتم إجراء قياسات في عدة مواقع على طول الألياف، وفي كل مكان، من منظورين مفصولة 90 درجة. تتطلب مقاييس موثوق منها F س التركيز على العديد من التفاصيل بما في ذلك مراعاة قوة سلبية، وتعديل طول قسيم عضلي لتحقيق أقصى قدر من تداخل خيوط سميكة ورقيقة، وتوظيف حلا تفعيل مع ر تركيز الكالسيومنتائج قبعة في تفعيل القصوى، والحفاظ على درجة حرارة التجريبية المطلوب، والحفاظ على ظروف التخزين المثلى (درجة الحرارة والمدة) من الألياف قبل يوم من التجربة.
في حين أن الخطوات المذكورة هنا تصف الإجراء لتقييم أقصى قوة متساوي القياس، فمن المستحسن في كثير من الأحيان إلى تقييم الصفات الوظيفية الهامة الأخرى من ألياف العضلات الهيكلية. ويمكن تحقيق ذلك من خلال توسيع بروتوكول تجريبي لتشمل التلاعب الميكانيكية إضافية من الألياف. على سبيل المثال، قياس السرعة التي الألياف يقصر ضد سلسلة من الأحمال المختلفة يسمح تحديد العلاقة قوة السرعة، والتي من علاقات القوة السلطة وسرعة الطاقة يمكن حسابها 10،23،24. بالإضافة إلى ذلك، وسرعة تقصير إلغاء تحميل يمكن تحديد من خلال توظيف "اختبار الركود" 25، والتي تتكون من تطبيق سلسلة من الذي يحفز الركود الخطوات تقصير وmeasuriنانوغرام الوقت اللازم من قبل الألياف لإزالة الترهل. آخر المعلمة الحركية التي كثيرا ما يقال هو ك TR، ثابت معدل لاستخدام القوة التجديد بعد اضطراب الميكانيكية التي يفصل مؤقتا عن crossbridges 26. وأخيرا، فإن العلاقة بين تركيز الكالسيوم وتوليد قوة النشط ("العلاقة قوة PCA") في كثير من الأحيان من الفائدة 18 ويمكن تحديدها من خلال تعريض الألياف إلى سلسلة من الحلول مع تركيزات الكالسيوم تتراوح من دون الحد الأدنى لتفعيل مقلص النظام لتلك كافية لإثارة أقصى تفعيل وبالتالي أقصى درجات القوة (F س).
على الرغم من الكثير من المعدات المذكورة هناك حاجة لتقييم الألياف انقباض واحد، ومعدات أخرى ليست ضرورية تماما. للتحكم طول، على سبيل المثال، أمر ضروري لأية البروتوكول التجريبي الذي يتطلب إطالة السريعة أو دقيقة أو تقصير من الألياف،ولكن ليس من الضروري للغاية لتقييم أقصى قوة متساوي القياس (على الرغم من مستوى الصفر القوة في السجل القوة لا يزال يتعين تحديدها من قبل بعض وسائل). ورشة عمل التي تسمح للمراقبة من الألياف من الجانب، وإن كانت مفيدة لتقييم مساحة المقطع العرضي، ليست ضرورية تماما عند وضع الألياف داخل الغرفة التجريبية. وعلاوة على ذلك، وسائل بديلة لتعريض الألياف إلى مختلف الحلول التجريبية يمكن استخدامها، بما في ذلك وضع نظام تشغيلها يدويا من الدوائر أو غرفة واحدة تسمح لملء السريع وتفريغه من الحلول. وأخيرا، في حين أن درجات الحرارة التجريبية الفرعية الفسيولوجية مثل 15 ° C تستخدم عادة لتحسين استنساخ القياسات الميكانيكية 1،2،3،5،8،12،17،27، فمن الممكن لتوليد بيانات صالحة في درجات حرارة أخرى 23 ، يتم أخذ 28 طالما آثار الحرارة على الخواص الحل (تركيز الكالسيوم، ودرجة الحموضة، وما إلى ذلك) في الاعتبار. تركيبة من حلول الاختبارات هي من بين أهم جوانب تقنيات الألياف permeabilized هو موضح هنا. الاعتبارات المتعلقة بتكوين حل معقدة وخارج نطاق هذا المقال. تم تصميم الحلول هو موضح في الخطوة 5 من قسم البروتوكول مع التركيز على تنشيط السريع من الألياف permeabilized على انتقاله من مرحلة ما قبل تفعيل لتفعيل الحلول مع الحفاظ على قوة ثابتة الأيونية، وتكوين الموجبة، والأسمولية 6،29. وقد استخدمت مناهج أخرى لتكوين حل مع نجاحا ملحوظا من قبل مجموعات بحثية أخرى وعادة الاستفادة من ثوابت ملزمة المنشورة والأدوات الحسابية 27،30،31. تركيزات أيونات الكالسيوم في مختلف الحلول تفعيل أهمية خاصة في دراسة شملت تفعيل submaximal مثل التقييمات قوة محكمة التحكيم الدائمة. للتجارب التي يتم تفعيلها بشكل كامل الألياف، مثل تلك التي تصفد هنا، وتركيز الكالسيوم في الحل تفعيل يتجاوز عادة بهامش مريح هو مطلوب لتحقيق أقصى قدر من القوة، مما يجعل معرفتها بدقة أقل أهمية. إضافة فوسفات الكرياتين مهم للتخزين المؤقت لاعبي التنس المحترفين وADP تقلبات intramyofibrillar التي لولاها تترافق مع النشاط مقلص. مطلوب الكرياتين كيناز لتحفيز نقل الفوسفات من فوسفات الكرياتين إلى ADP. تحت الظروف التجريبية التي تؤدي إلى ارتفاع معدلات دوران اعبي التنس المحترفين، بما في ذلك العمل في درجات حرارة عالية أو قياس عالية السرعة تقصير في الألياف السريعة 32، يجب إضافة الكرياتين كيناز إلى حل لاستكمال كيناز الكرياتين الذاتية التي لا تزال منضمة إلى الألياف. لظروف تجريبية أقل تطلبا، ونظام تجديد ATP هو أقل أهمية (27).
وتشمل القيود المفروضة على تقنية الألياف واحدة permeabilized ما يلي. البيانات التي تولدها هذه الاختبارات تحددخصائص مقلص من وحدة myofibrillar المحددة التي جرى ضمه الى جهاز تجريبي. ونتيجة لذلك، وهذا يجسد سوى جزء صغير من الألياف متعددة النوى كله من الذي حصل على الجزء الذي يمثل بدوره جزء صغير من العدد الإجمالي للألياف داخل العضلات. وهكذا ينبغي للمحققين أن تنظر بعناية في أخذ العينات اللازمة لدعم أي الاستنتاجات المستخلصة من التجارب. بالإضافة إلى ذلك، تقييم أثر تدخل التمرينات على وظيفة الألياف يفترض أن الألياف تقييم تم تجنيدهم بالفعل أثناء التدريب. على الرغم من محاولات بروتوكول لمحاكاة الوسط بين الخلايا الطبيعية من الألياف، وعملية permeabilization غمد الليف العضلي هي غير محددة ويسمح بالضرورة مكونات الخلايا القابلة للذوبان لنشر بحرية في حلول الاستحمام. وثمة نتيجة أخرى من نفاذية الغشاء هو تغيير في التوازن الاسموزي يتضح من تورم في حجم الألياف 33. الالألياف تورم يزيد من المسافة بين الأكتين والميوسين خيوط مما أدى إلى انخفاض حساسية الكالسيوم من النظام خيط عضلي 34،35، ولكن يمكن عكسها من خلال إدخال والمركبات النشطة osmotically كبيرة 34. A الحد النهائي للنظر هو نتيجة للأسلوب يستخدم لتوصيل الألياف إلى جهاز تجريبي. وهذا يتطلب دائما تشويه العلاقة المكانية داخل منظومة خيوط في وبالقرب من نقطة المرفق، مع حضور عجز وظيفي. على وجه التحديد، ومناطق من الألياف في والمتاخمة للنقاط التعلق يتم المساس وظيفيا، وبالتالي يسهم مصطنعة سلسلة مرونة لنظام القياس.
باختصار، لقد وصفنا وسيلة يمكن من خلالها تقييم القدرة على توليد القوة من ألياف العضلات الهيكلية permeabilized كيميائيا في المختبر. على الرغم من كان التركيز في هذه المادة على تقدير أقصى قوة generatin متساوي القياسز قدرة ألياف العضلات الهيكلية البشرية، يمكن تعديل المنهج التجريبي ومددت لتحديد مجموعة متنوعة من المعلمات والعلاقات الحركية عبر مجموعة من الأنواع، والثدييات أو غير ذلك.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene culture test tube with cap | Fisher Scientific | 14-956-3D | |
| 0.5 ml screw cap microcentrifuge | Fisher Scientific | 02-681-334 | |
| 0.5 ml microcentrifuge caps with o-ring | Fisher Scientific | 02-681-358 | |
| Microcentrifuge cryobox | Fisher Scientific | 5055-5005 | |
| pH meter | Mettler-Toledo | FE20 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
| Nonsterile-suture 10-0 monofilament | Ashaway Line Twine | S30002 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Forceps - Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microdissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | |
| Micrometer drives | Parker Hannifin | 3936M | |
| Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
| Temperature controller | Aplha Omega Instruments | Series 800 | |
| LabVIEW software | National Instruments | - | |
| Computer | Varied | - | |
| Chamber system | Aurora Scientific | 802D | |
| Length-controller | Aurora Scientific | 312C | |
| Force-transducer | Aurora Scientific | 403A | |
| Reagents | |||
| K-proprionate | TCI America | P0510 | |
| Imadizole | Sigma-Aldrich | I0125 | |
| MgCl2•6H20 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Brij 58 | Sigma-Aldrich | P5884 | |
| EGTA (acid) | Sigma-Aldrich | E0396 | |
| Na2H2ATP•0.56H2O | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| HEPES (acid) | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| MgO | Sigma-Aldrich | 529699 | |
| HDTA (acid) | TCI America | D2019 | |
| CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| KOH (1 N) | Sigma-Aldrich | 35113 | |
| HCL (1 N) | Sigma-Aldrich | 318949 | |
| Na2CrP•4H2O | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| pH 10 standard | Fisher Scientific | SB115 | |
| pH 7 standard | Fisher Scientific | SB107 | |
References
- Mendias, C. L., Kayupov, E., Bradley, J. R., Brooks, S. V., Claflin, D. R. Decreased specific force and power production of muscle fibers from myostatin-deficient mice are associated with a suppression of protein degradation. J Appl Physiol. 111 (1), 185-191 (2011).
- Gumucio, J. P., Davis, M. E., Bradley, J. R., Stafford, P. L., Schiffman, C. J., Lynch, E. B., Claflin, D. R., Bedi, A., Mendias, C. L. Rotator cuff tear reduces muscle fiber specific force production and induces macrophage accumulation and autophagy. J Orthop Res. 30 (12), 1963-1970 (2012).
- Mendias, C. L., Roche, S. M., Harning, J. A., Davis, M. E., Lynch, E. B., Sibilsky Enselman, E. r, Jacobson, J. A., Claflin, D. R., Calve, S., Bedi, A. Reduced muscle fiber force production and disrupted myofibril architecture in patients with chronic rotator cuff tears. J Shoulder Elbow Surg. 1 (4), 111-119 (2015).
- Moss, R. L. Sarcomere length-tension relations of frog skinned muscle fibres during calcium activation at short lengths. J Physiol. 292, 177-192 (1979).
- Chase, P. B., Kushmerick, M. J. Effects of pH on contraction of rabbit fast and slow skeletal muscle fibers. Biophys J. 53, 935-946 (1988).
- Moisescu, D. G., Thieleczek, R. Calcium and strontium concentration changes within skinned muscle preparations following a change in the external bathing solution. J Physiol. 275, 241-262 (1978).
- Walker, S. M., Schrodt, G. R. I Segment lengths and thin filament periods in skeletal muscle fibers of the Rhesus monkey and the human. Anat Rec. 178, 63-81 (1974).
- Gollapudi, S. K., Lin, D. C. Experimental determination of sarcomere force-length relationship in type-1 human skeletal muscle fibers. J Biomech. 42, 2011-2016 (2009).
- Brenner, B. Technique for stabilizing the striation pattern in maximally calcium-activated skinned rabbit psoas fibers. Biophys J. 41 (1), 99-102 (1983).
- Claflin, D. R., et al. Effects of high and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans. J Appl Physiol. 111, 1021-1030 (2011).
- Lynch, G. S., Faulkner, J. A., Brooks, S. V. Force deficits and breakage rates after single lengthening contractions of single fast fibers from unconditioned and conditioned muscles of young and old rats. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C249-C256 (2008).
- Frontera, W. R., Rodriguez Zayas, A., Rodriguez, N. Aging of human muscle: understanding sarcopenia at the single muscle cell level. Phys Med Rehabil Clin N Am. 23, 201-207 (2012).
- Malisoux, L., Francaux, M., Theisen, D. What do single-fiber studies tell us about exercise training. Med Sci Sports Exerc. 39 (7), 1051-1060 (2007).
- Widrick, J. L., Stelzer, J. E., Shoepe, T. C., Garner, D. P. Functional properties of human muscle fibers after short-term resistance exercise training. Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol. 238, 408-416 (2002).
- Trappe, S. Effects of spaceflight, simulated spaceflight and countermeasures on single muscle fiber physiology. J Gravit Physiol. 9 (1), 323-326 (2002).
- Malisoux, L., Jamart, C., Delplace, K., Nielens, H., Francaux, M., Thiesen, D. Effect of long-term muscle paralysis on human single fiber mechanics. J Appl Physiol. 102, 340-449 (2006).
- Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029. Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).
- Russell, A. J., et al. Activation of fast skeletal muscle troponin as a potential therapeutic approach for treating neuromuscular diseases. Nature Medicine. 18 (3), 352-356 (2012).
- Krivickas, L. S., Yang, J. I., Kim, S. K., Frontera, W. R. Skeletal muscle fiber function and rate of disease progression in amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 26, 636-643 (2002).
- Mendias, C. L., Marcin, J. E., Calerdon, D. R., Faulkner, J. A. Contractile properties of EDL and soleus muscles of myostatin-deficient mice. J Appl Physiol. 101, 898-905 (2006).
- Lynch, G. S., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Faulkner, J. A. Contraction-induced injury to single permeabilized muscle fibers from mdx, transgenic mdx and control mice. Am J Physiol Cell Physiol. 279, 1290-1294 (2000).
- Mizunoya, Q., Wakamatsu, J., Tatsumi, R., Ikeuchi, Y. Protocol for high-resolution separation of rodent myosin heavy chain isoforms in a mini-gel electrophoresis system. Anal Biochem. 377, 111-113 (2008).
- Hill, A. V. The heat of shortening and the dynamic constants of muscle. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 126, 136-195 (1938).
- Bottinelli, R., Canepari, M., Pellegrino, M. A., Reggiani, C. Force-velocity properties of human skeletal muscle fibres: myosin heavy chain isoform and temperature dependence. J Physiol. 495, 573-586 (1996).
- Edman, K. A. The velocity of unloaded shortening and its relation to sarcomere length and isometric force in vertebrate muscle fibres. J Physiol. 291, 143-159 (1979).
- Brenner, B., Eisenberg, E. Rate of force generation in muscle: Correlation with actomyosin ATPase activity in solution. PNAS. 83, 3542-3546 (1986).
- Moss, R. L. The effect of calcium on the maximum velocity of shortening in skinned skeletal muscle fibres of the rabbit. J. Muscle Res. Cell Motil. 3, 295-311 (1982).
- Pate, E., Wilson, G. J., Bhimani, M., Cooke, R. Temperature dependence of the inhibitory effects of orthovanadate on shortening velocity in fast skeletal muscle. Biophys J. 66, 1554-1562 (1994).
- Ashley, C. C., Moisescu, D. G. Effect of changing the composition of the bathing solutions upon the isometric tension-pCa relationship in bundles of crustacean myofibrils. J Physiol. 270, 627-652 (1977).
- Godt, R. E. Calcium-activated tension of skinned muscle fibers of the frog. Dependence on magnesium adenosine triphosphate concentration. J Gen Physiol. 63, 722-739 (1974).
- Fabiato, A., Fabiato, F. Calculator programs for computing the composition of the solutions containing multiple metals and ligands used for experiments in skinned skeletal muscle cells. Journal de Physiologie (Paris). 75, 463-505 (1979).
- Chase, P. B., Kushmerick, M. J. Effect of physiological ADP concentrations on contraction of single skinned fibers from rabbit fast and slow muscles). Am J Physiol. 268, C480-C489 (1995).
- Godt, R. E., Maughan, D. W. Swelling of skinned muscle fibers of the frog. Biophysical Journal. 19, 103-116 (1977).
- Kawai, M., Wray, J. S., Zhao, Y. The effect of lattice spacing change on cross-bridge kinetics in chemically skinned rabbit psoas muscle fibers. Biophys J. 64, 187-196 (1993).
- Millman, B. M. The filament lattice of striated muscle. Physiol Rev. 78 (2), 359-391 (1998).
- Edman, K. A. Contractile properties of mouse single muscle fibers, a comparison with amphibian muscle fibers. J Exp Biol. 208, 1905-1913 (2005).
- Phillips, S. K., Woledge, R. C. A comparison of isometric force, maximum power and isometric heat rate as a function of sarcomere length in mouse skeletal muscle. Pflügers Archiv. 420, 578-583 (1992).
- Stephenson, D. G., Williams, D. A. Effects of sarcomere length on the force-pCa relation in fast and slow-twitch skinned muscle fibres from the rat. J Physiol. 333, 637-653 (1982).
