Summary
Analys av de kontraktila egenskaperna hos kemiskt flådda eller permeabilized, skelett muskelfibrer erbjuder ett kraftfullt medel för att bedöma muskelfunktion på samma nivå som den enda muskelcellen. I den här artikeln redogör vi för en giltig och tillförlitlig teknik för att förbereda och testa permeabiliserades skelettmuskelfibrerna in vitro.
Introduction
Den primära funktionen hos skelettmuskulaturen är att generera kraft. Muskelkraften framkallas in vivo genom en komplex sekvens av händelser som inkluderar motornervaktionspotentialer, neuromuskulär transmission, muskelfiberaktionspotentialer, frisättning av intracellulära kalcium, och aktivering av systemet för reglering och kontraktila proteiner. Eftersom styrke är det slutliga resultatet av denna sekvens skulle ett underskott i kraft orsakas av fel på en eller flera av de enskilda stegen. En viktig egenskap hos den permeabilized preparatet fiber är att det eliminerar de flesta av de åtgärder som krävs för styrke in vivo, med endast de reglerande och kontraktila funktioner i samband med den myofibrillar apparaten kvar. Utredaren förutsätter kontroll över leverans aktivera kalcium och energi (ATP), och belönas med ett förenklat system som tillåter bedömning av de isolerade reglerings- och kontraktila strukturer sitt eget samarbetenfiguration. Mätningar av kraft med hjälp av permeabiliserade skelett muskelfibrer är därför värdefulla vid bedömningen av förändringar i muskelfunktion observerades in vivo. Till exempel har vi använt denna teknik för att karakterisera kraft produktionskapacitet av fibrer från myostatin bristfällig möss 1 och bedöma orsaken till ihållande muskelsvaghet uppvisade efter kronisk rotatorkuffskador 2,3.
Modern permeabilized fiber metod kan spåras till tidiga inflytelserika studier 4,5 och är för närvarande används av ett antal forskargrupper. Även om teknikerna har beskrivits i litteraturen, har de ännu inte presenterats i videoformat. Målet med denna artikel är att åskådliggöra en uppdaterad, giltig och tillförlitlig teknik för att mäta den maximala kraften produktionskapacitet av enskilda fibrer från kemiskt permeabiliserade skelettmuskelprover. För att åstadkomma detta, en individuell fibersegment (hänvisad till häri som en ̶0, fiber ") extraheras ur en förut permeabilized knippe av fibrer och placerades i en experimentell kammare innehållande en avkopplande lösning, vars utmärkande drag en kalciumkoncentration som är <10 nM. Fibern fästes sedan vid en ände till en kraftomvandlare och vid den andra änden till en längd-regulator. Med fibern hålles vid en optimal sarcomere längd, överförs den till en aktiverande lösning som har en kalciumkoncentration tillräcklig för att framkalla maximal aktivering och därigenom maximal isometrisk kontraktion kraft. Kraftdata förvärvas, lagras och analyseras med hjälp av en persondator.
Protocol
Alla procedurer som involverar djur eller mänskliga ämnen bör utföras i enlighet med tillämpliga riktlinjer, förordningar och tillsynsmyndigheter. University of Michigan utskottet för användning och skötsel av djur (UCUCA) och University of Michigan Medical Center Institutional Review Board godkände alla djur och mänskliga förfaranden som beskrivs i den här artikeln.
1. Gör Analysera och lagring stamlösning
Obs: De slutliga volymer som anges i följande instruktioner kan skalas upp eller ner som önskat.
- I en 1000 ml bägare till 800 ml avjoniserat vatten (ASTM typ 1). Att upprätthålla en mild rör om, lägga till alla de föreningar som anges i tabell 1 till det avjoniserade vattnet och tillåta dem att lösas upp.
Förening Önskad Konc. (M) Formel Vikt (g / mol) Lägg till 1 L (g) </ Tr>K-propionat 0,250 112,17 28,040 Imidazol 0,040 68,08 2,720 EGTA 0,010 380,40 3,800 MgCl2 • 6 H2O 0,004 203,31 0,813
Tabell 1: Dissecting och lagring lager lösningskomponenter.
- Ta till en slutlig volym av 1000 ml med avjoniserat vatten. Notera att det inte är nödvändigt att pH i lösningen vid denna tid. Förvara stamlösning vid 4 ° C.
2. Gör lagringslösning
- För att göra 200 ml lagringslösning, börja med 100 ml dissekera och lagring stamlösning i en 250 ml bägare. Tillsätt tillräckligt med Na 2 H 2 ATP för att få slut adenosintrifosfat (ATP) koncentration till 2 mM. Ta till en slutlig volym av 200 ml med glycerol. Justera till pH 7,00 med kaliumhydroxid (KOH). Förvara lagringslösningen vid -20 ° C.
OBS: På grund av den viskösa karaktären av glycerol det kan vara svårt att exakt fördela volymprocent. På grund av detta, vi lägger typiskt glycerolen viktprocent (100 ml glycerol väger ungefär 126 g).
3. Gör Analysera Solution
- För att göra 200 ml dissekera lösning, börja med 100 ml av dissekera och lagring stamlösning i en 250 ml bägare.
- Tillsätt tillräckligt med Na 2 H 2 ATP för att få slut ATP-koncentration till 2 mM. Justera pH till 7,00 med KOH. Bringa den slutliga volymen till 200 ml med avjoniserat vatten. Alikvotera i volymer av 2,5 ml och lagra vid -80 ° C.
4. Gör Analysera lösning med Brij 58
Anm: Brij 58 är en icke-jonisk detergent som stör (permeabilizes) lipiddubbelskikt.
<ol>5. Gör testa lösningar
Obs: Följande är anpassad från Moisescu och Thieleczek 1978 (6). Se Diskussion för ytterligare kommentarer om att förbereda testlösningar.
- Förbered tre separata 1000 ml bägare märkta "Avkopplande", "Pre-aktiverande" och "Aktivera". Lägg 400 ml avjoniserat vatten till varje bägare.
- Lägg föreningarna som anges i tabell 2 till lämplig bägare och sedan värma lösningarna till mellan 70 ° C och 80 ° C. Upprätthåll en lösningstemperatur av 70-80 ° C under 30 minuter under ständig omrörning.
Anmärkning: En temperatur av 70 till 80 ° C hjälper till att Elimination av kolsyra som bildas genom omsättning av kalciumkarbonat med EGTA i aktiveringslösningen. De avkopplande lösning och pre-aktiverande lösningar behandlas på samma sätt som den aktiverande lösningen för att upprätthålla konsekvens.
| AVKOPPLANDE LÖSNING | PRE-aktiverande lösning | Aktiverande lösning | |||||
| Förening | Formel Vikt (g / mol) | Önskad koncentration (mM) | Obligatorisk Massa (g) | Önskad koncentration (mM) | Obligatorisk Massa (g) | Önskad koncentration (mM) | Obligatorisk Massa (g) |
| HEPES (syra) | 238,30 | 90,0 | 10,724 | 90,0 | 10,724 | 90,00 | 10,724 |
| MgO | 40,31 | 10,3 | 0,208 | 8,5 | 0,171 | 8,12 | 0,164 |
| EGTA (syra) | 380,40 | 52,0 | 9,890 | 52,00 | 9,890 | ||
| HDTA (syra) | 348,36 | 50,0 | 8,709 | ||||
| CaCO 3 | 100,10 | 50,00 | 2,503 | ||||
Tabell 2: Relaxing, pre-aktiverande och aktiverande lösningskomponenter.
- Kyl lösningen till rumstemperatur och tillsätt tillräcklig NaN3 / KOH att bringa den slutliga NaN3 koncentration till 1 mM.
VARNING: NaN3 (natriumazid) är giftig. Se de kemiska MSDS före hantering av denna kemikalie.- För att göra 100 ml 100 mM natrium-azid-lösning, tillsätt 0,65 g NaN3 till 10 ml av en IN KOH. Justera till en slutlig volym av 100 ml med avjoniserat vatten.
- Justera pH-värdet till cirka 7,10 med hjälp av KOH.
- Efter steg 5,4 lägga tillräcklig Na 2 H 2 ATP för att bringa den slutliga ATP-koncentrationen till 8 mm och tillräcklig Na 2 CrP att bringa den slutliga phosophate kreatin (CRP) koncentration till 10 mM.
- Föra varje lösning till den slutliga volymen av 500 ml med användning av avjoniserat vatten. Chill eller värma lösningarna till den temperatur vid vilken försök kommer att utföras, använd sedan KOH att förapH-värdet till 7,10 med bibehållen denna temperatur.
- Lägg avslappnande lösning till bägaren innehållande pre-aktiverande lösning så att den slutliga för-aktiverande lösning är en del avkopplande lösning i 500 pre-aktiverande lösning. Alikvotera i volymer av 2,5 ml och lagra vid -80 ° C.
6. Gör Sutur Loops
- Börja med en sträng av icke-steril USP 10-0 monofilament nylonsutur.
- Använd pincett för att skapa en ring med strängen med användning av dubbel överhandsknop teknik. Minska knut i storlek till cirka 750 um diameter. Kan bedömas Loop diameter under mikroskop med hjälp okularfokalplattan markeringar.
- Använd microdissecting sax för att avlägsna överskott av sutur lämnar endast slingan och små (500 | im) svansar på vardera sidan. Ett exempel på en färdig slinga visas i figur 1.
- Upprepa steg 6,2-6,3 tills 4 användbara slingor har gjorts. Store loopar i ett silikonelastomer pläterade petrJag skålen för framtida bruk.
Obs: Fyra sutur slingor krävs för varje testad fiber.
7. Paket Prov
Obs: Följande steg beskriver förfarandet för att dissekera det ursprungliga provet i mindre experimentella "buntar" som enkla fibrer så småningom kommer att extraheras och testas. I alla tider bör behandlas provet med omsorg. För ändamålet av denna beskrivning, kommer instruktioner ges som om utredaren är högerhänt.
- Skaffa provet av intresse och överföra den till anläggningen där dissektion kommer att äga rum.
Obs: Metoder för vävnadsbiopsi kommer att variera beroende på experimentell modell och studiedesign. Om möjligt bör muskel perfusion upprätthållas fram till tidpunkten för biopsi. - Om provet skall överföras mellan fångstplatsen och dissekera plats, transportera den i en flaska innehållande kyld dissekera lösning medan hölls på is.
- Förbered en 5 cm silikonelastomeröverdragna petriskål med kyld dissekera lösning och 02:58 insekt monteringsstift (100 pm diameter, rostfritt stål).
- Överför provet till skålen. Se till att provet förblir nedsänkt genom att tillsätta mer dissekera lösning om det behövs.
- Inspektera provet under mikroskop och manipulera den för att rikta in de längsgående axlarna hos fibrerna mot höger skuldra utredaren (figur 2). Sedan förankra provet till skålen genom att klämma fast vid hörnen.
Obs: Utnyttja eventuella kvarvarande bindväv som förankringspunkter vid denna tid, eftersom detta kommer att maximera prov bruk och bevara fiber integritet. Bunten kan nålas i lätt spänning för att hjälpa till att definiera interfibrära marginaler. - Med tången i den vänstra handen och microdissecting sax i höger, börja försiktigt dissekera en bunt längs de längsgående marginalerna mellan fibrer
Obs: Beroende påtotal längd, ytterligare dissekera bunten i flera mindre buntar. - Se till att bunt mått mäter ca 0,5-1 mm i bredd och ≥3 mm i längd. Bedöm dimensioner med hjälp av ett mikroskop med räknefält markeringar i okularet, eller genom att placera en linjal i skålen.
- Ta bort och kasta alla vävnad som är skadad av tången eller stift som en följd av dissekera processen.
- Upprepa processen tills ett tillräckligt antal buntar har dissekeras eller tills provet har uttömts.
Obs: Antalet buntar som kan erhållas kommer att bero på ett flertal faktorer innefattande storleken och tillståndet för det ursprungliga provet, morfologin av muskeln, och expertisen av utredaren.
8. permeabilize Fibrer
- Överför buntarna från dissekera lösningen i en flaska innehållande 2,5 ml färskt, kylt, dissekera lösning med icke-joniska tvättmedel "Brij 58" läggas(0,5%, vikt / volym). Inkubera på is under 30 min med tillfällig, försiktig omrörning. Se till att buntarna förblir nedsänkt under inkubation.
- Vid slutet av 30 minuters inkubation, överföra buntarna till en flaska innehållande färsk dissekera lösning (ingen Brij 58) och agitera försiktigt och kortfattat att ta bort eventuella kvarvarande tvättmedel.
9. Förbered Buntar för lagring
- Överför buntarna till en flaska innehållande kyld lagringslösning och inkubera över natten vid 4 ° C.
10. Store Bundles
- Följande dag, förbereda en förvaringsbox, tåla -80 ° C, med tillräckligt individuella 0,5 ml skruvlock koniska rör för att rymma alla buntar som erhållits under dissekera processen (en bunt per rör). Varje koniskt rör ska fyllas med 200-400 pl av färskt lagringslösning.
- Överför buntar i de individuellt märkta koniska rör. Se till att bunten inte fastnatden sida av det koniska röret eller flyter på ytan av lösningen. Förslut koniska rör och lagra proverna vid -80 ° C tills dagen för provning.
11. Förbered experimentell utrustning
Obs: Den anpassade anordningen är sammansatt av en scen som rymmer en längd styrenhet och kraftomvandlare, en rörlig kammarsystem och en 10X dissektion mikroskop. Mikrometer driv installationer möjliggör exakt manipulering av fiberfästytor. Laser diffraktionsmönstren används för att uppskatta sarcomere längd. Data som genereras under experiment registreras på en persondator. Se Figur 3 för kommenterade bilder av försöksuppställningen.
- Tina en flaska varje avkopplande, pre-aktiverande och aktiverande lösningar och underhålla på is. Observera att ATP och CrP är labila föreningar som bör hållas vid låga temperaturer.
- Förbered mikroskopet, testapparaten och tillhörande dator för användning. Fyll den första experimentella kammaren med avkopplande lösning. I vår apparat, innehåller den första kammaren prismor som ger utredaren att fotografera fibern från sidan. Fyll den andra experimentkammaren med pre-aktiverande lösningen och den tredje med aktiverande lösning.
- Justera temperaturen så att i kammar termometer Displayen visar 15 ° C. Gäng två förberedda sutur slingor på rostfritt stål fästytor som sträcker sig från både kraftomvandlare och längd-controller (Figur 5A).
12. Utdrag permeabiliserade Single Fiber
- Tina ett fiberknippe av intresse, och överför till en silikonelastomeröverdragna petriskål med färska, kylda avkopplande lösning. Säkra bunten med stift i vardera änden och se till att den är nedsänkt.
- Med hjälp av pincett, ta tag en fiber i ena änden och börja smidigt utvinna den längs sin längdaxel.
Obs: Tryck skadaänden av fibern som orsakas av tången är inte ett problem vid denna tidpunkt eftersom kontraktila egenskaper på detta område inte kommer att testas. Försiktighet bör dock iakttas vid utvinna fibrer från bunten sedan sammanväxningar mellan fibrer och den extracellulära matrisen kan leda till överdriven spänning, vilket slutligen leder till sträck inducerad skada. Observera att betydande variabilitet existerar bland muskler i den grad i vilken fibrerna vidhäftar till den omgivande extracellulära matrisen. Fibrer som misstänks ha skadats av en sådan sträcka skall kasseras. - Använda ett rakblad eller skalpell för att modifiera en pipettspets, som visas i (fig 4). Introducera fibern in i spetsen tillsammans med en liten mängd av avkopplande lösning. Överför enda fiber från silikonelastomeren pläterade petriskål till den experimentella kammare som innehåller avkopplande lösningen.
13. Mount Single Fiber
Obs: Ett steg-för-steg depictipå kan ses i fig 5.
- Vägledande försiktigt med pincett, ta bort fibrerna från pipettspetsen och förankra den till längd-regulatorn (till vänster) användning av den första suturslingan.
- Använd en enda mjuk rörelse vid åtdragning av slingan med pincett. Se till att en lika stor och motsatt spänning appliceras på endera änden av suturen.
- Den första slingan bör knytas runt 1 mm till 2 mm från änden av längden styrenheten fästyta.
- Manipulera den andra änden av fibern mot den kraft-omvandlaren (höger) och säkra fibern med användning av samma procedur. Ta bort överflödig sutur med hjälp av microdissecting sax (Figur 5C).
- Placera fibern under en liten mängd av spänning genom att öka avståndet mellan längd controller och kraftgivararmarna med x-koordinat mikrometer enhet (Figur 3A).
- Trä den andra slingan över den första och förankra fibernvid en punkt inom 0,2 mm från slutet av kraftomvandlare fästyta (figur 5D).
- Ta bort överflödig sutur med hjälp av microdissecting sax.
- Fiberfästprocessen kan resultera i förlust av lösningen från kammaren. Om det behövs, tillsätt mer avkopplande lösning för att säkerställa lösningens yta är platt (vare sig konkav eller konvex). En plan yta är viktig vid bedömningen sarcomere längd med laser diffraktion.
- Rikta in fiber parallellt med sidoväggarna hos den experimentella kammaren genom att justera läget av längden styrenheten i riktningen för y-axeln.
- Undersökning fibern med hjälp av prisma sidovy och justera positionen av längden styrenheten i riktningen för z-axeln tills fibern är parallellt med golvet av kammaren.
Anmärkning: Positionering av fibern parallellt med golvet av kammaren kan åstadkommas utan kammar prismor genom att fokusera först på ena änden av fibern och thöna, utan att justera mikroskopet fokus, vilket innebär att andra änden av fibern i fokus med sin z-axeln mikrometer enhet. - Om fibern är på något sätt förvridna, vriden eller skadad på grund av monteringsprocessen, bör fibern kasseras och en ny fiber bifogas.
14. Ställ Optimal sarcomere Längd
- När fibern har korrekt inriktade i kammaren, sätter den kalibrerade målet skärmen på den främre aspekten av mikroskopet och rikta in den över den första experimentella kammaren.
Obs: Målet Skärmen kalibreras med standardgitter ekvationen λ = SL sinθ, där SL är sarcomere längd, är θ diffraktionsvinkeln mellan 0 ° och 1 ° brutna balkar och λ är våglängden för lasern. - Sätt på lasern och justera positionen av scenen så att laser passerar genom centrum av fibern.
VARNING: Koncentrerad laserljus kan vara skadliga to syn. Försök aldrig att visualisera fibern genom mikroskopet när lasern är på. - Positionera fibern i förhållande till laserstrålen för att avböja laserljuset och observera en interferens smattra på kalibrerade målet (Bild 6). Släck lampor för att visualisera detta mönster tydligare.
Obs: Om den korrekta positioneringen av laserstrålen, är ingen interferensmönster sett, tyder detta på att de myofibrillära komponenterna i fibern är onormala / skadade och att fibern bör ersättas med en ny. - För att ställa in sarcomere längd, öka eller minska spänningen på fibern med hjälp av längd controller x-axeln mikrometer enheten tills den önskade avståndet mellan den spridda ljuset observeras på målet skärmen.
Obs: Den optimala sarcomere fiberns längd beror på den djurart från vilken provet erhölls. En sarcomere längd av 2,7 um vanligen antas vara optimala när åsnorsjunga fibrer från mänsklig vävnad 7,8. - Efter optimal sarcomere längd har ställts in, mäta avståndet mellan de två innersta suturer. Detta görs enklast med hjälp av digital avläsning på mikrometer enhet som styr x-axelrörelse av kammaren. Placera kammaren så att den vertikala hårkors av okularet är inriktad på den innersta kanten av den innersta suturen och nollställ digital avläsning på mikrometer enheten.
- Översätt scenen längs x-axeln i förhållande till mikroskopet tills den når den andra innersta sutur. Den digitala displayen kommer att indikera fiberns längd. Detta värde ska registreras som fiberlängd, Lf.
Anmärkning: Det skall inses att avståndet mellan de två innersta suturer kommer att bestämma den funktionella längden av kontraktil vävnad som utvärderas. Utredaren bör sträva efter enhetlighet i den här dimensionen (dvs. L f) inom enserie experiment.
15. Uppskattning tvärsnittsarea (CSA)
- Bibehåll fibern vid Lf och använda mikroskopet monterade kameran för att fånga en hög förstoring bild av den centrala delen av fibern från både toppen och sidovyer. Sidovy bilder kan tas med hjälp av prismat inbäddade i sidan av kammaren.
Anmärkning: Vid växling mellan topp och sidovyer är det viktigt att flytta mikroskopet endast i y-riktningen för att säkerställa att de två bilderna är "i registret" och därför visar två olika vyer av samma avsnitt av fibern. - Skaffa mätningar vid denna tid att normalisera absolut kraft senare i studien. Teknikerna för att erhålla dessa mätningar beskrivs senare och visas i figurerna 7A och 7B.
16. Framkalla Isometrisk Sammandragning
Obs: När data som genereras under dessa experiments kan samlas in och tolkas utan användning av en dator, programvara som möjliggör förvärv, display, lagring och analys av kraft svaren är fördelaktig. Den anpassade LabVIEW programvara som skapats av vårt laboratorium gör att dessa funktioner samt förmågan att utforma "rörelse tåg" som styr verkan av längd-styrenhet under ett experiment.
- Kontrollera att temperaturen på den avkopplande, pre-aktiverande och aktiverande lösningar är stabila vid 15 ° C.
- Använd kammarstyrprogram för att flytta fibern till kammaren innehållande pre-aktiverande lösning och inkubera det i 3 min.
Anm: För-aktiverande lösningen svagt buffrad för Ca2 +, vilket resulterar i en mycket snabb aktivering och kraftutveckling vid införande av fibern till den aktiverande lösningen. - Med 10 sekunder kvar i pre-aktiverande lösningen och fiberlängd hölls vid Lf, upprätta en nolla foRCE nivå i den experimentella post.
Obs! "Hitta Force Zero" rörelse av längden kontrollen avslöjar kraftomvandlare nivå som motsvarar noll kraft (dvs. fibern blir kort slack som ett resultat av rörelsen). Passiv kraften är skillnaden mellan detta noll och kraftnivån precis före omvandlaren-nollställnings rörelse. - Vid slutet av den tre minuter, flytta fibern till kammaren innehållande den aktiverande lösningen och tillåta maximal isometrisk kraft att utvecklas, vilket framgår av en platå i kraft som föregås av en snabb ökning.
- Efter att ha nått maximal isometrisk kraft, använd längd-regulatorn för att identifiera kraftomvandlarens utsignal som motsvarar noll kraft i kammaren som innehåller den aktiverande lösningen.
Anmärkning: Detta är nödvändigt eftersom det kraftomvandlarens utsignal som motsvarar nollkraft är i allmänhet olika för varje lösning fylld kammare. - Efter uppnående av en andra kraft plateau tillbaka fibern till kammaren innehållande avkopplande lösningen. Testning är nu klar. För att testa flera fibrer under någon session aspirera alla lösningar och lägga till nya, kylda lösningar.
Obs: Brenners cykel protokoll bör beaktas när framkalla maximala sammandragningar under en längre tidsperiod. Detta protokoll har visats bevara strukturella och mekaniska egenskaper i maximalt aktiverade fibern 9.
Representative Results
Friska, kemiskt permeabiliserade enskilda fibrer ska visas enhetlig form och har konsekvent ränder mellanrum när den visas med hög förstoring. Fibrer som är oflexibel när manipuleras med pincett eller har uppenbara strukturella skador ska kasseras.
Hög förstoring digitala bilder som tagits under steg 15 analyseras med avseende på 5 mätningar parade diameter längs mittsektionen av fibern. Fiber CSA beräknas antar en elliptisk tvärsektion och i genomsnitt fem individuella CSA mätningar som visas i figur 7A. Figur 7B tjänar också till att belysa hur fiberdimensioner i en vy kan vara betydligt annorlunda jämfört med parade dimensioner i den andra vyn (dvs. gränsöverskridande sektionerna inte, i allmänhet, rund).
Representativa kraft spår från humana långsamma och snabba fibrer visas i fig 8A och 8B, respektive. Voltage utsignalen från kraftomvandlaren förvärvas under ett test och omvandlas för att tvinga (mN) med användning av datainsamling och analysmjukvara (LabVIEW). Figur 9 illustrerar den strategi som används för att bedöma maximal aktiv kraft (Fq), som beräknas genom att subtrahera den kraft som krävs för att hålla fibern vid optimala sarcomere längd medan i ett avslappnat tillstånd (passiv kraft, A P), från den största isometrisk kraft som utvecklas under maximal fiberaktivering (totala kraften, F T). Eftersom utsignalen från den kraft-omvandlaren som motsvarar noll kraft är i allmänhet olika för var och en av de olika bad kamrarna, vi kort lossa fiber i både pre-aktiverande och aktiverande lösningar för att fånga nollkraftnivå i experimentell rekord. Normalisering av maximal aktiv kraft genom fiber CSA används för att generera den mer informativ värdet av specifik kraft (SF o). Eftersom det tar hänsyn till CSA fiberns SF o
Typiska egenskaper hos friska, vuxna fibrer från Claflin et al. 2011 10 för människa, Mendias et al. 2011 1 för mus och Gumucio et al. 2012 2 för råtta beskrivs i tabell 3. All data som presenteras i tabell 3 genererades genom att använda tekniker som beskrivs i den här artikeln.
| Humant (Vastus lateralis) | Mus (EDS) | Råtta (Infraspinatus) | ||||
| Man | Kvinna | Man | Man | |||
| Typ 1 | Typ 2a | Typ 1 | Typ 2a | (Inte skrivit) | (Inte skrivit) | |
| CSA (xm 2) | 4880 - 6900 | 5270 - 8380 | 3870 - 5470 | 4010 - 5610 | 1850 - 3080 | 5290 - 8010 |
| Fq (mN) | 0,79-1,17 | 1,02-1,54 | 0,64-0,97 | 0,71-1,07 | 0,14-0,25 | 0,55-0,97 |
| sF o (kPa) | 142-182 | 165-210 | 156-193 | 172-214 | 67-94 | 102-131 |
| n | 129 | 160 | 149 | 207 | 37 | 94 |
Tabell 3. Typiska egenskaper hos friska, vuxna fibrer från humant vastus later 10, mus extensor digitorum longus 1 och råtta infraspinatus 2 muskler. Optimala sarcomere längder fastställdes till 2,7 um för mänskliga fibrer 7,8 och 2,5 pm för både mus (36, 37) och rått-fibrer (38). Experimentell L f områden (25: e och 75: e kvartiler) var 1,39-1,73 mm, 1,17-1,53 mm och 1,32-1,59 mm för människa, mus och råtta respektive. Områden som visas indikerar de 25: e och 75: e kvartil och n är antalet testade fibrer.
De vanligaste problemen under testningen inkluderar suturslinga slip, vilket resulterar i en kraft response med en "fånga" såsom den som visas i figur 10A, och en partiell eller full tjocklek riva av fibern, vilket resulterar i en kraft svar som returnerar abrupt mot eller (paus) noll medan fibern fortfarande nedsänkt i aktiverande lösning (Figur 10B). Om en glidning, tår eller brott inträffar under ett experiment, bör fibern kasseras och data exkluderas, men upprätthålla ett register över fiber misslyckanden kan också vara informativ 11. Ett annat negativt resultat som kan påträffas är den tidig aktivering av fibern medan i pre-aktiverande lösning (Figur 10C). Delvis aktivering i pre-aktiverande lösning föreslår betydande kors väl kontaminering (dvs. en oavsiktlig ökning av kalciumkoncentrationen i pre-aktiverande väl). I detta fall bör alla bad aspireras och sköljdes väl med avjoniserat vatten. Torkning skiljeytorna mellan kamrarna är också rekomded som fukt eller kondens i dessa områden kan leda till uppsugning av lösningen mellan bad. Beslutet att inkludera eller exkludera data kommer i slutändan att bero på den experimentella inriktning och bör därför övervägas vid utformningen av studien.
Figur 1: suturslinga (10-0 monofilament nylonsutur).
Figur 2:. Bundle dissektion Tång är i vänster hand, microdissection sax är i höger hand. Röd linje visar den gynnsamma orienteringen av handleden och sax med längdaxlar fibrerna.
Figur 3: (A) testapparat med märkta komponenter. (A) Experimentella kammare med genomskinliga bottnar. (B) Längd-controller. (C) Kraft-omvandlare. (D) Ljuskälla. (E) Längd-controller xyz mikrometer enhet med digital display. (F) Stage mikrometer enhet med digital display. (G) Force-omvandlare xyz mikrometer enhet. (H) Plattform för kalibrerad laser diffraktion mål skärm. (I) Vibrationsisoleringsbord. (B) Närbild vy av experimentkammare. (J) Rostfritt fäst stål yta som sträcker sig från längden kontrollen. (K) Rostfritt fäst stål yta som sträcker sig från kraftomvandlare. (L) Sido prisma. (M) Bostäder för termoelektriska kylmoduler. (N) Termo för rapportering kammar temperature.
Figur 4: Modifierad 100 l pipettspets används för att överföra fiber från dissektion skålen experimentell kammare.
Figur 5:. Montering enda fiber på experimentell utrustning (A) Beredda sutur slingor träs på rostfria fästytor. (B) Fiberfördes till experimentell kammare. (C) Fiber förankrad i rostfritt stål fästytor genom att först par av sutur slingor med överskott sutur avlägsnas. (D) andra par sutur slingor gängade över toppen av första sutur slingor och bundna på plats.
Figur 6: sarcomere längd bedöms av projektionen av en laserinterferensmönster på en kalibrerad mål skärm (a) Laser källa.. (B) Mirror. (C) Mål-skärmen. (D) Laserinterferensmönster.
Figur 7: (A) Bestämning av fibertvärsektionsarea vid optimal sarcomere längd (humant = 2,7 ^ m). Förutsatt ett elliptiskt tvärsnitt är CSA beräknas för vart och ett av fem ställen längs fiber midsection och medelvärdet av de fem enskilda mätningar redovisas som fiber CSA. 2a representerar uppifrån diameter och är en axel ellipsen representerar 2b sidan diameter och är den andra axeln hos ellipsen. (B) Representativa fiber bilder illustrerar varje mätningar de fem motsvarande diameter tagna i både toppen och sidan.
Figur 8: representativ kraft spår från friska människor vastus later muskelfibrer (A) Typ 1 fiber (CSA: 5710 pm 2, Fo: 0,89 mN och SF o: 156 kPa).. (B) Typ 2a fiber (CSA: 9510 pm 2, Fo: 1.66 mN och SF o: 174 kPa). Fiber myosin tung kedja typ bestämdes genom användning av elektro separation och silverfärgningsteknik 22.
oad / 52.695 / 52695fig9.jpg "/>
Figur 9: Beräkning av maximal aktiv kraft (F o) (a) expanderad vy av fiberkraft svar under slack framkallande rörelse längd-controller inleddes pre-aktiverande lösning.. A P är den kraft som krävs för att bibehålla en sarkomeren längd på 2,7 | im med fibern i vila. (B) Utökad tanke på längd-controller slack framkallande rörelse. Observera att Fo = F T - F P.
Figur 10: (A) suturslinga slip, framgår av en "fånga" i kraft spår under ökningen av våld. Kontrollera att vara säker slingor är säkra innan du aktiverar fibern. (B) Fiber paus under aktivering. Kan bero på dålig fiber integritet eller behandling aggressiv fibern under suturslinga platsling. (C) För tidig fiberaktivering delvis på grund av förorening av pre-aktiveringskammare med Ca2 +.
Discussion
Bedömningar av de kontraktila egenskaperna hos permeabiliserade enstaka skelettmuskelfibrerna används för att undersöka muskelfunktion i en mängd olika sammanhang. Som exempel kan nämnas studier som har utvärderat effekterna av åldrande 12, motion 10,13,14, spaceflight 15, skada 2,3,16, läkemedelsbehandlingar 17,18, sjukdom 19 och genetisk manipulation 20,21 på fiberstruktur och funktion. På grund av möjligheten att direkt bedöma kontraktila prestanda myofibriller i sin nativa konfiguration, ger denna teknik en attraktiv plattform för att bilda sig en uppfattning om myofibrillar funktion frånvarande av potentiellt störande effekter som är närvarande när neuromuskulära signalöverföring och excitation-inducerad kalciumfrisättning är inkluderade i systemet som studeras. Vidare kan användas funktionstestning av enskilda fibrer för att komplettera kontraktila proteinidentifieringsresultat, såsom deerhållits genom immunhistokemi eller gelelektrofores + western blöt 22.
En av de primära funktionerna hos skelettmuskulaturen är att generera kraft. Följaktligen sF o, ett mått på den inneboende kraftgenererande kapaciteten hos ett kontraktila systemet, är av stort intresse för muskel fysiologer. Tillförlitliga uppskattningar SF o kräver exakta mått på både fiber CSA och F o. Eftersom fibrer är i allmänhet varken cirkulär i tvärsnitt, eller enhetlig CSA längs sin längd, stor försiktighet bör iakttas vid uppskattningen CSA. För detta ändamål, utförs mätningar vid flera ställen utmed fiberns längd och, vid varje plats, från två perspektiv åtskilda av 90 °. Tillförlitliga åtgärder Fq kräver uppmärksamhet på flera detaljer som står för passiv kraft, justera sarcomere längd för att maximera överlappning av tjocka och tunna trådar, som sysselsätter en aktiverande lösning med en kalciumkoncentration thatt resulterar i maximala aktiveringen, upprätthålla den önskade försökstemperaturen och bibehålla optimala lagringsförhållanden (temperatur och varaktighet) för fibrerna före dagen för experimentet.
Medan stegen här beskriver förfarandet för att utvärdera maximal isometrisk kraft, är det ofta önskvärt att utvärdera andra viktiga funktionella egenskaper hos skelettmuskelfibrerna. Detta kan uppnås genom att förlänga det experimentella protokollet för att inkludera ytterligare mekaniska manipulationer av fibern. Till exempel, mätning av den hastighet med vilken fibern förkortar mot en serie av olika laster möjliggör bestämning av den kraft-hastighetsrelation, från vilken kraft effekt och hastighet-maktförhållandena kan beräknas 10,23,24. Dessutom kan hastigheten på obelastade matfett bestämmas genom användning av "slak testet" 25, vilka består av att applicera en serie av, glapp inducerande shorte steg och measuring den tid som krävs av fibern för att avlägsna slacket. En annan kinetisk parameter som ofta rapporteras är k st, hastighetskonstanten för kraft sanering efter en mekanisk störning som tillfälligt lösgör alla crossbridges 26. Slutligen är förhållandet mellan kalciumkoncentrationen och aktiv kraft generationen (det "kraft-pCa förhållande") ofta av intresse 18 och kan fastställas genom exponering av fibern för en serie lösningar med kalciumkoncentrationer som sträcker sig från under tröskelvärdet för aktivering av kontraktila systemet till de som är tillräckliga för att framkalla maximal aktivering och därför maximal kraft (Fq).
Fastän mycket av den nämnda utrustningen behövs för bedömning av enkelfiber kontraktilitet, är annan utrustning som inte är absolut nödvändigt. Längden-controller, till exempel, är viktigt för alla försöksprotokoll som kräver snabb eller exakt förlängning eller förkortning av fiber,men är inte absolut nödvändigt för att utvärdera maximal isometrisk kraft (även en nollkraftnivå i kraft posten måste ändå identifieras på något sätt). Prismorna som tillåter observation av fibern från sidan, medan användbar för att bedöma tvärsnittsarea, är inte absolut nödvändiga vid positionering av fibern inuti försökskammaren. Vidare innebär alternativ för exponering av fibern till de olika experimentella lösningar skulle kunna användas, innefattande att utforma en manuellt manövrerade system av kammare eller en enda kammare som möjliggör snabb fyllning och tömning av lösningar. Slutligen, medan den under fysiologiska experimentella temperaturer såsom 15 ° C användes vanligen för att förbättra reproducerbarheten av mekaniska mätningar 1,2,3,5,8,12,17,27, är det möjligt att alstra giltiga data vid andra temperaturer 23 28 så länge som effekterna av temperaturen på lösnings egenskaper (kalciumkoncentration, pH, etc.) beaktas. Kompositionerna av testlösningar är bland de mest kritiska aspekterna av permeabilized fibertekniker som beskrivs här. Överväganden om lösningskomposition är komplexa och utanför ramen för denna artikel. De lösningar som beskrivs i steg 5 i protokollet avsnitt är utformade med en betoning på snabb aktivering av permeabilized fibern på dess överföring från pre-aktivering att aktivera lösningar och samtidigt behålla en konstant jonstyrka, katjonisk sammansättning, och osmolaritet 6,29. Andra metoder för lösningskomposition har använts med betydande framgång av andra forskargrupper och typiskt utnyttja publicerade bindningskonstanter och beräkningsverktyg 27,30,31. Koncentrationerna av kalciumjoner i de olika aktiverande lösningar är särskilt viktigt i studier med submaximal aktivering såsom kraft-PCA utvärderingar. För experiment i vilka fibrerna är fullt aktiverade, såsom de som beskriverd här, kalciumkoncentrationen i den aktiverande lösningen överstiger normalt med god marginal som krävs för att uppnå maximal kraft, vilket gör dess exakta kunskaper mindre kritisk. Tillsats av kreatinfosfat är viktig för buffring av intramyofibrillar ATP och ADP fluktuationer som annars skulle uppkomma vid en kontraktil aktivitet. Kreatinkinas krävs för att katalysera fosfatöverföringen från kreatinfosfat till ADP. Under experimentella betingelser som resulterar i höga ATP omsättningshastigheter, inklusive arbetar vid höga temperaturer eller mäta höghastighets förkortning i snabba fibrer 32, måste kreatinkinas tillsättas till lösningen för att komplettera den endogena kreatinkinas som förblir bunden till fibern. För mindre krävande experimentella betingelser är ATP-regenereringssystemet mindre kritisk 27.
Begränsningar av permeabiliserad enda fiber teknik innefattar följande. De data som genereras av dessa tester definierarkontraktila egenskaperna hos den specifika myofibrillar enhet som var fäst vid den experimentella apparaturen. Följaktligen fångar detta bara en liten bråkdel av hela multinukleära fibern från vilket det segment erhölls, som, i sin tur, utgör en liten andel av det totala antalet fibrer inom muskeln. Utredarna bör därför noga överväga den provtagning som krävs för att stödja de slutsatser som dragits från försöken. Dessutom, utvärdera effekterna av en träning intervention på fiber funktion förutsätter att fibrerna utvärderade faktiskt rekryterades under utbildningen. Även protokollet försöker att efterlikna den naturliga intracellulära miljön i fibern är sarcolemma permeabilization processen ospecifik och nödvändigtvis ger lösliga intracellulära beståndsdelar att fritt diffundera in i bad lösningar. En ytterligare konsekvens av membranpermeabiliteten är en förändring i den osmotiska balansen bevisas av en svullnad i fibervolym 33. Denfiber svullnad ökar avståndet mellan aktin och myosin filament resulterar i minskad kalcium känslighet myofilament systemet 34,35, men kan vändas genom införandet av stora, osmotiskt aktiva föreningar 34. En slutlig begränsning att överväga är en följd av den teknik som används för att fästa fibrerna till den experimentella apparaturen. Detta kräver alltid att snedvrida den rumsliga förhållandet inom glöd systemet och nära fästpunkterna, med att delta i funktionella brister. Närmare bestämt är de regioner i fibern vid och intill fästpunkterna funktionellt äventyras och därigenom bidra arte serie elasticitet mätsystemet.
Sammanfattningsvis har vi beskrivit ett sätt att bedöma kraft produktionskapacitet av kemiskt permeabiliserade skelettmuskelfibrerna in vitro. Även om fokus i denna artikel har varit på en bedömning av maximal isometrisk kraft generating kapacitet av mänskliga skelett muskelfibrer, kan modifieras den experimentella förhållningssätt och utvidgas till att bestämma en mängd olika kinetiska parametrar och relationer i en rad arter, däggdjur eller på annat sätt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene culture test tube with cap | Fisher Scientific | 14-956-3D | |
| 0.5 ml screw cap microcentrifuge | Fisher Scientific | 02-681-334 | |
| 0.5 ml microcentrifuge caps with o-ring | Fisher Scientific | 02-681-358 | |
| Microcentrifuge cryobox | Fisher Scientific | 5055-5005 | |
| pH meter | Mettler-Toledo | FE20 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
| Nonsterile-suture 10-0 monofilament | Ashaway Line Twine | S30002 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Forceps - Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microdissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | |
| Micrometer drives | Parker Hannifin | 3936M | |
| Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
| Temperature controller | Aplha Omega Instruments | Series 800 | |
| LabVIEW software | National Instruments | - | |
| Computer | Varied | - | |
| Chamber system | Aurora Scientific | 802D | |
| Length-controller | Aurora Scientific | 312C | |
| Force-transducer | Aurora Scientific | 403A | |
| Reagents | |||
| K-proprionate | TCI America | P0510 | |
| Imadizole | Sigma-Aldrich | I0125 | |
| MgCl2•6H20 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Brij 58 | Sigma-Aldrich | P5884 | |
| EGTA (acid) | Sigma-Aldrich | E0396 | |
| Na2H2ATP•0.56H2O | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| HEPES (acid) | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| MgO | Sigma-Aldrich | 529699 | |
| HDTA (acid) | TCI America | D2019 | |
| CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| KOH (1 N) | Sigma-Aldrich | 35113 | |
| HCL (1 N) | Sigma-Aldrich | 318949 | |
| Na2CrP•4H2O | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| pH 10 standard | Fisher Scientific | SB115 | |
| pH 7 standard | Fisher Scientific | SB107 | |
References
- Mendias, C. L., Kayupov, E., Bradley, J. R., Brooks, S. V., Claflin, D. R. Decreased specific force and power production of muscle fibers from myostatin-deficient mice are associated with a suppression of protein degradation. J Appl Physiol. 111 (1), 185-191 (2011).
- Gumucio, J. P., Davis, M. E., Bradley, J. R., Stafford, P. L., Schiffman, C. J., Lynch, E. B., Claflin, D. R., Bedi, A., Mendias, C. L. Rotator cuff tear reduces muscle fiber specific force production and induces macrophage accumulation and autophagy. J Orthop Res. 30 (12), 1963-1970 (2012).
- Mendias, C. L., Roche, S. M., Harning, J. A., Davis, M. E., Lynch, E. B., Sibilsky Enselman, E. r, Jacobson, J. A., Claflin, D. R., Calve, S., Bedi, A. Reduced muscle fiber force production and disrupted myofibril architecture in patients with chronic rotator cuff tears. J Shoulder Elbow Surg. 1 (4), 111-119 (2015).
- Moss, R. L. Sarcomere length-tension relations of frog skinned muscle fibres during calcium activation at short lengths. J Physiol. 292, 177-192 (1979).
- Chase, P. B., Kushmerick, M. J. Effects of pH on contraction of rabbit fast and slow skeletal muscle fibers. Biophys J. 53, 935-946 (1988).
- Moisescu, D. G., Thieleczek, R. Calcium and strontium concentration changes within skinned muscle preparations following a change in the external bathing solution. J Physiol. 275, 241-262 (1978).
- Walker, S. M., Schrodt, G. R. I Segment lengths and thin filament periods in skeletal muscle fibers of the Rhesus monkey and the human. Anat Rec. 178, 63-81 (1974).
- Gollapudi, S. K., Lin, D. C. Experimental determination of sarcomere force-length relationship in type-1 human skeletal muscle fibers. J Biomech. 42, 2011-2016 (2009).
- Brenner, B. Technique for stabilizing the striation pattern in maximally calcium-activated skinned rabbit psoas fibers. Biophys J. 41 (1), 99-102 (1983).
- Claflin, D. R., et al. Effects of high and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans. J Appl Physiol. 111, 1021-1030 (2011).
- Lynch, G. S., Faulkner, J. A., Brooks, S. V. Force deficits and breakage rates after single lengthening contractions of single fast fibers from unconditioned and conditioned muscles of young and old rats. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C249-C256 (2008).
- Frontera, W. R., Rodriguez Zayas, A., Rodriguez, N. Aging of human muscle: understanding sarcopenia at the single muscle cell level. Phys Med Rehabil Clin N Am. 23, 201-207 (2012).
- Malisoux, L., Francaux, M., Theisen, D. What do single-fiber studies tell us about exercise training. Med Sci Sports Exerc. 39 (7), 1051-1060 (2007).
- Widrick, J. L., Stelzer, J. E., Shoepe, T. C., Garner, D. P. Functional properties of human muscle fibers after short-term resistance exercise training. Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol. 238, 408-416 (2002).
- Trappe, S. Effects of spaceflight, simulated spaceflight and countermeasures on single muscle fiber physiology. J Gravit Physiol. 9 (1), 323-326 (2002).
- Malisoux, L., Jamart, C., Delplace, K., Nielens, H., Francaux, M., Thiesen, D. Effect of long-term muscle paralysis on human single fiber mechanics. J Appl Physiol. 102, 340-449 (2006).
- Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029. Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).
- Russell, A. J., et al. Activation of fast skeletal muscle troponin as a potential therapeutic approach for treating neuromuscular diseases. Nature Medicine. 18 (3), 352-356 (2012).
- Krivickas, L. S., Yang, J. I., Kim, S. K., Frontera, W. R. Skeletal muscle fiber function and rate of disease progression in amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 26, 636-643 (2002).
- Mendias, C. L., Marcin, J. E., Calerdon, D. R., Faulkner, J. A. Contractile properties of EDL and soleus muscles of myostatin-deficient mice. J Appl Physiol. 101, 898-905 (2006).
- Lynch, G. S., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Faulkner, J. A. Contraction-induced injury to single permeabilized muscle fibers from mdx, transgenic mdx and control mice. Am J Physiol Cell Physiol. 279, 1290-1294 (2000).
- Mizunoya, Q., Wakamatsu, J., Tatsumi, R., Ikeuchi, Y. Protocol for high-resolution separation of rodent myosin heavy chain isoforms in a mini-gel electrophoresis system. Anal Biochem. 377, 111-113 (2008).
- Hill, A. V. The heat of shortening and the dynamic constants of muscle. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 126, 136-195 (1938).
- Bottinelli, R., Canepari, M., Pellegrino, M. A., Reggiani, C. Force-velocity properties of human skeletal muscle fibres: myosin heavy chain isoform and temperature dependence. J Physiol. 495, 573-586 (1996).
- Edman, K. A. The velocity of unloaded shortening and its relation to sarcomere length and isometric force in vertebrate muscle fibres. J Physiol. 291, 143-159 (1979).
- Brenner, B., Eisenberg, E. Rate of force generation in muscle: Correlation with actomyosin ATPase activity in solution. PNAS. 83, 3542-3546 (1986).
- Moss, R. L. The effect of calcium on the maximum velocity of shortening in skinned skeletal muscle fibres of the rabbit. J. Muscle Res. Cell Motil. 3, 295-311 (1982).
- Pate, E., Wilson, G. J., Bhimani, M., Cooke, R. Temperature dependence of the inhibitory effects of orthovanadate on shortening velocity in fast skeletal muscle. Biophys J. 66, 1554-1562 (1994).
- Ashley, C. C., Moisescu, D. G. Effect of changing the composition of the bathing solutions upon the isometric tension-pCa relationship in bundles of crustacean myofibrils. J Physiol. 270, 627-652 (1977).
- Godt, R. E. Calcium-activated tension of skinned muscle fibers of the frog. Dependence on magnesium adenosine triphosphate concentration. J Gen Physiol. 63, 722-739 (1974).
- Fabiato, A., Fabiato, F. Calculator programs for computing the composition of the solutions containing multiple metals and ligands used for experiments in skinned skeletal muscle cells. Journal de Physiologie (Paris). 75, 463-505 (1979).
- Chase, P. B., Kushmerick, M. J. Effect of physiological ADP concentrations on contraction of single skinned fibers from rabbit fast and slow muscles). Am J Physiol. 268, C480-C489 (1995).
- Godt, R. E., Maughan, D. W. Swelling of skinned muscle fibers of the frog. Biophysical Journal. 19, 103-116 (1977).
- Kawai, M., Wray, J. S., Zhao, Y. The effect of lattice spacing change on cross-bridge kinetics in chemically skinned rabbit psoas muscle fibers. Biophys J. 64, 187-196 (1993).
- Millman, B. M. The filament lattice of striated muscle. Physiol Rev. 78 (2), 359-391 (1998).
- Edman, K. A. Contractile properties of mouse single muscle fibers, a comparison with amphibian muscle fibers. J Exp Biol. 208, 1905-1913 (2005).
- Phillips, S. K., Woledge, R. C. A comparison of isometric force, maximum power and isometric heat rate as a function of sarcomere length in mouse skeletal muscle. Pflügers Archiv. 420, 578-583 (1992).
- Stephenson, D. G., Williams, D. A. Effects of sarcomere length on the force-pCa relation in fast and slow-twitch skinned muscle fibres from the rat. J Physiol. 333, 637-653 (1982).
