Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

HPLC قياس الحمض النووي الأكسدة العلامات البيولوجية، 8 أوكسو 7،8-ثنائي هيدرو-2'-deoxyguanosine، في الخلايا المستزرعة والأنسجة الحيوانية

Published: August 1, 2015 doi: 10.3791/52697
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Environmental Health Science and Research Bureau, Health Canada

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو الكشف عن الحمض النووي الأكسدة علامة، 8 أوكسو 7،8-ثنائي هيدرو-2'-deoxyguanosine (8 أوكسو dGuo) من قبل HPLC-ED، في DNA من الخلايا المستنبتة أو الأنسجة الحيوانية.

Abstract

ويرتبط الاكسدة مع العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية، وكذلك التمثيل الغذائي أجنبي بيولوجيا، مما يؤدي إلى أكسدة الجزيئات الكبيرة، بما في ذلك الحمض النووي. ولذلك، كشف الفعال للأكسدة الحمض النووي مهم لمجموعة متنوعة من التخصصات البحثية، بما في ذلك الأدوية والسموم. A العلامات البيولوجية المشتركة للأضرار الحمض النووي oxidatively هو 8-أوكسو 7،8-ثنائي هيدرو-2'-deoxyguanosine (8 أوكسو dGuo، غالبا ما يشار إليها باسم خطأ 8-هيدروكسي-2'-deoxyguanosine (8-OH-dGuo أو 8 -oxo-DG)). وقد وصفت عدة بروتوكولات لقياس 8 أوكسو dGuo ارتفاع ضغط اللوني السائل مع كشف الكهروكيميائية (HPLC-ED). ومع ذلك، طبقت هذه أساسا لDNA تنقية تعامل مع الموالية للتأكسد. بالإضافة إلى ذلك، بسبب الاختلافات المنهجية بين المختبرات، ويرجع ذلك أساسا إلى الاختلافات في المعدات التحليلية، واعتماد أساليب نشرت للكشف عن 8 أوكسو dGuo من قبل HPLC-ED يتطلب التحسين دقيق من قبل كل مختبر. Aبروتوكول شامل، واصفا مثل هذه العملية الأمثل، غير متوفرة. هنا، يتم وصف بروتوكول مفصلة للكشف عن 8 أوكسو dGuo من قبل HPLC-ED، في DNA من الخلايا المستنبتة أو الأنسجة الحيوانية. فإنه يوضح كيفية إعداد عينة من الحمض النووي يمكن بسهولة وبسرعة الأمثل لتقليل أكسدة الحمض النووي غير المرغوب فيها التي يمكن أن تحدث أثناء إعداد العينات. ويظهر هذا البروتوكول كيفية اكتشاف 8 أوكسو dGuo في الخلايا المستزرعة الإنسان غدية السنخية (أي الخلايا A549) تعامل مع عامل مؤكسد KBrO 3، ومن الطحال من الفئران المعرضة للثنائي بنزو الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات (صفر، ع) chrysene (DBC، المعروف سابقا باسم بنزو (أ، ل) بيرين، DalP). عموما، يوضح هذا العمل كيف منهجية HPLC-ED يمكن أن يكون الأمثل بسهولة للكشف عن 8 أوكسو dGuo في العينات البيولوجية.

Introduction

تساهم أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS)، الذي مستويات ثابتة للدولة يمكن أن تزيد خلال العديد من الحالات المرضية والتمثيل الغذائي xenotoxic، إلى زيادة وتيرة الحمض النووي من التلف التأكسدي. بين عدة النووية nucleobases الممكنة منتجات الأكسدة، ويمكن أن الحمض النووي من التلف التأكسدي بسهولة أن تقاس باستخدام علامة مستقرة 8 أوكسو 7،8-ثنائي هيدرو-2'-deoxyguanosine (8 أوكسو dGuo)، التي تعد واحدة من أشكال المؤكسد من 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-أوكسو dGuo هو آفة DNA الأكثر وفرة 2، وبالتالي، وقد درس لمزيد من التفاصيل والعلامات البيولوجية أكسدة الحمض النووي على الرغم من وجود الحمض النووي عدة منتجات الأكسدة 3. في البشر، وهذا الضرر يمكن إصلاحه عن طريق قاعدة إصلاح الختان بنسبة 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1) 4. إذا تركت دون إصلاح، ويمكن 8 أوكسو dGuo المساهمة في تشكيل قاعدة الطفرات الزوج إحلال (أي G إلى T transversions) 4. الأهم من ذلك، 8 أوكسو dGuo هو علامة المنشأة FOالحمض النووي من التلف (ص) في ما يتعلق استهلال وتعزيز التسرطن 2. ولذلك التقدير الدقيق 8 أوكسو dGuo هو العلامات البيولوجية مفيدة ومرغوبة من الحمض النووي من التلف التأكسدي 5.

هناك ارتباك واسع النطاق في الأدبيات المتعلقة الأسماء الصحيحة لأشكال تلف oxidatively ل2-deoxyguanosine وعلاوة على ذلك، والاسم الصحيح للمجمع (ق) تقاس بشكل روتيني والعلامات البيولوجية من الحمض النووي من التلف التأكسدي 6. من 6،8-diketo و 6 إنول، 8-كيتوني أشكال صنواني من 8 أوكسو dGuo (كما هو موضح في الشكل رقم 1) هما tautomers أبرز مناقشتها في الأدب 5،7. شكل 6،8-diketo هو الشكل الأبرز في درجة الحموضة الفسيولوجية 7.4، و هو الأبرز أكسدة الحمض النووي المنتج 7. لذا، 8 أوكسو dGuo، بدلا من 8 هيدروكسي dGuo هو الاسم الأنسب لهذا المنتج أكسدة 6. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن 2-deoxyguanosine (dGuo)، بدلا من nucleobبورصة عمان جوانين (غواتيمالا) أو غوانوزين ريبونوكليوزيد (قوه) على التوالي، تم الكشف من قبل معظم وسائل 6.

كشف دقيق وتقدير من 8 أوكسو dGuo يمثل تحديا للأسباب التالية: أ) التباين في الهضم من عينة من الحمض النووي، والثاني) الأكسدة عرضية من dGuo إلى 8 أوكسو dGuo التي يمكن أن تحدث أثناء إعداد العينات، والثالث) الحاجة للتحقق من صحة الفعال للالتحليلي طريقة HPLC-ED 8. في هذا البروتوكول، ونحن تهدف إلى تحقيق ط) من خلال توفير الظروف المواتية لاستكمال عملية الهضم DNA والثاني) من قبل خالب إدراج المعدن وحلول المعالجة خالب وكاشف عزل DNA الخاص، في حين أن الثالث) كانت موجهة جزئيا فقط إدراج الضوابط الإيجابية، وبالتالي تنص على أن الأسلوب هو قادر على اكتشاف 8 أوكسو dGuo في العينات البيولوجية. مزيد من التأكيد هو أبعد من نطاق هذه الورقة. ومع ذلك، فإننا واثقون من أن هذا البروتوكول سوف تساعد المحتملينالمستخدمين على تحديد المدى الذي يحتاجون إليه للتحقق من صحة رسميا البروتوكول، حسب أغراضها. وهناك قائمة من الخطوات المطلوبة للمصادقة رسمية من طريقة أخرى. خلال تطوير ونشر طريقة للكشف عن 8 أوكسو dGuo، تم استعراض أساليب نشر وتوحيدها. وبالتالي، فإن هذا الأسلوب يلغي الحاجة إلى جمع المعلومات من عدة مصادر منشورة التي تفتقر في كثير من الأحيان تفاصيل التجريبية مهمة بينما توفر أيضا وسيلة سريعة ومباشرة من اختبار إذا تم اعتماد أسلوب للكشف وتقدير من 8 أوكسو dGuo بنجاح. كان يعمل هذا الأسلوب تكييفها لتحليل عينات من الحمض النووي بنجاح من الخلايا المستزرعة والأنسجة الفئران. هذه المقالة الفيديو سوف تساعد مجموعات أخرى في إنشاء وسيلة فعالة للكشف عن موثوقة وتقدير من 8 أوكسو dGuo من قبل HPLC-ED.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

التأكد من أن جميع تربية الحيوانات، والإسكان، والتعامل مع والتجريب الالتزام بالقواعد واللوائح المحلية وتمت الموافقة على أن بروتوكولات التجارب قبل البدء في أي دراسة. لوصف التجارب، تمت الموافقة على رعاية الحيوان، ومعالجة، والعلاج من قبل لجنة رعاية الحيوان وزارة الصحة الكندية. راجع "الجدول الكواشف" للحصول على معلومات الموردين.

1. جمع العينات البيولوجية

  1. الخلايا أو الأنسجة الحيوانية
    1. زراعة خلايا غدية A549 السنخية الإنسان في F12-K وسائل الإعلام التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني، 100 وحدة / مل من البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين.
    2. خلايا البذور على ما يقرب من 1 مليون خلية في 10 سم لوحة. لكل تجربة، استخدم مجموعة من 12 لوحات في المجموع (ثلاث لوحات في مكررة واحدة البيولوجي X أربع جرعات) لتوفير ما يكفي من الحمض النووي (80 ميكروغرام) لعملية الهضم الأنزيمي وتحليل HPLC.
    3. عندما تصبح كثافة الخلية أكبر من تقريباimately 70٪ من مساحة سطح لوحة، وإزالة وسائل الإعلام وغسل خلايا مرتين مع 4 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، ودرجة الحموضة 7.4.
    4. للخلايا الحيوانية مثقف، استخدم KBrO 3 كعنصر تحكم إيجابية.
      ملاحظة: وجود علاقة خطية طردية بين KBrO تركيز 3 والتردد 8-أوكسو dGuo تم الإبلاغ في الأدبيات 9.
    5. حل KBrO 3 في برنامج تلفزيوني. تأكد من أن تركيز النهائي في مستنبت الخلية أكبر من 1 ملم إلى الحصول على زيادة ذات دلالة إحصائية في 8 أوكسو dGuo بالنسبة لخلايا الامم المتحدة وعرضة للخطر. إضافة نفس التركيز من KBrO 3 إلى كل لوحة في سلسلة (على سبيل المثال، لوحات 12 10 سم).
    6. احتضان لوحات لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية. إزالة وسائل الإعلام ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
    7. إضافة 1 مل من محلول التربسين (تركيز الأسهم 2.5 غرام / مل)، واحتضان لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    8. يغسل مع 4 مل PBS، وجمع الخلايا من كل مجموعة الى احد polystyr 50 مل المخروطيةالشم أنبوب الطرد المركزي، والطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    9. إزالة برنامج تلفزيوني وتخزين بيليه خلية في -80 درجة مئوية حتى إجراء مزيد من التحليل. أكسدة الحمض النووي الاصطناعي يمكن التقليل من جراء العزلة النووية، كما هو موضح في مكان آخر (10).
  2. الأنسجة الحيوانية
    1. الجرعة الحيوانات كما هو مطلوب. لهذا البروتوكول، والكبار (9 أسابيع من العمر) علاج الذكور مؤتة الماوس عن طريق أنبوب تغذية عن طريق الفم يوميا لثلاثة أيام متتالية مع 20 ملغ DBC / كجم من وزن الجسم يوميا المذاب في زيت الزيتون.
      ملاحظة: هذا الحيوان المعدلة وراثيا الموانئ المهندسة λ-الجراثيم وتحور الجين مراسل lacZ من E. القولونية 11 يستخدم لمكافحة القوارض المعدلة وراثيا المقايسات الطفرة 12.
    2. أداء تشريح الحيوان على سبيل المثال، تخدير الفئران يمكن أن تستخدم الأيزوفلورين ومن ثم الموت الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم يليه افتتاح تجويف الصدر. فلاش على الفور الأنسجة تجميد في النيتروجين السائل. مخزن الأنسجة في -80 درجة مئوية حتى التحليل.
      ملاحظة: توقيت القتل الرحيم بعد العلاج قد يكون متغير آخر مهم (على سبيل المثال، كانت أكسدة الحمض النووي القصوى في 72 ساعة بعد التعرض للضوضاء في الدماغ الفئران والكبد 13).

2. استخراج الحمض النووي، إن الأمطار وغسل (لأنسجة الانتقال مباشرة إلى 2.2)

  1. التجانس الخلايا التي تم جمعها في 50 مل المخروطية أنبوب الطرد المركزي البوليسترين مع 1 مل من الحمض النووي عزل الوكيل مثل DNAzol. استخدام 1000 ميكرولتر طرف ماصة لتفريق بيليه الخلية حتى الحل هو متجانس. نقل جناسة لأنبوب جديد microcentrifuge 1.5 مل. احتضان على الجليد لمدة 10-20 دقيقة. انتقل إلى 2،3.
  2. التجانس 15-20 ملغ من الأنسجة في 1 مل يده الخالط الزجاج غير لاصقة تحتوي على 500 ميكرولتر كيل عزل الحمض النووي. بلطف رفع وخفض الخالط لمدة 1 دقيقة. سوف الأنسجة ليونة تتطلب وقتا أقل. علاج لطيف يضمن القص أقل من DNA. تخزين جناسة على الجليد لمدة حوالي 10-20 دقيقة.
  3. كريةجناسة بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 10000 x ج و 4 درجات مئوية في 1.5 مل المخروطية أنبوب microcentrifuge.
  4. نقل بعناية طاف مما أدى إلى الجديد 1.5 مل أنبوب microcentrifuge مع إيلاء اهتمام دقيق لتجنب الاتصال بيليه.
  5. ترسيب الحمض النووي من جناسة بإضافة 0.5 مل 100٪ ETOH لكل 1 مل من جناسة. عكس أنابيب 10 مرات لضمان عزل كاشف وETOH تختلط بما فيه الكفاية.
  6. عند هذه النقطة، راسب الحمض النووي هو لزج، بكرة وضعها على طرف ماصة بلاستيكية (على سبيل المثال، مع القدرة على الاحتفاظ أقصاها 200 ميكرولتر) ثم نقل إلى 1.5 مل جديدة المخروطية أنبوب microcentrifuge.
    ملاحظة: الطرد المركزي السريع يمكن أن تستخدم لإزالة أي المحللة المتبقية من عزل الحمض النووي.
    (غسل DNA والإذابة)
  7. إضافة 1 مل من 75٪ ETOH إلى عزل الحمض النووي. تعليق بيليه الحمض النووي بدقة من قبل قلب الأنابيب 10 مرات.
  8. صب بعناية الإيثانول من الأنبوب. ضمان عشربيليه ه DNA العصي إلى جانب الأنبوب. تخزين أنابيب عموديا لمدة 1-2 دقيقة، واستخدام ماصة لإزالة أي فائض ETOH من الجزء السفلي من الأنبوب.
  9. تكرار DNA يغسل مرة أخرى، وإما تخزين العينة في ETOH في -20 ° C (مستقر لعدة أشهر) أو الشروع فورا في عملية الهضم.
  10. حل DNA العازلة في الهضم (هو موضح أدناه) ثم تحديد باستخدام الطرق الطيفية القياسية (أي الامتصاصية في 260 نانومتر باستخدام معمل NanoDrop الطيف).

3. الأنزيمية الهضم

  1. إعداد "العازلة الهضم" من خلال الجمع بين وحدات التخزين المناسبة (اعتمادا على عدد العينات التي يتم هضمها) 50 مم أحادي فوسفات الصوديوم (التي تحتوي على 2.0 ملي بوكل، 1.0 ملي desferal (DFO) و 200 ملي MgCl 2) مع 50 ملم ثنائي القاعدة نا الفوسفات (يحتوي أيضا 2.0 ملي بوكل، 1.0 ملم و 200 ملم DFO MgCl 2). يتطلب كل عينة 4.0 ميكرولتر أحادي و17،0 ميكرولتر حل فوسفات ثنائي القاعدة.
    2. <لى> إزالة أي ETOH المتبقية من الجزء السفلي من الأنبوب والهواء الجاف عينات لمدة 5 دقائق. تأكد من أن الحمض النووي لا تجف تماما.
  2. حل 80 ميكروغرام الحمض النووي المستخرج في 21.0 ميكرولتر من العازلة الهضم، إضافة 1 وحدة من الدناز I يذوب في 2.0 ميكرولتر من العازلة الهضم.
  3. دوامة برفق لتحقيق خلط دقيق واحتضان لمدة 1.5 ساعة عند 37 ° C.
  4. في نهاية فترة الحضانة، إضافة 216.4 ميكرولتر من ثنائي القاعدة 50 ملي نا حل الفوسفات التي تحتوي على 2.0 ملي بوكل، 1.0 ملم و 200 ملم DFO MgCl 2.
  5. إعداد "الهضم العازلة-2" من خلال الجمع بين مجلد واحد من العازلة الهضم مع تسعة مجلدات من ثنائي القاعدة، 50 ملي نا الفوسفات (مع 2.0 ملي بوكل، 1.0 ملم و 200 ملم DFO MgCl 2).
  6. إضافة 0.025 وحدة من فسفودايستراز (PDE) I انزيم في 16.3 ميكرولتر الهضم العازلة-2. ماصة صعودا وهبوطا لعدة ثوان، ثم دوامة برفق لتحقيق خلط دقيق واحتضان لمدة 1.5 ساعة عند 37 ° C.
  7. إضافة 00.4 وحدات من الفوسفاتيز القلوية (AP) في 8.0 ميكرولتر الهضم العازلة-2. ماصة صعودا وهبوطا لعدة ثوان، ثم دوامة برفق لتحقيق خلط دقيق واحتضان لمدة 1.5 ساعة عند 37 ° C. إضافة 33.0 ميكرولتر HPLC الصف MeOH.
  8. تشغيل عينات من الحمض النووي يهضم على HPLC، كما هو موضح أدناه، على الفور أو تخزينها في -80 درجة مئوية حتى استخدامها للحد من الأكسدة. ملاحظة: الخطوات الهضم 1.5 ساعة المقترحة هنا تقوم على الفترات اقترحت في مكان آخر 9 وعلى النتائج التي بروتوكولات مماثلة تحقيق كامل الهضم DNA 9. لذلك، كان من المفترض أن العامل المحدد الوحيد لتحقيق كان الهضم الكامل الوقت وأن تثبيط أنزيم والتجانس عينة كانت لا تكاد تذكر.

4. HPLC تشغيل: إعداد موبايل المرحلة، إعداد الأجهزة والصيانة

  1. استخدام الماء عالى النقاء لتحضير جميع المحاليل وتعامل مع السندات الراتنج عالية القوة (على سبيل المثال، Chelex 100: الستايرين divinylbeالبوليمرات nzene مع iminodiacetate أيونات المعادن التي تمر بمرحلة انتقالية كلاب مع تقارب عالية) للحد من التلوث بالمعادن وأكسدة الحمض النووي خلال إعداد العينات.
  2. إعداد 250 ملي نا العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 6.2. استخدام نسبة 1: 3.6957 للثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم (FW = 177.99 جم / مول) إلى أحادي فوسفات الصوديوم (FW = 119.98 جم / مول).
    مثال: لذلك، من أجل حل الأسهم 3 L الجمع بين 70.81 غرام من أحادي القاعدة و28،43 غرام من مسحوق ثنائي القاعدة، إضافة الماء حتى على سبيل المثال، 2.8 L وتحقق من أن الرقم الهيدروجيني للمحلول 6.2. ضبط درجة الحموضة مع 250 ملي أحادي أو ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم الحلول، التي أعدت بشكل منفصل وليس عن طريق الأحماض المركزة أو قواعد. إضافة 2.24 غرام من بوكل للحصول على تركيز من 10 ملي بوكل.
  3. إعداد المرحلة المتنقلة في ثلاث زجاجات، لا يقل عن 1 L لكل منهما، تحتوي على: المذيبات B - HPLC الصف الميثانول، والمذيبات - B عالى النقاء الماء، والمذيبات C - العازلة الفوسفات من الخطوة 4.2. إدراج HPLC الطور المتحرك إمدادات أنابيب في زجاجات. remainiيجب أن تراجع أنابيب نانوغرام أيضا في واحدة من الزجاجات (على سبيل المثال، حل C) وتستعد حتى لو أنها ليست مطلوبة لخلط.
  4. خلال الفترة السابقة، وخلط الحلول الطور المتحرك إلى 6٪ المذيبات A، 74٪ المذيبات B و 20٪ المذيبات C لتحقيق حل نهائي لل50 ملي العازلة فوسفات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 6.2) مع 2.0 ملي بوكل، و 6٪ MeOH.
  5. فصل القطب من كشف الكهروكيميائية، تفكيكة وإشارة نظيفة وأقطاب العمل مع حلول التنظيف الكهربائي وتلميع أقراص الموصى بها من قبل الشركة المصنعة. شطف السطوح تنظيفها بالماء عالى النقاء، ومسح المياه قبالة بلطف وضمان كاشف جاف قبل أن يتحول النظام على.
  6. إعادة تجميع كشف وربط مرحلة مدخل المحمول إلى القطب. بدوره على تدفق والسماح للمرحلة النقالة لتملأ الكهربائي قبل ربط منفذ أنبوب المرحلة المحمول. تثبيت عمود جديد قبل بدء الأمثل. ضمان التثبيت في الاتجاه الصحيح ووOLLOWS التوصيات عن الشركة الصانعة.
  7. بدوره على الأجهزة جنة البرنامج الرفيعة المستوى قبل وقت كاف (على سبيل المثال، 1 ساعة) من عينة تحاليل للسماح للموازنة والحد من الضوضاء الأساسي. انظر الجدول رقم 1 لضبط المقترح؛ يجب وضع حد الضغط مرة أخرى إلى 3000 رطل لكل بوصة مربعة لتجنب الضرر العمود. بدوره على الغاز الراحل. المضي قدما فتيلة المضخات ووضع التدرج المذيبات.
  8. رئيس الجاف المضخات وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. نفعل ذلك لترطيب خطوط عندما تم استبدال مرحلة الجوالة أو يتعرض لها مدخل أنابيب للهواء.
  9. تحديد القرص فتيلة وإدراج البلاستيك 10-15 مل حقنة هناك. تأكد من إدخال الحقنة بالكامل قبل فتح الخط. لفتح خطوط تتحول ببساطة القرص عكس اتجاه عقارب الساعة لدورة واحدة.
  10. بدء رئيس الوزراء في اختيار واجهة HPLC المناسبة. سحب بلطف حقنة لرسم السوائل في خطوط. مرة واحدة السائل يتدفق، رئيس مجلس اكتمال؛ يسمح البرنامج لالانتهاء من التشغيل. أكرر لجميع خطوط (عادة أربعة، اعتمادا على الصك).
  11. بدلا من ذلك، رئيس الرطب عندما يتم المبللة خطوط بالفعل من رئيس الجاف سابق (انظر أدناه).
    ملاحظة: عندما انقضت على كمية كبيرة من الوقت بين الاستخدامات (على سبيل المثال، 2 أسابيع أو أكثر)، وأوصى رئيس الجاف.
  12. تغيير تركيبة مكونات المذيبات الطور المتحرك إلى 25٪ لكل منهما باستخدام واجهة المستخدم HPLC. من واجهة، حدد "وظيفة مباشرة" الخيار، ثم حدد "ويت رئيس" الخيار. هذا سيقوم رئيس كل الخطوط في نفس الوقت.
  13. تأكد من أن كل الهواء من النظام من خلال مراقبة خط رئيس الرطب لأنه يدخل في حاوية النفايات. بعد البرايم جيد، وضمان أن يتم ترك أي فقاعات في الخط. إذا استمرت فقاعات، كرر فتيلة.
  14. مرة واحدة وتستعد المضخة، تبدأ في التحرك الطور المتحرك HPLC. استخدام واجهة HPLC لتغيير تكوين الطور المتحرك يدويا إلى 6٪ الميثانول (A المذيبات) و 94٪الماء (مذيب B)، وحدد معدل تدفق 0.9 مل / دقيقة. سماح 5 دقائق لمسح أي الميثانول من الخطوة التنظيف العمود.
  15. بعد 5 دقائق، تغيير التركيبة إلى 6٪ الميثانول (A المذيبات)، والمياه 74٪ (المذيبات B)، و 20٪ عازلة (المذيبات C)، وزيادة معدل التدفق إلى 1.0 مل / دقيقة. تعيين المعلمات الأخرى كما هي ملخصة في الجدول رقم 1، وتعيين الحد يعود الضغط إلى 3000 رطل لكل بوصة مربعة لتجنب الضرر العمود.
    ملاحظة: المشاكل المحتملة مع الإعداد HPLC وتشمل الانجراف خط الأساس، وذروة الانقسام وتقلص كثافة الإشارة. هذه عادة ما يمكن التغلب عليها عن طريق تنظيف العمود بعد كل استخدام، تنظيف الكهربائي المتكرر، والتأكد من أن المحاليل خالية من التلوث (على سبيل المثال، الجسيمات أو نمو الجراثيم).
  16. تشغيل المرحلة المتنقلة لحوالي 1-1.5 ساعة لتحقيق إشارة خط الأساس مستقرة.
  17. باستخدام واجهة البرنامج الصك، المعلمات مختارة كما هو مبين في الجدول رقم 1 وتعيين وقت التشغيل لمدة 15 دقيقة. حقن سامسبيل. استخدام زيادة مرات المدى للعينات معقدة (تحديد هذا تجريبيا من خلال مراقبة وجود أو عدم وجود قمم تتجاوز فترة 15 دقيقة).
    ملاحظة: أدوات البرنامج يسمح برمجة المدى الظروف عينة والإعداد لautosampling.
  18. بعد أن تم الانتهاء من تشغيل، إيقاف الخلية كشف باستخدام واجهة للكشف. فمن المهم اتباع توصيات الشركة المصنعة فيما يتعلق بانخفاض الطاقة كاشف كما مناولتها وإيقاف التشغيل يمكن أن تلحق الضرر الصك. DO NOT إيقاف الخلية عن طريق التحول الجزء الخلفي من كاشف لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف الصك.
  19. تغيير التركيبة مرحلة المحمول إلى 6٪ الميثانول و 94٪ من المياه يدويا. تشغيل لمدة 5 دقائق.
  20. تخفيض يدويا معدل التدفق إلى 0.7 مل / دقيقة، وعلى الفور تغيير التركيبة إلى 50٪ MeOH و 50٪ من المياه. تشغيل لمدة 20 دقيقة على الأقل. فشل لتشغيل هذه الخطوة للمرة أوصى يمكن أن يؤدي إلى تلف العمود وكاشف. إيقاف تدفق، لد ثم إيقاف الغاز الراحل.

5. إعداد المعايير

  1. إعداد عازلة المرحلة المحمول كما هو موضح في الخطوات 4،1-4،3 أعلاه. من المهم استخدام الطور المتحرك HPLC لإعداد معايير لتجنب القمم الناتجة عن اختلاط حلول متباينة بعد حقن العينة.
  2. تمييع هذا الحل احد من كل خمسة مع الماء عالى النقاء قبل استخدامها، ويجب أن يحتوي على الحل النهائي 6٪ MeOH.
  3. dGuo قياسي
    ملاحظة: إمكانية الأكسدة العالية المطلوبة للكشف عن dGuo قد تزيد من خطر التدخل قياس المركبات electroactive. هذا يمكن التحقق منها، على سبيل المثال، منحنى القياسية للكشف عن الأشعة فوق البنفسجية من dGuo في 260 نانومتر، ومقارنتها منحنى القياسية التي تم إنشاؤها باستخدام الكشف EC. إذا كان كل من محاذاة بشكل جيد (على سبيل المثال، الشكل التكميلي 1) وقد اتخذت والآثار مصفوفة العينة بعين الاعتبار، يمكن للمرء أن المضي قدما في كشف dGuo بواسطة الأشعة فوق البنفسجية في 260 نانومتر، بدلا من الكشف EC.
    1. دوامة بسرعة عالية حتى يذوب تماما dGuo. هذا هو مخزون الابتدائي؛ تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية لعدة أسابيع.
    2. لإنشاء dGuo الأسهم الثانوية (0.5 ملم)، وتمييع 143 ميكرولتر من الأسهم dGuo الابتدائي في 857 ميكرولتر من الطور المتحرك HPLC. تخزين على الجليد حتى استخدامها وإعداد الطازجة يوميا.
    3. تقديم مزيد من التخفيفات لخلق منحنى القياسية (على سبيل المثال، الجدول 2). مخزن الحلول على الجليد وإعداد الطازجة يوميا. معايير تشغيل في سلسلة مع العينات التجريبية.
    4. قبل تشغيل، تختلف الجهد للكشف عن استخدام أعلى تركيز للسهم للعثور على الجهد الأمثل.
  4. 8-أوكسو dGuo قياسي
    1. قياس 1.0 ملغ من 8 أوكسو dGuo في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. إضافة 0.1 مل HPLC الصف MeOH. دوامة على سرعة عالية حتى 8 أوكسو dGuo يذوب تماما. هذا هو المخزون الأساسي من 8 أوكسو dGuo. تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة بغازيأسابيع األطراف.
    2. في أنبوب منفصل، والجمع بين 2.9 ميكرولتر من الأسهم الابتدائي و997.1 ميكرولتر من HPLC الطور المتحرك العازلة، دوامة. هذا هو مخزون الثانوي (10000 نانومتر).
    3. لإيجاد حل لعمل منحنى قياسي (250 نيوتن متر)، والجمع بين 24.4 ميكرولتر من الأسهم الثانوي و975.6 ميكرولتر من العازلة المرحلة المحمول.
    4. أداء المزيد من التخفيفات في تقديم الحلول المطلوبة لإنشاء منحنى القياسية (على سبيل المثال، الجدول 3). مخزن الحلول على الجليد وإعداد الطازجة يوميا. معايير تشغيل مع العينات التجريبية.
  5. تحديد الكمية
    1. دمج المنطقة تحت المنحنى لكل 8 أوكسو dGuo وdGuo باستخدام البرمجيات القياسية (كجزء من واجهة HPLC والحاسوب؛ انظر التكميلي الشكل 2A).
    2. بناء المنحنى القياسي (تركيز يعرف كل تحليلها مقابل المنطقة تحت المنحنى (التكميلي الشكل 2B). وباستخدام معادلة منحنى قياسي، وحساب نسبة ل8-أوكسو dGuo / dGuo لكل عينة.

6. الاغاروز جل الكهربائي

ملاحظة: الاغاروز الكهربائي للهلام يمكن أداؤها للتحقق من اكتمال DNA الهضم.

  1. إعداد 50X تريس، خلات-EDTA (تاي) العازلة، عن طريق إذابة 242 جم تريس قاعدة (FW = 121.14) في 750 مل ماء عالى النقاء. إضافة 57.1 مل حمض الخليك الجليدي و 100 مل من 0.5 M EDTA (8.0 درجة الحموضة، وسوف EDTA حل تماما عندما يتم ضبط درجة الحموضة الحل إلى 8.0 مع مثل هيدروكسيد الصوديوم) وإضافة الماء عالى النقاء إلى الحجم النهائي من 1 L. مخزن في RT، تمييع هذه 50X حل قبل استخدامها.
  2. تزن من 1 غرام من الاغاروز وحله في 100 مل 1X TAE العازلة، التدفئة في الميكروويف لمدة 1-2 دقيقة. ارتداء نظارات واقية ومعدات وقائية لتجنب الاتصال مع الاغاروز المغلي.
  3. تبريد حل لأسفل حتى ما يقرب من 50 ° C، إضافة 5 ميكرولتر إيثيديوم بروميد (تحذير: المغير) وسكبه في الاغاروز جهاز هلام التوالي. إدراج مشط.
  4. انتظر حتى يتصلب حل، صب عازلة TAE على هلام وتحميل العينات (الحجم يعتمد على حجم مشط، عادة، يتم تحميل 10-20 ميكرولتر من عينة من الحمض النووي، ويخلط مع 6X تشغيل صبغ لتصور وتسهيل التحميل).
  5. تشغيل هلام حتى يهاجر الصبغة حوالي 2/3 طول هلام (على سبيل المثال، 45 دقيقة في 150 V). تصور العصابات DNA تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ولوحظ dGuo أن يكون لها الوقت الاحتفاظ 4.7 دقيقة في حين كان 8 أوكسو dGuo فترة الاحتفاظ حوالي 6.4 دقيقة (الشكل 2A وباء). هناك اختلاف حول 1000 أضعاف في مرتفعات الذروة بين التحاليل اثنين، كما يظهر في الشكل 2C. تم الحصول على Voltammograms لمدة 8-أوكسو dGuo وdGuo وفقا للمعايير التوالي في إمكانية العمل في مجموعة من 0،2-1،1 V. تم تحديد إمكانية العمل المثلى ل8 أوكسو dGuo أن يكون +0.5 V، و+0.9 V لdGuo (الشكل 3). هذه الإمكانات هي في الاتفاق مع غيرها من أقطاب الكربون زجاجي موضح في الأدب 14،15. وذكر أن الحد من الكشف ومجموعة ديناميكية من 8 أوكسو dGuo وdGuo كشف الكهروكيميائية أن تكون في نطاق فيمتومول ونانومول على التوالي 8،9. يجب تشغيل منحنيات القياسية لdGuo و 8 أوكسو dGuo يوميا لضمان الكشف خطي عبر مجموعة تركيز مناسب وأداء السليمتعصب الصك (الشكل 4). هي التي شيدت المنحنيات القياسية التي المتهم بالتآمر في منطقة ذروة بوصفها وظيفة من تركيز الحليلة معروف (الشكل التكميلي 2) أن يسمح احد لحساب تركيز الحليلة في عينات من المعادلة المتولدة من المنحنيات القياسية.

مطلوب الكامل DNA الهضم لقياسات دقيقة من التردد 8-أوكسو dGua، فهناك عدة طرق الهضم الحمض النووي الجيني قد اقترح 8،15،16. عند الضرورة، يمكن التحقق من فعالية استخراج الحمض النووي والهضم باستخدام الاغاروز الكهربائي هلام (الشكل 5A) وHPLC-ED (الشكل 5B). الممرات مع مسحة DNA واضحة في الشكل 5A (على سبيل المثال، والممرات 2، 4، 6، 9، 11، و 13) تشير إلى وجود الحمض النووي عسر الهضم بينما العينات مع شظايا الحمض النووي هضم الاعادة جل وكانت بالتالي لم يتم كشفها. الهضبة في الشكل 5B إلى أن زيادة incubatiعلى الحمض النووي مع إنزيمات الهضم وراء 1.5 ساعة لا يؤدي إلى أكبر مبلغ من dGuo الكشف، مما يشير إلى عملية الهضم الكامل تقريبا بعد 1.5 ساعة. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام كل من الاغاروز الكهربائي جل وHPLC-ED لاختبار فائدة المخزن المؤقت الهضم DNA القائم على الفوسفات يعملون هنا. يتم مطابقة هذا المخزن المؤقت بشكل جيد لمرحلة الجوالة HPLC ولا تؤدي إلى الضوضاء غير المرغوب فيها للكشف عن تعزى إلى اختلاط حلول متباينة (لا تظهر البيانات). لذلك، والتحول من المخزن المؤقت اقترح في الأدب (أي تريس، حمض الهيدروكلوريك 8) ينصح العازلة فوسفات الصوديوم لهذا البروتوكول (يسار مقابل الجانب الأيمن من الشكل 5A). يرجى ملاحظة أن الافتراضات الكامنة وراء تحسين الهضم DNA كانت أن تثبيط الانزيم والتجانس عينة كانت لا تكاد تذكر، وكان الوقت الهضم العامل المحدد فقط، كما هو مذكور أعلاه. وهناك احتمال أن الهضم DNA غير مكتمل أدى إلى شظايا التي هي صغيرة جدا ليكون DETEالمديرية التنفيذية على بقايا هلام الاغاروز. على الرغم من أن مثل هذا الخطأ المنهجي سيؤثر جميع العينات على قدم المساواة، المزيد من التجارب (على سبيل المثال، وعلاج الخلايا المستزرعة مع radiolabelled الموالية للأكسدة 10) يمكن أن تجرى على يستبعد تماما مثل هذا الاحتمال.

خلافا للحلول القياسية، وDNA هضمها، سواء من الخلايا أو الأنسجة المعزولة الماوس، أنتج عدة قمم إضافية (6A الشكل و6B). وكانت هذه بعيدة عن 8 أوكسو dGuo وdGuo القمم، لكن ارتفاعه التجارب كجزء من التدريبات التحقق من صحة المبينة في المناقشة هناك حاجة لفحص إذا قمم إضافية (أي عينة النجاسة وذلك بسبب الآثار مصفوفة، على سبيل المثال) تتداخل مع الكمي . وأكد للdGuo 8 أوكسو الذروة عن طريق المراسلة من الوقت الاحتفاظ مع معيار؛ وعلاوة على ذلك، وزيادة في 8 أوكسو dGuo الذروة لعينات من خلايا أو الحيوانات التي خضعت للعلاج الموالية للأكسدة (الشكل 7). الموالية للأكسدة KBrO 3 يشارك في التجريد-إلكترون واحد من جوانين الذي يؤدي إلى تشكيل 8 أوكسو dGuo 17. ومن الجدير بالذكر أنه في غياب الضغط الموالية للأكسدة، تم الكشف عن 2.4 جزيئات 8 أوكسو dGuo في 10 7 dGuo في الخلايا A549 (الشكل 7A). هذه تعادل 4.5 جزيئات 8 أوكسو dGuo / 10 7 dGuo الكشف في خلايا A549 لاحظ استخدام كبديل لذلك، النهج القائم على قياس الطيف الكتلي تهدف إلى معالجة أوجه القصور المحتملة للطريقة HPLC-ED 9. العلاج DBC (أي 20.0 ملغ يوميا DBC / كجم من وزن الجسم يوميا لمدة ثلاثة أيام) زيادة 8 أوكسو dGuo المستويات في DNA الماوس الطحال. وهذا هو أيضا نتيجة متوقعة، لأن من المعروف ROS إلى أن يتم إنتاجها خلال عملية التمثيل الغذائي للمواد الهيدروكربونية العطرية متعددة الحلقات في الجسم الحي 8. وكانت المستويات النسبية لل8 أوكسو dGuo في الطحال من الحيوانات بهيج 8،3-9،4 8 أوكسو dGuo / 10 6 dGuo (الشكل 7B)، والتي هي في agreemen ممتازةر مع القيم المنشورة من أربعة جزيئات 8 أوكسو DG / 10 6 dGuo قياس في خلايا الطحال الفئران في ظل ظروف قياسية من قبل HPLC-ED 18. أرقام 6 و 7 تظهر أن مستويات 8 أوكسو dGuo فوق خط الأساس هي صغيرة جدا . وبالتالي إذا يتأكسد DNA إلى مستويات أدنى مما هو ملاحظ هنا، فإن مستويات 8 أوكسو dGuo قد لا يمكن تمييزها من خط الأساس الذي ينبغي أن يوضع في الاعتبار من قبل المستخدمين بروتوكول المحتملين.

الشكل 1
الشكل 1. هيكل من 8 أوكسو dGuo وصنو لها 8-OH-dGuo. لاحظ أن 8 أوكسو dGuo بدلا من 8-OH-dGuo هو صنو كبير في درجة الحموضة 7.4.

الرقم 2
الشكل 2. مرات الاحتفاظ لdGuo (A) و 8 أوكسو dGuo (B). HPLC-ED وقد تم الحصول على الاستشرابية من حقن 10.0 ميكرولتر من أي dGuo، (1.0 نانومول الكل) أو 8 أوكسو dGuo (1000 fmol الكل) والكشف عند 0.9 V (A) أو 0.5 V (B). وكانت ذروة استبقاء dGuo حوالي 4.7 دقيقة (A) وذلك ل8 أوكسو dGuo كانت حوالي 6.4 دقيقة (B). ذروة اسعة في 2-3 دقائق ومن المرجح الناجم عن الاضطرابات الحقن وتتأثر (أي والحاضر دائما في كثافة مماثلة) من خلال تركيز 8 أوكسو dGuo. (C) الاستشرابية فرضه من حقنتين منفصلة الموصوفة في الفقرة (أ) و (B) الكشف عنها بواسطة الأشعة فوق البنفسجية (260 نانومتر). تم تشغيل المعايير في نفس اليوم باستخدام أوضاع التشغيل متطابقة. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

وفاق / ftp_upload / 52697 / 52697fig3.jpg "/>
الشكل 3. كشف الأمثل الجهد. (A) Voltammogram من dGuo (تركيز النهائي 1 نانومول) الكشف عن طريق التحليل HPLC-ED في مجموعة من 0،7-1،1 V. (B) Voltammogram من 8 أوكسو dGuo (تركيز النهائي 500 fmol) الكشف عن طريق التحليل HPLC-ED في مجموعة من 0،3-0،7 V. وسائل ثلاث تجارب مستقلة (N = 3) ± الانحراف المعياري هو موضح. في بعض الحالات أشرطة الخطأ هي أصغر من رموز التآمر.

الرقم 4
الرقم 4. منحنى القياسية لdGuo (A) و 8 أوكسو dGuo (B). عشرة ميكرولتر من أي dGuo أو 8 أوكسو dGuo تم حقن وتقاس HPLC-ED عند 0.9 V (A) أو 0.6 V (B ). وسائل لثلاث تجارب مستقلة (N = 3) ± الانحراف المعياري هو مبين. في بعض الحالات أشرطة الخطأ هي SMألير من رموز التآمر.

الرقم 5
الرقم 5. تحسين الهضم DNA. (A) تم هضمها وثمانون ميكروجرام من الخصيتين سمك السلمون DNA كما هو موضح 8 في تريس، حمض الهيدروكلوريك، عازلة الجلايسين خلات (يسار) أو العازلة فوسفات الصوديوم (يمين). تم تشغيل الاغاروز الكهربائي هلام (1.0٪) في 150 V لمدة 45 دقيقة. حارة 1 و 8: سلم DNA. الممرات 2 و 4 و 6: DNA عسر الهضم. الممرات 3 و 5 و 7: DNA هضمها. الممرات 9، 11، و 13: الحمض النووي عسر الهضم (العازلة الفوسفات)؛ الممرات 10، 12، و 14: هضم الحمض النووي (العازلة الفوسفات) (B) الخصيتين سالمون DNA (80 ميكروغرام) ويهضم هذه الوثيقة التي يحتضنها مع الدناز I، PDE الأول، وAP ل0،5-2،5 ساعة في كل خطوة، في 50 ملي العازلة الفوسفات التي تحتوي على كلوريد المغنيسيوم وDFO. خمسون ميكرولتر من كل عينة، التي تحتوي على 7.3 ميكروغرام من الحمض النووي هضمها، وتحليلها من قبل HPLC (أي 0.9 V و 1 مل / دقيقة فلوث) للكشف عن dGuo. ويبين الشكل وسيلة لثلاث تجارب مستقلة (N = 3) ± الخطأ المعياري للمتوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 6A
الرقم 6B
الرقم 6. الاستشرابية لمدة 8-أوكسو dGuo كشف في الخلايا المستزرعة (A) أو الأنسجة الحيوانية (B). (A) إستفتاء DNA من خلايا A549، وتعامل أو غير المعالجة مع KBrO 3. (B) DNA إستفتاء من الطحال من DBC الفئران المعالجة بالإثير. تحولت قمم إلى اليسار بسبب إزالة العمود حارس (بسبب تراكم الضغط في الجهاز؛ وأكدت موقفها مع المعايير). تم تشغيل المعايير والعينات في نفس اليوم باستخدام حالة تشغيل متطابقةالصورة و10 مل حقن كميات في 1 مل / دقيقة معدل التدفق و 0.5 و 0.9 V لdGuo و 8 أوكسو dGuo، على التوالي. الرجاء النقر هنا للحصول على نسخة أكبر من لوحة A؛ هنا لوحة B.

الرقم 7
الرقم 7. الكمي من 8 أوكسو dGuo في العينات البيولوجية. تم دمج قمم وبالمقارنة مع المنحنيات القياسية (انظر الشكل 2 التكميلي لمزيد من التفاصيل) لانتاج مستويات 8 أوكسو dGuo في DNA من خلايا A549، وتعامل مع KBrO 3 ( A)، ومستويات أو 8 أوكسو dGuo في DNA من الطحال من الفئران DBC المعاملة (B). نجمة (*) تشير إلى دلالة إحصائية (p <00.05، تحليل التباين الأحادي (ANOVA) (A)، تي الطالب اختبار (B)). وتظهر وسائل ثلاثة (A) أو خمسة (B) تجارب مستقلة ± الخطأ المعياري للمتوسط. تم جمع عينات 4 أو 24 ساعة بعد العلاج لمدة 3 أيام.

الطور المتحرك العازلة الفوسفات 50.0 ملي نا، ودرجة الحموضة 6.2، يحتوي على 6٪ MeOH و 2.0 ملي بوكل
معدل تدفق الطور المتحرك 1.0 مل / دقيقة
نوع العمود YMC-BASIC مع المستعبدين السيليكا كروية
طول العمود 15 سم
القطر الداخلي العمود 3.5 مم
درجة حرارة العمود 35 ° C
درجة الحرارة كاشف 29 ° C
وضع التيار الكهربائي لمدة 8-أوكسو dGuo +0.5 V
وضع الجهد لdGuo +0.9 V
حجم الحقن 10.0 مل

الجدول 1. المعلمات أداة للكشف وتقدير من 8 أوكسو dGuo من قبل HPLC-ED.

nmoles 100 نانومتر المعيار، ميكرولتر المرحلة HPLC موبايل، ميكرولتر التخفيف، أضعاف
5 300 0 1
2.5 150 150 2
1 60 240 5
0.5 30 270 10
0.25 15 285 20
0.1 6 294 50

الجدول 2. </ قوي> إعداد منحنى قياسي لdGuo.

fmoles 250 نانومتر المعيار، ميكرولتر المرحلة HPLC موبايل، ميكرولتر التخفيف، أضعاف
2500 300 0 1
1000 120 180 2.5
500 150 150 5
250 150 150 10
100 120 180 25
50 150 150 50

الجدول 3. إعداد منحنى قياسي لمدة 8-أوكسو dGuo.

الرقم 8
سوب تم إنشاء plementary الشكل 1. مقارنة الكهروكيميائية (EC) وكشف القائم على الأشعة فوق البنفسجية من dGuo. منحنى قياسي للكشف عن dGuo من خلال الكشف الكهروكيميائية (EC) أو كشف الأشعة فوق البنفسجية (260 نانومتر). تم دمج المناطق الذروة لdGuo الذروة عند حوالي 4.7 دقيقة من قبل كل من الأساليب. N = 3، يعني يتم عرض ± الانحراف المعياري.

الرقم 9
الشكل التكميلي 2. الكمي لdGuo من منحنى القياسية. مثال على استخدام المنحنى القياسي لتحديد يظهر تركيز dGuo. يمكن تحديد (A) منطقة الذروة التي كتبها التكامل باستخدام البرمجيات القياسية. (B) يتم استخدام هذه المعلومات لإنشاء منحنى قياسي من أجل استخدام معادلة خط لحساب تركيز الحليلة مجهولين في العينة.52697 / 52697fig9large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

على الرغم من أن 8 أوكسو dGuo تم الإبلاغ عن العلامات البيولوجية مفيدة للأكسدة الحمض النووي، يمكن تقدير لها موثوق تحديا. على الرغم من أن العديد من الطرق التي نشرت موجودة، وهناك حاجة ل، نظرة عامة وصفية شاملة للبروتوكول للسماح للباحثين لنشر الأسلوب في مختبراتهم. نحن هنا تقديم لمحة مفصلة عن بروتوكول القائم HPLC من شأنها أن تسمح للمستخدمين الجدد لإنشاء وسيلة فعالة للكشف عن 8 أوكسو dGuo النوعي والكمي.

ثلاث طرق رئيسية التي تم وصفها لتقدير حجم 8 أوكسو dGuo. وتشمل هذه انزيم مرتبط المناعي مقايسة (ELISA) القائم على مجموعات تجارية 19، السائل اللوني / قياس الطيف الكتلي (MS) أساليب (على سبيل المثال، كما هو موضح في مكان آخر (9) وسائل HPLC-ED، مثل تلك التي وصفها في هذه الوثيقة. يمكن أساليب ELISA تعاني من التدخلات مع بعض المركبات في العينات البيولوجية (19). وبشكل عام، النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام chromatogrتعتبر تقنيات aphic أكثر موثوقية لمدة 8-أوكسو dGuo الكمي مقارنة مع الأساليب القائمة ELISA-20. في المقارنة بين الطرق HPLC-ED مع الطرق القائمة على MS-، والاستفادة من السابق هو نسبيا تجهيزات رخيصة الثمن (أي ما يقرب من أمر من حجم أقل تكلفة من المعدات لأساليب تستند MS). بالإضافة إلى ذلك، HPLC-MS متفوقون على أساليب HPLC-ED كما في السابق ليست عرضة للتدخلات محتملة مع المركبات electroactive وتوفير والقياسات الكمية لا لبس فيها باستخدام النظائر 21.

وقد أثيرت مخاوف بشأن استخدام أساليب الاستخراج الفينول التقليدية لاستخراج الحمض النووي الجيني لاستخدامها لمدة 8-أوكسو dGuo الكمي 22. وقد لاحظ العديد من الباحثين أن الظروف المرتبطة استخراج الفينول معيار يمكن إدخال dGuo الأكسدة غير المرغوب فيها وبالتالي زيادة مستويات خط الأساس 1،9. لمعالجة هذه المشكلة، خلية وأنيماالحمض النووي الجيني ل يمكن استخراجها وتنقيتها باستخدام بروتوكول DNAzol تعديل 22. DNAzol يحتوي على تركيزات عالية من غوانيدين ثيوسيانات، والدراسات السابقة وقد لاحظ 9 أدنى مستوى القاعدية تشكيل 8 أوكسو dGuo عند استخدام DNAzol مقارنة phenol- التقليدية وأساليب الاستخراج أساس ناي. تم استخدام مركب خالب حديد DFO للحد من إنتاج ROS وأكسدة الحمض النووي خلال إعداد العينات. كما ذكر أعلاه، فإن مستويات 8 أوكسو dGuo في الخلايا A549 بهيج (الشكل 7A) مشابهة إلى حد كبير لماذا تم قياس باستخدام أسلوب يستند إلى MS-13. هذا يشير إلى أن إدراج الاحتياطات وصف لأساليب يستند إلى MS-13 يسمح تقليل أكسدة الحمض النووي غير المرغوب فيها أثناء إعداد العينات وتحليلها لتحقيق دقيق الكمي 8 أوكسو dGuo من قبل HPLC-ED. توقيت خلايا الثقافة التشريح أو الحصاد بعد العلاج الموالية للأكسدة قد تكون عاملا مهما آخر، كما رأينا هنا من خلال رفض 8 أوكسو dGuo المستوياتفي الطحال في 24 ساعة مقابل 4 ساعات بعد العلاج الاخير (7B الشكل). قد يكون هذا يرجع إلى تفعيل إصلاح قاعدة الختان للقضاء على الحمض النووي من التلف.

قيود واضحة اثنين من طريقة وصفها هي: (1) شرط لأسعار الكميات الكبيرة بدلا من الحمض النووي (حوالي 80 ميكروغرام لكل عينة لتحقيق ثلاثة مكررات التقنية)، و (2) أي تشويش محتمل من المركبات التي يبلغ حجمه المشترك. تبين أنه ليس هناك سوى صغيرة جدا (أي حوالي 15 ملغ) وكان قطعة من الطحال (حوالي 15٪ من إجمالي وزن الأنسجة) كافية للحصول على 80 ميكروغرام من الحمض النووي، وترك كمية كافية من الأنسجة لأخرى (على سبيل المثال، التعبير الجيني) التحليلات. كمية من الحمض النووي المستخرج هو معلمة هامة أخرى تؤثر على أكسدة الحمض النووي مصطنعة 23،24،25. لذلك، والعمل مع كبير إلى حد ما (~ 80 ملغ / عينة) التي نقترح هنا يتسق مع التوصيات السابقة باستخدام> 30 ملغ لتقليل أكسدة الحمض النووي مصطنعة 25.لأنسجة أصغر (على سبيل المثال، الحصين)، يمكن للمرء أن تقليص البروتوكول أن تبدأ مع 20-30 ميكروغرام DNA، لأن هذا ينبغي أن يكون كافيا لمدة 2-3 أشواط. أن كميات أكبر من DNA تيسر من المفترض ان قرار من قمم أعلى من الضوضاء في الخلفية، ولكن هذا لا يزال يتعين تجريبيا التحقق من وجود مواد يحتمل أن التدخل يمكن أن تعالج على أساس كل حالة على حدة، وأنه من الضروري أن تتضمن دائما عينة DNA من في وقت واحد في المختبر أو في علاجات الجسم الحي مع مراقبة إيجابية ما هو معروف للحث على الحمض النووي من التلف التأكسدي (انظر الشكل 7).

على الرغم من أن تم الإبلاغ عن الفوسفات في مخازن الفوسفات للحد من نشاط إنزيم الفوسفاتيز القلوية، وأكدت التجارب الأسلوب الأمثل (الشكل 5) أن العازلة الفوسفات يمكن بسهولة استخدامها. منذ يرد العازلة الفوسفات في المرحلة المتنقلة، واستخدامه في إعداد العينات خفض الضوضاء كاشف بسبب سولتنفيس عن الاختلاط. تم الأمثل الجهد وبالتالي، تكوين العازلة، استخراج الحمض النووي والهضم وشملت الضوابط الإيجابية. وعلاوة على ذلك، يقدم موجز يبين كيف أن هذه المتغيرات يمكن أن يكون الأمثل مزيدا من المختبرات الفردية. كان هدفنا لانتاج الطريقة التي يمكن أن تكون مفيدة للمختبرات متخصصة تهدف إلى تطوير فحص للكشف عن 8 أوكسو dGuo النوعي والكمي.

ومع ذلك، نلاحظ أن التحقق من صحة الرسمي للطريقة هو مطلوب، على النحو المبين في الخطوات التصديقات التي أوصى بها المؤتمر الدولي لمواءمة المتطلبات الفنية لتسجيل الأدوية للاستخدام البشري (ICH) للتأكد من صحة الإجراءات التحليلية (أي التراث الثقافي غير المادي Q2 ( R1) 26). باختصار، ينبغي أن عناصر من التحقق من صحة الكمي فحص فحص في: 1) الدقة (والتي يمكن أن يتحقق عن طريق بما في ذلك العينات مع كميات مختلفة من 8 أوكسو dGuo ارتفعت في؛ 2) مجموعة والخطي (الاستجابة الخطية عبر تحويلةتركيز الحليلة العضوية؛ 3) الدقة (التكرار واستنساخ)؛ 4) الحد من الكشف (عموما، النقطة التي إشارة إلى نسبة الضوضاء أكبر أو يساوي 03/02؛ وهذا قد يكون تعتمد على مصفوفة)؛ 5) الحد من الكميات (تركيز الذي الاستجابة تجتمع بعض مستويات محددة سلفا مثل 2 × الانحراف المعياري للرقابة؛ وقد تكون تعتمد على مصفوفة)؛ 6) الانتقائية / خصوصية (القدرة على الكشف عن الحليلة في عينات معقدة مقابل حلول أنيق)؛ 7) استنساخ (القدرة على الحصول على نفس النتيجة في مختبرات مختلفة مع شركات مختلفة)؛ و8) متانة ونظام ملاءمة. كما غرض التحقق من الصحة أوصت به ICH هو إثبات أنه هو "مناسبة لأغراض المقصودة"، وسوف العديد من المختبرات المرجح لها أغراض مختلفة، فإن المستخدمين المحتملين لهذا الاختبار أن تحقق هذا إلى حد الضرورة. تقدير دقيق ل8 أوكسو dGuo غير مرغوب فيه في علم السموم والجزيئات الخطيئة الطبم فإنه يمكن تعزيز فهم الإجهاد التأكسدي كيف، وبشكل أكثر تحديدا أكسدة الحمض النووي، وميكانيكيا وتجريبيا ترتبط التأثيرات الصحية السلبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا البحث من قبل مبادرة وزارة الصحة الكندية الجينوم بحوث والتنمية (GRDI) والاستراتيجية التنظيمية الكندية للتكنولوجيا الحيوية (CRSB). الكتاب ليس لديهم تضارب في المصالح.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
8-oxo-dGuo standard Cayman Chemical Company 89320 Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine"; see Fig. 1 and text for details.
Alkaline phosphatase Sigma-Aldrich P5931 From E. coli
Chelex 100 Sigma-Aldrich C7901 Chelates heavy metals
Desferoxamine mesylate Sigma-Aldrich D9533
dGuo standard Sigma-Aldrich D7145
Dibasic sodium phosphate Sigma-Aldrich S9390
DNA from salmon sperm Sigma-Aldrich D1626 Sodium salt
DNase I Sigma-Aldrich D4527 TypeII, from bovine pancreas
DNAzol Invitrogen 10503-27
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma-Aldrich E4884 The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 (e.g. with NaOH)
F12-K media ATCC 30-2004
Foetal bovine serum ATCC 30-2020
Guard column Chromatographic Specialties YBA 99S03 0204GC Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Monobasic sodium phosphate Sigma-Aldrich S9638
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-122
Phosphate buffered saline Invitrogen 15190-250
Phosphodiesterase I enzyme  Sigma-Aldrich P3243 Type II from Crotalus adamaneus venom
Teflon homogenizer Thomas Scientific 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed.
Trypsin Invitrogen 15050-065
YMC-BASIC column with bonded spherical silica Chromatographic Specialties YBA 99S03 1546WT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine. Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).
  2. Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. 8-hydroxy-2' -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis. J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).
  3. Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features. J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).
  4. Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature. Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).
  5. Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine. Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).
  6. Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., Møller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA. Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).
  7. Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3rd, Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair. Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).
  8. Park, J. -H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).
  9. Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).
  10. Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up. Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).
  11. Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).
  12. Test No. 488: Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays. , Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD). Available from: http://www.oecd-ilibrary.org (2015).
  13. Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat. Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).
  14. European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods. Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).
  15. Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in the presence of uric acid. Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).
  16. Ravanat, J. -L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay. Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).
  17. Kawanishi, S., Murata, M. Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress. Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).
  18. Tahara, S., Kaneko, T. Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation. Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).
  19. Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA. Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).
  20. Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).
  21. Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA. Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).
  22. Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA. Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).
  23. Collins, A. R., Cadet, J., Möller, L., Poulsen, H. E., Viña, J. Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells. Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).
  24. Badouard, C., Ménézo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. Determination of new types of DNA lesions in human sperm. Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).
  25. Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features. Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).
  26. Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH), 2015 Mar 1, San Diego, CA, , Available at: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf (2015).

Tags

الكيمياء، العدد 102، والإجهاد التأكسدي، الحمض النووي من التلف، 8 أوكسو 7،8-ثنائي هيدرو-2'-deoxyguanosine، 8-هيدروكسي-2'-deoxyguanosine، أجنبي بيولوجيا الأيض، صحة الإنسان
HPLC قياس الحمض النووي الأكسدة العلامات البيولوجية، 8 أوكسو 7،8-ثنائي هيدرو-2&#39;-deoxyguanosine، في الخلايا المستزرعة والأنسجة الحيوانية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chepelev, N. L., Kennedy, D. A.,… More

Chepelev, N. L., Kennedy, D. A., Gagné, R., White, T., Long, A. S., Yauk, C. L., White, P. A. HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2’-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues. J. Vis. Exp. (102), e52697, doi:10.3791/52697 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter