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Chemistry

डीएनए ऑक्सीकरण biomarker के HPLC मापन, 8-ऑक्सो-7,8-Dihydro-2'-deoxyguanosine, संवर्धित कोशिकाओं और जानवरों के ऊतकों में

Published: August 1, 2015 doi: 10.3791/52697
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Environmental Health Science and Research Bureau, Health Canada

Summary

इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य डीएनए ऑक्सीकरण मार्कर का पता लगाना है, 8-ऑक्सो-7,8-Dihydro-2'-deoxyguanosine संवर्धित कोशिकाओं या जानवरों के ऊतकों से डीएनए में (8-ऑक्सो-dGuo) एचपीएलसी-प्रवर्तन निदेशालय द्वारा,।

Abstract

ऑक्सीडेटिव तनाव डीएनए सहित Biomacromolecules के ऑक्सीकरण, के लिए अग्रणी, कई शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं, साथ ही xenobiotic चयापचय के साथ जुड़ा हुआ है। इसलिए, डीएनए ऑक्सीकरण की कुशल पता लगाने चिकित्सा और विष विज्ञान सहित अनुसंधान विषयों की एक किस्म के लिए महत्वपूर्ण है। Oxidatively क्षतिग्रस्त डीएनए के एक आम बायोमार्कर 8-ऑक्सो-7,8-Dihydro-2'-deoxyguanosine (8-ऑक्सो-dGuo है, अक्सर ग़लती के रूप में भेजा 8-हाइड्रोक्सी-2'-deoxyguanosine (8 ओह dGuo या 8 -oxo-डीजी))। विद्युत का पता लगाने (एचपीएलसी-ईडी) के साथ उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा 8-ऑक्सो-dGuo माप के लिए कई प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। हालांकि, इन मुख्य रूप से समर्थक oxidants के साथ इलाज शुद्ध डीएनए के लिए लागू किया गया था। इसके अलावा, की वजह से मुख्य रूप से विश्लेषणात्मक उपकरणों में अंतर करने के लिए प्रयोगशालाओं के बीच पद्धति मतभेद,, एचपीएलसी-प्रवर्तन निदेशालय द्वारा 8-ऑक्सो-dGuo का पता लगाने के लिए प्रकाशित तरीकों को अपनाने के प्रत्येक प्रयोगशाला से सावधान अनुकूलन की आवश्यकता है। एइस तरह के एक अनुकूलन प्रक्रिया का वर्णन व्यापक प्रोटोकॉल, कमी है। इधर, एक विस्तृत प्रोटोकॉल संवर्धित कोशिकाओं या जानवरों के ऊतकों से डीएनए में, एचपीएलसी-प्रवर्तन निदेशालय द्वारा 8-ऑक्सो-dGuo का पता लगाने के लिए वर्णित है। यह डीएनए नमूना तैयार आसानी से और तेजी से नमूना तैयार करने के दौरान हो सकता है कि अवांछनीय डीएनए ऑक्सीकरण को कम से कम करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है दिखाता है कि कैसे। इस प्रोटोकॉल ऑक्सीकरण एजेंट KBrO 3 के साथ इलाज किया सुसंस्कृत मानव वायुकोशीय ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं (यानी, A549 कोशिकाओं) में 8-ऑक्सो-dGuo पता लगाने, और POLYCYCLIC सुरभित हाइड्रोकार्बन dibenzo (डीईएफ़, पी) chrysene के संपर्क में चूहों की तिल्ली से करने के लिए कैसे पता चलता है (पूर्व dibenzo (ए, एल) pyrene रूप में जाना जाता डीबीसी, DalP)। कुल मिलाकर, यह काम एक HPLC-प्रवर्तन निदेशालय कार्यप्रणाली आसानी से जैविक नमूने में 8-ऑक्सो-dGuo का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है दिखाता है कि कैसे।

Introduction

जिसका स्थिर राज्य स्तर कई रोग की स्थिति और xenotoxic चयापचय के दौरान बढ़ा सकते हैं रिएक्टिव ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस), ऑक्सीडेटिव डीएनए की क्षति की एक वृद्धि की आवृत्ति के लिए योगदान करते हैं। कई संभव nucleobases ऑक्सीकरण उत्पादों के अलावा, ऑक्सीडेटिव डीएनए की क्षति आसानी से स्थिर मार्कर का उपयोग करके मापा जा सकता है 8-ऑक्सो-7,8-Dihydro-2'-deoxyguanosine 2 का ऑक्सीकरण रूपों में से एक है जो (8-ऑक्सो-dGuo), ' -deoxyguanosine (dGuo) 1। 8-ऑक्सो-dGuo इसलिए, कई डीएनए ऑक्सीकरण उत्पादों 3 के अस्तित्व के बावजूद एक डीएनए ऑक्सीकरण बायोमार्कर के रूप में अधिक से अधिक विस्तार करने के लिए अध्ययन किया गया है, सबसे प्रचुर मात्रा में डीएनए घाव 2 और। इंसानों में, इस नुकसान 8 oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1) 4 से बेस छांटना मरम्मत के माध्यम से ठीक किया जा सकता। गैर-मरम्मती के लिए छोड़ दिया है, 8-ऑक्सो-dGuo आधार जोड़ी-प्रतिस्थापन म्यूटेशन के गठन (यानी, जी transversions टी करने के लिए) के लिए योगदान कर सकते हैं 4। महत्वपूर्ण बात है, 8-ऑक्सो-dGuo की स्थापना की एक मार्कर के लिए हैदीक्षा और कैंसरजनन 2 की पदोन्नति के संबंध में आर डीएनए की क्षति। इसलिए, 8-ऑक्सो-dGuo की सही मात्रा का ठहराव ऑक्सीडेटिव डीएनए की क्षति 5 का एक उपयोगी और वांछनीय बायोमार्कर है।

इसके अलावा, यौगिक (ओं) का सही नाम नियमित ऑक्सीडेटिव डीएनए की क्षति 6 के एक बायोमार्कर के रूप में मापा oxidatively क्षतिग्रस्त 2-deoxyguanosine के रूपों और, के लिए सही नाम के बारे में साहित्य में बड़े पैमाने पर भ्रम की स्थिति है। 8-ऑक्सो-dGuo (चित्र 1 में दिखाया गया है) के 6,8-diketo और 6-enol, 8-कीटो tautomeric रूपों साहित्य 5,7 में चर्चा की दो सबसे प्रमुख tautomers हैं। 6,8-diketo फार्म 7.4 के शारीरिक पीएच पर सबसे प्रमुख रूप है, और सबसे प्रमुख डीएनए ऑक्सीकरण उत्पाद 7 है। इसलिए, 8-ऑक्सो-dGuo, बजाय 8-हाइड्रोक्सी-dGuo इस ऑक्सीकरण उत्पाद 6 के लिए सबसे उपयुक्त नाम है। बल्कि यह nucleob की तुलना में, कि 2-deoxyguanosine (dGuo) नोट करने के लिए भी महत्वपूर्ण हैएएसई गुआनिन (गुआ) या ribonucleoside ग्वानोसिन (गुओ), क्रमशः, सबसे विधियों 6 से पता चला है।

सटीक पहचान और 8-ऑक्सो-dGuo की मात्रा का ठहराव की वजह से चुनौती दे रहा है: डीएनए नमूने के पाचन में मैं) परिवर्तनशीलता, द्वितीय) आकस्मिक नमूना तैयार करने के दौरान हो सकता है कि 8-ऑक्सो-dGuo को dGuo के ऑक्सीकरण, और तृतीय) की आवश्यकता विश्लेषणात्मक एचपीएलसी-प्रवर्तन निदेशालय विधि 8 के प्रभावी सत्यापन के लिए। इस प्रोटोकॉल में, हम पूरी डीएनए पाचन के लिए अनुकूल और द्वितीय) में शामिल किए जाने धातु chelator और chelator इलाज समाधान और एक विशेष डीएनए को अलग अभिकर्मक ने तीन) केवल आंशिक रूप से शामिल किए जाने से संबोधित किया गया था, जबकि स्थिति, उपलब्ध कराने के द्वारा मैं) को प्राप्त करने के उद्देश्य से सकारात्मक नियंत्रण है और इस प्रकार विधि जैविक नमूने में 8-ऑक्सो-dGuo पता लगाने में सक्षम है कि प्रदान करते हैं। आगे मान्यता इस पत्र के दायरे से बाहर है। हालांकि, हम इस प्रोटोकॉल भावी मदद मिलेगी कि विश्वास कर रहे हैंउपयोगकर्ताओं के लिए जो वे औपचारिक रूप से अपने उद्देश्यों पर निर्भर करता है, प्रोटोकॉल को मान्य करने की आवश्यकता करने के लिए सीमा निर्धारित। विधि की औपचारिक सत्यापन के लिए आवश्यक कदम की एक सूची आगे प्रदान की जाती है। 8-ऑक्सो-dGuo का पता लगाने के लिए एक विधि का विकास और तैनाती के दौरान प्रकाशित तरीकों की समीक्षा की और समेकित थे। इस प्रकार, इस विधि 8-ऑक्सो-dGuo का पता लगाने और मात्रा का ठहराव के लिए विधि सफलतापूर्वक अपनाया गया है तो भी परीक्षण के लिए तेजी से और सीधा साधन उपलब्ध कराने, जबकि अक्सर महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक विवरण की कमी है कि कई प्रकाशित स्रोतों से जानकारी इकट्ठा करने के लिए की आवश्यकता समाप्त। यह अनुकूलित विधि सफलतापूर्वक संवर्धित कोशिकाओं और murine ऊतकों से डीएनए नमूने का विश्लेषण करने के लिए नियुक्त किया गया था। इस वीडियो लेख एचपीएलसी-प्रवर्तन निदेशालय द्वारा विश्वसनीय पता लगाने और 8-ऑक्सो-dGuo की मात्रा का ठहराव के लिए एक प्रभावी तरीका स्थापित करने में अन्य समूहों की सहायता करेंगे।

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Protocol

सुनिश्चित करें कि सभी पशुपालन, आवास, हैंडलिंग और प्रयोग स्थानीय नियमों और विनियमों का पालन करना और उस प्रयोग प्रोटोकॉल किसी भी अध्ययन शुरू करने से पहले मंजूरी दे दी है। वर्णित प्रयोगों के लिए, जानवरों की देखभाल, हैंडलिंग, और उपचार स्वास्थ्य कनाडा पशु की देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। 'आपूर्तिकर्ताओं जानकारी के लिए "अभिकर्मकों तालिका" देखें।

1. जैविक नमूने का संग्रह

  1. कोशिकाओं या जानवरों के ऊतकों
    1. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, पेनिसिलिन की 100 इकाइयों / एमएल और स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर युक्त F12-कश्मीर मीडिया में मानव वायुकोशीय ग्रंथिकर्कटता A549 कोशिकाओं को विकसित।
    2. एक 10 सेमी प्रति प्लेट लगभग 1 मिलियन कोशिकाओं पर बीज कोशिकाओं। एक प्रयोग के लिए, enzymatic पाचन और HPLC विश्लेषण के लिए कुल 12 प्लेट (एक जैविक दोहराने एक्स चार खुराक प्रति तीन प्लेट) पर्याप्त डीएनए (80 माइक्रोग्राम) प्रदान करने का एक सेट का उपयोग करें।
    3. सेल घनत्व लगभग तुलना में अधिक से अधिक हो जाता हैimately थाली सतह क्षेत्र के 70%, मीडिया को हटाने और फॉस्फेट बफर खारा के 4 मिलीलीटर (पीबीएस), पीएच 7.4 के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें।
    4. सुसंस्कृत पशु कोशिकाओं के लिए, एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में KBrO 3 का उपयोग करें।
      नोट: KBrO 3 एकाग्रता और 8-ऑक्सो-dGuo आवृत्ति के बीच एक सकारात्मक रैखिक संबंध साहित्य 9 में सूचना दी गई है।
    5. पीबीएस में KBrO 3 भंग। सेल संस्कृति माध्यम में अंतिम एकाग्रता संयुक्त राष्ट्र के संपर्क में कोशिकाओं को 8-ऑक्सो-dGuo सापेक्ष में एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण वृद्धि प्राप्त करने के लिए अधिक से अधिक से अधिक 1 मिमी है कि सुनिश्चित करें। श्रृंखला (जैसे, 12 10 सेमी प्लेट) में प्रत्येक थाली करने के लिए KBrO 3 का एक ही एकाग्रता जोड़ें।
    6. 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए प्लेटें सेते हैं। मीडिया निकालें और पीबीएस के साथ एक बार धो लें।
    7. Trypsin समाधान के 1 मिलीलीटर (शेयर एकाग्रता 2.5 ग्राम / एमएल) जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए सेते हैं।
    8. एक एकल 50 मिलीलीटर शंक्वाकार polystyr में सेट प्रत्येक से कोशिकाओं को इकट्ठा करने, 4 मिलीलीटर पीबीएस के साथ धोएं4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,000 XG पर ईन अपकेंद्रित्र ट्यूब, और अपकेंद्रित्र।
    9. पीबीएस निकालें और आगे के विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर सेल गोली की दुकान। कहीं और 10 में वर्णित के रूप में कृत्रिम डीएनए ऑक्सीकरण इसके अलावा, परमाणु अलगाव को कम किया जा सकता है।
  2. जानवरों के ऊतकों
    1. आवश्यकता के रूप में पशुओं को खुराक। इस प्रोटोकॉल के लिए, वयस्क (उम्र के 9 सप्ताह) जैतून का तेल में भंग 20 मिलीग्राम डीबीसी / किलो BW प्रति दिन के साथ लगातार तीन दिनों के लिए दैनिक मौखिक gavage द्वारा पुरुष Muta माउस का इलाज।
      नोट: यह ट्रांसजेनिक पशु बंदरगाहों इंजीनियर ई से λ-जीवाणुभोजी और उत्परिवर्तन रिपोर्टर जीन lacZ कोलाई 11 ट्रांसजेनिक कृंतक उत्परिवर्तन assays के 12 के लिए प्रयोग किया जाता है।
    2. पशु शव-परीक्षा जैसे प्रदर्शन करना, चूहे isoflurane का उपयोग करते हुए और फिर छाती गुहा खोलने के द्वारा पीछा ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से euthanized सकते हैं anesthetized। इसके तत्काल बाद तरल नाइट्रोजन में फ्रीज ऊतकों फ्लैश। विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ऊतकों।
      नोट: उपचार के बाद इच्छामृत्यु के समय एक और महत्वपूर्ण चर हो सकता है (उदाहरण के लिए, डीएनए ऑक्सीकरण चूहे के मस्तिष्क और जिगर 13 में शोर प्रदर्शन के बाद 72 घंटा में अधिक से अधिक था)।

2. डीएनए निकालना, वर्षा और वाश (टिश्यूज 2.2 सीधे आगे बढ़ने के लिए)

  1. ऐसे DNAzol के रूप में डीएनए को अलग एजेंट के 1 मिलीलीटर के साथ एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार polystyrene के अपकेंद्रित्र ट्यूब में एकत्र कोशिकाओं homogenize। समाधान सजातीय है जब तक सेल गोली को फैलाने के लिए एक 1000 μl विंदुक टिप का उपयोग करें। एक नया 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब homogenate स्थानांतरण। 10-20 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं। 2.3 के लिए आगे बढ़ें।
  2. 500 μl डीएनए अलग एजेंट युक्त 1 मिलीलीटर हाथ nonstick कांच homogenizer में ऊतक की 15-20 मिलीग्राम homogenize। धीरे बढ़ाने के लिए और के बारे में 1 मिनट के लिए कम homogenizer; नरम ऊतकों कम समय की आवश्यकता होगी। कोमल उपचार डीएनए की कम बाल काटना सुनिश्चित करता है। के बारे में 10-20 मिनट के लिए बर्फ पर homogenate स्टोर।
  3. गोली10,000 XG पर 10 मिनट के लिए और एक 1.5 मिलीलीटर शंक्वाकार microcentrifuge ट्यूब में 4 डिग्री सेल्सियस के लिए centrifugation द्वारा homogenate।
  4. ध्यान से गोली से संपर्क करने से बचने के लिए सावधान ध्यान दे एक नया 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में जिसके परिणामस्वरूप सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण।
  5. Homogenate के 1 मिलीलीटर प्रति 0.5 एमएल 100% EtOH जोड़कर homogenate से डीएनए वेग। अलग-थलग अभिकर्मक सुनिश्चित करने के लिए ट्यूबों 10 बार पलटना और EtOH पर्याप्त मिलाया जाता है।
  6. इस बिंदु पर, डीएनए वेग (200 μl की एक अधिकतम धारण क्षमता के साथ, उदाहरण के लिए) एक प्लास्टिक विंदुक टिप पर यह स्पूल और फिर एक नया 1.5 मिलीलीटर शंक्वाकार microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरित, चिपचिपा है।
    नोट: त्वरित centrifugation के पृथक डीएनए से किसी भी शेष lysate को दूर करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।
    (डीएनए धो और solubilization)
  7. पृथक डीएनए के लिए 75% EtOH के 1 मिलीलीटर जोड़ें। ट्यूब 10 बार inverting द्वारा अच्छी तरह से डीएनए गोली निलंबित।
  8. ध्यान से ट्यूब से इथेनॉल छानना। गु सुनिश्चित करेंई डीएनए ट्यूब की ओर से चिपक गोली। 1-2 मिनट के लिए खड़ी ट्यूब की दुकान और ट्यूब के नीचे से किसी भी अतिरिक्त EtOH के दूर करने के लिए एक विंदुक का उपयोग करें।
  9. डीएनए एक बार फिर धो दोहराएँ, और (कई महीनों के लिए स्थिर) या तुरंत पाचन के लिए आगे बढ़ना -20 डिग्री सेल्सियस पर EtOH में नमूना की दुकान या तो।
  10. पाचन बफर में डीएनए (नीचे वर्णित) भंग और उसके बाद (यानी, 260 एनएम पर absorbance NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग) मानक स्पेक्ट्रोस्कोपी तरीकों का उपयोग कर यों।

3. enzymatic पाचन

  1. उचित संस्करणों के संयोजन से "पाचन बफर" तैयार अकेले आधार ना फॉस्फेट 50 मिमी के साथ द्विक्षारकीय ना फॉस्फेट (2.0 मिमी KCl, 1.0 मिमी desferal (डीएफओ) और 200 मिमी 2 MgCl युक्त) 50 मिमी की (नमूनों की संख्या के आधार पर पच जा सकता है) (यह भी 2.0 मिमी KCl, 1.0 मिमी डीएफओ और 200 मिमी 2 MgCl युक्त)। प्रत्येक नमूना अकेले आधार 4.0 μl और 17.0 μl द्विक्षारकीय फॉस्फेट समाधान की आवश्यकता है।
    2. <ली> के बारे में 5 मिनट के लिए ट्यूब और हवा शुष्क नमूने के नीचे से किसी भी शेष EtOH के लिए निकालें। डीएनए पूरी तरह से बाहर सूखा नहीं है कि सुनिश्चित करें।
  2. , पाचन बफर के 21.0 μl में 80 माइक्रोग्राम निकाले डीएनए भंग मैं पाचन बफर के 2.0 μl में भंग DNase की 1 यूनिट जोड़ें।
  3. भंवर हल्के से पूरी तरह से मिश्रण को प्राप्त करने और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 घंटे के लिए सेते हैं।
  4. ऊष्मायन अवधि के अंत में, 2.0 मिमी KCl, 1.0 मिमी डीएफओ और 200 मिमी 2 MgCl युक्त द्विक्षारकीय 50 मिमी ना फॉस्फेट समाधान के 216.4 μl जोड़ें।
  5. द्विक्षारकीय के नौ खंडों, 50 मिमी ना फॉस्फेट (2.0 मिमी KCl के साथ, 1.0 मिमी डीएफओ और 200 मिमी 2 MgCl) के साथ पाचन बफर में से एक मात्रा के संयोजन से "पाचन बफर -2" की तैयारी।
  6. फॉस्फोडाइस्टरेज़ की 0.025 इकाइयों (PDE) मैं पाचन बफर -2 के 16.3 μl में एंजाइम जोड़ें। पिपेट ऊपर और नीचे कई सेकंड के लिए, तो हल्के से भंवर पूरी तरह से मिश्रण को प्राप्त करने और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 घंटे के लिए सेते हैं।
  7. 0 जोड़ेंपाचन बफर-2 की 8.0 μl में alkaline फॉस्फेट (एपी) की .4 इकाइयों। पिपेट ऊपर और नीचे कई सेकंड के लिए, तो हल्के से भंवर पूरी तरह से मिश्रण को प्राप्त करने और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 घंटे के लिए सेते हैं। 33.0 μl एचपीएलसी ग्रेड MeOH जोड़ें।
  8. ऑक्सीकरण कम करने के लिए उपयोग करें जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर सही दूर, नीचे वर्णित या दुकान के रूप में, एचपीएलसी पर पचा डीएनए नमूने चलाएँ। नोट: इस तरह के अंतराल के आधार पर कर रहे हैं यहाँ का सुझाव दिया 1.5 घंटा पाचन चरणों समान प्रोटोकॉल पूरा डीएनए पाचन 9 को प्राप्त है कि कहीं और 9 और निष्कर्षों पर सुझाव दिया। इसलिए, यह केवल सीमित कारक पूरा पाचन समय और उस एंजाइम निषेध और नमूना inhomogeneity नगण्य थे प्राप्त करने के लिए मान लिया था कि।

4. एचपीएलसी भागो: मोबाइल चरण, इंस्ट्रुमेंटेशन स्थापना और रखरखाव की तैयारी

  1. सभी बफर समाधान तैयार करने के लिए ultrapure पानी का प्रयोग करें और उच्च बंधन ताकत राल (जैसे, Chelex 100 के साथ इलाज किया: styrene divinylbeiminodiacetate साथ nzene copolymer के उच्च आत्मीयता के साथ chelate संक्रमण धातुओं) नमूना तैयार करने के दौरान धातु संदूषण और डीएनए ऑक्सीकरण कम करने के लिए कि आयनों।
  2. 250 मिमी ना फॉस्फेट बफर, पीएच 6.2 से तैयार करें। 1 के अनुपात का उपयोग करें: द्विक्षारकीय सोडियम फास्फेट की 3.6957 (परिवार कल्याण = 177.99 छ / मोल) सोडियम फास्फेट (परिवार कल्याण = 119.98 छ / मोल) अकेले आधार करने के लिए।
    उदाहरण: इसलिए, एक 3 एल शेयर समाधान के लिए, अकेले आधार का 70.81 जी और द्विक्षारकीय पाउडर के 28.43 छ गठबंधन जैसे करने के लिए पानी जोड़ने के लिए, 2.8 एल और समाधान के पीएच 6.2 सत्यापित करें कि। ध्यान केंद्रित एसिड या ठिकानों से अलग है और नहीं तैयार 250 मिमी मोनो या द्विक्षारकीय सोडियम फास्फेट समाधान के साथ पीएच को समायोजित करें। 10 मिमी KCl की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए KCl के 2.24 छ जोड़ें।
  3. युक्त, कम से कम 1 एल, तीन बोतलों में प्रत्येक मोबाइल चरण तैयार: विलायक बी - एचपीएलसी ग्रेड मेथनॉल, विलायक - बी ultrapure पानी, और विलायक सी - 4.2 कदम से फॉस्फेट बफर। बोतलों में एचपीएलसी मोबाइल चरण की आपूर्ति ट्यूबिंग डालें; remainiएनजी ट्यूब भी बोतलों में से एक (उदाहरण के लिए, समाधान सी) में डूबा हुआ है और वे मिश्रण के लिए आवश्यक नहीं कर रहे हैं, भले ही primed किया जाना चाहिए।
  4. चलाने के दौरान, 2.0 मिमी KCl के साथ 50 मिमी सोडियम फॉस्फेट बफर (पीएच 6.2), और 6% MeOH का अंतिम समाधान प्राप्त करने के लिए 6% विलायक ए, 74% विलायक बी और 20% विलायक सी के रूप में मोबाइल चरण समाधान मिश्रण।
  5. , विद्युत डिटेक्टर से इलेक्ट्रोड को अलग करें यह और इलेक्ट्रोड सफाई समाधान के साथ स्वच्छ संदर्भ और काम कर इलेक्ट्रोड और निर्माता से सिफारिश की चमकाने डिस्क अलग करना। , Ultrapure पानी के साथ साफ सतहों कुल्ला धीरे पानी पोंछ और डिटेक्टर पर सिस्टम बदल से पहले सूखा है सुनिश्चित करते हैं।
  6. डिटेक्टर पुनः और इलेक्ट्रोड के लिए मोबाइल चरण इनलेट कनेक्ट। प्रवाह पर मुड़ें और मोबाइल चरण आउटलेट मोबाइल चरण ट्यूब संलग्न करने से पहले इलेक्ट्रोड को भरने के लिए अनुमति देते हैं। अनुकूलन शुरू करने से पहले एक नया स्तंभ स्थापित करें। सुनिश्चित करें कि स्थापना के लिए उचित दिशा और एफ में हैसभी निर्माता की सिफारिशों OLLOWS।
  7. अच्छी तरह से आगे (जैसे, 1 घंटा) नमूने के HLPC इंस्ट्रूमेंटेशन चालू करें संतुलन अनुमति देने के लिए और आधारभूत शोर को कम करने के लिए विश्लेषण करती है। सुझाव दिया सेटिंग्स के लिए 1 टेबल देखें; वापस दबाव सीमा स्तंभ क्षति से बचने के लिए 3,000 साई करने के लिए सेट किया जाना चाहिए। Degasser चालू करें। पंप भड़काना और विलायक ढाल की स्थापना के साथ आगे बढ़ें।
  8. सूखी प्रधानमंत्री निर्माता के निर्देशों के अनुसार पंपों। एक मोबाइल चरण प्रतिस्थापित किया गया है या ट्यूबिंग इनलेट हवा के संपर्क में है जब लाइनों गीला करने के लिए यह मत करो।
  9. भड़काना डिस्क का पता लगाने और वहाँ एक 10-15 मिलीलीटर की प्लास्टिक सिरिंज डालें। सिरिंज पूरी तरह से लाइन खोलने से पहले डाला जाता है सुनिश्चित करें। खोलने के लिए लाइनों बस एक बारी के लिए डिस्क काउंटर दक्षिणावर्त बारी है।
  10. उपयुक्त एचपीएलसी इंटरफ़ेस चयन के साथ प्रधानमंत्री की शुरुआत करें। धीरे लाइनों में तरल पदार्थ आकर्षित करने के लिए सिरिंज खींच। द्रव बह रहा है एक बार, प्रधानमंत्री पूरा हो गया है; कार्यक्रम करने की अनुमतिभाग समाप्त। सभी लाइनों (यंत्र के आधार पर आम तौर पर चार) के लिए दोहराएँ।
  11. वैकल्पिक रूप से, लाइनों के लिए पहले से ही एक पहले सूखा प्रधानमंत्री से गीला कर रहे हैं जब गीला प्रधानमंत्री (नीचे देखें)।
    नोट: समय की एक बड़ी राशि का उपयोग करता है (उदाहरण के लिए, 2 सप्ताह या अधिक) के बीच बीत गया है, जब एक सूखी प्रधानमंत्री की सिफारिश की है।
  12. 25% एचपीएलसी उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस का उपयोग करने के लिए प्रत्येक मोबाइल चरण विलायक घटकों की संरचना में परिवर्तन करें। इंटरफ़ेस से, फिर, "प्रत्यक्ष फंक्शन" विकल्प का चयन करें "गीले प्रधानमंत्री" विकल्प का चयन करें। यह एक ही समय में प्रधानमंत्री सभी लाइनों होगा।
  13. सब हवा इसे बर्बाद कंटेनर में प्रवेश करती है के रूप में गीला प्रधानमंत्री लाइन को देख कर प्रणाली से बाहर है सुनिश्चित करें। एक अच्छा प्रधानमंत्री के बाद, कोई बुलबुले लाइन में छोड़ दिया जाता है कि यह सुनिश्चित करने के। बुलबुले जारी रहती है तो भड़काना दोहराएँ।
  14. पंप primed है एक बार, एचपीएलसी मोबाइल चरण के लिए आगे बढ़ शुरू करते हैं। मैन्युअल रूप से 6% मेथनॉल (विलायक ए) और 94% करने के लिए मोबाइल चरण की संरचना को बदलने के लिए एचपीएलसी इंटरफेस का प्रयोग करेंपानी (विलायक बी), और 0.9 मिलीग्राम / मिनट के प्रवाह की दर का चयन करें। 5 मिनट के स्तंभ सफाई कदम से किसी भी मेथनॉल खाली करने के लिए अनुमति दें।
  15. 5 मिनट के बाद, 6% मेथनॉल (विलायक ए), 74% पानी (विलायक बी), 20% बफर (विलायक सी) के लिए संरचना को बदलने के 1.0 मिलीग्राम / मिनट के लिए प्रवाह की दर में वृद्धि। तालिका 1 में संक्षेप में, और स्तंभ क्षति से बचने के लिए 3,000 साई वापस करने के लिए दबाव सीमा निर्धारित के रूप में अन्य मानकों सेट करें।
    नोट: एचपीएलसी स्थापना के साथ संभावित समस्याओं बहती आधारभूत, विभाजन शिखर और कम संकेत तीव्रता शामिल हैं। ये आम तौर पर प्रत्येक उपयोग, लगातार इलेक्ट्रोड सफाई के बाद स्तंभ सफाई, और बफर समाधान प्रदूषण से मुक्त कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के द्वारा दूर किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, बात कण या माइक्रोबियल विकास)।
  16. एक स्थिर आधारभूत संकेत प्राप्त करने के बारे में 1-1.5 घंटे के लिए मोबाइल चरण चलाएँ।
  17. साधन सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस का उपयोग करना, 1 टेबल में संकेत दिया और 15 मिनट का समय चलाने के सेट के रूप में चयन करें मापदंडों। सैम इंजेक्षनमिसाल। जटिल नमूने के लिए बढ़ा रन बार का उपयोग करें (15 मिनट के अंतराल से परे चोटियों की उपस्थिति या अनुपस्थिति देख कर अनुभव से यह निर्धारित)।
    नोट: साधन सॉफ्टवेयर autosampling के लिए नमूना रन शर्तों के प्रोग्रामिंग और सेटअप की अनुमति देता है।
  18. रन पूरा कर लिया गया है, के बाद डिटेक्टर के इंटरफेस का उपयोग कर डिटेक्टर सेल बंद कर देते हैं। यह अनुचित हैंडलिंग के रूप डिटेक्टर नीचे शक्ति के बारे में निर्माता की सिफारिशों का पालन करें और साधन नुकसान पहुंचा सकता है-बंद करने के लिए महत्वपूर्ण है। साधन को नुकसान पहुंचा सकता है के रूप में यह डिटेक्टर के पीछे स्विचन द्वारा सेल से दूर बारी नहीं है।
  19. मैन्युअल 6% मेथनॉल और 94% पानी के लिए मोबाइल चरण संरचना बदल जाते हैं। 5 मिनट के लिए चलाएं।
  20. मैन्युअल तुरंत, 0.7 मिलीग्राम / मिनट के लिए प्रवाह दर को कम 50% MeOH और 50% पानी के लिए संरचना बदल जाते हैं। कम से कम 20 मिनट के लिए चलाएं। विफलता स्तंभ और डिटेक्टर को नुकसान में परिणाम सकता है की सिफारिश की समय के लिए इस कदम को चलाने के लिए। , प्रवाह बंद करें एकफिर degasser बंद कर देते हैं घ।

मानक 5. तैयारी

  1. ऊपर के चरणों 4.1-4.3 में उल्लिखित के रूप में मोबाइल चरण बफर तैयार करें। यह नमूना इंजेक्शन के बाद भिन्न समाधान के मिश्रण से उत्पन्न चोटियों से बचने के लिए मानकों की तैयारी के लिए एचपीएलसी मोबाइल चरण उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  2. Ultrapure पानी पहले का उपयोग करने के साथ पांच में इस समाधान एक पतला, और अंतिम समाधान 6% MeOH शामिल होना चाहिए।
  3. dGuo स्टैंडर्ड
    नोट: dGuo का पता लगाने के लिए आवश्यक उच्च ऑक्सीकरण संभावित electroactive यौगिकों दखल को मापने का खतरा बढ़ सकता है। इस उदाहरण के लिए, द्वारा सत्यापित किया जा सकता है, एक मानक 260 एनएम dGuo की यूवी का पता लगाने की वक्र और चुनाव आयोग का पता लगाने के साथ बनाया मानक वक्र के लिए यह तुलना। दोनों अच्छी तरह से संरेखित हैं (उदाहरण के लिए, पूरक चित्रा 1) और नमूना मैट्रिक्स प्रभाव को ध्यान में रखा गया है, एक नहीं बल्कि चुनाव आयोग का पता लगाने की तुलना में, 260 एनएम पर यूवी द्वारा dGuo पता लगाने के साथ आगे बढ़ सकते हैं।
    1. DGuo जब तक उच्च गति पर भंवर पूरी तरह घुल। इस प्राथमिक स्टॉक है; कई हफ्तों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    2. माध्यमिक dGuo शेयर (0.5 मिमी) बनाने के लिए, एचपीएलसी मोबाइल चरण के 857 μl में प्राथमिक dGuo शेयर के 143 μl पतला। उपयोग करें जब तक बर्फ पर दुकान और नए सिरे से दैनिक तैयार करते हैं।
    3. एक मानक वक्र बनाने के लिए आगे dilutions बनाओ (उदाहरण के लिए, तालिका 2)। बर्फ पर स्टोर समाधान और नए सिरे से दैनिक तैयार करते हैं। प्रयोगात्मक नमूने के साथ श्रृंखला में चलाने के लिए मानकों।
    4. चलाने से पहले, इष्टतम वोल्टेज खोजने के लिए शेयर के सर्वोच्च एकाग्रता का उपयोग कर डिटेक्टर वोल्टेज भिन्नता है।
  4. 8-ऑक्सो-dGuo स्टैंडर्ड
    1. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 8-ऑक्सो-dGuo की 1.0 मिलीग्राम उपाय। 0.1 मिलीलीटर एचपीएलसी ग्रेड MeOH जोड़ें। 8-ऑक्सो-dGuo जब तक उच्च गति पर भंवर पूरी तरह घुल। यह 8 ऑक्सो-dGuo के प्राथमिक शेयर है। सेव के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोरआम हफ्तों।
    2. एक अलग ट्यूब में, प्राथमिक स्टॉक के 2.9 μl और HPLC मोबाइल चरण बफर, भंवर के 997.1 μl गठबंधन। यह माध्यमिक शेयर (10,000 एनएम) है।
    3. मानक वक्र (250 एनएम) के लिए काम कर रहे एक समाधान बनाने के लिए, माध्यमिक शेयर की 24.4 μl और मोबाइल चरण बफर के 975.6 μl गठबंधन।
    4. एक मानक वक्र बनाने के लिए आवश्यक समाधान प्रदान करने के लिए आगे dilutions प्रदर्शन (जैसे, 3 टेबल)। बर्फ पर स्टोर समाधान और नए सिरे से दैनिक तैयार करते हैं। प्रयोगात्मक नमूनों के साथ चलाने के लिए मानकों।
  5. मात्रा का ठहराव
    1. के लिए वक्र के तहत क्षेत्र एकीकृत दोनों 8-ऑक्सो-dGuo (एचपीएलसी कंप्यूटर इंटरफेस के एक भाग के रूप में, पूरक 2A चित्रा देखें) मानक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर और dGuo।
    2. , मानक की अवस्था का समीकरण का उपयोग करना। मानक वक्र (वक्र (अनुपूरक चित्रा 2 बी) के तहत क्षेत्र बनाम प्रत्येक विश्लेष्य के ज्ञात एकाग्रता का निर्माण 8- के लिए अनुपात की गणनाऑक्सो-dGuo प्रत्येक नमूने के लिए / dGuo।

6. agarose जेल वैद्युतकणसंचलन

नोट: agarose जेल वैद्युतकणसंचलन डीएनए पाचन की पूर्णता को सत्यापित करने के लिए किया जा सकता है।

  1. 750 मिलीलीटर ultrapure पानी में 242 छ Tris आधार (परिवार कल्याण = 121.14) भंग करके, 50x Tris- एसीटेट EDTA (TAE) बफर तैयार करें। 57.1 मिलीलीटर हिमनदों एसिटिक एसिड और 0.5 एम EDTA के 100 मिलीलीटर जोड़ें (पीएच 8.0; EDTA के पूरी तरह से समाधान पीएच जैसे के साथ 8.0, NaOH के लिए निकाला जाता है जब भंग करेंगे) और आरटी पर 1 एल स्टोर के अंतिम मात्रा करने के लिए ultrapure पानी जोड़ने के लिए, का उपयोग करने से पहले इस समाधान 50x पतला।
  2. Agarose की 1 ग्राम वजन और 1-2 मिनट के लिए माइक्रोवेव में 100 मिलीलीटर 1x TAE बफर, हीटिंग में इसे भंग। Agarose उबलते के साथ संपर्क से बचने के लिए चश्मे और सुरक्षा उपकरण पहनें।
  3. (: उत्परिवर्तजन सतर्कता) और agarose जेल चल तंत्र में डालना लगभग 50 डिग्री सेल्सियस तक समाधान शांत हो जाओ, 5 μl ethidium ब्रोमाइड जोड़ें। कंघी डालें।
  4. (मात्रा कंघी आकार पर निर्भर करता है, आम तौर पर, डीएनए नमूने के 10-20 μl भरी हुई है, 6X चल डाई के साथ मिश्रित कल्पना और लदान की सुविधा के लिए), समाधान solidifies रुको जब तक जेल से अधिक TAE बफर डालना और नमूने लोड।
  5. डाई जेल के लगभग 2/3 लंबाई migrates तक जेल चला (उदाहरण के लिए, 45 मिनट के लिए 150 वी पर)। पराबैंगनी प्रकाश के तहत डीएनए बैंड कल्पना।

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Representative Results

dGuo 8-ऑक्सो-dGuo लगभग 6.4 मिनट (2A चित्रा और बी) के एक अवधारण समय था जबकि 4.7 मिनट की एक अवधारण समय है मनाया गया। चित्रा -2 में देखा के रूप में दो analytes के बीच शिखर हाइट्स में लगभग 1,000 गुना अंतर नहीं है। 8-ऑक्सो-dGuo और dGuo के लिए voltammograms +1,1 वी +0,2 की रेंज में काम कर रहे एक संभावित पर चल रहा मानकों के द्वारा प्राप्त किया गया 8-ऑक्सो-dGuo के लिए अधिकतम काम कर संभावित 0.5 वी, और 0.9 होने के लिए निर्धारित किया गया था dGuo के लिए वी (चित्रा 3)। ये क्षमता साहित्य 14,15 में वर्णित अन्य बेजान कार्बन इलेक्ट्रोड के साथ समझौते में हैं। का पता लगाने और 8-ऑक्सो-dGuo और dGuo विद्युत का पता लगाने के गतिशील रेंज की सीमा क्रमश: 8,9, femtomole और nanomole सीमा में होने की सूचना दी है। DGuo और 8-ऑक्सो-dGuo के लिए मानक घटता एक उपयुक्त एकाग्रता रेंज भर में रैखिक का पता लगाने को सुनिश्चित करने और उचित प्रदर्शन करने के लिए दैनिक चलाया जाना चाहिएयंत्र की मंजूरी (चित्रा 4)। मानक घटता एक मानक घटता से उत्पन्न समीकरण से नमूनों में विश्लेष्य एकाग्रता की गणना करने की अनुमति देता है कि ज्ञात विश्लेष्य एकाग्रता (अनुपूरक चित्रा 2) के एक समारोह के रूप में शिखर क्षेत्र की साजिश रचने के द्वारा निर्माण कर रहे हैं।

पूरा डीएनए पाचन 8-ऑक्सो-dGua आवृत्ति और कई जीनोमिक डीएनए पाचन विधियों की सटीक मापन के लिए आवश्यक है 8,15,16 सुझाव दिया गया है। जहां आवश्यक हो, डीएनए निष्कर्षण और पाचन की प्रभावकारिता agarose जेल वैद्युतकणसंचलन (चित्रा 5A) और HPLC-प्रवर्तन निदेशालय (चित्रा 5 ब) का उपयोग कर सत्यापित किया जा सकता है। चित्रा 5 ए में स्पष्ट डीएनए स्मियर के साथ लेन (जैसे, गलियों 2, 4, 6, 9, 11, और 13) पचा डीएनए टुकड़े के साथ नमूने जेल से दूर चला और इस तरह नहीं चल पाता थे जबकि पचाया डीएनए की उपस्थिति का संकेत। चित्रा 5 ब में पठार आगे incubati इंगित करता है किपाचन एंजाइमों के साथ डीएनए के पर 1.5 घंटे के लिए 1.5 घंटे के बाद लगभग पूरा पाचन, सुझाव का पता चला dGuo की अधिक से अधिक राशि में परिणाम नहीं करता परे। इसके अलावा, agarose जेल वैद्युतकणसंचलन और HPLC-प्रवर्तन निदेशालय दोनों यहाँ कार्यरत फॉस्फेट आधारित डीएनए पाचन बफर की उपयोगिता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया। इस बफर अच्छी तरह से एचपीएलसी मोबाइल चरण के लिए मिलान है और रोप्य भिन्न समाधान के मिश्रण को अवांछनीय डिटेक्टर शोर को जन्म देना नहीं है (डेटा) नहीं दिखाया। इसलिए, बफर से स्विच साहित्य में सुझाव दिया है (यानी, Tris-एचसीएल 8) सोडियम फॉस्फेट बफर (चित्रा 5 ए के दाईं ओर बनाम छोड़ दिया है) इस प्रोटोकॉल के लिए सिफारिश की है। डीएनए पाचन के अनुकूलन के लिए अंतर्निहित मान्यताओं एंजाइम निषेध और नमूना inhomogeneity नगण्य थे और जैसा कि ऊपर कहा पाचन समय, केवल सीमित कारक था कि थे कि कृपया ध्यान दें। अधूरा डीएनए पाचन देते होने के लिए बहुत छोटे हैं कि टुकड़ों में हुई एक संभावना है किagarose जेल अवशेष पर cted। इस तरह के एक व्यवस्थित त्रुटि समान रूप से सभी नमूनों को प्रभावित करेगा हालांकि, आगे के प्रयोगों (जैसे, एक radiolabelled समर्थक ऑक्सीडेंट 10 के साथ संवर्धित कोशिकाओं का इलाज) पूरी तरह से इस तरह के एक संभावना को खारिज करने के लिए आयोजित किया जा सकता है।

मानक समाधान के विपरीत, पचा डीएनए, चाहे अलग कक्षों या माउस ऊतकों से, कई अतिरिक्त चोटियों (चित्रा 6A और 6B) का उत्पादन किया। इन 8-ऑक्सो-dGuo और dGuo चोटियों से दूर थे, लेकिन चर्चा में उल्लिखित सत्यापन अभ्यास के एक भाग के रूप में प्रयोगों spiking अतिरिक्त चोटियों (यानी, कारण मैट्रिक्स प्रभाव के लिए नमूना अशुद्धता, उदाहरण के लिए) मात्रा का ठहराव के साथ हस्तक्षेप अगर जांच करने की जरूरत है । 8-ऑक्सो-dGuo शिखर मानक के साथ प्रतिधारण समय के पत्राचार द्वारा पुष्टि की गई; और इसके अलावा, प्रो-ऑक्सीडेंट उपचार कराना पड़ा कि कोशिकाओं या जानवरों से नमूने (चित्रा 7 के लिए 8-ऑक्सो-dGuo शिखर में वृद्धि)। प्रो-ऑक्सीडेंट KBrO 8-ऑक्सो-dGuo गठन 17 की ओर जाता है कि गुआनिन से एक इलेक्ट्रॉन अमूर्त में 3 भाग लेता है। यह समर्थक ऑक्सीडेंट तनाव के अभाव में, 10 7 dGuo प्रति 8-ऑक्सो-dGuo 2.4 अणुओं A549 कोशिकाओं (चित्रा 7A) में पाया गया कि ध्यान देने योग्य है। यह एक वैकल्पिक, एचपीएलसी-प्रवर्तन निदेशालय विधि 9 के संभावित कमियों को संबोधित करने के लिए डिज़ाइन मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कर मनाया A549 कोशिकाओं में पाया 8-ऑक्सो-dGuo / 10 7 dGuo के 4.5 अणुओं के बराबर है। डीबीसी उपचार (यानी, दैनिक 20.0 मिलीग्राम डीबीसी / किलो BW प्रति दिन तीन दिनों के लिए) माउस तिल्ली डीएनए में 8-ऑक्सो-dGuo स्तर में वृद्धि हुई। आरओएस विवो 8 में POLYCYCLIC सुरभित हाइड्रोकार्बन के चयापचय के दौरान उत्पादित करने के लिए जाना जाता है, क्योंकि यह भी एक उम्मीद परिणाम है। निर्बल पशुओं की तिल्ली में 8-ऑक्सो-dGuo के रिश्तेदार का स्तर उत्कृष्ट agreemen में है जो 8.3-9.4 8-ऑक्सो-dGuo / 10 6 dGuo (चित्रा 7B) थे,एचपीएलसी-प्रवर्तन निदेशालय 18 से मानक शर्तों के तहत murine प्लीहा कोशिकाओं में मापा चार 8-ऑक्सो-डीजी अणुओं / 10 6 dGuo की प्रकाशित मूल्यों के साथ टी। आधारभूत ऊपर 8-ऑक्सो-dGuo का स्तर बहुत छोटे हैं कि 6 और 7 शो आंकड़े । डीएनए यहाँ मनाया की तुलना में निचले स्तर ऑक्सीकरण हो जाता है इस प्रकार हैं, 8-ऑक्सो-dGuo के स्तर भावी प्रोटोकॉल उपयोगकर्ताओं द्वारा ध्यान में रखा जाना चाहिए जो आधारभूत से पृथक हो सकता है।

चित्र 1
चित्रा 1. 8-ऑक्सो-dGuo की संरचना और उसके tautomer 8 ओह dGuo। 8-ऑक्सो-dGuo के बजाय 8 ओह dGuo 7.4 पीएच में प्रमुख tautomer है कि ध्यान दें।

चित्र 2
DGuo (ए) और 8-ऑक्सो-dGuo (बी)। एचपीएलसी-एड के लिए चित्रा 2. रिटेंशन टाइम्स chromatograms, या तो dGuo के 10.0 μl इंजेक्शन से प्राप्त (1.0 nmol कुल) या 8-ऑक्सो-dGuo (1,000 fmol कुल) और 0.9 वी (ए) या ​​0.5 वी (बी) में पाया गया। dGuo के लिए अवधारण शिखर लगभग 4.7 मिनट (ए) और कि 8-ऑक्सो-dGuo के लिए गया था लगभग 6.4 मिनट (बी) था। 2-3 मिनट में व्यापक शिखर संभावना इंजेक्शन गड़बड़ी की वजह से और 8-ऑक्सो dGuo की एकाग्रता द्वारा (समान तीव्रता में यानी, हमेशा वर्तमान) अप्रभावित है। (सी) आरोपित chromatograms दो अलग-अलग (ए) में वर्णित इंजेक्शन और से यूवी (260 एनएम) द्वारा पता लगाया (बी)। मानकों के समान रन शर्तों का उपयोग एक ही दिन में चलाए जा रहे थे। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 3. अनुकूलन डिटेक्टर वोल्टेज। DGuo (ए) Voltammogram 0.7-1.1 वी (बी) 8-ऑक्सो-dGuo की Voltammogram की दूरी पर एचपीएलसी-प्रवर्तन निदेशालय विश्लेषण से पता चला (अंतिम एकाग्रता 1 nmol) (अंतिम एकाग्रता 500 fmol) तीन स्वतंत्र प्रयोगों के 0.3-0.7 वी मतलब है की एक श्रृंखला पर एचपीएलसी-प्रवर्तन निदेशालय विश्लेषण से पता चला (एन = 3) मानक विचलन दिखाया ±। कुछ मामलों में त्रुटि सलाखों साजिश रचने प्रतीकों से छोटे हैं।

चित्रा 4
DGuo (ए) और 8-ऑक्सो-dGuo (बी)। इंजेक्शन और 0.9 वी (ए) या ​​0.6 वी पर एचपीएलसी-प्रवर्तन निदेशालय द्वारा मापा गया था dGuo या 8-ऑक्सो-dGuo या तो दस microliters (b के लिए चित्रा 4. मानक वक्र )। तीन स्वतंत्र प्रयोगों का साधन (एन = 3) दिखाया ± मानक विचलन। कुछ मामलों में त्रुटि सलाखों एसएम हैंसाजिश रचने के प्रतीकों से Aller।

चित्रा 5
डीएनए पाचन 5. अनुकूलन चित्रा। Tris-एचसीएल में 8 के रूप में वर्णित (ए) सामन वृषण डीएनए के अस्सी माइक्रोग्राम पचा किया गया था, ग्लाइसिन-एसीटेट बफर (बाएं) या सोडियम फॉस्फेट बफर (दाएं)। Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन (1.0%) 45 मिनट के लिए 150 वी पर चलाया गया था। लेन 1 और 8: डीएनए सीढ़ी; गलियों 2, 4, और 6: पचाया डीएनए; गलियों 3, 5, और 7: पचा डीएनए; गलियों 9, 11, और 13: पचाया डीएनए (फॉस्फेट बफर); 10, 12, और 14 गलियों:। पचा डीएनए (फॉस्फेट बफर) (बी) के सामन वृषण डीएनए (80 माइक्रोग्राम) 50 में, हर कदम प्रति 0.5-2.5 घंटे के लिए DNase मैं, PDE मैं और एपी के साथ incubating द्वारा इस के साथ साथ पचा किया गया था मैग्नीशियम क्लोराइड और डीएफओ युक्त मिमी फॉस्फेट बफर। पचा डीएनए के 7.3 माइक्रोग्राम से युक्त प्रत्येक नमूने के पचास microliters, (यानी, 0.9 वी और 1 मिलीग्राम / मिनट फ़्लो HPLC द्वारा विश्लेषण किया गया थाडब्ल्यू) dGuo पता लगाने के लिए। चित्रा तीन स्वतंत्र प्रयोगों (एन = 3) मतलब की मानक त्रुटि ±। के साधन से पता चलता है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6A
चित्रा 6B
A549 कोशिकाओं, KBrO 3 के साथ इलाज या अनुपचारित से चित्रा संवर्धित कोशिकाओं (ए) या ​​पशु ऊतक (बी) में 8-ऑक्सो-dGuo का पता लगाने के लिए 6. chromatograms। (ए) पचा डीएनए। (बी) डीबीसी की तिल्ली से पचा डीएनए -treated चूहों। चोटियों के कारण गार्ड स्तंभ को हटाने के लिए छोड़ दिया करने के लिए स्थानांतरित कर दिया (कारण तंत्र में दबाव बिल्ड अप करने के लिए, अपनी स्थिति के मानकों के साथ की पुष्टि की थी)। मानक और नमूने समान रन हालत का उपयोग करते हुए एक ही दिन में चलाए जा रहे थे1 मिलीग्राम / मिनट प्रवाह दर और 0.5 और क्रमशः dGuo और 8-ऑक्सो-dGuo, के लिए 0.9 वी एस और 10 मिलीलीटर इंजेक्शन की मात्रा,। क्लिक करें यहाँ एक पैनल का एक बड़ा संस्करण के लिए; यहाँ पैनल बी के लिए।

चित्रा 7
चित्रा जैविक नमूने में 8-ऑक्सो-dGuo 7. मात्रा। चोटियों एकीकृत और मानक घटता (अधिक जानकारी के लिए अनुपूरक चित्र 2 देखें) KBrO 3 (के साथ इलाज किया A549 कोशिकाओं से डीएनए में 8-ऑक्सो-dGuo के स्तर की उपज के लिए की तुलना में थे ए), डीबीसी इलाज चूहों (बी) की तिल्ली से डीएनए में या 8-ऑक्सो-dGuo स्तरों। सितारे (*) सांख्यिकीय महत्व का संकेत (पी <0विचरण का .05, एक तरह से विश्लेषण (एनोवा) (ए), छात्र के टी-परीक्षण (बी))। तीन (ए) या ​​पांच (बी) के मतलब की मानक त्रुटि ± स्वतंत्र प्रयोगों के साधन दिखाए जाते हैं। नमूने एकत्र 4 या 3 दिन के इलाज के बाद 24 घंटे के थे।

मोबाइल फेज़ 50.0 मिमी ना फॉस्फेट बफर, पीएच 6.2, 6% MeOH और 2.0 मिमी KCl युक्त
मोबाइल चरण प्रवाह की दर 1.0 मिलीग्राम / मिनट
स्तंभ प्रकार बंधुआ गोलाकार सिलिका के साथ YMC-बेसिक
स्तंभ की लंबाई 15 सेमी
कॉलम भीतरी व्यास 3.5 मिमी
कॉलम तापमान 35 डिग्री सेल्सियस
डिटेक्टर तापमान 29 डिग्री सेल्सियस
8-ऑक्सो-dGuo के लिए वोल्ट सेटिंग 0.5 वी
DGuo के लिए वोल्ट सेटिंग 0.9 वी
इंजेक्शन की मात्रा 10.0 मिलीलीटर

एचपीएलसी-प्रवर्तन निदेशालय द्वारा पता लगाने और 8-ऑक्सो-dGuo की मात्रा का ठहराव के लिए तालिका 1. साधन मापदंडों।

nmoles 100 एनएम मानक, μl एचपीएलसी मोबाइल चरण, μl कमजोर पड़ने, गुना
5 300 0 1
2.5 150 150 2
1 60 240 5
0.5 30 270 10
0.25 15 285 20
0.1 6 294 50

तालिका 2 </ DGuo के लिए मानक वक्र के मजबूत> तैयार करना।

fmoles 250 एनएम मानक, μl एचपीएलसी मोबाइल चरण, μl कमजोर पड़ने, गुना
2500 300 0 1
1,000 120 180 2.5
500 150 150 5
250 150 150 10
100 120 180 25
50 150 150 50

तालिका 8-ऑक्सो-dGuo के लिए मानक वक्र 3. तैयार करना।

आंकड़ा 8
समर्थन plementary चित्रा विद्युत (ईसी) और dGuo की यूवी-आधारित पता लगाने के 1. तुलना करें। मानक वक्र विद्युत का पता लगाने (ईसी) या यूवी का पता लगाने (260 एनएम) द्वारा dGuo का पता लगाने के लिए बनाया गया था। शिखर क्षेत्रों दोनों तरीकों से लगभग 4.7 मिनट पर dGuo शिखर के लिए एकीकृत किया गया। एन = 3, ± मानक विचलन दिखाए जाते हैं इसका मतलब है।

9 चित्रा
इसके मानक वक्र से dGuo के पूरक चित्रा 2. मात्रा। DGuo की एकाग्रता दिखाया गया है निर्धारित करने के लिए मानक वक्र के उपयोग का एक उदाहरण है। (ए) पीक क्षेत्र मानक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एकीकरण के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। (ख) इस जानकारी का उपयोग किया जाता है नमूने में अज्ञात विश्लेष्य एकाग्रता की गणना करने के लिए लाइन का समीकरण का उपयोग करने के क्रम में एक मानक वक्र का निर्माण करने के लिए।52,697 / 52697fig9large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

8-ऑक्सो-dGuo डीएनए ऑक्सीकरण का एक उपयोगी बायोमार्कर के रूप में सूचित किया गया है, अपने विश्वसनीय मात्रा का ठहराव एक चुनौती बन सकते हैं। कई प्रकाशित तरीकों मौजूद हैं, उनके प्रयोगशालाओं में विधि को तैनात करने के लिए शोधकर्ताओं की अनुमति के लिए प्रोटोकॉल के लिए एक व्यापक, वर्णनात्मक अवलोकन के लिए एक की जरूरत है। यहाँ हम 8-ऑक्सो-dGuo का पता लगाने और मात्रा का ठहराव के लिए एक प्रभावी तरीका स्थापित करने के लिए नए उपयोगकर्ताओं की अनुमति होगी कि एक HPLC आधारित प्रोटोकॉल की एक विस्तृत अवलोकन प्रस्तुत करते हैं।

8-ऑक्सो-dGuo की मात्रा का ठहराव के लिए वर्णित किया गया है कि तीन प्रमुख तरीकों। कहीं और 9 में वर्णित है और इस तरह के रूप में है कि एचपीएलसी-प्रवर्तन निदेशालय के तरीकों, के साथ साथ वर्णित के रूप में ये वाणिज्यिक किट 19 जैसे, तरल क्रोमैटोग्राफी / मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के तरीके ((एलिसा) परख immunosorbent आधारित एंजाइम से जुड़ी शामिल हैं। एलिसा तरीकों के हस्तक्षेप से ग्रस्त कर सकते हैं जैविक नमूने 19 में कुछ यौगिकों के साथ। सामान्य में, परिणामों का उपयोग कर प्राप्त chromatographic तकनीक एलिसा आधारित विधियों 20 के साथ तुलना में 8-ऑक्सो-dGuo मात्रा का ठहराव के लिए और अधिक विश्वसनीय माना जाता है। एमएस आधारित विधियों के साथ एचपीएलसी-प्रवर्तन निदेशालय तरीकों की तुलना में, पूर्व का लाभ अपेक्षाकृत सस्ती उपकरण (एमएस आधारित विधियों के लिए उपकरणों की तुलना में कम महंगा परिमाण की, यानी लगभग एक आदेश) है। पूर्व electroactive यौगिकों के साथ संभावित हस्तक्षेप से ग्रस्त नहीं हैं और आइसोटोप 21 का उपयोग करते हुए स्पष्ट, मात्रात्मक मापन प्रदान के रूप में इसके अलावा, एचपीएलसी एमएस एचपीएलसी-प्रवर्तन निदेशालय तरीकों से बेहतर कर रहे हैं।

चिंताएं 8-ऑक्सो-dGuo मात्रा का ठहराव 22 के लिए प्रयोग की जाने वाली जीनोमिक डीएनए की निकासी के लिए पारंपरिक फिनोल निकासी तरीकों के उपयोग के संबंध में उठाया गया है। कई शोधकर्ताओं मानक फिनोल निष्कर्षण के साथ जुड़े शर्तों आधारभूत स्तर 1,9 बढ़ रही है, इस प्रकार अवांछित dGuo ऑक्सीकरण लागू कर सकते हैं कि उल्लेख किया है। इस समस्या को, सेल और एनिमा पता करने के लिएएल जीनोमिक डीएनए निकाला और एक संशोधित DNAzol प्रोटोकॉल 22 का उपयोग कर शुद्ध किया जा सकता है। DNAzol guanidine thiocyanate की उच्च सांद्रता होते हैं, और पिछले अध्ययनों 9 DNAzol पारंपरिक phenol- और नई-आधारित निष्कर्षण तरीकों की तुलना में प्रयोग किया जाता है जब कम बेसल स्तर 8-ऑक्सो-dGuo गठन का उल्लेख किया है। लोहे chelating यौगिक डीएफओ नमूना तैयार करने के दौरान आरओएस उत्पादन और डीएनए ऑक्सीकरण कम करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। जैसा कि ऊपर बताया गया है, निर्बल A549 कोशिकाओं (चित्रा 7A) में 8-ऑक्सो-dGuo स्तरों एक एमएस आधारित पद्धति 13 द्वारा मापा गया था क्या करने के लिए अत्यधिक समान थे। यह एमएस आधारित विधियों 13 के लिए वर्णित सावधानियों का समावेश एचपीएलसी-प्रवर्तन निदेशालय द्वारा सही 8-ऑक्सो-dGuo मात्रा का ठहराव प्राप्त करने के लिए नमूना तैयार करने और विश्लेषण के दौरान अवांछनीय डीएनए ऑक्सीकरण के न्यूनतम अनुमति दी है कि पता चलता है। 8-ऑक्सो-dGuo के स्तर में गिरावट के द्वारा यहाँ देखा के रूप में प्रो-ऑक्सीडेंट उपचार के बाद शव-परीक्षा या कटाई संस्कृति कोशिकाओं के समय, एक अन्य महत्वपूर्ण कारक हो सकता हैपिछले उपचार (चित्रा 7B) के बाद 24 घंटा बनाम 4 घंटे में तिल्ली में। यह डीएनए की क्षति को खत्म करने के लिए बेस छांटना मरम्मत की सक्रियता की वजह से हो सकता है।

वर्णित विधि के दो स्पष्ट सीमाएं हैं: (1) के डीएनए का नहीं बल्कि बड़ी मात्रा के लिए आवश्यकता (नमूना प्रति के बारे में 80 माइक्रोग्राम तीन तकनीकी प्रतिकृति प्राप्त करने के लिए), और सह-eluting यौगिकों से (2) संभावित हस्तक्षेप। यह केवल एक बहुत छोटा है (यानी, के बारे में 15 मिलीग्राम) तिल्ली (कुल ऊतक के वजन के बारे में 15%) के टुकड़े के लिए ऊतक के लिए पर्याप्त मात्रा में छोड़ने के डीएनए के 80 माइक्रोग्राम प्राप्त करने के लिए पर्याप्त था पाया गया कि अन्य (जैसे, जीन अभिव्यक्ति) विश्लेषण करती है। निकाले डीएनए की राशि artifactual डीएनए ऑक्सीकरण 23,24,25 को प्रभावित करता है कि एक और महत्वपूर्ण पैरामीटर है। इसलिए, हम यहाँ का सुझाव है कि जगह बड़े (~ 80 मिलीग्राम / नमूना) के साथ काम artifactual डीएनए ऑक्सीकरण 25 कम करने के लिए> 30 मिलीग्राम का उपयोग कर के पिछले सिफारिशों के अनुरूप है।इस 2-3 रन के लिए पर्याप्त होना चाहिए के बाद से छोटे ऊतकों (जैसे, हिप्पोकैम्पस) के लिए, एक, 20-30 माइक्रोग्राम डीएनए के साथ शुरू करने के लिए प्रोटोकॉल के नीचे पैमाने सकता है। डीएनए की बड़ी मात्रा में संभवतः पृष्ठभूमि शोर से ऊपर चोटियों के संकल्प में सुविधा होगी, लेकिन इस प्रयोगात्मक होना संभावित हस्तक्षेप पदार्थों की उपस्थिति का एक मामला-दर-मामला आधार पर संबोधित किया जा सकता है सत्यापित करने के लिए रहता है, और यह हमेशा से डीएनए नमूना शामिल करने के लिए आवश्यक है इन विट्रो में या ऑक्सीडेटिव डीएनए की क्षति के लिए प्रेरित करने के लिए जाना जाता है कि एक सकारात्मक नियंत्रण के साथ विवो उपचार में एक साथ (7 चित्रा देखें)।

फॉस्फेट बफ़र्स में फॉस्फेट alkaline फॉस्फेट की गतिविधि को कम करने के लिए सूचित किया गया है, विधि अनुकूलन प्रयोगों (चित्रा 5) फॉस्फेट बफर आसानी से इस्तेमाल किया जा सकता है कि पुष्टि की। फॉस्फेट बफर मोबाइल चरण में निहित है के बाद से, नमूना तैयार करने में इसके उपयोग के प के कारण डिटेक्टर शोर कममिश्रण वेंट। इस प्रकार वोल्टेज, बफर संरचना, डीएनए निष्कर्षण और पाचन अनुकूलित किया गया और सकारात्मक नियंत्रण शामिल थे। इसके अलावा, इन चर आगे अलग-अलग प्रयोगशालाओं द्वारा अनुकूलित किया जा सकता रूपरेखा कैसे एक सारांश प्रदान की जाती है। हमारा लक्ष्य 8-ऑक्सो-dGuo का पता लगाने और मात्रा का ठहराव के लिए एक परख विकसित करने के उद्देश्य विशेषज्ञ प्रयोगशालाओं के लिए उपयोगी हो सकता है कि एक विधि निर्माण करने के लिए किया गया था।

हालांकि, हम विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं के सत्यापन (यानी, आईसीएच Q2 के लिए (मानव उपयोग (आईसीएच) के लिए औषधि के पंजीकरण के लिए तकनीकी आवश्यकताओं के Harmonisation पर अंतर्राष्ट्रीय सम्मेलन द्वारा की सिफारिश की सत्यापन चरणों के तहत उल्लिखित के रूप में विधि का औपचारिक सत्यापन की आवश्यकता है, ध्यान दें कि आर 1) 26)। संक्षेप में, मात्रात्मक सत्यापन के तत्वों को परख की जांच करनी चाहिए: नुकीला-8-ऑक्सो-dGuo के विभिन्न मात्रा के साथ नमूने सहित द्वारा पूरा किया जा सकता है, जो 1) सटीकता (; एक्सटेंशन भर में 2) रेंज और linearity (रैखिक प्रतिक्रियाएंडेड विश्लेष्य एकाग्रता; 3) प्रेसिजन (repeatability और reproducibility); पता लगाने के 4) सीमा (आम तौर पर, बिंदु, जिस पर शोर अनुपात करने के लिए संकेत अधिक से अधिक या 2-3 बराबर है, इस मैट्रिक्स निर्भर) हो सकता है; प्रतिक्रिया कुछ पूर्व निर्धारित स्तरों जैसे 2 एक्स नियंत्रण के मानक विचलन को पूरा करती है, जिस पर 5) quantitation की सीमा (एकाग्रता, मैट्रिक्स पर निर्भर) हो सकता है; साफ समाधान बनाम जटिल नमूने) में विश्लेष्य पता लगाने के लिए 6) चयनात्मकता / विशिष्टता (क्षमता; 7) reproducibility के () अलग ऑपरेटरों के साथ विभिन्न प्रयोगशालाओं में एक ही परिणाम प्राप्त करने की क्षमता; और 8) मजबूती और सिस्टम उपयुक्तता। आईसीएच से सिफारिश की सत्यापन करने के उद्देश्य से यह "अपनी इच्छित प्रयोजनों के लिए उपयुक्त 'है और कई प्रयोगशालाओं की संभावना विभिन्न प्रयोजनों के लिए होगा कि प्रदर्शित करने के लिए है, इस परख के भावी उपयोगकर्ताओं को आवश्यक समझा हद तक इस मान्य करने के लिए होगा। 8-ऑक्सो-dGuo की सटीक मात्रा का ठहराव विष विज्ञान और आणविक चिकित्सा पाप में वांछनीय हैयह कैसे oxidative तनाव की समझ है, और अधिक विशेष रूप से डीएनए ऑक्सीकरण में वृद्धि कर सकते सीई, mechanistically और अनुभव से स्वास्थ्य के प्रतिकूल प्रभाव से जुड़ा हुआ है।

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Acknowledgments

इस शोध स्वास्थ्य कनाडा जीनोमिक्स रिसर्च एंड डेवलपमेंट इनिशिएटिव (GRDI) और जैव प्रौद्योगिकी के लिए नियामक कनाडा रणनीति (CRSB) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। लेखकों के हितों का कोई विवाद नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
8-oxo-dGuo standard Cayman Chemical Company 89320 Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine"; see Fig. 1 and text for details.
Alkaline phosphatase Sigma-Aldrich P5931 From E. coli
Chelex 100 Sigma-Aldrich C7901 Chelates heavy metals
Desferoxamine mesylate Sigma-Aldrich D9533
dGuo standard Sigma-Aldrich D7145
Dibasic sodium phosphate Sigma-Aldrich S9390
DNA from salmon sperm Sigma-Aldrich D1626 Sodium salt
DNase I Sigma-Aldrich D4527 TypeII, from bovine pancreas
DNAzol Invitrogen 10503-27
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma-Aldrich E4884 The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 (e.g. with NaOH)
F12-K media ATCC 30-2004
Foetal bovine serum ATCC 30-2020
Guard column Chromatographic Specialties YBA 99S03 0204GC Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Monobasic sodium phosphate Sigma-Aldrich S9638
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-122
Phosphate buffered saline Invitrogen 15190-250
Phosphodiesterase I enzyme  Sigma-Aldrich P3243 Type II from Crotalus adamaneus venom
Teflon homogenizer Thomas Scientific 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed.
Trypsin Invitrogen 15050-065
YMC-BASIC column with bonded spherical silica Chromatographic Specialties YBA 99S03 1546WT

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References

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रसायन विज्ञान अंक 102 oxidative तनाव डीएनए क्षति 8-ऑक्सो-7,8-Dihydro-2'-deoxyguanosine 8-हाइड्रोक्सी-2'-deoxyguanosine xenobiotic चयापचय मानव स्वास्थ्य
डीएनए ऑक्सीकरण biomarker के HPLC मापन, 8-ऑक्सो-7,8-Dihydro-2&#39;-deoxyguanosine, संवर्धित कोशिकाओं और जानवरों के ऊतकों में
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