Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

HPLC המדידה של ה- DNA חמצון ביומרקר, 8-אוקסו-7,8-Dihydro-2'-deoxyguanosine, בתאים בתרבית ורקמות בעלי החיים

Published: August 1, 2015 doi: 10.3791/52697
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Environmental Health Science and Research Bureau, Health Canada

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא הגילוי של סמן חמצון ה- DNA, 8-אוקסו-7,8-Dihydro-2'-deoxyguanosine (8-אוקסו-dGuo) על ידי HPLC-ED, בDNA מהתאים בתרבית או רקמות של בעלי חיים.

Abstract

סטרס חמצונים קשור הרבה תהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים, כמו גם חילוף חומרים xenobiotic, מוביל לחמצון של Biomacromolecules, כולל DNA. לכן, זיהוי יעיל של חמצון ה- DNA הוא חשוב עבור מגוון רחב של תחומי מחקר, כוללים רפואה וטוקסיקולוגיה. סמן ביולוגי משותף של דנ"א פגום oxidatively הוא 8-אוקסו-7,8-Dihydro-2'-deoxyguanosine (8-אוקסו-dGuo; לעתים קרובות מכונה בטעות כ8-הידרוקסי-2'deoxyguanosine (8-OH-dGuo או 8 -oxo-DG)). כמה פרוטוקולים ל8-אוקסו-dGuo מדידה על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה עם זיהוי אלקטרוכימי (HPLC-ED) תוארו. עם זאת, אלה יושמו בעיקר ל- DNA מטוהר שטופל בפרו-חמצון. בנוסף, עקב הבדלים מתודולוגיים בין מעבדות, בעיקר בשל הבדלים בציוד אנליטי, האימוץ של שיטות שפורסמו לצורך זיהוי של 8-אוקסו-dGuo ידי HPLC-ED דורש אופטימיזציה זהירה בכל מעבדה.פרוטוקול מקיף, המתאר תהליך האופטימיזציה כזה, חסר. כאן, פרוטוקול מפורט מתואר לגילוי של 8-אוקסו-dGuo ידי HPLC-ED, בDNA מהתאים בתרבית או רקמות של בעלי חיים. זה מדגים כיצד הכנת דגימת DNA יכולה להיות מותאמת בקלות ובמהירות כדי למזער חמצון ה- DNA לא רצוי שיכול להתרחש במהלך הכנת מדגם. פרוטוקול זה מראה כיצד לזהות 8-אוקסו-dGuo בתאים בתרבית אדם אדנוקרצינומה מכתשי (כלומר, תאי A549) שטופלו בסוכן חמצון KBrO 3, ומהטחול של עכברים שנחשפו לdibenzo פחמימנים ארומטיים polycyclic (def, עמ ') chrysene (DBC, שנקרא בעבר פיר dibenzo (, יב), DalP). בסך הכל, עבודה זו מדגימה כיצד מתודולוגיה HPLC-ED יכולה להיות מותאמת בקלות לזיהוי של 8-אוקסו-dGuo בדגימות ביולוגיות.

Introduction

מינים תגובתי חמצן (ROS), מצב יציב שיכולים להגדיל את הרמות בהרבה מצבים פתולוגיים וחילוף חומרי xenotoxic, תורמים לשכיחות מוגברת של נזק לדנ"א חמצוני. בין כמה מוצרי חמצון nucleobases האפשרי, נזק לדנ"א חמצוני יכול בקלות למדוד באמצעות הסמן היציב 8-אוקסו-7,8-Dihydro-2'-deoxyguanosine (8-אוקסו-dGuo), שהוא אחת מצורות חמצון של 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-אוקסו-dGuo הוא נגע DNA הנפוץ ביותר 2, ולכן, כבר למד לפירוט רב יותר כסמן ביולוגי חמצון ה- DNA למרות קיומם של מוצרי חמצון ה- DNA המרובים 3. בבני אדם, נזק זה ניתן לתיקון באמצעות תיקון כריתת בסיס על ידי glycosylase 8-oxoguanine 1 (hOGG1) 4. אם עזב מתוקן, 8-אוקסו-dGuo יכול לתרום להיווצרותן של מוטציות זוג-החלפת בסיס (כלומר, G לT transversions) 4. חשוב לציין, 8-אוקסו-dGuo הוא סמן הוקם FOנזק לדנ"א r ביחס לייזום והקידום של היווצרות הסרטן 2. לכן, כימות מדויק של 8-אוקסו-dGuo הוא סמן ביולוגי שימושי ורצוי של נזק לדנ"א חמצוני 5.

יש בלבול נפוץ בספרות בנוגע לשמות הנכונים לצורות oxidatively פגועות של 2-deoxyguanosine ו, יתר על כן, את השם הנכון של המתחם (ים) שנמדדו באופן שגרתי כסמן ביולוגי של נזק לדנ"א חמצוני 6. צורות tautomeric 8-קטו 6,8-diketo ו6-enol, של 8-אוקסו-dGuo (מוצג באיור 1) הן שני tautomers הבולט ביותר שנדון בספרות 5,7. טופס 6,8-diketo הוא הצורה הבולטת ביותר ב- pH הפיזיולוגי של 7.4, והוא מוצר חמצון ה- DNA הבולט 7. לכן, 8-אוקסו-dGuo, במקום 8-הידרוקסי-dGuo הוא השם המתאים ביותר למוצר חמצון זה 6. כמו כן, חשוב לשים לב ש2-deoxyguanosine (dGuo), ולא nucleobגואנין ASE (גואה) או guanosine ribonucleoside (גואו), בהתאמה, הוא זוהה על ידי רוב השיטות 6.

איתור וכימות של 8-אוקסו-dGuo מדויקים הוא מאתגר עקב: השתנות i) בעיכול של דגימת DNA, ii) חמצון adventitious של dGuo 8-אוקסו-dGuo שיכול להתרחש במהלך הכנת מדגם, וiii) את הצורך לאימות יעילה של שיטת HPLC-ED אנליטיים 8. בפרוטוקול זה, אנו חותרים להשגת i) על ידי מתן תנאים, נוחים לעיכול DNA מלא וii) על ידי chelator הכללת המתכת ופתרונות שטופל chelator ומגיב בידוד-דנ"א מיוחד, תוך iii) היה ממוען רק באופן חלקי על ידי הכללת בקרות חיוביות וכך לספק כי השיטה היא מסוגלת לאתר 8-אוקסו-dGuo בדגימות ביולוגיות. אימות נוספת היא מעבר להיקף של מאמר זה. עם זאת, אנו בטוחים כי פרוטוקול זה יעזור לי פוטנציאלימשתמשים לקבוע את המידה שבה הם צריכים לאמת באופן רשמי בפרוטוקול, בהתאם לצרכיהם. רשימה של צעדים הנדרשים לאימות הפורמאלית של השיטה מסופקת נוספת. במהלך הפיתוח והפריסה של שיטה לזיהוי 8-אוקסו-dGuo, שיטות שפורסמו נסקרו ומאוחדת. לכן, שיטה זו מבטלת את הצורך לאסוף מידע ממספר מקורות שפורסמו, כי לעתים קרובות חסרי פרטים ניסיוניים חשובים גם בעת מתן אמצעי מהיר ופשוט של בדיקות אם השיטה לאיתור והכימות של 8-אוקסו-dGuo כבר אימצה בהצלחה. שיטה מותאמת זה הועסקה לנתח בהצלחה דגימות DNA מהתאים בתרבית רקמה ועכברית. מאמר זה וידאו יסייע קבוצות אחרות בהקמת שיטה יעילה לגילוי אמין וכימות של 8-אוקסו-dGuo ידי HPLC-ED.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ודא שכל בעלי חיים, דיור, טיפול וניסויים לדבוק בכללים ותקנות מקומיים וכי פרוטוקולי ניסויים אושרו לפני תחילת כל מחקר. לניסויים שתוארו, טיפול בבעלי חיים, טיפול, וטיפול אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים הבריאות בקנדה. ראה "שולחן ריאגנטים" למידע של הספקים.

1. איסוף דגימות ביולוגיות

  1. תאים או רקמות בעלי החיים
    1. לגדל תאי A549 אדנוקרצינומה מכתשיים אדם בתקשורת F12-K המכילה 10% בסרום שור עוברי, 100 / מיליליטר יחידות של פניצילין 100 מיקרוגרם / מיליליטר של סטרפטומיצין.
    2. תאי זרע בכ 1 מיליון תאים לכל צלחת 10 סנטימטרים. עבור כל ניסוי, שימוש בערכה של 12 צלחות בסך הכל (שלוש צלחות ללשכפל ביולוגי אחד x ארבע מנות) כדי לספק מספיק DNA (80 מיקרוגרם) לעיכול אנזימטי וניתוח HPLC.
    3. כאשר צפיפות תאים הופכת גדולה יותר מכimately 70% משטח הצלחת, להסיר תקשורת לשטוף תאים פעמיים עם 4 מיליליטר של פוספט שנאגרו מלוח (PBS), pH 7.4.
    4. לתאים של בעלי חיים מתורבתים, להשתמש KBrO 3 כביקורת חיובית.
      הערה: קשר לינארי חיובי בין ריכוז KBrO 3 ותדירות 8-אוקסו-dGuo כבר דווחה בספרות 9.
    5. לפזר KBrO 3 בPBS. ודא שהריכוז הסופי בתרבית תאים הבינוני הוא גדול מ -1 מ"מ להשיג עלייה מובהקת סטטיסטי ב8-אוקסו-dGuo ביחס לתאים שנחשפו לאו"ם. להוסיף אותו הריכוז של KBrO 3 לכל צלחת בסדרה (למשל, צלחות 12 10 סנטימטרים).
    6. דגירה הצלחות במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס. הסר את המדיה ולשטוף פעם אחת עם PBS.
    7. הוסף 1 מיליליטר של תמיסת טריפסין (ריכוז המניה 2.5 גר '/ מיליליטר) ודגירה של 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    8. לשטוף עם 4 מיליליטר PBS, לאסוף את התאים מכל להגדיר לpolystyr 50 מיליליטר חרוטי אחתצינור ENE צנטריפוגות, וצנטריפוגה XG ב 1000 עבור 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    9. הסר PBS ולאחסן את התא גלולה ב -80 ° C עד לניתוח נוסף. חמצון ה- DNA מלאכותי ניתן למזער עוד יותר על ידי בידוד גרעיני, כפי שתואר במקום אחר 10.
  2. רקמות בעלי החיים
    1. מינון בעלי חיים כנדרש. לפרוטוקול זה, למבוגרים (9 שבועות של גיל) טיפול בגברים מוטה עכבר על ידי gavage פה יומי במשך שלושה ימים רצופים עם 20 מ"ג לקילו ליום BW DBC / מומס בשמן זית.
      נמלי בעלי חיים מהונדסים זה מהונדס λ-bacteriophage וlacZ גן כתב המוטציה מא: הערה 11 coli משמש עבור מבחני מוטציה מכרסמים מהונדס 12.
    2. לבצע נתיחה לאחר מוות של בעלי חיים לדוגמא, בהרדמה העכברים יכולים באמצעות isoflurane ולאחר מכן מורדמים באמצעות נקע בצוואר הרחם ואחרי פתיחת בית חזה. מייד יהבהבו רקמות הקפאה בחנקן נוזלי. רקמות חנות ב -80 ° C עד ניתוח.
      הערה: התזמון של המתת חסד לאחר הטיפול יכול להיות אחר משתנה חשוב (למשל, חמצון ה- DNA היה מקסימאלי ב 72 שעות לאחר חשיפה לרעש במוח החולדה וכבד 13).

2. הפקת DNA, רטיבות ולשטוף (לרקמות להמשיך ישירות 2.2)

  1. Homogenize התאים שנאספו בצינור צנטריפוגות קלקר חרוטי 50 מיליליטר עם 1 מיליליטר סוכן ה- DNA של בידוד כגון DNAzol. השתמש קצה פיפטה μl 1,000 לפזר את התא גלולה עד הפתרון הוא הומוגנית. העבר את homogenate לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר חדש. לדגור על קרח במשך 10-20 דקות. המשך 2.3.
  2. Homogenize 15-20 מ"ג של רקמה בhomogenizer זכוכית nonstick כף יד 1 מיליליטר מכיל 500 סוכן בידוד DNA μl. בעדינות להעלות וhomogenizer נמוך יותר עבור דקות על 1; רקמות רכות תדרוש פחות זמן. טיפול עדין מבטיח פחות גז של ה- DNA. אחסן את homogenate על קרח על 10-20 דקות.
  3. גלולהhomogenate על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 10,000 XG ו4 ° C בצינור microcentrifuge חרוטי 1.5 מיליליטר.
  4. להעביר בזהירות את supernatant שנוצר לתוך צינור microcentrifuge חדש 1.5 מיליליטר תשומת לב זהיר, כדי למנוע יצירת קשר עם גלולה.
  5. לזרז DNA מhomogenate על ידי הוספת 0.5 מיליליטר EtOH 100% לכל 1 מיליליטר של homogenate. היפוך צינורות 10 פעמים כדי להבטיח מגיב בידוד וEtOH הם מספיק מעורבים.
  6. בשלב זה, משקע ה- DNA הוא צמיג, סליל אותו על קצה פיפטה פלסטיק (למשל, עם קיבולת החזקה המרבית של 200 μl) ולאחר מכן הועבר לצינור microcentrifuge חדש 1.5 מיליליטר חרוטי.
    הערה: צנטריפוגה מהירה יכולה להיות מועסק על מנת להסיר כל lysate שנותר מה- DNA המבודד.
    (DNA לשטוף וsolubilization)
  7. הוסף 1 מיליליטר של 75% EtOH ל- DNA המבודד. להשעות את גלולה DNA ביסודיות על ידי היפוך הצינורות 10 פעמים.
  8. למזוג בזהירות את אתנול מהצינור. ודא כי הדואר DNA גלולה מקלות לצד של הצינור. אחסן את הצינורות אנכי במשך 1-2 דקות ולהשתמש בפיפטה כדי להסיר כל EtOH עודף מהחלק התחתון של הצינור.
  9. חזור על DNA לשטוף פעם נוספת, וגם לאחסן את המדגם בEtOH ב -20 ° C (יציב במשך כמה חודשים) או מייד להמשיך עיכול.
  10. לפזר DNA במאגר עיכול (שיפורט להלן) ולאחר מכן לכמת בשיטות ספקטרוסקופיות סטנדרטיים (כלומר, הספיגה ב 260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop).

3. אנזימתי עיכול

  1. הכן "חיץ עיכול" על ידי שילוב של כרכים מתאימים (תלוי במספר הדגימות להתעכל) של 50 מ"מ פוספט Na monobasic (המכילים 2.0 מ"מ KCl, desferal מ"מ 1.0 (DFO) ו -200 מ"מ MgCl 2) פוספט Na dibasic עם 50 מ"מ (גם מכיל 2.0 מ"מ KCl, 1.0 מ"מ DFO ו -200 מ"מ MgCl 2). כל דגימה דורשת 4.0 μl monobasic ו17.0 μl פתרון פוספט dibasic.
    2. <li> הסר את כל EtOH שנותר מהחלק התחתון של הצינור ודגימות אוויר יבש במשך כ 5 דקות. ודא שה- DNA לא להתייבש לחלוטין.
  2. לפזר DNA שחולץ 80 מיקרוגרם ב21.0 μl של חיץ העיכול, להוסיף 1 יחידה של DNase אני מומס ב2.0 μl של חיץ עיכול.
  3. מערבולת קלה להשיג ערבוב יסודי ודגירה של 1.5 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
  4. בתום תקופת הדגירה, להוסיף 216.4 μl של 50 dibasic פתרון פוספט מ"מ Na המכיל 2.0 מ"מ KCl, 1.0 מ"מ DFO ו -200 מ"מ MgCl 2.
  5. הכן "עיכול חיץ-2" על ידי שילוב של כרך אחד של חיץ עיכול עם תשעה כרכים של dibasic, 50 מ"מ פוספט Na (עם 2.0 מ"מ KCl, 1.0 מ"מ DFO ו -200 מ"מ MgCl 2).
  6. להוסיף 0.025 יחידות של phosphodiesterase (PDE) אני אנזים ב16.3 μl של חיץ-2 עיכול. פיפטה למעלה ולמטה במשך כמה שניות, ואז מערבולת קלה להשיג ערבוב יסודי ודגירה של 1.5 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
  7. הוסף 0.4 יחידות של phosphatase אלקליין (AP) ב8.0 μl של חיץ-2 עיכול. פיפטה למעלה ולמטה במשך כמה שניות, ואז מערבולת קלה להשיג ערבוב יסודי ודגירה של 1.5 שעות על 37 מעלות צלזיוס. להוסיף 33.0 כיתה HPLC μl MeOH.
  8. הפעל דגימות DNA מתעכלים על HPLC, כפי שיתואר להלן, מייד או לאחסן ב -80 ° C עד שימוש כדי למזער חמצון. הערה: שלבי העיכול 1.5 שעות הציעו כאן מבוססים על מרווחים כאלה הציעו במקום אחר 9 ועל הממצאים שפרוטוקולים דומים להשיג עיכול DNA שלם 9. לכן, הנחה היה שהגורם המגביל היחיד להשיג עיכול מלא הזמן ושinhomogeneity עיכוב אנזים והמדגם היו זניח.

4. HPLC הפעלה: הכנת הניידת שלב, התקנת מכשור ותחזוקה

  1. השתמש במי ultrapure להכין את כל פתרונות החיץ וטופל בשרף כוח אג"ח גבוה (למשל, Chelex 100: divinylbe סטירןקופולימר nzene עם iminodiacetate יונים שמתכות מעבר Chelate עם זיקה גבוהה) כדי למזער את זיהום מתכת וחמצון ה- DNA במהלך הכנת מדגם.
  2. הכן 250 חיץ פוספט מ"מ Na, pH 6.2. השתמש יחס של 1: 3.6957 של פוספט נתרן dibasic (FW = 177.99 g / mol) לmonobasic פוספט נתרן (FW = 119.98 g / mol).
    לדוגמא: לכן, לפתרון מניות 3 L לשלב 70.81 גרם של monobasic ו28.43 גרם של אבקת dibasic, מוסיף מים עד לדוגמא, 2.8 ליטר ולוודא שה- pH של התמיסה הוא 6.2. התאם את ה- pH עם 250 פתרונות מונו או פוספט נתרן dibasic מ"מ, שהוכנו בנפרד ולא על ידי חומצות או בסיסים מרוכזים. להוסיף 2.24 גרם של KCl להשיג ריכוז של 10 מ"מ KCl.
  3. הכן שלב נייד בשלושה בקבוקים, L לפחות 1 כל אחת, המכיל: B ממס - מתנול HPLC הכיתה, ממס - מים ultrapure B, ו- C ממס - חיץ פוספט מהשלב 4.2. הכנס צינורות אספקת שלב נייד HPLC לבקבוקים; remainiצינורות ng יש גם טבלו באחד מהבקבוקים (למשל, C פתרון) ודרוכים, גם אם הם אינם נדרשים לערבוב.
  4. בזמן הריצה, לערבב את פתרונות ששלב הניידים כממס 6%, 74% B ממס וממס של 20% C כדי להשיג פתרון סופי של 50 מ"מ חיץ פוספט נתרן (pH 6.2) עם 2.0 מ"מ KCl, ו -6% MeOH.
  5. לנתק את האלקטרודה מגלאי אלקטרוכימי, לפרק אותו והתייחסות נקייה ואלקטרודות עבודה עם פתרונות ניקוי אלקטרודה ודיסקי ליטוש מומלצים על ידי היצרן. יש לשטוף את המשטחים לנקות עם מים ultrapure, לנגב את המים בעדינות ולהבטיח את הגלאי הוא יבש לפני הפעלת המערכת על.
  6. להרכיב מחדש את הגלאים ולחבר את כניסת השלב הניידת לאלקטרודה. הפעל את הזרימה ולאפשר את השלב הנייד כדי למלא את האלקטרודה לפני הצמדת צינור השלב הנייד לשקע. התקן טור חדש לפני תחילת אופטימיזציה. ודא שהתקנה היא בכיוון הנכון וFollows המלצות כל היצרן.
  7. הפעל את מכשור HLPC גם קדימה (למשל, 1 שעה) של מדגם ניתוח כדי לאפשר איזון וכדי להפחית את הרעש בנקודת ההתחלה. ראה טבלה 1 להגדרות הציעו; מגבלת הלחץ האחורית צריכה להיות מוגדרת 3,000 psi, כדי למנוע נזק עמודה. הפעל את מסלק הגזים. להמשיך ביחולו המשאבות והקמת שיפוע ממס.
  8. ראש יבש המשאבות לפי הוראות יצרן. האם זה להרטיב את הקווים כאשר שלב נייד הוחלף או כניסת צינורות חשופה לאוויר.
  9. אתר את דיסק האתחול ולהכניס מזרק פלסטיק 10-15 מיליליטר שם. ודא את המזרק מוכנס באופן מלא לפני שפתח את הקו. כדי לפתוח את השורות פשוט להפוך נגד כיוון השעון דיסק לתורם אחד.
  10. התחל עם ראש בחירת ממשק HPLC המתאים. משוך בעדינות את המזרק לצייר נוזל לתוך השורות. ברגע שהנוזל זורם, ראש הושלם; לאפשר לתכנית ללסיים את הריצה. חזור לכל הקווים (בדרך כלל ארבעה, תלוי במכשיר).
  11. לחלופין, ראש רטוב כאשר הקווים כבר רטוב מראש יבש קודם לכן (ראה להלן).
    הערה: כאשר כמות גדולה של זמן שחלף בין שימושים (לדוגמא, 2 שבועות או יותר), ראש יבש מומלץ.
  12. לשנות את הרכב של רכיבי ממס השלב הנייד ל- 25% כל אחד באמצעות ממשק משתמש HPLC. מהממשק, בחר באפשרות "פונקציה ישירה", ולאחר מכן בחר באפשרות "רטוב ראש". זה יהיה ראש את כל הקווים באותו הזמן.
  13. ודא שכל האוויר יצא מהמערכת על ידי התבוננות בקו ראש הרטוב כפי שהוא מזין את מיכל הפסולת. אחרי ראש טוב, לוודא שאין בועות נשארות בקו. אם בועות להתמיד, לחזור תחול.
  14. ברגע שהמשאבה דרוכה, להתחיל לנוע השלב הנייד HPLC. השתמש בממשק HPLC לשנות באופן ידני את ההרכב של השלב הנייד למתנול (6% ממס) ו -94%מים (ב ממס), ובחר קצב זרימה של 0.9 מיליליטר / דקה. לאפשר 5 דקות כדי לנקות כל מתנול מהשלב ניקוי עמודה.
  15. לאחר 5 דקות, לשנות את הרכב למתנול (6% ממס), 74% מים (ב ממס), חיץ 20% (C ממס), להגדיל את קצב הזרימה ל1.0 מיליליטר / דקה. להגדיר את הפרמטרים אחרים כפי שסוכם בטבלה 1, ולהגדיר את מגבלת לחץ חזרה ל3,000 psi, כדי למנוע נזק עמודה.
    הערה: בעיות פוטנציאליות עם התקנת HPLC כוללות בסיס נסחף, שיא פיצול ועוצמת אות פחתה. אלה בדרך כלל ניתן להתגבר על ידי ניקוי העמודה לאחר כל שימוש, ניקוי אלקטרודה תכוף, ולהבטיח שפתרונות החיץ חופשיים של זיהום (למשל, חומר חלקיקים או התפתחותם של חיידקים).
  16. הפעל את השלב הנייד כ 1-1.5 שעות כדי להשיג אות בסיס יציבה.
  17. שימוש בממשק תוכנת מכשיר, בחרו פרמטרים כפי שצוין בטבלה 1 ולהגדיר את זמן ריצת 15 דקות. להזריק את סםple. השתמש פעמים ריצה מוגברות לדגימות מורכבות (לקבוע את זה באופן אמפירי על ידי התבוננות הנוכחות או עדר של פסגות מעבר מרווח 15 דקות-).
    הערה: תוכנת כלי מאפשרת תכנות של תנאי הפעלת מדגם והתקנה לautosampling.
  18. אחרי הריצות הושלמו, לכבות את תא הגלאי באמצעות הממשק של הגלאי. חשוב לעקוב אחר המלצות יצרן לגבי הפעלה מטה הגלאי כטיפול לא נכון וכיבוי עלול לגרום נזק למכשיר. אל תכבה את התא על ידי מעבר האחורי של הגלאי כמו זה יכול לגרום נזק למכשיר.
  19. באופן ידני לשנות את הרכב השלב הנייד למתנול 6% ו -94% מים. הפעל למשך 5 דקות.
  20. ידני להפחית את קצב הזרימה של 0.7 מיליליטר / דקה, מייד לשנות את הרכב לMeOH 50% ו -50% מים. לרוץ לפחות 20 דקות. אי להפעיל את הצעד הזה בפעם המומלצת עלולים לגרום לניזק לעמודה והגלאים. כבה את הזרימה,אז d לכבות את מסלק הגזים.

5. הכנת התקנים

  1. הכן חיץ שלב נייד כפי שמתואר בשלבים 4.1-4.3 לעיל. חשוב להשתמש בשלב HPLC הנייד להכנת תקנים כדי למנוע פסגות כתוצאה מערבוב של פתרונות שונים לאחר הזרקת מדגם.
  2. לדלל פתרון אחד זה בחמישה במי ultrapure לפני השימוש, והפתרון הסופי חייב לכלול 6% MeOH.
  3. dGuo תקן
    הערה: פוטנציאל חמצון גבוה הנדרש לאיתור dGuo עלול להגביר את הסיכון למדידה מפריעה תרכובות electroactive. זה יכול להיות מאומת על ידי, למשל, עקומה סטנדרטית של גילוי UV של dGuo ב 260 ננומטר והשוואתה לעקומת הסטנדרט שנוצרה עם גילוי EC. אם שני ליישר היטב (למשל, איור משלים 1) ומדגם אפקטי המטריצה ​​נלקחו בחשבון, ניתן להמשיך באיתור dGuo ידי UV ב 260 ננומטר, ולא גילוי EC.
    1. מערבולת במהירות גבוהה עד dGuo מתמוססת לחלוטין. זהו המניות העיקריות; לאחסן ב -20 ° C למשך מספר שבועות.
    2. כדי ליצור את מניית dGuo המשנית (0.5 מ"מ), לדלל 143 μl של מניית dGuo העיקרית ב857 μl של שלב נייד HPLC. אחסן על קרח עד לשימוש ולהכין טרי בכל יום.
    3. הפוך את דילולים נוספים כדי ליצור עקומה סטנדרטית (לדוגמא, טבלה 2). פתרונות חנות על קרח ולהכין טרי בכל יום. סטנדרטים לרוץ בסדרה עם דגימות ניסוי.
    4. לפני לרוץ, להשתנות מתח הגלאי באמצעות הריכוז הגבוה ביותר של המניה למצוא מתח אופטימלי.
  4. 8-אוקסו-dGuo תקן
    1. למדוד 1.0 מ"ג של 8-אוקסו-dGuo בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. להוסיף MeOH הכיתה 0.1 מיליליטר HPLC. מערבולת במהירות גבוהה עד 8-אוקסו-dGuo מתמוססת לחלוטין. זהו המניות העיקריות של 8-אוקסו-dGuo. חנות ב -20 ° C לsevשבועות eral.
    2. בצינור נפרד, לשלב 2.9 μl של מניות עיקריות ו997.1 μl של חיץ שלב נייד HPLC, מערבולת. זהו המניות המשניות (10,000 ננומטר).
    3. כדי ליצור פתרון עבודה לעקומה סטנדרטית (250 ננומטר), לשלב 24.4 μl של מניות המשניות ו975.6 μl של חיץ שלב נייד.
    4. לבצע דילולים נוספים כדי לספק את הפתרונות הנדרשים כדי ליצור עקומה סטנדרטית (לדוגמא, טבלה 3). פתרונות חנות על קרח ולהכין טרי בכל יום. סטנדרטים לרוץ עם דגימות הניסוי.
  5. כימות
    1. לשלב את השטח מתחת לעקומה לשני 8-אוקסו-dGuo וdGuo באמצעות תוכנה סטנדרטית (כחלק מממשק HPLC-מחשב, ראה איור 2 א המשלים).
    2. לבנות עקומה סטנדרטית (ריכוז ידוע של כל אנליטי לעומת שטח מתחת לעקומה (2B איור המשלים). שימוש במשוואה של העקומה סטנדרטית, לחשב את היחס ל8-אוקסו-dGuo / dGuo עבור כל דגימה.

6. Agarose ג'ל אלקטרופורזה

הערה: ג'ל אלקטרופורזה agarose ניתן לבצע כדי לאמת את השלמות של מערכת עיכול DNA.

  1. הכן 50x טריס-אצטט-EDTA (טה) חיץ, על ידי המסת בסיס 242 גרם טריס (FW = 121.14) בשנת 750 מיליליטר המים ultrapure. להוסיף 57.1 מיליליטר חומצה אצטית קרחונית ושל 0.5 M EDTA 100 מיליליטר (pH 8.0; EDTA יתמוסס לחלוטין כאשר pH הפתרון מותאם ל8.0 עם למשל, NaOH) ולהוסיף מים ultrapure לנפח סופי של 1 ל 'חנות ב RT, לדלל 50x לפני שימוש זה פתרון.
  2. לשקול את 1 גרם של agarose ולפזר אותו ב100 מיליליטר חיץ 1x טה, חימום במיקרוגל במשך 1-2 דקות. לחבוש משקפי מגן וציוד מגן להימנע ממגע עם רותח agarose.
  3. להתקרר הפתרון עד כ 50 מעלות צלזיוס, להוסיף 5 μl ethidium ברומיד (זהירות: mutagen) ולשפוך אותו לתוך מכשיר ריצת agarose ג'ל. הכנס את המסרק.
  4. חכה עד שמתמצק הפתרון, לשפוך חיץ טה על ג'ל ולטעון את הדגימות (נפח תלוי בגודל מסרק, בדרך כלל, 10-20 μl של דגימת DNA טעון, מעורב עם צבע פועל 6x לדמיין ולהקל טעינה).
  5. הפעל את הג'ל עד הצבע נודד כ 2/3 האורך של ג'ל (למשל, 45 דקות ב 150 V). דמיינו להקות DNA תחת אור UV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

dGuo נצפה ליש זמן שמירה של 4.7 דקות ואילו 8-אוקסו-dGuo זמן שמירה של כ 6.4 דקות (איור 2 א 'וב'). יש הבדל כ -1,000 פי בגבה השיא בין שני analytes, כפי שניתן לראות באיור 2 ג. Voltammograms ל8-אוקסו-dGuo וdGuo התקבלו על ידי סטנדרטים פועלים בפוטנציאל עבודה בטווח של 0.2-1.1 V. פוטנציאל העבודה האופטימלי עבור 8-אוקסו-dGuo היה נחוש להיות 0.5 V, ו0.9 V לdGuo (איור 3). פוטנציאלים אלה הם בהסכם עם אלקטרודות פחמן מזוגגות אחרות המתוארות בספרות 14,15. המגבלה של איתור וטווח דינמי של זיהוי אלקטרוכימי 8-אוקסו-dGuo וdGuo מדווחת להיות בטווח femtomole וnanomole, בהתאמה 8,9. עקומות סטנדרטיים לdGuo ו8-אוקסו-dGuo יש להפעיל יומית כדי להבטיח איתור ליניארית בטווח ריכוז מתאים ונכון לבצעאהה של המכשיר (איור 4). עקומות סטנדרטיים בנויות על ידי התוויית אזור השיא כפונקציה של ריכוז הידוע אנליטי (איור משלים 2) שמאפשר לחשב את ריכוז אנליטי בדגימות מהמשוואה שנוצרה מהעקומות סטנדרטי.

עיכול DNA שלם נדרש למדידות מדויקות של תדירות 8-אוקסו-dGua וכמה שיטות עיכול הדנ"א הגנומי הוצעו 8,15,16. במידת צורך, את היעילות של מיצוי DNA ועיכול ניתן לאמת באמצעות אלקטרופורזה agarose ג'ל (איור 5 א) וHPLC-ED (איור 5). נתיבים עם כתם DNA ברור באיור 5 א '(לדוגמא, נתיבים 2, 4, 6, 9, 11, ו -13) מצביעים על הנוכחות של DNA לא מעוכל ואילו דגימות עם שברי DNA מתעכלים לברוח ג'ל והיו וכך מבלי שיבחינו. הרמה באיור 5 מצביעה על כך שincubati נוסףעל ה- DNA עם אנזימי עיכול מעבר 1.5 שעות לא לגרום לכמות גדולה יותר של dGuo מזוהה, המצביע על עיכול כמעט מלא לאחר 1.5 שעות. בנוסף, שני ג'ל אלקטרופורזה agarose וHPLC-ED שמשו לבדיקת השירות למאגר ה- DNA העיכול מבוסס פוספט מועסק כאן. מאגר זה מתאים מאוד לשלב הנייד HPLC ולא לגרום לרעש בלתי רצוי גלאי המיוחס לערבוב של פתרונות שונים (מידע לא מוצג). לכן, את המתג מהחיץ הציע בספרות (כלומר, טריס-HCl 8) לחיץ פוספט נתרן מומלץ לפרוטוקול זה (משמאל לעומת צד ימין של איור 5A). שים לב שההנחות שבבסיס לאופטימיזציה של מערכת עיכול DNA היו שinhomogeneity עיכוב ומדגם האנזים היו זניח וזמן עיכול היה הגורם המגביל בלבד, כאמור לעיל. אפשרות שעיכול DNA שלם הביא שברים שהם קטנים מדי כדי להיות Detected על שרידי agarose ג'ל. למרות שגיאה שיטתית כזה משפיע על כל הדגימות באופן שווה, ניסויים נוספים (למשל, טיפול בתאים בתרבית עם פרו-חמצון radiolabelled 10) יכולים להיות שנערכו כדי לשלול לחלוטין אפשרות כזו.

שלא כמו פתרונות סטנדרטיים, ה- DNA מתעכל, אם מהתאים מבודדים או רקמות עכבר, המיוצר על כמה פסגות נוספות (איור 6 א ו6B). אלה היו רחוקים מפסגות 8-אוקסו-dGuo וdGuo, אבל spiking ניסויים כחלק מתרגילי אימות שתוארו בדיון יש צורך לבחון אם פסגות נוספות (כלומר, טומאת מדגם בשל השפעות מטריצה, למשל) להפריע לכימות . השיא-dGuo 8-אוקסו אושר על ידי התכתבות של זמן שמירה עם הסטנדרטי; ויתר על כן, להגדיל בשיא-dGuo 8-אוקסו לדגימות מהתאים או בעלי החיים שעברו טיפול פרו-חמצון (איור 7). Pro-חמצון KBrO 3 משתתף בהפשטה אחד-אלקטרון מגואנין שמובילה להיווצרות 8-אוקסו-dGuo 17. ראוי לציין כי בהעדר הלחץ הפרו-החמצון, 2.4 מולקולות של 8-אוקסו-dGuo לכל 10 7 dGuo אותרו בתאי A549 (איור 7 א). זה דומה לרמה של 4.5 מולקולות של 8-אוקסו-dGuo / 10 7 dGuo זוהו בתאי A549 נצפו באמצעות חלופה, גישה מבוססת ספקטרומטר מסה נועדה לתת מענה חסרונות פוטנציאליים של שיטת HPLC-ED 9. טיפול DBC (מ"ג 20.0 כלומר, מדי יום DBC / קילוגרם BW ליום במשך שלושה ימים) עלה רמות-dGuo 8-אוקסו בDNA טחול עכבר. זוהי גם תוצאה צפויה, מאז ROS ידוע להיות מיוצר בחילוף החומרים של פחמימנים ארומטיים פוליציקליים in vivo 8. הרמות היחסית של 8-אוקסו-dGuo בטחול של בעלי החיים unstressed היו 8.3-9.4 8-אוקסו-dGuo / 10 6 dGuo (איור 7), שהוא בagreemen המצויןלא עם ערכים שפורסמו של ארבע מולקולות 8-אוקסו-DG / 10 6 dGuo נמדדו בתאי הטחול עכברי בתנאים סטנדרטיים על ידי HPLC-ED 18. איורים 6 ו -7, עולה כי הרמות של 8-אוקסו-dGuo מעל לקו הבסיס קטנות מאוד . לכן, אם ה- DNA הוא מתחמצן לרמות נמוכות יותר שנצפה כאן, הרמות של 8-אוקסו-dGuo יכולות להיות שאין להבחין בין תחילת המחקר, אשר צריך להיות כל הזמן בראש של משתמשי פרוטוקול פוטנציאליים.

איור 1
איור 1. מבנה של 8-אוקסו-dGuo וtautomer 8-OH-dGuo. שים לב ש8-אוקסו-dGuo במקום 8-OH-dGuo הוא tautomer הגדול ב- pH 7.4.

איור 2
פעמים שמירת איור 2. לdGuo () ו8-אוקסו-dGuo (B). HPLC-ED chromatograms התקבל מהזרקת 10.0 μl של שני dGuo, (1.0 nmol סך הכל) או (סה"כ fmol 1,000) 8-אוקסו-dGuo וזוהה על 0.9 V () או 0.5 V (B). שיא השייר dGuo היה כ 4.7 דקות () ושעבור 8-אוקסו-dGuo היה כ 6.4 דקות (B). השיא הרחב ב2-3 דקות נגרמים ככל הנראה על ידי הפרעות הזרקה ואינו מושפע (כלומר, תמיד נוכח בעוצמה דומה) על ידי הריכוז של 8-אוקסו dGuo. (ג) chromatograms הפרובלמטיקה משתי זריקות נפרדות מתוארות ב() ו (ב) זוהה על ידי UV (ננומטר 260). הסטנדרטים נוהלו באותו היום באמצעות תנאי הפעלה זהים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

es / ftp_upload / 52,697 / 52697fig3.jpg "/>
איור 3. מתח גלאי אופטימיזציה. () Voltammogram של dGuo (nmol הריכוז סופי 1) זוהה על ידי ניתוח HPLC-ED בטווח של .7-1.1 V. (ב) Voltammogram של 8-אוקסו-dGuo (ריכוז סופי 500 fmol) זוהה על ידי ניתוח HPLC-ED בטווח של .3-0.7 V. אמצעי של שלושה ניסויים עצמאיים (N = 3) ± סטיית תקן לראות. במקרים מסוימים ברים שגיאה קטנים יותר מסימני המזימות.

איור 4
איור 4. עקומת סטנדרט לdGuo () ו8-אוקסו-dGuo (B). עשרה מיקרוליטר של שני dGuo או 8-אוקסו-dGuo הוזרקו ונמדדו על ידי HPLC-ED על 0.9 V () או 0.6 V (B ). באמצעות שלושה ניסויים עצמאיים (N = 3) ± סטיית תקן לראות. במקרים מסוימים סורגי שגיאה מ"ראלר מסימני קשירת קשר.

איור 5
איור 5. אופטימיזציה של מערכת עיכול DNA. () שמונים מיקרוגרם של אשכים סלמון DNA היה מתעכל כמתואר 8 בטריס HCl, חיץ גליצין-אצטט (משמאל) או חיץ פוספט נתרן (מימין). אלקטרופורזה agarose ג'ל (1.0%) הייתה לרוץ על 150 V 45 דקות. ליין 1 ו -8: סולם DNA; נתיבים 2, 4, ו -6: DNA מעוכל; נתיבים 3, 5, ו -7: DNA מתעכל; נתיבים 9, 11, ו -13: ה- DNA לא מעוכל (חיץ פוספט); נתיבי 10, 12, ו -14:. מתעכל DNA (חיץ פוספט) (ב) אשכים סלמון DNA (80 מיקרוגרם) היה מתעכלים במסמך זה על ידי דוגרים עם DNase אני, אני PDE, וAP ל0.5-2.5 שעות לכל צעד, ב 50 חיץ פוספט מ"מ המכיל מגנזיום כלוריד וDFO. חמישים מיקרוליטר של כל דגימה, המכילים 7.3 מיקרוגרם של ה- DNA מתעכל, נותחו על ידי HPLC (כלומר, 0.9 V ו 1 מיליליטר / פלו דקותw) כדי לזהות dGuo. איור מציג אמצעים של שלושה ניסויים עצמאיים (N = 3) ± סטיית התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6 א
איור 6
DNA איור 6. chromatograms לגילוי-dGuo 8-אוקסו בתאים בתרבית (א) או רקמה מן החי (ב '). () מתעכל מתאי A549, טופלו או לא טופלו עם KBrO 3. (ב) DNA מתעכל מהטחול של DBC עכברי -treated. פסגות עברו לשמאל עקב ההסרה של עמודת שומר (בשל לחץ הצטברות במנגנון; עמדתם אושרה בתקנים). תקנים ודגימות היו לרוץ באותו היום באמצעות מצב הפעלה זההכרכים של 10 מיליליטר והזרקה, בקצב זרימה 1 מיליליטר / דקה ו0.5 ו -0.9 V לdGuo ו8-אוקסו-dGuo, בהתאמה. אנא לחץ כאן לגרסה גדולה יותר של פנל; כאן ללוח ב '.

איור 7
איור 7. כימות של 8-אוקסו-dGuo בדגימות ביולוגיות. פיקס שולבו ובהשוואה לעקומות סטנדרטית (ראה איור 2 משלים לפרטים נוספים) להניב רמות 8-אוקסו-dGuo בDNA מתאי A549, שטופלו עם 3 KBrO ( ), רמות או 8-אוקסו-dGuo בדנ"א מהטחול של עכברים שטופלו DBC (B). כוכבים (*) מצביעים על מובהקות סטטיסטיות (p <0.05, ניתוח בכיוון אחד של שונות, מבחן t (ב)) (ANOVA) (). באמצעות שלושה () או חמש (ב) ניסויים עצמאיים ± סטיית ההתקן של הממוצע מוצגים. דגימות נאספו 4 או 24 שעות לאחר הטיפול של 3 ימים.

שלב נייד חיץ פוספט 50.0 מ"מ Na, pH 6.2, המכיל MeOH 6% ו -2.0 מ"מ KCl
קצב זרימת שלב נייד 1.0 מיליליטר / דקה
סוג העמודה YMC-בסיסי עם סיליקה הכדורית ערובה
אורך טור 15 סנטימטר
קוטר פנימי עמודה 3.5 מ"מ
טמפרטורת עמודה 35 מעלות צלזיוס
טמפרטורת גלאי 29 מעלות צלזיוס
הגדרת מתח ל8-אוקסו-dGuo 0.5 V
הגדרת מתח לdGuo 0.9 V
הזרקת נפח 10.0 מיליליטר

טבלת 1. פרמטרים כלי לאיתור וכימות של 8-אוקסו-dGuo ידי HPLC-ED.

nmoles 100 ננומטר סטנדרטיים, μl שלב HPLC הנייד, μl דילול, לקפל
5 300 0 1
2.5 150 150 2
1 60 240 5
0.5 30 270 10
0.25 15 285 20
0.1 6 294 50

טבלה 2. </ Strong> הכנת העקומה סטנדרטית לdGuo.

fmoles 250 ננומטר סטנדרטיים, μl שלב HPLC הנייד, μl דילול, לקפל
2500 300 0 1
1,000 120 180 2.5
500 150 150 5
250 150 150 10
100 120 180 25
50 150 150 50

שולחן 3. הכנת העקומה סטנדרטית ל8-אוקסו-dGuo.

איור 8
Sup plementary איור 1. השוואה של אלקטרוכימיים (EC) וזיהוי מבוסס UV של dGuo. עקומת תקן נוצר עבור dGuo זיהוי על ידי זיהוי אלקטרוכימי (EC) או זיהוי UV (260 ננומטר). אזורי שיא שולבו לשיא dGuo בכ 4.7 דקות על ידי שני השיטות. N = 3, אמצעי ± סטיית תקן מוצגת.

איור 9
איור משלים 2. כימות dGuo מהעקומה סטנדרטית שלה. דוגמא לשימוש בעקומה סטנדרטית כדי לקבוע את הריכוז של dGuo מוצג. () אזור שיא יכול להיקבע על ידי אינטגרציה באמצעות תוכנה סטנדרטית. (ב) מידע זה משמש לבנות עקומה סטנדרטית כדי להשתמש במשוואה של הקו כדי לחשב את ריכוז אנליטי ידוע במדגם.52,697 52697fig9large.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות 8-אוקסו-dGuo דווח כסמן ביולוגי שימושי של חמצון ה- DNA, הכימות אמין שלה יכול להוות אתגר. למרות כמה שיטות שפורסמו קיימות, יש צורך בסקירה מקיפה, תיאורים של פרוטוקול להתיר לחוקרים לפרוס את השיטה במעבדות שלהם. כאן אנו מציגים סקירה מפורטת של פרוטוקול מבוסס HPLC שיאפשר למשתמשים חדשים להקים שיטה יעילה לגילוי 8-אוקסו-dGuo וכימות.

שלוש שיטות עיקריות שתוארו לכימות של 8-אוקסו-dGuo. אלה כוללים אנזים צמוד immunosorbent assay (ELISA) מבוסס ערכות מסחריות 19, כרומטוגרפיה / ספקטרומטריית מסה נוזלית שיטות (MS) (למשל, כפי שתוארו במקום אחר 9 ושיטות HPLC-ED, כגון זה שתוארו במסמך זה. שיטות ELISA יכולות לסבול מהפרעות עם תרכובות מסוימות בדגימות ביולוגיות 19. באופן כללי, תוצאות שהושגו באמצעות chromatogrטכניקות aphic נחשבות אמינות יותר לכימות 8-אוקסו-dGuo בהשוואה לשיטות מבוססות ELISA 20. בהשוואת שיטות HPLC-ED עם השיטות מבוססות MS, היתרון של לשעבר הוא יחסית זול ציוד (כלומר, כ סדר הגודל פחות יקר מאשר ציוד לשיטות מבוססות MS). בנוסף, HPLC-MS עדיף על שיטות HPLC-ED כלשעבר אינם נוטה להפרעות פוטנציאליות עם תרכובות electroactive ולספק מדידות חד-משמעיות, כמותי באמצעות איזוטופים 21.

חששות הועלו בנוגע לשימוש בשיטות מיצוי פנול מסורתיים להפקת DNA הגנומי שתשמש לכימות 8-אוקסו-dGuo 22. כמה חוקרים ציינו כי התנאים הקשורים לחילוץ פנול הסטנדרטי יכולים להציג את חמצון dGuo לא רצוי ובכך להגדיל רמות בסיס 1.9. כדי לטפל בבעיה, תא והאנימה זההדנ"א הגנומי l ניתן לחלץ ומטוהר באמצעות פרוטוקול DNAzol שונה 22. DNAzol מכיל ריכוזים גבוהים של thiocyanate guanidine, ומחקרים קודמים 9 ציינו היווצרות 8-אוקסו-dGuo נמוכה רמה בסיסית כאשר DNAzol משמש בהשוואה לphenol- המסורתית ושיטות חילוץ מבוססות נאי. מתחם chelating הברזל DFO שימש כדי למזער ייצור ROS וחמצון ה- DNA במהלך הכנת מדגם. כפי שצוין לעיל, רמות 8-אוקסו-dGuo בתאי A549 unstressed (איור 7 א) היו דומות מאוד למה שנמדד על ידי שיטה מבוססת MS 13. הדבר מצביע על כך שילוב של אמצעי זהירות שתוארה לשיטות מבוססות MS 13 מותר מזעור חמצון ה- DNA לא רצוי במהלך הכנת מדגם וניתוח על מנת להשיג כימות 8-אוקסו-dGuo מדויק על ידי HPLC-ED. עיתוי של תאי תרבות נתיחה לאחר מוות או קצירה לאחר טיפול פרו-חמצון עשוי להיות גורם חשוב נוסף, כפי שניתן לראות כאן על ידי ירידה של 8 אוקסו-dGuo רמותבטחול בשעות לעומת 24 שעות 4 לאחר הטיפול האחרון (איור 7). זה יכול להיות בגלל ההפעלה של תיקון כריתת הבסיס לחסל נזק לדנ"א.

שתי מגבלות ברורות של השיטה המתוארת הן: (1) הדרישה לכמויות גדולות למדי של ה- DNA (כ -80 מיקרוגרם לדגימה להשיג שלושה משכפל טכני), ו- (2) הפרעה אפשרית מתרכובות משחררי שיתוף. נמצא כי רק קטן מאוד (כלומר, כ -15 מ"ג) חתיכת הטחול (כ -15% ממשקל רקמה) הייתה מספיק כדי לקבל 80 מיקרוגרם של ה- DNA, והשאיר כמות מספקת של רקמה לאחרים (למשל, ביטוי גנים) מנתח. כמות ה- DNA שחולץ היא פרמטר קריטי אחר המשפיע על חמצון ה- DNA artifactual 23,24,25. לכן, עבודה עם גדול למדי (~ 80 מ"ג / מדגם) שאנו מציעים כאן היא בקנה אחד עם המלצות קודמות של שימוש ב> 30 מ"ג כדי למזער חמצון ה- DNA artifactual 25.לרקמות קטנות יותר (למשל, היפוקמפוס), אפשר להקטין את הפרוטוקול להתחיל עם 20-30 DNA מיקרוגרם, שכן זה צריך להיות מספיק 2-3 ריצות. כמויות גדולות יותר של ה- DNA היו ככל הנראה להקל על הרזולוציה של פסגות מעל רעש רקע, אבל זה נשאר להיות בניסוי אימת הימצאותם של חומרים שעלולים להפריע ניתן לטפל על בסיס מקרה לפי מקרה, וזה הכרחי תמיד לכלול דגימת DNA מ בו זמנית במבחנה או בטיפולי vivo עם שליטה חיובית שידועה לגרום נזק לדנ"א חמצוני (ראה איור 7).

למרות פוספט במאגרי פוספט דווח לצמצם את הפעילות של phosphatase אלקליין, ניסויי אופטימיזציה שיטה (איור 5) אישרו כי חיץ פוספט יכול בקלות לשמש. מאז חיץ פוספט כלול בשלב הנייד, השימוש בו בהכנת מדגם מופחת רעש גלאי בשל סוללפרוק ערבוב. , הרכב חיץ, מיצוי DNA כך מתח ועיכול היו מותאמים ובקרות חיוביות נכללו. יתר על כן, סיכום מתאר כיצד משתנה אלה יכולים להיות מותאמים יותר על ידי מעבדות בודדות מסופק. המטרה שלנו הייתה לייצר שיטה שיכול להיות שימושי למעבדות מומחה במטרה לפתח assay לגילוי 8-אוקסו-dGuo וכימות.

עם זאת, נציין, כי אימות פורמאלית של השיטה נדרש, כפי שתוארה באימותים המומלצים על ידי הרמוני הבינלאומי של דרישות טכניות לרישום של תרופות לאדם השימוש (ICH) הצעדים לאימות של נהלים אנליטיים (כלומר, Q2 ICH ( R1) 26). בקצרה, האלמנטים של אימות כמותית יש לבחון את של assay: 1) דיוק (שניתן להשיג על ידי כולל דוגמאות עם כמויות שונות של 8-אוקסו-dGuo הממוסמר-ב; 2) מגוון וליניאריות (תגובה ליניארית בשלוחהריכוז אנליטי הסתיימה; דיוק 3) (הדירות ושחזור); 4) מגבלה של זיהוי (בדרך כלל, הנקודה שבה יחס האות לרעש היא גדולה או שווה 2-3; זה עשוי להיות מטריצה ​​תלויה); 5) מגבלה של כימות (ריכוז שבתגובה פוגשת כמה רמות שנקבעו מראש כמו 2 x סטיית תקן של שליטה; יכול להיות מטריצה ​​תלויה); 6) הסלקטיביות / הספציפיות (יכולת לזהות אנליטי בדגימות מורכבות לעומת פתרונות מסודרים); 7) שחזור (היכולת לקבל את אותה התוצאה במעבדות שונות עם מפעילים שונים); ו8) חוסן והתאמת מערכת. כמטרת האימות המומלצת על ידי ICH היא להוכיח שזה "מתאים למטרות המיועדים שלו" וסביר להניח כי יש מעבדות רבות למטרות שונות, המשתמשים הפוטנציאליים של assay זה יצטרכו לאמת את זה כלנדרש. כימות מדויק של 8-אוקסו-dGuo רצוי בטוקסיקולוגיה וחטא רפואה מולקולריתCe זה יכול לשפר את ההבנה של לחץ חמצוני איך, ובאופן ספציפי יותר חמצון ה- DNA, הוא מכניסטי ואמפירי קשור להשפעות בריאותיות שליליות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי משרד הבריאות הקנדית ג'נומיקס המחקר ופיתוח היוזמה (GRDI) ותקינת האסטרטגיה הקנדית לביוטכנולוגיה (CRSB). יש הסופרים אין ניגוד האינטרסים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
8-oxo-dGuo standard Cayman Chemical Company 89320 Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine"; see Fig. 1 and text for details.
Alkaline phosphatase Sigma-Aldrich P5931 From E. coli
Chelex 100 Sigma-Aldrich C7901 Chelates heavy metals
Desferoxamine mesylate Sigma-Aldrich D9533
dGuo standard Sigma-Aldrich D7145
Dibasic sodium phosphate Sigma-Aldrich S9390
DNA from salmon sperm Sigma-Aldrich D1626 Sodium salt
DNase I Sigma-Aldrich D4527 TypeII, from bovine pancreas
DNAzol Invitrogen 10503-27
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma-Aldrich E4884 The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 (e.g. with NaOH)
F12-K media ATCC 30-2004
Foetal bovine serum ATCC 30-2020
Guard column Chromatographic Specialties YBA 99S03 0204GC Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Monobasic sodium phosphate Sigma-Aldrich S9638
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-122
Phosphate buffered saline Invitrogen 15190-250
Phosphodiesterase I enzyme  Sigma-Aldrich P3243 Type II from Crotalus adamaneus venom
Teflon homogenizer Thomas Scientific 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed.
Trypsin Invitrogen 15050-065
YMC-BASIC column with bonded spherical silica Chromatographic Specialties YBA 99S03 1546WT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine. Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).
  2. Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. 8-hydroxy-2' -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis. J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).
  3. Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features. J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).
  4. Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature. Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).
  5. Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine. Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).
  6. Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., Møller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA. Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).
  7. Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3rd, Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair. Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).
  8. Park, J. -H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).
  9. Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).
  10. Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up. Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).
  11. Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).
  12. Test No. 488: Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays. , Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD). Available from: http://www.oecd-ilibrary.org (2015).
  13. Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat. Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).
  14. European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods. Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).
  15. Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in the presence of uric acid. Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).
  16. Ravanat, J. -L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay. Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).
  17. Kawanishi, S., Murata, M. Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress. Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).
  18. Tahara, S., Kaneko, T. Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation. Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).
  19. Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA. Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).
  20. Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).
  21. Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA. Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).
  22. Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA. Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).
  23. Collins, A. R., Cadet, J., Möller, L., Poulsen, H. E., Viña, J. Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells. Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).
  24. Badouard, C., Ménézo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. Determination of new types of DNA lesions in human sperm. Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).
  25. Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features. Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).
  26. Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH), 2015 Mar 1, San Diego, CA, , Available at: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf (2015).

Tags

כימיה גיליון 102 סטרס חמצוני נזק לדנ"א 8-אוקסו-7,8-Dihydro-2'-deoxyguanosine 8-2'-deoxyguanosine הידרוקסי Xenobiotic מטבוליזם בריאות אדם
HPLC המדידה של ה- DNA חמצון ביומרקר, 8-אוקסו-7,8-Dihydro-2&#39;-deoxyguanosine, בתאים בתרבית ורקמות בעלי החיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chepelev, N. L., Kennedy, D. A.,… More

Chepelev, N. L., Kennedy, D. A., Gagné, R., White, T., Long, A. S., Yauk, C. L., White, P. A. HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2’-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues. J. Vis. Exp. (102), e52697, doi:10.3791/52697 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter