Summary
Målet med denne protokol er påvisningen af DNA oxidation markering, 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosin (8-oxo-dGuo) ved HPLC-DE, i DNA fra dyrkede celler eller dyrevæv.
Abstract
Oxidativt stress er forbundet med mange fysiologiske og patologiske processer, samt xenobiotisk metabolisme, hvilket fører til oxidation af biomakromolekyler, herunder DNA. Derfor er det vigtigt for en række forsknings- discipliner, herunder medicin og toksikologi effektiv detektion af DNA oxidation. En fælles biomarkør for oxidativt beskadiget DNA er 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosin (8-oxo-dGuo, ofte fejlagtigt betegnet som 8-hydroxy-2'-deoxyguanosin (8-OH-dGuo eller 8 -oxo-dG)). Adskillige protokoller til 8-oxo-dGuo måling ved højtryksvæskekromatografi med elektrokemisk detektion (HPLC-ED) er blevet beskrevet. Imidlertid blev disse hovedsagelig anvendes til oprenset DNA behandlet med pro-oxidanter. Hertil kommer, på grund af metodologiske forskelle mellem laboratorier, primært på grund af forskelle i analyseudstyr, vedtagelse af publicerede metoder til påvisning af 8-oxo-dGuo ved HPLC-ED kræver omhyggelig optimering af hvert laboratorium. Enomfattende protokol, som beskriver en sådan optimeringsproces, mangler. Her er en detaljeret protokol beskrevet for påvisning af 8-oxo-dGuo ved HPLC-DE, i DNA fra dyrkede celler eller dyrevæv. Det illustrerer, hvordan forberedelse DNA-prøve kan let og hurtigt optimeret til at minimere uønsket DNA oxidation, der kan forekomme under forberedelsen. Denne protokol viser, hvordan man kan opdage 8-oxo-dGuo i dyrkede humane alveolære adenocarcinomceller (dvs. A549-celler) behandlet med oxidationsmidlet KBrO 3, og fra milten af mus udsat for den polycykliske dibenzo aromatisk carbonhydrid (def, s) chrysen (DBC, tidligere kendt som dibenzo (a, l) pyren, DalP). Samlet set dette arbejde illustrerer, hvordan en HPLC-ED metode kan let optimeres til påvisning af 8-oxo-dGuo i biologiske prøver.
Introduction
Reaktive ilt arter (ROS), hvis steady state niveauer kan stige under mange patologiske tilstande og xenotoxic stofskifte, bidrager til en øget frekvens af oxidative DNA-skader. Blandt flere mulige nukleobaser oxidationsprodukter kan let måles, oxidativ DNA-beskadigelse bruge den stabile markør 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosin (8-oxo-dGuo), som er en af de oxiderede former af 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-oxo-dGuo er den mest udbredte DNA læsion 2, og derfor er blevet studeret til nærmere som en DNA oxidation biomarkør trods eksistensen af multiple DNA oxidationsprodukter 3. Hos mennesker kan denne skade repareres via basen excision reparation ved 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1) 4. Hvis ikke repareres, kan 8-oxo-dGuo bidrager til dannelsen af basepar-substitutionsmutationer (dvs. G til T transversioner) 4. Vigtigere, 8-oxo-dGuo er en etableret markør for DNA-skader i forhold til initiering og fremme af carcinogenese 2. Derfor nøjagtig kvantificering af 8-oxo-dGuo er en nyttig og ønskelig biomarkør for oxidativ DNA-skade 5.
Der er udbredt forvirring i litteraturen vedrørende de korrekte navne for oxidativt-beskadigede former af 2-deoxyguanosin og desuden det korrekte navn for forbindelsen (r) rutinemæssigt målt som biomarkør for oxidativ DNA-skade 6. De 6,8-diketo og 6-enol, 8-keto tautomere former af 8-oxo-dGuo (vist i figur 1) er de to mest fremtrædende tautomerer omtales i litteraturen 5,7. Den 6,8-diketo formular er den mest fremtrædende form ved fysiologisk pH på 7,4, og er den mest fremtrædende DNA oxidationsprodukt 7. Derfor, 8-oxo-dGuo, snarere end 8-hydroxy-dGuo er den mest passende navn for dette oxidationsprodukt 6. Det er også vigtigt at bemærke, at 2-deoxyguanosin (dGuo), snarere end nucleobase guanin (Gua) eller ribonucleosid guanosin (Guo) henholdsvis detekteres ved de fleste metoder 6.
Nøjagtig påvisning og kvantificering af 8-oxo-dGuo er udfordrende på grund af: i) variation i fordøjelsen af DNA-prøven, ii) utilsigtet oxidation af dGuo til 8-oxo-dGuo som kan forekomme under prøveforberedelse, og iii) behovet for effektiv validering af den analytiske HPLC-ED-metoden 8. I denne protokol, vi sigter mod at opnå i) ved at skabe vilkår, gunstige for komplet DNA fordøjelse og ii) ved inddragelse metalchelatoren og chelator-behandlede løsninger og en særlig DNA-isolerende reagens, mens iii) blev kun delvist behandles i inddragelse af positive kontroller og således tilvejebringer, at fremgangsmåden er i stand til at detektere 8-oxo-dGuo i biologiske prøver. Yderligere validering er uden for rammerne af dette papir. Men vi er overbeviste om, at denne protokol vil hjælpe den potentiellebrugere bestemme, i hvilket omfang de skal formelt godkende protokollen, afhængigt af deres formål. En liste over trin, der kræves for den formelle validere metoden tilvejebringes yderligere. Under udvikling og implementering af en metode til 8-oxo-dGuo afsløring, blev offentliggjort metoder revideret og konsolideret. Således er denne metode eliminerer behovet for at indsamle oplysninger fra flere offentliggjorte kilder, der ofte mangler vigtige eksperimentelle detaljer og giver samtidig hurtige og ligetil hjælp af test, hvis metode til påvisning og kvantificering af 8-oxo-dGuo er blevet vedtaget med succes. Denne tilpassede metode blev anvendt med succes analysere DNA-prøver fra dyrkede celler og murine væv. Denne video artikel vil hjælpe andre grupper med at etablere en effektiv metode til pålidelig detektion og kvantificering af 8-oxo-dGuo ved HPLC-ED.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sikre, at alle dyrehold, bolig, håndtering og eksperimentering overholde lokale regler og bestemmelser, og at eksperimenter protokoller er godkendt forud for påbegyndes undersøgelsen. For de beskrevne eksperimenter blev dyr pleje, håndtering og behandling er godkendt af Health Canada Animal Care udvalget. Se "Reagenser tabellen" for leverandørernes oplysninger.
1. Indsamling Biologiske prøver
- Celler eller animalske væv
- Grow humane alveolære adenocarcinom A549-celler i F12-K medium indeholdende 10% føtalt bovint serum, 100 enheder / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin.
- Seed celler ved ca. 1 million celler pr 10 cm plade. For hvert forsøg, bruge et sæt af 12 plader i alt (tre plader pr en biologisk gentagelse x fire doser) for at give nok DNA (80 ug) for enzymatisk fordøjelse og HPLC-analyse.
- Når celledensitet bliver større end ca.imately 70% af pladens areal, fjern medier og vask cellerne to gange med 4 ml phosphatbufret saltvand (PBS), pH 7,4.
- For dyrkede dyreceller, bruge KBrO 3 som en positiv kontrol.
BEMÆRK: En positiv lineær sammenhæng mellem KBrO 3 koncentration og 8-oxo-dGuo frekvens er blevet rapporteret i litteraturen 9. - Opløs KBrO 3 i PBS. Sikre at den endelige koncentration i celledyrkningsmediet er større end 1 mm for at opnå en statistisk signifikant stigning i 8-oxo-dGuo forhold til un-eksponerede celler. Tilføje den samme koncentration af KBrO 3 til hver plade i serien (f.eks 12 10-cm plader).
- Pladerne inkuberes i 3 timer ved 37 ° C. Fjern mediet og vask en gang med PBS.
- Der tilsættes 1 ml trypsin-opløsning (koncentration af stamopløsning 2,5 g / ml) og inkuberes i 3 minutter ved 37 ° C.
- Vask med 4 ml PBS, indsamle cellerne fra hvert sæt i en enkelt 50 ml konisk polystyrENE centrifugerør, og der centrifugeres ved 1000 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Fjern PBS og opbevares cellepelleten ved -80 ° C indtil yderligere analyse. Kunstige DNA oxidation kan yderligere minimeres ved nuklear isolering, som beskrevet andetsteds 10.
- Dyrevæv
- Dosis dyr efter behov. Til denne protokol, voksen (9 uger) behandling af mandlig Muta Mouse ved oral sondeernæring dagligt i tre på hinanden følgende dage med 20 mg DBC / kg legemsvægt per dag opløst i olivenolie.
BEMÆRK: Denne transgene dyr havne manipuleret λ-bakteriofag og mutation reportergen lacZ fra E. coli 11 anvendes til transgene gnavere mutationsanalyser 12. - Udføre animalsk obduktion f.eks bedøvet musene kan anvendes isofluran og derefter aflivet via cervikal dislokation efterfulgt af brysthulen åbning. Straks flash freeze væv i flydende nitrogen. Opbevar væv ved -80 ° C indtil analyse.
BEMÆRK: Timingen af eutanasi efter behandlingen kan være en anden vigtig variabel (for eksempel DNA oxidation var maksimal efter 72 timer efter støjbelastningen i rottehjerne og lever 13).
- Dosis dyr efter behov. Til denne protokol, voksen (9 uger) behandling af mandlig Muta Mouse ved oral sondeernæring dagligt i tre på hinanden følgende dage med 20 mg DBC / kg legemsvægt per dag opløst i olivenolie.
2. DNA ekstraktion, nedbør og Wash (For Væv gå direkte til 2.2)
- Homogenisere de indsamlede celler i et 50 ml konisk centrifugerør polystyren med 1 ml DNA isolering middel såsom DNAzol. Brug en 1.000 pi pipettespids at dispergere cellepelleten indtil opløsningen er homogen. Overfør homogenat i et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør. Der inkuberes på is i 10-20 min. Fortsæt til 2.3.
- Homogenisere 15-20 mg væv i en 1 ml håndholdt nonstick glashomogenisator indeholdende 500 pi DNA isolerende middel. Forsigtigt hæve og sænke homogenisator i omkring 1 min; blødere væv vil kræve mindre tid. Skånsom behandling sikrer mindre klipning af DNA. Opbevar homogenatet på is i ca. 10-20 min.
- Pellethomogenatet ved centrifugering i 10 minutter ved 10.000 xg og 4 ° C i en 1,5 ml konisk mikrocentrifugerør.
- Overføre omhyggeligt den resulterende supernatant til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør meget opmærksom på at undgå kontakt pelleten.
- Udfælde DNA fra homogenatet ved tilsætning af 0,5 ml 100% EtOH per 1 ml homogenat. Invert rør 10 gange for at sikre isolering af reagens og EtOH er tilstrækkeligt blandet.
- På dette tidspunkt, DNA-præcipitatet er tyktflydende, spole det på en plast pipettespids (f.eks, med en maksimal bedrift kapacitet på 200 pi) og derefter overført til et nyt 1,5 ml konisk mikrocentrifugerør.
BEMÆRK: Hurtig centrifugering kan anvendes til at fjerne eventuelle rester af lysatet fra det isolerede DNA.
(DNA Vask og Solubilisering) - Der tilsættes 1 ml 75% EtOH til det isolerede DNA. Suspender DNA-pelleten grundigt ved at vende rørene 10 gange.
- Dekanteres forsigtigt ethanol fra røret. Sørg for, at the DNA-pelleten pinde til siden af røret. Opbevar rørene lodret i 1-2 minutter og brug en pipette til at fjerne overskydende EtOH fra bunden af røret.
- Gentag DNA vaskes en gang mere, og enten opbevares prøven i EtOH ved -20 ° C (stabile i adskillige måneder) eller straks indgive fordøjelsen.
- DNA i fordøjelsen puffer (beskrevet nedenfor) opløses og derefter kvantificere anvendelse af standard spektroskopiske metoder (dvs. absorbans ved 260 nm ved anvendelse af spektrofotometer NanoDrop).
3. Enzymatisk fordøjelse
- Forbered "fordøjelse buffer" ved at kombinere passende mængder (afhængigt af antallet af prøver, der skal fordøjes) 50 mM monobasisk Na fosfat (indeholdende 2,0 mM KCI, 1,0 mM desferal (DFO) og 200 mM MgCl2) med 50 mM dibasisk Na fosfat (også indeholdende 2,0 mM KCI, 1,0 mM DFO og 200 mM MgCl2). Hver prøve kræver 4,0 pi monobasiske og 17,0 pi dibasisk phosphat opløsning. <li> Fjern eventuelle resterende EtOH fra bunden af røret og værelser med tørre prøver til omkring 5 min. Sikre, at DNA'et ikke tørre helt ud.
- Opløs 80 ug ekstraheret DNA i 21,0 pi af fordøjelsen puffer, tilsættes 1 enhed af DNase I opløst i 2,0 pi fordøjelse buffer.
- Vortex let at opnå grundig blanding og inkuberes i 1,5 time ved 37 ° C.
- Ved slutningen af inkubationsperioden tilsættes 216,4 pi dibasisk 50 mM Na-phosphat-opløsning indeholdende 2,0 mM KCI, 1,0 mM DFO og 200 mM MgCI2.
- Forberede "fordøjelse buffer-2" ved at kombinere et volumen digestionspuffer med ni volumener dibasisk, 50 mM Na-phosphat (med 2,0 mM KCI, 1,0 mM DFO og 200 mM MgCl2).
- Tilføj 0,025 enheder af phosphodiesterase (PDE) Jeg enzym i 16,3 pi fordøjelse buffer-2. Pipette op og ned i flere sekunder, derefter vortex let at opnå grundig blanding og inkuberes i 1,5 time ved 37 ° C.
- Tilføj 0.4 Enheder af alkalisk phosphatase (AP) i 8,0 pi fordøjelse buffer-2. Pipette op og ned i flere sekunder, derefter vortex let at opnå grundig blanding og inkuberes i 1,5 time ved 37 ° C. Tilføje 33,0 pi HPLC-kvalitet MeOH.
- Køre fordøjede DNA-prøver på HPLC, som beskrevet nedenfor, med det samme eller opbevares ved -80 ° C indtil anvendelse for at minimere oxidation. BEMÆRK: De 1,5-timers fordøjelse trin foreslået her, er baseret på sådanne intervaller foreslået andetsteds 9 og på resultaterne, at lignende protokoller opnå fuldstændig DNA fordøjelse 9. Derfor blev det antaget, at den eneste begrænsende faktor for at opnå fuldstændig fordøjelse var tid, og at enzyminhibering og prøve inhomogenitet var ubetydelig.
4. HPLC Run: Udarbejdelse af Mobile Phase, Instrumentering opsætning og vedligeholdelse
- Brug ultrarent vand at forberede alle bufferopløsninger og behandlet med høj bindingsstyrke harpiks (f.eks Chelex 100: styren divinylbenzene copolymer med iminodiacetat ioner at chelat overgangsmetaller med høj affinitet) for at minimere forurening metal og DNA oxidation under forberedelsen.
- Forbered 250 mM Na-phosphatbuffer, pH 6,2. Bruge et forhold på 1: 3,6957 dibasisk natriumphosphat (FW = 177,99 g / mol) til natriumdihydrogenphosphat (FW = 119,98 g / mol).
Eksempel: Derfor, for en 3 L stamopløsning kombinere 70.81 g monobasisk og 28,43 g dibasisk pulver, tilsættes vand op til f.eks 2,8 L og kontrollere, at opløsningens pH er 6.2. Justering af pH med 250 mM mono- eller dibasisk natriumphosphat løsninger, fremstillet separat og ikke af koncentrerede syrer eller baser. Tilføj 2,24 g KCI for at opnå en koncentration på 10 mM KCl. - Forbered mobil fase i tre flasker, mindst 1 L hver indeholdende: opløsningsmiddel B - HPLC-grade methanol, opløsningsmiddel - B ultrarent vand, og opløsningsmidlet C - phosphatpuffer fra trin 4.2. Indsæt HPLC mobil fase forsyning slangen i flaskerne; remaining reagensglas skal også dyppet i en af flaskerne (f.eks opløsning C) og primet, selv om de ikke er nødvendige til blanding.
- Under løbet blande den mobile fase løsninger som 6% opløsningsmiddel A, 74% opløsningsmiddel B og 20% opløsningsmiddel C at opnå en endelig opløsning af 50 mM natriumphosphatpuffer (pH 6,2) med 2,0 mM KCI, og 6% MeOH.
- Frigør elektroden fra den elektrokemiske detektor, adskille det og rent henvisning og arbejdsvilkår elektroder med elektrode rensevæsker og polerskiver anbefalet af producenten. Skyl de rengjorte overflader med ultrarent vand, tørre vandet ud blidt og sikre detektoren er tør, før du tænder for systemet.
- Saml detektoren og tilslut den mobile fase indløb til elektroden. Tænd strømmen og lade den mobile fase for at fylde elektroden før fastgørelse udløbet mobile fase rør. Installer en ny kolonne før start optimering. Sørg for, at installationen er i den rigtige retning og follows alle producentens anbefalinger.
- Tænd for HPLC-instrumentering i god tid (f.eks 1 time) af analyserne af prøverne at der opnås ligevægt og reducere baseline støj. Se tabel 1 for foreslåede indstillinger; modtrykket grænse bør sættes til 3.000 psi for at undgå kolonne skader. Tænd for afgasser. Fortsæt med priming pumperne og oprettelse solvent gradient.
- Tør prime pumperne ifølge producentens anvisninger. Gøre dette, når en mobil fase er blevet udskiftet eller slangen indløb er udsat for luft til våd linjerne.
- Find priming disken og indsætte en 10-15 ml plastsprøjte der. Sørg for, at sprøjten er sat helt, før du åbner linjen. For at åbne linjerne blot dreje skiven mod uret for en tur.
- Start prime med den passende udvælgelse HPLC interface. Træk forsigtigt sprøjten til at trække væske ind linjerne. Når væsken strømmer, det primære er færdig; programmet lov til atafslutte kørslen. Gentag for alle linjer (normalt fire, afhængigt af instrumentet).
- Alternativt våd prime når linjerne er allerede vædes fra en tidligere tør prime (se nedenfor).
BEMÆRK: Når en stor del af tiden er forløbet mellem anvendelser (f.eks 2 uger eller mere), anbefales en tør prime. - Ændre sammensætningen af den mobile fase opløsningsmiddel komponenter til 25% hver anvendelse af HPLC brugergrænseflade. Fra grænsefladen, skal du vælge "Direct Function" valgmulighed, skal du vælge "Wet Prime" valgmulighed derefter. Dette vil prime alle linjer på samme tid.
- Sørg al luften er ude af systemet ved at observere den våde prime linje som den kommer ind i affaldsbeholderen. Efter en god prime, sikre, at ingen bobler efterlades i linjen. Hvis bobler fortsætter, gentag priming.
- Når pumpen er spædet, begynder at bevæge HPLC mobil fase. Brug HPLC grænseflade til manuelt at ændre sammensætningen af den mobile fase til 6% methanol (opløsningsmiddel A) og 94%vand (opløsningsmiddel B), og vælg en strømningshastighed på 0,9 ml / min. Tillad 5 min at rydde enhver methanol fra kolonnen rengøring trin.
- Efter 5 minutter ændre sammensætningen til 6% methanol (opløsningsmiddel A), 74% vand (opløsningsmiddel B), 20% puffer (opløsningsmiddel C), øge strømningshastigheden til 1,0 ml / min. Indstil andre parametre som opsummeret i tabel 1, og indstille modtrykket grænse til 3000 psi for at undgå kolonne skader.
BEMÆRK: Potentielle problemer med HPLC setup inkluderer drivende baseline, split peak og formindsket signal intensitet. Disse kan som regel løses ved at rense kolonnen efter hver brug, hyppig elektrode rengøring, og sikre, at de bufferopløsninger er fri for forurening (f.eks, partikler eller mikrobiel vækst). - Køre den mobile fase for omkring 1-1,5 timer at opnå en stabil basislinje signal.
- Brug af instrumentet software interface vælge parametre som angivet i tabel 1, og sæt køretid til 15 min. Injicere sample. Anvende øgede kørselstider for komplekse prøver (bestemme dette empirisk ved iagttagelse af tilstedeværelsen eller fraværet af toppe ud over 15-min interval).
BEMÆRK: Instrument software giver programmering af prøve køre betingelser og opsætning for autosampling. - Efter kørslerne er afsluttet, slukkes detektoren celle ved anvendelse grænsefladen af detektoren. Det er vigtigt at følge producentens anbefalinger vedrørende slukke detektoren som forkert håndtering og nedlukning kan beskadige instrumentet. Sluk IKKE cellen ved at skifte bagsiden af detektoren, da dette kan beskadige instrumentet.
- Manuelt ændre den mobile fase præparat til 6% methanol og 94% vand. Køre i 5 min.
- Reducere manuelt strømningshastigheden til 0,7 ml / min, straks ændre sammensætningen til 50% MeOH og 50% vand. Køre i mindst 20 min. Manglende køre dette trin for den anbefalede tid kan resultere i skader på søjlen og detektoren. Sluk for strømmen, end derefter slukke afgasseren.
5. Udarbejdelse af standarder
- Forbered mobil fase puffer som beskrevet i trin 4.1-4.3 ovenfor. Det er vigtigt at anvende HPLC mobil fase til fremstilling af standarder for at undgå toppe som følge af blanding af forskellige opløsninger efter injektion af prøve.
- Fortynd denne løsning hver femte med ultrarent vand før brug, og den endelige løsning skal indeholde 6% MeOH.
- dGuo Standard
BEMÆRK: Høj oxidation potentiale kræves til dGuo detektering kan øge risikoen for at måle forstyrrende elektroaktive forbindelser. Dette kan verificeres ved, for eksempel en standardkurve for UV-detektion af dGuo ved 260 nm og sammenligne det med standardkurven oprettet med EC-detektion. Hvis både tilslutter godt (f.eks Supplerende figur 1) og prøvematrixen virkninger er blevet taget i betragtning, kan man gå videre med dGuo påvisning ved UV ved 260 nm snarere end EC-detektion.- Vortex ved høj hastighed, indtil dGuo opløses fuldstændigt. Dette er den primære lager; opbevares ved -20 ° C i flere uger.
- At skabe den sekundære dGuo lager (0,5 mM), fortyndes 143 ul primær dGuo lager i 857 ul HPLC mobil fase. Opbevar på is indtil brug og forberede frisk hver dag.
- Foretage yderligere fortyndinger at skabe en standardkurve (f.eks, tabel 2). Butiksløsninger på is og forberede frisk hver dag. Køre standarder i serie med eksperimentelle prøver.
- Før løbe, variere detektoren spænding ved hjælp af den højeste koncentration af bestanden til at finde den optimale spænding.
- 8-oxo-dGuo Standard
- Måle 1,0 mg af 8-oxo-dGuo i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Tilføje 0,1 ml HPLC-kvalitet MeOH. Vortex på høj hastighed, indtil 8-oxo-dGuo opløses fuldstændigt. Dette er den primære lager af 8-oxo-dGuo. Opbevares ved -20 ° C i sevrale uger.
- I et separat rør, kombinere 2,9 pi primære lager og 997,1 pi HPLC mobil fase puffer, vortex. Dette er den sekundære lager (10.000 nM).
- Hvis du vil oprette en arbejdsgruppe løsning for standardkurven (250 nM), kombinere 24,4 pi sekundær bestand og 975,6 ul mobil fase buffer.
- Udfør yderligere fortyndinger til at levere de løsninger, der er nødvendige for at skabe en standardkurve (fx tabel 3). Butiksløsninger på is og forberede frisk hver dag. Køre standarder med de eksperimentelle prøver.
- Kvantificering
- Integrere arealet under kurven for både 8-oxo-dGuo og dGuo anvendelse af standard software (som en del af HPLC-computer interface, se supplerende figur 2A).
- Konstruere standardkurve (kendt koncentration af hver analyt vs. areal under kurven (Supplerende figur 2B). Ved hjælp af ligningen for standardkurven, beregne forholdet for 8-oxo-dGuo / dGuo for hver prøve.
6. Agarosegelelektroforese
BEMÆRK: Agarosegelelektroforese kan udføres for at verificere fuldstændigheden af DNA-fordøjelse.
- Forbered 50x Tris-acetat-EDTA (TAE) puffer, ved at opløse 242 g Tris-base (FW = 121,14) i 750 ml ultrarent vand. Tilføje 57,1 ml iseddike og 100 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0; EDTA vil opløses fuldstændigt, når opløsningens pH justeres til 8,0 med fx NaOH) og tilsæt ultrarent vand til et endeligt volumen på 1 L. Opbevares ved stuetemperatur, fortyndes denne opløsning 50x før brug.
- Afvejes 1 g agarose og opløse det i 100 ml 1x TAE buffer, opvarmning i mikrobølgeovnen i 1-2 min. Bær beskyttelsesbriller og beskyttelsesudstyr for at undgå kontakt med kogende agarose.
- Afkøl opløsningen ned, indtil ca. 50 ° C, tilsættes 5 pi ethidiumbromid (advarsel: mutagen), og hæld det i agarosegelen kørende apparat. Sæt kammen.
- Vent, indtil løsningen størkner, hæld TAE buffer over gelen og indlæse prøverne (volumen afhænger af kammen størrelse, typisk er 10-20 pi DNA-prøve indlæst, blandet med 6x kører farvestof til at visualisere og fremme læsning).
- Køre gelen, indtil farvestoffet vandrer ca. 2/3 af længden af gelen (f.eks, 45 minutter ved 150 V). Visualisere DNA-bånd under UV-lys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
dGuo blev observeret at have en retentionstid på 4,7 min mens 8-oxo-dGuo havde en retentionstid på ca. 6,4 min (figur 2A og B). Der er omkring 1000 gange forskel i tophøjderne mellem de to analytter, som det ses i figur 2C. Voltammogrammer for 8-oxo-dGuo og dGuo blev opnået ved kørende standarder på en arbejdende potentiale i intervallet 0,2-1,1 V. Den optimale arbejder potentiale for 8-oxo-dGuo blev bestemt til at være +0,5 V og 0,9 V for dGuo (figur 3). Disse potentialer er i overensstemmelse med andre glasagtig kulstof elektroder beskrevet i litteraturen 14,15. Detektionsgrænsen og dynamikområde 8-oxo-dGuo og dGuo elektrokemisk detektion er rapporteret at være i femtomole og nanomol rækkevidde henholdsvis 8,9. Standardkurver for dGuo og 8-oxo-dGuo skal køres dagligt for at sikre lineær detektion tværs af en egnet koncentrationsområde og korrekt udførestemmelse af instrumentet (figur 4). Standardkurver konstrueres ved at afbilde toparealet som funktion af kendt analytkoncentration (Supplerende figur 2), der tillader en at beregne koncentrationen analyt i prøverne fra ligningen genereret fra standardkurverne.
Komplette DNA-fordøjelse er påkrævet for nøjagtige målinger af 8-oxo-dGua frekvens og flere genomiske DNA fordøjelse metoder er blevet foreslået 8,15,16. Om nødvendigt kan effektiviteten af DNA-ekstraktion og fordøjelse kontrolleres ved hjælp af agarosegelelektroforese (figur 5A) og HPLC-ED (figur 5B). Baner med indlysende DNA smear i figur 5A (fx bane 2, 4, 6, 9, 11, og 13) indikerer tilstedeværelsen af ufordøjet DNA, mens prøver med fordøjede DNA-fragmenter løbe gelen og var dermed uopdaget. Plateauet i figur 5B viser, at yderligere incubatipå af DNA med fordøjelsesenzymer end 1,5 time ikke resulterer i større mængde dGuo detekteret, hvilket tyder næsten fuldstændig fordøjelse efter 1,5 timer. Desuden blev både agarosegelelektroforese og HPLC-ED anvendt til at teste anvendeligheden af den phosphat-baserede DNA-fordøjelse buffer anvendes her. Denne buffer godt matches med HPLC mobil fase og ikke giver anledning til uønsket støj detektor tilskrives blanding af uens opløsninger (data ikke vist). Derfor, overgangen fra bufferen foreslået i litteraturen (dvs. Tris-HCI 8) til natriumphosphatbuffer anbefales til denne protokol (venstre versus højre side af figur 5A). Bemærk, at de underliggende forudsætninger for optimering af DNA fordøjelse var, at enzym hæmning og prøve inhomogenitet var ubetydelig og fordøjelse tid var den eneste begrænsende faktor, som anført ovenfor. En mulighed, at ufuldstændig fordøjelse DNA resulterede i fragmenter, der er for små til at være deteCTED på agarosegelen resterne. Selvom sådan en systematisk fejl vil påvirke alle prøver lige, yderligere eksperimenter (f.eks behandling af dyrkede celler med et radioaktivt mærket pro-oxidant 10) kan udføres helt at udelukke en sådan mulighed.
I modsætning til standard løsninger, det fordøjede DNA, enten fra isolerede celler eller musevæv, produceret flere andre toppe (figur 6A og 6B). Disse var fjernt fra de 8-oxo-dGuo og dGuo toppe, men standardtilsætningsforsøg som en del af validerings- øvelser skitseret i Diskussion Der er behov for at undersøge, om yderligere toppe (dvs. prøve urenhed skyldes matrixvirkninger, for eksempel) interfererer med kvantificering . Den 8-oxo-dGuo peak blev bekræftet ved korrespondance retentionstiden med den standard; og desuden øges i 8-oxo-dGuo top for prøver fra celler eller dyr, der undergik pro-oxidant behandling (figur 7). Pro-oxidant KBrO 3 deltager i én-elektron abstraktion fra guanin, der fører til 8-oxo-dGuo formationen 17. Det er bemærkelsesværdigt, at i mangel af pro-oxidant stress, blev 2,4 molekyler af 8-oxo-dGuo per 10 7 dGuo detekteret i A549-celler (figur 7A). Dette kan sammenlignes med 4.5 molekyler af 8-oxo-dGuo / 10 7 dGuo detekteret i A549-celler observeret ved anvendelse af et alternativ, massespektrometri tilgang designet til at løse potentielle mangler i HPLC-ED-metoden 9. DBC behandling (dvs. daglig 20,0 mg DBC / kg legemsvægt pr dag i tre dage) 8-oxo-dGuo niveauer i muse milt-DNA. Dette er også et forventet resultat, eftersom ROS vides at blive produceret i metabolismen af polycykliske aromatiske carbonhydrider in vivo 8. De relative niveauer af 8-oxo-dGuo i milten af tryksvage dyr var 8,3-9,4 8-oxo-dGuo / 10 6 dGuo (figur 7B), som er i fremragende agreement med publicerede værdier for fire 8-oxo-dG-molekyler / 10 6 dGuo målt i murine miltceller under standardbetingelser ved HPLC-ED 18. Figur 6 og 7 viser, at niveauerne af 8-oxo-dGuo over baseline er meget små . Så hvis DNA oxideres til lavere niveauer end observeret her, kan niveauerne af 8-oxo-dGuo kunne skelnes fra baseline, som bør holdes for øje af potentielle protokol brugere.
Figur 1. Struktur af 8-oxo-dGuo og dets tautomer 8-OH-dGuo. Bemærk, at 8-oxo-dGuo snarere end 8-OH-dGuo er den største tautomer ved pH 7,4.
Figur 2. Retentionstider for dGuo (A) og 8-oxo-dGuo (B). HPLC-ED chromatogrammer blev opnået fra et 10,0 pi injektion af enten dGuo, (1,0 nmol i alt) eller 8-oxo-dGuo (1.000 fmol alt) og påvist ved 0,9 V (A) eller 0,5 V (B). Tilbageholdelsen top for dGuo var ca. 4,7 min (A), og at der for 8-oxo-dGuo var ca. 6,4 min (B). Den brede top ved 2-3 min er sandsynligvis forårsaget af injektion forstyrrelser og er upåvirket (dvs. altid er til stede på samme intensitet) med koncentrationen af 8-oxo dGuo. (C) Overlejrede chromatogrammer fra to separate injektioner beskrevet i (A) og (B) detekteret ved UV (260 nm). Standarderne blev kørt på den samme dag ved hjælp af identiske køre betingelser. Klik her for at se en større version af dette tal.
es / ftp_upload / 52697 / 52697fig3.jpg "/>
Figur 3. Optimering detektor spænding. (A) voltammogram af dGuo (slutkoncentration 1 nmol) detekteres ved HPLC-ED-analyse på en afstand af 0,7-1,1 V. (B) voltammogram af 8-oxo-dGuo (slutkoncentration 500 fmol) detekteret ved HPLC-ED-analyse på en afstand på 0,3-0,7 V. hjælp af tre uafhængige forsøg (N = 3) ± standardafvigelse er vist. I nogle tilfælde fejlsøjler er mindre end plotning symboler.
Figur 4. Standardkurve for dGuo (A) og 8-oxo-dGuo (B). Ti mikroliter enten dGuo eller 8-oxo-dGuo blev injiceret og måles ved HPLC-ED ved 0,9 V (A) eller 0,6 V (B ). Hjælp af tre uafhængige forsøg (n = 3) ± standardafvigelse er vist. I nogle tilfælde fejlsøjler er smAller end plotte symboler.
Figur 5. Optimering af DNA fordøjelse. (A) Eighty mikrogram laksetestikel DNA blev fordøjet som beskrevet 8 i Tris-HCI, glycin-acetatpuffer (venstre) eller natriumphosphatpuffer (højre). Agarose gelelektroforese (1,0%) blev kørt ved 150 V i 45 minutter. Bane 1 og 8: DNA stigen; bane 2, 4 og 6: ufordøjet DNA; bane 3, 5 og 7: fordøjet DNA; bane 9, 11 og 13: ufordøjet DNA (phosphatpuffer); Banerne 10, 12 og 14:. fordøjede DNA (phosphatbuffer) (B) Salmon testikler DNA (80 ug) blev spaltet heri ved inkubering med DNase I, PDE I, og AP til 0,5-2,5 timer pr hvert trin, i 50 mM phosphatbuffer indeholdende magnesiumchlorid og DFO. Halvtreds mikroliter af hver prøve, indeholdende 7,3 ug fordøjet DNA blev analyseret ved HPLC (dvs. 0,9 V og 1 ml / min flow) for at detektere dGuo. Figuren viser hjælp af tre uafhængige forsøg (N = 3) ± standardfejl af middelværdien. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. kromatogrammer for 8-oxo-dGuo påvisning i dyrkede celler (A) eller dyrevæv (B). (A) skåret DNA fra A549-celler, behandlet eller ubehandlet med KBrO 3. (B) skåret DNA fra milten fra DBC -behandlede mus. Toppe forskudt til venstre på grund af fjernelse af guard kolonne (på grund af trykopbygning i apparatet; deres stilling blev bekræftet med standarder). Standarder og prøver blev kørt på samme dag under anvendelse af identisk run tilstands og 10 ml injektionsvolumener på 1 ml / min strømningshastighed og 0,5 og 0,9 V for dGuo og 8-oxo-dGuo hhv. Venligst klik her for en større version af panel A, her til panel B.
Figur 7. Kvantificering af 8-oxo-dGuo i biologiske prøver. Toppe blev integreret og sammenlignet med standardkurver (se supplerende figur 2 for yderligere detaljer), hvilket gav 8-oxo-dGuo niveauer i DNA fra A549-celler, behandlet med KBrO 3 ( A), eller 8-oxo-dGuo niveauer i DNA fra milten fra DBC-behandlede mus (B). Stjerner (*) angiver statistisk signifikans (p <0.05, Envejs variansanalyse (ANOVA) (A), t-test (B)). Hjælp af tre (A) eller fem (B) uafhængige eksperimenter ± standardafvigelse af middelværdien er vist. Prøver blev opsamlet 4 eller 24 timer efter den 3-dages behandling.
| Mobil fase | 50,0 mM Na-phosphat, pH 6,2, indeholdende 6% MeOH og 2,0 mM KCI |
| Mobil fase strømningshastighed | 1,0 ml / minut |
| Kolonnetypen | YMC-BASIC med bundet sfæriske silica |
| Søjlelængde | 15 cm |
| Kolonne indre diameter | 3,5 mm |
| Søjletemperatur | 35 ° C |
| Detektortemperatur | 29 ° C |
| Spænding indstilling til 8-oxo-dGuo | +0,5 V |
| Spænding indstilling for dGuo | 0,9 V |
| Injektionsvolumen | 10,0 ml |
Tabel 1. parametre Instrument til påvisning og kvantificering af 8-oxo-dGuo ved HPLC-ED.
| nmol | 100 nM standard, pi | HPLC mobil fase pi | Fortynding, fold |
| 5 | 300 | 0 | 1 |
| 2.5 | 150 | 150 | 2 |
| 1 | 60 | 240 | 5 |
| 0,5 | 30 | 270 | 10 |
| 0.25 | 15 | 285 | 20 |
| 0,1 | 6 | 294 | 50 |
Tabel 2. </ Strong> Udarbejdelse af standardkurve for dGuo.
| fmol | 250 nM standard, pi | HPLC mobil fase pi | Fortynding, fold |
| 2.500 | 300 | 0 | 1 |
| 1.000 | 120 | 180 | 2.5 |
| 500 | 150 | 150 | 5 |
| 250 | 150 | 150 | 10 |
| 100 | 120 | 180 | 25 |
| 50 | 150 | 150 | 50 |
Tabel 3. Udarbejdelse af standardkurve for 8-oxo-dGuo.
Sup plerende Figur 1. Sammenligning af elektrokemisk (EF) og UV-baseret detektion af dGuo. standardkurve blev skabt til dGuo detektion ved elektrokemisk detektion (EF) eller UV-detektion (260 nm). Toparealer blev integreret til dGuo top ved ca. 4,7 minutter ved begge metoder. N = 3, betyder ± standardafvigelse er vist.
Supplerende Figur 2. Kvantificering af dGuo fra sin standardkurve. Et eksempel på anvendelse af standardkurven til at bestemme koncentrationen af dGuo vises. (A) Peak område kan bestemmes ved integration ved anvendelse af standard software. (B) Denne information bruges at konstruere en standardkurve for at kunne bruge ligningen for linjen for at beregne den ukendte analytkoncentration i prøven.52.697 / 52697fig9large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selvom 8-oxo-dGuo er blevet rapporteret som en nyttig biomarkør for DNA oxidation, kan dens pålidelig kvantificering en udfordring. Selvom der findes adskillige offentliggjorte metoder, er der behov for en omfattende, beskrivende oversigt over protokol til at tillade forskere at implementere metoden i deres laboratorier. Her præsenterer vi en detaljeret oversigt over en HPLC-baseret protokol, der vil tillade nye brugere til at etablere en effektiv metode til 8-oxo-dGuo detektion og kvantificering.
Tre større metoder, der er beskrevet til kvantificering af 8-oxo-dGuo. Disse indbefatter enzymkoblet immunosorbent assay (ELISA) -baseret kommercielle kit 19, væskekromatografi / massespektrometri (MS) metoder (f.eks, som beskrevet andetsteds 9 og HPLC-ED metoder, såsom den beskrevet heri. ELISA-metoder kan lide af interferens med visse forbindelser i biologiske prøver 19. Generelt resultater opnået ved anvendelse Chromatographic teknikker betragtes som mere pålidelige til 8-oxo-dGuo kvantificering i sammenligning med ELISA-baserede metoder 20. Ved sammenligning af HPLC-ED metoder med MS-baserede metoder, den fordel, at den førstnævnte er relativt billigt udstyr (dvs. ca. en størrelsesorden mindre omkostningskrævende end udstyr til MS-baserede metoder). Desuden HPLC-MS er bedre end HPLC-ED metoder, da førstnævnte ikke er tilbøjelige til potentielle indgreb i elektroaktive forbindelser og give entydige, kvantitative målinger ved hjælp af isotoper 21.
Der er blevet rejst vedrørende brugen af traditionelle phenolekstraktion metoder til udvinding af genomisk DNA, der skal anvendes til 8-oxo-dGuo kvantificering 22. Flere forskere har bemærket, at de betingelser, der er forbundet med standard phenolekstraktion kan introducere uønsket dGuo oxidation dermed øge grundlinjeniveauer 1,9. For at løse dette problem, celle og animal genomisk DNA kan ekstraheres og oprenses under anvendelse af en modificeret DNAzol protokol 22. DNAzol indeholder høje koncentrationer af guanidinthiocyanat, og tidligere undersøgelser 9 har bemærket lavere basalniveau 8-oxo-dGuo formation når DNAzol anvendes i forhold til traditionel phenol- og NaI-baserede ekstraktionsmetoder. Strygejernet chelateringsforbindelse DFO blev brugt til at minimere ROS produktion og DNA oxidation under forberedelsen. Som bemærket ovenfor er de 8-oxo-dGuo niveauer i tryksvage A549-celler (Figur 7A) var meget lig det, der blev målt ved et MS-baseret metode 13. Dette antyder, at indarbejdelse af forholdsregler, der er beskrevet for de MS-baserede metoder 13 tilladte minimering af uønsket DNA oxidation under forberedelse og analyse prøve at opnå nøjagtig 8-oxo-dGuo kvantificering med HPLC-ED. Timingen af obduceres eller høst kultur celler efter pro-oxidant behandling kan være en anden vigtig faktor, som det ses her ved faldende 8-oxo-dGuo niveaueri milten på 24 hr vs. 4 timer efter den sidste behandling (figur 7B). Dette kan skyldes aktivering af basen excision reparation at fjerne DNA-beskadigelse.
De to oplagte begrænsninger i den beskrevne fremgangsmåde er: (1) kravet om temmelig store mængder af DNA (ca. 80 ug pr prøve for at opnå tre tekniske replikater), og (2) potentiel interferens fra co-eluerende forbindelser. Det fandtes, at kun en meget lille (dvs. ca. 15 mg) stykke milt (ca. 15% af den samlede væv vægt) var tilstrækkelig til at opnå 80 ug af DNA, hvilket efterlader en tilstrækkelig mængde væv efter andre (f.eks genekspression) analyser. Mængden af ekstraheret DNA er en anden kritisk parameter, der påvirker kunstig DNA oxidation 23,24,25. Derfor arbejder med temmelig store (~ 80 mg / prøve), som vi foreslår her er i overensstemmelse med tidligere henstillinger fra at bruge> 30 mg for at minimere kunstig DNA oxidation 25.For mindre væv (f.eks hippocampus), kunne man skalere ned protokollen til at starte med 20-30 ug DNA, da dette bør være tilstrækkeligt til 2-3 kørsler. Større mængder af DNA formentlig lette løsningen af toppe over baggrundsstøj, men dette mangler at blive eksperimentelt verificeret Tilstedeværelsen af potentielt interfererende stoffer kan adresseres fra sag til sag, og det er vigtigt at altid omfatte DNA-prøve fra samtidig in vitro eller in vivo behandlinger med en positiv kontrol, der vides at inducere oxidativ DNA-beskadigelse (se figur 7).
Selvom phosphat i phosphatbuffere er blevet rapporteret at reducere aktiviteten af alkalisk phosphatase, metodeoptimering eksperimenter (figur 5) bekræftede, at phosphatbuffer let kunne anvendes. Da fosfatbuffer er indeholdt i den mobile fase, dets anvendelse i prøveforberedelse reduceret detektor støj på grund af sollufte blanding. Således spænding, puffer sammensætning, DNA-ekstraktion og fordøjelse blev optimeret og positive kontroller blev inkluderet. Desuden er et sammendrag skitserer, hvordan disse variabler kan yderligere optimeres ved enkelte laboratorier forudsat. Vores mål var at producere en metode, der kan være nyttige for specialiserede laboratorier til formål at udvikle en analyse for 8-oxo-dGuo detektion og kvantificering.
Men vi konstatere, at den formelle validere metoden er påkrævet, som skitseret under valideringer skridt anbefalet af den internationale konference om harmonisering af tekniske krav til registrering af lægemidler til mennesker (ICH) for validering af analytiske procedurer (dvs. ICH Q2 ( R1) 26). Kort fortalt bør de elementer af kvantitativ validering undersøge testens: 1) nøjagtighed (som kan opnås ved at inkludere prøver med forskellige mængder af 8-oxo-dGuo spiked-in, 2) område og linearitet (lineær respons på tværs extended analytkoncentration; 3) præcision (repeterbarhed og reproducerbarhed); 4) detektionsgrænse (generelt, det punkt, hvor signal-støj-forholdet er større end eller lig 2-3, hvilket kan være matrix-afhængig); 5) grænse for kvantificering (koncentration, hvor responsen opfylder nogle forudbestemte niveauer såsom 2 x standardafvigelse af kontrol; kan være matrix-afhængig); 6) selektivitet / specificitet (evne til at detektere analytten i komplekse prøver versus pæne opløsninger); 7) reproducerbarhed (evnen til at få det samme resultat i forskellige laboratorier med forskellige personer); og 8) robusthed og systemets egnethed. Da formålet med valideringen anbefales af ICH er at demonstrere, at det er "egnet til det tilsigtede formål", og mange laboratorier vil sandsynligvis have forskellige formål, ville de potentielle brugere af denne analyse at validere dette i det omfang det skønnes nødvendigt. Nøjagtig kvantificering af 8-oxo-dGuo er ønskelig i toksikologi og molekylær medicin syndce kan øge forståelsen af, hvordan oxidativ stress, og mere specifikt DNA oxidation er mekanistisk og empirisk forbundet med sundhedsskadelige virkninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af Health Canada Genomics Research and Development Initiative (GRDI) og den canadiske Regulatory strategi for bioteknologi (CRSB). Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-oxo-dGuo standard | Cayman Chemical Company | 89320 | Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine"; see Fig. 1 and text for details. |
| Alkaline phosphatase | Sigma-Aldrich | P5931 | From E. coli |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | Chelates heavy metals |
| Desferoxamine mesylate | Sigma-Aldrich | D9533 | |
| dGuo standard | Sigma-Aldrich | D7145 | |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| DNA from salmon sperm | Sigma-Aldrich | D1626 | Sodium salt |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | TypeII, from bovine pancreas |
| DNAzol | Invitrogen | 10503-27 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 (e.g. with NaOH) |
| F12-K media | ATCC | 30-2004 | |
| Foetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Guard column | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 0204GC | Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Monobasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | 15190-250 | |
| Phosphodiesterase I enzyme | Sigma-Aldrich | P3243 | Type II from Crotalus adamaneus venom |
| Teflon homogenizer | Thomas Scientific | 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively | Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed. |
| Trypsin | Invitrogen | 15050-065 | |
| YMC-BASIC column with bonded spherical silica | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 1546WT |
References
- Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine. Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).
- Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. 8-hydroxy-2' -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis. J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).
- Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features. J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).
- Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature. Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).
- Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine. Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).
- Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., Møller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA. Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).
- Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3rd, Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair. Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).
- Park, J. -H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).
- Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).
- Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up. Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).
- Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).
- Test No. 488: Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays. , Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD). Available from: http://www.oecd-ilibrary.org (2015).
- Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat. Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).
- European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods. Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).
- Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in the presence of uric acid. Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).
- Ravanat, J. -L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay. Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).
- Kawanishi, S., Murata, M. Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress. Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).
- Tahara, S., Kaneko, T. Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation. Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).
- Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA. Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).
- Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).
- Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA. Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).
- Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA. Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).
- Collins, A. R., Cadet, J., Möller, L., Poulsen, H. E., Viña, J. Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells. Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).
- Badouard, C., Ménézo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. Determination of new types of DNA lesions in human sperm. Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).
- Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features. Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).
- Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH), 2015 Mar 1, San Diego, CA, , Available at: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf (2015).
