Summary
Målet med detta protokoll är att upptäcka DNA oxidation markör, 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxiguanosin (8-oxo-dGuo) med hjälp av HPLC-ED, i DNA från odlade celler eller djurvävnader.
Abstract
Oxidativ stress är förknippad med många fysiologiska och patologiska processer, liksom xenobiotisk metabolism, vilket leder till oxidation av biomakromolekyler, inklusive DNA. Därför är det viktigt för en mängd olika forskningsdiscipliner, inklusive medicin och toxikologi effektiv detektering av DNA oxidation. En vanlig biomarkör av oxidativt skadat DNA är 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxiguanosin (8-oxo-dGuo; ofta felaktigt kallas 8-hydroxi-2'-deoxiguanosin (8-OH-dGuo eller 8 oxo-dG)). Flera protokoll för 8-oxo-dGuo mätning av högtrycksvätskekromatografi med elektrokemisk detektion (HPLC-ED) har beskrivits. Men dessa var i huvudsak tillämpas på renat DNA behandlades med pro-oxidanter. Dessutom, på grund av metodskillnader mellan laboratorier, främst på grund av skillnader i analysutrustning, kräver antagandet av publicerade metoder för detektion av 8-oxo-dGuo av HPLC-ED noggrann optimering av varje laboratorium. ENomfattande protokoll, beskriver en sådan optimering, saknas. Här är ett detaljerat protokoll som beskrivits för detektion av 8-oxo-dGuo genom HPLC-DE, i DNA från odlade celler eller djurvävnader. Det illustrerar hur DNA provberedning kan lätt och snabbt optimeras för att minimera oönskade DNA oxidation som kan inträffa under provberedning. Detta protokoll visar hur man upptäcker 8-oxo-dGuo i odlade humana alveolär adenokarcinomceller (dvs A549-celler) som behandlades med oxidationsmedlet KBrO 3, och från mjälten hos möss som exponerats för polycykliska aromatiska kolväten dibenso (def, p) krysen (DBC, tidigare känd som dibenso (a, l) pyren, DALP). Sammanfattningsvis illustrerar detta arbete hur en HPLC-ED-metodik kan lätt optimeras för detektion av 8-oxo-dGuo i biologiska prover.
Introduction
Reaktiva syrespecies (ROS), vars steady state nivåer kan öka under många patologiska tillstånd och xenotoxic metabolism, bidrar till en ökad frekvens av oxidativ DNA-skada. Bland flera möjliga nukleobaser oxidationsprodukter, kan oxidativ DNA-skada lätt mätas med användning av stabila markör 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxiguanosin (8-oxo-dGuo), som är en av de oxiderade formerna av 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-oxo-dGuo är den vanligast förekommande DNA skada 2, och därför har studerats för att mer i detalj som en DNA-oxidation biomarkör trots att det finns flera DNA-oxidationsprodukter 3. Hos människor kan skadorna repareras via bas excision reparation av 8-oxoguanine glykosylas 1 (hOGG1) 4. Om den lämnas oreparerad, kan 8-oxo-dGuo bidra till bildningen av baspar-substitutionsmutationer (dvs G till T-transversioner) 4. Viktigare är 8-oxo-dGuo en etablerad markör for DNA-skador i samband med inledandet och främjandet av cancer 2. Därför är korrekt kvantifiering av 8-oxo-dGuo en användbar och önskvärd biomarkör av oxidativ DNA-skada 5.
Det finns en utbredd förvirring i litteraturen om rätt namn för oxidativt skadade former av 2-deoxiguanosin och, dessutom, det korrekta namnet på föreningen (s) rutinmässigt mätt som en biomarkör för oxidativ DNA-skada 6. De 6,8-diketo och 6-enol, 8-keto tautomera former av 8-oxo-dGuo (visad i fig 1) är de två mest framträdande tautomerer som diskuteras i litteraturen 5,7. Den 6,8-diketo formen är den mest framträdande formen vid fysiologiskt pH-värde av 7,4, och är den mest framträdande DNA-oxidationsprodukt 7. Därför, 8-oxo-dGuo, är i stället för 8-hydroxi-dGuo den mest lämpliga namnet för denna oxidationsprodukt 6. Det är också viktigt att notera att 2-deoxiguanosin (dGuo), snarare än nucleobASE guanin (Gua) eller ribonukleosid guanosin (Guo), respektive, detekteras av de flesta metoder 6.
Exakt upptäckt och kvantifiering av 8-oxo-dGuo är utmanande på grund av: i) variationen i nedbrytning av DNA-provet, ii) oavsiktlig oxidation av dGuo till 8-oxo-dGuo som kan inträffa under provberedning, och iii) behovet för effektiv validering av analytiska HPLC-ED metod 8. I detta protokoll, vi syftar till att uppnå i) genom att skapa förutsättningar, gynnsamma för fullständig DNA matsmältningen och ii) genom att inkludera metallkelator och kelator behandlade lösningar och en speciell DNA-isolering reagens, medan iii) endast delvis behandlas av införandet av positiva kontroller och således åstadkomma att metoden kan detektera 8-oxo-dGuo i biologiska prover. Ytterligare validering är utanför ramen för denna uppsats. Men vi är övertygade om att detta protokoll kommer att hjälpa blivandeanvändarna avgöra i vilken utsträckning som de behöver för att formellt godkänna protokollet, beroende på deras syften. En lista över åtgärder som krävs för formellt godkännande av metoden tillhandahålls vidare. Under utveckling och spridning av en metod för 8-oxo-dGuo upptäckt, publicerades metoder granskas och konsolideras. Således, denna metod eliminerar behovet av att samla in information från flera publicerade källor som ofta saknar viktiga experimentella detaljer samtidigt som de ger snabba och enkla sätt att testa om metoden för detektion och kvantifiering av 8-oxo-dGuo har antagits med framgång. Detta anpassad metod användes för att framgångsrikt analysera DNA-prov från odlade celler och mus vävnad. Denna video artikeln kommer att hjälpa andra grupper i upprättandet av en effektiv metod för tillförlitlig detektering och kvantifiering av 8-oxo-dGuo av HPLC-ED.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Se till att all djurhållning, inrymmande, hantering och experimenterande följer lokala regler och föreskrifter och att försöksprotokoll är godkända innan påbörjas någon studie. För de beskrivna experiment djuromsorg, hantering och behandling som godkänts av Health Canada Animal Care kommittén. Se "Reagens bordet" för leverantörernas uppgifter.
1. Samla Biologiska Prover
- Celler eller djurvävnader
- Väx mänskliga alveolära adenokarcinom A549-celler i F12-K-medium innehållande 10% fetalt bovint serum, 100 enheter / ml av penicillin och 100 | ig / ml streptomycin.
- Seed celler på cirka 1 miljon celler per 10 cm platta. För varje experiment, använda en uppsättning av 12 plattor totalt (tre plattor per en biologisk replikera x fyra doser) för att ge tillräckligt med DNA (80 ng) för enzymatisk matsmältning och HPLC-analys.
- När celltätheten blir större än ca.imately 70% av plattans ytarea, avlägsna media och tvätta cellerna två gånger med 4 ml av fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,4.
- För odlade djurceller, använder KBrO 3 som en positiv kontroll.
OBS: Ett positivt linjärt samband mellan KBrO 3 koncentration och 8-oxo-dGuo frekvensen har rapporterats i litteraturen 9. - Lös KBrO 3 i PBS. Se till att den slutliga koncentrationen i cellodlingsmediet är större än 1 mM för att erhålla en statistiskt signifikant ökning av 8-oxo-dGuo relativt un-exponerade celler. Tillsätt samma koncentration av KBrO 3 till varje platta i serien (t.ex. 12 10-cm plattor).
- Inkubera plattorna under 3 h vid 37 ° C. Ta bort materialet och tvätta en gång med PBS.
- Tillsätt 1 ml av trypsinlösning (stamkoncentration 2,5 g / ml) och inkubera i 3 min vid 37 ° C.
- Tvätta med 4 ml PBS, samla cellerna från varje uppsättning till en enda 50 ml koniska polystyren-centrifugrör, och centrifugera vid 1000 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Ta bort PBS och lagra cellpelleten vid -80 ° C fram till vidare analys. Artificiell DNA oxidation kan ytterligare minimeras genom nukleär isolering, som beskrivs på annat håll 10.
- Djurvävnader
- Dos djur efter behov. För detta protokoll, vuxen (9 veckors ålder) behandling av manlig Muta mus genom oral sondmatning dagligen under tre på varandra följande dagar med 20 mg DBC / kg kroppsvikt per dag upplöst i olivolja.
OBS: Denna transgena djur hamnar konstruerad λ-bakteriofag och mutation reportergen lacZ från E. coli 11 används för transgena gnagare mutationsanalyser 12. - Utför djur obduktion t.ex. bedövades mössen kan med hjälp av isofluran och sedan avlivas via halsdislokation följt av bröst kavitetsöppningen. Omedelbart flash frysa vävnader i flytande kväve. Förvara vävnader vid -80 ° C tills analys.
OBS: Tidpunkten för eutanasi efter behandlingen kan vara en annan viktig variabel (till exempel, DNA-oxidationen var maximal vid 72 timmar efter exponering för buller i rått hjärna och lever 13).
- Dos djur efter behov. För detta protokoll, vuxen (9 veckors ålder) behandling av manlig Muta mus genom oral sondmatning dagligen under tre på varandra följande dagar med 20 mg DBC / kg kroppsvikt per dag upplöst i olivolja.
2. DNA-extraktion, nederbörd och tvätt (för vävnader gå direkt till 2,2)
- Homogenisera de uppsamlade cellerna i en 50 ml koniskt polystyren centrifugrör med en ml DNA-isolering medel såsom DNAzol. Använd en 1000 mikroliter pipettspets för att dispergera cellpelleten tills lösningen är homogen. Överför homogenatet till en ny 1,5 ml mikrocentrifugrör. Inkubera på is under 10-20 minuter. Fortsätt till 2,3.
- Homogenisera 15-20 mg vävnad i en 1 ml handhållen nonstick glashomogenisator innehållande 500 ul DNA isoleringsmedel. Försiktigt höja och sänka homogenisator under ca 1 min; mjukare vävnader kräver mindre tid. Skonsam behandling ger mindre klippning av DNA. Förvara homogenatet på is under ca 10 till 20 minuter.
- Pellethomogenatet genom centrifugering under 10 min vid 10000 xg och 4 ° C i en 1,5 ml koniskt mikrocentrifugrör.
- Försiktigt överföra den resulterande supernatanten i ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör stor uppmärksamhet för att undvika kontakt med pellets.
- Fällning DNA från homogenatet genom tillsats av 0,5 ml 100% EtOH per 1 ml homogenat. Vänd rören 10 gånger för att säkerställa att isolera reagens och EtOH är tillräckligt blandat.
- Vid denna punkt, är DNA-fällningen viskös, spolen den på en plast pipettspets (t.ex., med en maximal kapacitet att hålla 200 ul) och överfördes därefter i ett annat 1,5 ml koniskt mikrocentrifugrör.
OBS: Snabb centrifugering kan användas för att avlägsna eventuell kvarvarande lysatet från det isolerade DNA: t.
(DNA Tvätta och Solubilisering) - Tillsätt 1 ml 75% EtOH för nämnda, isolerade DNA. Suspendera DNA-pelleten noggrant genom att vända rören 10 gånger.
- Försiktigt dekan etanolen från röret. Se till att the-DNA pelle fastnar på sidan av röret. Förvara rören vertikalt under 1-2 min och använda en pipett för att avlägsna eventuellt överskott av EtOH från botten av röret.
- Upprepa DNA tvätta en gång till, och antingen lagra provet i EtOH vid -20 ° C (stabila under flera månader) eller omedelbart gå vidare till matsmältningen.
- Upplös DNA i digereringsbuffert (beskriven nedan) och sedan kvantifiera med användning av standard spektroskopiska metoder (dvs. absorbans vid 260 nm med användning av Nanodrop spektrofotometer).
3. Enzymatisk Digestion
- Förbered "matsmältningen buffert" genom att kombinera lämpliga volymer (beroende på antalet prover som ska rötas) av 50 mM monobasiskt natriumfosfat (innehållande 2,0 mM KCl, 1,0 mM desferal (DFO) och 200 mM MgCl2) med 50 mM dibasiskt natriumfosfat (som också innehåller 2,0 mM KCl, 1,0 mM DFO och 200 mM MgCl2). Varje prov kräver 4,0 pl enbasiska och 17,0 pl dibasiskt fosfatlösning. <li> Ta bort eventuellt kvarvarande EtOH från botten av röret och lufttorka prover för ca 5 min. Se till att DNA: t inte torka ut helt.
- Lös 80 mikrogram extraherat DNA i 21.0 il av matsmältningen buffert, tillsätt 1 enhet DNas I upplöst i 2,0 pl matsmältningen buffert.
- Vortexa försiktigt för att uppnå noggrann blandning och inkubera i 1,5 h vid 37 ° C.
- Vid slutet av inkubationsperioden, tillsätt 216,4 | il av dibasisk 50 mM Na-fosfatlösning innehållande 2,0 mM KCl, 1,0 mM DFO och 200 mM MgCl2.
- Förbered "matsmältningen buffert-2" genom att kombinera en volym av matsmältningen buffert med nio volymer dibasiskt, 50 mM Na-fosfat (med 2,0 mM KCl, 1,0 mM DFO och 200 mM MgCl2).
- Lägg 0,025 enheter av fosfodiesteras (PDE) Jag enzym i 16.3 il matsmältningen buffert-2. Pipettera upp och ned under några sekunder, sedan virvel lätt att uppnå noggrann blandning och inkubera i 1,5 h vid 37 ° C.
- Lägg 0.4 Enheter alkaliskt fosfatas (AP) i 8,0 pl matsmältningen buffert-2. Pipettera upp och ned under några sekunder, sedan virvel lätt att uppnå noggrann blandning och inkubera i 1,5 h vid 37 ° C. Lägg 33,0 pl av HPLC-kvalitet MeOH.
- Kör digererade DNA-prover på HPLC, såsom beskrivs nedan, på en gång eller förvara vid -80 ° C fram till användning för att minimera oxidation. OBS! 1,5-hr matsmältningen steg föreslås här bygger på sådana intervall föreslog någon annanstans 9 och om resultatet att liknande protokoll uppnå fullständig DNA matsmältningen 9. Därför antogs det att den enda begränsande faktorn för att uppnå fullständig uppslutning var dags och att enzymhämning och prov inhomogenitet var försumbar.
4. HPLC Run: Framställning av mobil fas, instrumentering Setup och underhåll
- Använd ultrarent vatten för att förbereda alla buffertlösningar och behandlades med hög vidhäftning harts (t.ex. Chelex 100: styren divinylbenzene sampolymer med iminodiacetat joner att kelat övergångsmetaller med hög affinitet) för att minimera metallföroreningar och DNA-oxidation under provberedning.
- Bered 250 mM Na-fosfatbuffert, pH 6,2. Använd ett förhållande av 1: 3,6957 dibasiskt natriumfosfat (FW = 177,99 g / mol) till monobasiskt natriumfosfat (FW = 119,98 g / mol).
Exempel: Därför, för en 3 L stamlösning kombinera 70,81 g monobasiskt och 28.43 g dibasisk pulver, tillsätt vatten upp till exempelvis 2,8 L och kontrollera att lösningens pH är 6,2. Justera pH-värdet med 250 mM mono- eller dibasisk natriumfosfatlösningar, som framställts separat och inte genom koncentrerade syror eller baser. Lägg 2,24 g KCl för erhållande av en koncentration av 10 mM KCl. - Förbered mobila fasen i tre flaskor, åtminstone 1 L vardera innehållande lösningsmedel B - HPLC-kvalitet metanol, lösningsmedel - B ultrarent vatten, och lösningsmedlet C - fosfatbuffert från steg 4.2. Sätt HPLC mobil fas matningsslangen in flaskorna; remaining rör måste också doppas i en av flaskorna (t.ex. lösning C) och primas även om de inte behövs för att blanda.
- Under körningen, blanda den mobila fasen lösning 6% lösningsmedel A, 74% lösningsmedel B och 20% lösningsmedel C för att uppnå slutlig lösning av 50 mM natriumfosfatbuffert (pH 6,2) med 2,0 mM KCl och 6% MeOH.
- Lossa elektroden från den elektrokemiska detektorn, isär den och ren referens- och arbetselektroderna med elektrod rengöringsmedel och polerskivor som rekommenderas av tillverkaren. Skölj de rengjorda ytorna med ultrarent vatten, torka av vattnet försiktigt och se till att detektorn är torr innan du slår på systemet.
- Sätt ihop detektorn och anslut den mobila inloppsfasen till elektroden. Sätt på flödet och tillåta den mobila fasen för att fylla upp elektroden innan monteringen utlopps mobila fasen rör. Installera en ny kolumn före start optimering. Försäkra dig om att installationen är i rätt riktning och follows alla tillverkarens rekommendationer.
- Slå på HPLC instrumentering i god tid före (t.ex. 1 timme) analys att tillåta jämvikt och för att minska baslinjen buller. Se tabell 1 för föreslagna inställningar; mottrycket gräns bör sättas till 3000 psi för att undvika kolumn skador. Slå på avgas. Fortsätt med fyllning pumparna och inrätta lösningsmedelsgradient.
- Torr prime pumparna enligt tillverkarens anvisningar. Gör detta för att väta rader när en mobil fas har ersatts eller inloppsslangen är exponerad för luft.
- Leta reda på priming skivan och sätta in en plastspruta 10-15 ml där. Se till att sprutan är helt införd innan du öppnar linjen. För att öppna linjerna vänder helt enkelt skivan moturs för ett varv.
- Starta prime med lämplig HPLC val av gränssnitt. Dra försiktigt sprutan för att dra vätska in i ledningarna. När vätska flödar, är den främsta komplett; låta programmetavsluta körningen. Upprepa för alla linjer (vanligtvis fyra, beroende på instrumentet).
- Alternativt, våt prime då linjerna är redan vätta från en tidigare torr prim (se nedan).
OBS: När en stor del av tiden har förflutit mellan användningarna (t.ex. 2 veckor eller mer), är en torr prime rekommenderas. - Ändra sammansättningen av den mobila fasen komponenter lösningsmedel till 25% vardera med hjälp av HPLC-användargränssnittet. Från gränssnittet, välj "Direct Function" alternativet, välj sedan "Wet Prime" alternativet. Detta kommer prime alla linjer samtidigt.
- Se till all luft är ur systemet genom att observera den våta främsta raden som det kommer in i avfallsbehållare. Efter en bra främsta, se till att inga bubblor finns kvar i ledningen. Om bubblor kvarstår, upprepa priming.
- När pumpen är fylld, börjar flytta HPLC mobil fas. Använd HPLC-gränssnitt för att manuellt ändra sammansättningen av den mobila fasen till 6% metanol (lösningsmedel A) och 94%vatten (lösningsmedel B), och väljer en flödeshastighet av 0,9 ml / min. Låt 5 min för att rensa alla metanol från kolonnen reningssteget.
- Efter 5 minuter, ändra sammansättningen till 6% metanol (lösningsmedel A), 74% vatten (lösningsmedel B), 20% buffert (lösningsmedel C) öka flödeshastigheten till 1,0 ml / minut. Ange andra parametrar som sammanfattas i tabell 1, och ställ in mottrycksgränsen till 3.000 psi för att undvika kolumn skador.
OBS: Potentiella problem med HPLC inställningar inkluderar drivande baslinje, delad topp och minskad signalstyrka. Dessa kan oftast lösas genom att rengöra kolonnen efter varje användning, frekvent elektrod rengöring, och se till att buffertlösningar är fri från föroreningar (t.ex. partiklar eller mikrobiell tillväxt). - Kör den mobila fasen under ca 1-1,5 timmar för att uppnå en stabil baslinje signal.
- Med hjälp av instrumentets programvara gränssnitt väljer parametrar som anges i tabell 1 och ställ användningstid till 15 minuter. Injicera sampel. Använd ökade körtider för komplexa prover (avgöra detta empiriskt genom att observera närvaron eller frånvaron av toppar efter 15 minuters intervall).
OBS: Instrument programvara kan programmering av provkörningen förhållanden och inställningar för autosampling. - Efter försöken har slutförts, stäng av detektorcellen med hjälp av gränssnittet för detektorn. Det är viktigt att följa tillverkarens rekommendationer när det gäller att stänga av detektorn som felaktig hantering och avstängning kan skada instrumentet. INTE stänga av cellen genom att slå på baksidan av detektorn, eftersom detta kan skada instrumentet.
- Ändra den mobila fasen kompositionen till 6% metanol och 94% vatten manuellt. Kör under 5 min.
- Manuellt reducera flödeshastigheten till 0,7 ml / minut, omedelbart ändra sammansättningen till 50% MeOH och 50% vatten. Kör i minst 20 minuter. Underlåtenhet att köra detta steg under rekommenderad tid kan resultera i skador på kolonnen och detektorn. Stäng av flödet, end sedan stänga av avgas.
5. Beredning av standarder
- Förbered buffert mobil fas som beskrivs i steg 4.1-4.3 ovan. Det är viktigt att använda HPLC rörlig fas för beredning av standarder för att undvika toppar som härrör från blandning av olika lösningar efter provinjektion.
- Späd denna lösning en av fem med ultrarent vatten före användning, och den slutliga lösningen måste innehålla 6% MeOH.
- dGuo Standard
OBS: Hög oxidationspotential som krävs för dGuo upptäckt kan öka risken för att mäta störande elektro föreningar. Detta kan verifieras genom att, till exempel, en standardkurva för UV-detektering av dGuo vid 260 nm och jämföra den med den standardkurva som skapats med EG detektion. Om båda ansluter väl (t.ex. Kompletterande Figur 1) och provmatriseffekter har beaktats, kan man fortsätta med dGuo detektion med UV vid 260 nm, snarare än EG upptäckt.- Vortex i hög fart tills dGuo upplöses helt. Detta är den primära lager; lagra vid -20 ° C under flera veckor.
- För att skapa den sekundära dGuo lager (0,5 mM), späd 143 | il av primär dGuo lager i 857 | il HPLC mobil fas. Förvara på is tills användning och förbereda färskt dagligen.
- Göra ytterligare utspädningar för att skapa en standardkurva (t.ex. tabell 2). Butikslösningar på is och förbereda färskt dagligen. Kör standarder i serie med experimentella prover.
- Före att köra, variera detektorspänning med den högsta koncentrationen av beståndet för att hitta en optimal spänning.
- 8-oxo-dGuo Standard
- Mät 1,0 mg 8-oxo-dGuo i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Lägg 0,1 ml HPLC-kvalitet MeOH. Vortex på hög hastighet tills 8-oxo-dGuo upplöses helt. Detta är den primära lager av 8-oxo-dGuo. Förvara vid -20 ° C under sevrala veckor.
- I ett separat rör, kombinera 2.9 il primär lager och 997,1 il HPLC mobil fas buffert, virvel. Detta är den sekundära lager (10 tusen nM).
- För att skapa en fungerande lösning för standardkurvan (250 nM), kombinera 24.4 il sekundär lager och 975,6 il buffert mobil fas.
- Utför ytterligare utspädning för att ge de lösningar som krävs för att skapa en standardkurva (t.ex. tabell 3). Butikslösningar på is och förbereda färskt dagligen. Kör standarder med de experimentella prover.
- Kvantifiering
- Integrera arean under kurvan för både 8-oxo-dGuo och dGuo användning av standardmjukvara (som en del av HPLC-datorgränssnitt, se Tilläggs Figur 2A).
- Konstruera standardkurva (känd koncentration av varje analyt kontra area under kurvan (Kompletterande Figur 2B). Genom att använda ekvationen för standardkurvan, beräkna förhållandet för 8-oxo-dGuo / dGuo för varje prov.
6. Agarosgelelektrofores
OBS: Agarosgelelektrofores kan utföras för att verifiera fullständigheten hos DNA-digerering.
- Förbered 50x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffert, genom att lösa 242 g Trisbas (FW = 121,14) i 750 ml ultrarent vatten. Lägg 57,1 ml isättika och 100 ml av 0,5 M EDTA (pH 8,0; EDTA kommer att fullständigt upplösas när lösningens pH justeras till 8,0 med t ex, NaOH) och tillsätt ultrarent vatten till en slutlig volym på 1 L. Förvaras vid RT, Späd denna lösning 50x före användning.
- Väg upp 1 g av agaros och lös det i 100 ml 1x TAE-buffert, uppvärmning i mikrovågsugn i 1-2 minuter. Använd skyddsglasögon och skyddsutrustning för att undvika kontakt med kokande agaros.
- Kyl lösningen tills ca 50 ° C, tillsätt 5 pl etidiumbromid (försiktighet: mutagen) och häll det i agarosgelen igång apparaten. Sätt kammen.
- Vänta tills lösningen stelnar, häll TAE buffert över gelen och ladda proven (volym beror på kam storlek, typiskt, är 10-20 il DNA-prov laddad, blandat med 6x kör färgämne för att visualisera och underlätta lastning).
- Kör gelen tills färgämnet migrerar ungefär 2/3 av längden av gelén (t ex 45 min vid 150 V). Visualisera DNA-band under UV-ljus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
dGuo observerades ha en retentionstid på 4,7 minuter, medan 8-oxo-dGuo hade en retentionstid av ca 6,4 min (Figur 2A och B). Det är ca 1000-faldig skillnad i topphöjderna mellan de två analyterna, såsom visas i Figur 2C. Voltammogram för 8-oxo-dGuo och dGuo erhölls genom löpande standarder på en arbetspotential inom intervallet 0,2-1,1 V. Den optimala arbetspotential för 8-oxo-dGuo bestämdes till +0,5 V och +0,9 V för dGuo (Figur 3). Dessa potentialer är i överensstämmelse med andra glasartade kolelektroder som beskrivs i litteraturen 14,15. Detektionsgränsen och dynamiskt omfång av 8-oxo-dGuo och dGuo elektrokemisk detektion rapporteras vara i femtomol och nanomol sortiment, respektive 8,9. Standardkurvor för dGuo och 8-oxo-dGuo bör köras dagligen för att säkerställa linjär detektering över ett lämpligt koncentrationsområde och korrekt utföraning av instrumentet (fig 4). Standardkurvor konstrueras genom att plotta topparean som en funktion av känd analytkoncentration (Kompletterande Fig 2) som tillåter en att beräkna analytkoncentrationen i proverna från ekvationen genereras från standardkurvorna.
Fullständiga DNA digere krävs för noggrann mätning av 8-oxo-dGua frekvens och flera genomiska DNA-uppslutningsmetoder har föreslagits 8,15,16. Vid behov kan kontrolleras effekten av DNA-extraktion och nedbrytning med hjälp av agarosgelelektrofores (figur 5A) och HPLC-ED (Figur 5B). Lanes med uppenbar DNA smeta i figur 5A (t.ex. spår 2, 4, 6, 9, 11, och 13) anger närvaron av osmält DNA medan prover med spjälkade DNA-fragment rinna av gel och var därmed oupptäckt. Platån i Figur 5B visar att ytterligare incubatipå av DNA med rötnings enzymer bortom 1,5 h inte resulterar i större mängd dGuo detekteras, vilket tyder på nästan fullständig omsättning efter 1,5 h. Dessutom har både agarosgelelektrofores och HPLC-ED används för att testa användbarheten av den fosfatbaserade DNA-digereringsbuffert som användes här. Denna buffert är väl anpassad till HPLC mobil fas och inte ger upphov till oönskad detektorbrus hänförlig till blandning av olika lösningar (data ej visade). Därför övergången från bufferten föreslagits i litteraturen (dvs Tris-HCI 8) till natriumfosfatbuffert rekommenderas för detta protokoll (vänster kontra höger sida av figur 5A). Observera att de underliggande antagandena för optimering av DNA-digestion var att enzyminhibering och prov inhomogenitet var försumbara och koktiden var den enda begränsande faktorn, enligt ovan. En möjlighet att ofullständig DNA matsmältningen resulterade i fragment som är för små för att vara DETEcted på agarosgelen resterna. Även om ett sådant systematiskt fel skulle påverka alla prover lika, ytterligare experiment (t.ex. behandling av odlade celler med ett radioaktivt märkt pro-oxidant 10) skulle kunna utföras för att fullständigt utesluta denna möjlighet.
Till skillnad från standardlösningar, det digererade DNA, antingen från isolerade celler eller musvävnader, producerade flera ytterligare toppar (fig 6A och 6B). Dessa var långt från de 8-oxo-dGuo och dGuo toppar, men spiking experiment som en del av validerings övningar som beskrivs i diskussionen behövs för att undersöka om ytterligare toppar (dvs. prov förorening på grund av matriseffekter, till exempel) stör kvantifiering . Den 8-oxo-dGuo topp bekräftades genom motsvarighet till retentionstiden med standarden; och dessutom öka i 8-oxo-dGuo toppen för prov från celler eller djur som genomgick pro-oxidant behandling (Figur 7). Pro-oxidant KBrO 3 deltar i en-elektron abstraktion från guanin som leder till 8-oxo-dGuo bildning 17. Det är anmärkningsvärt att i frånvaro av pro-oxidanten stress, var 2.4 molekyler av 8-oxo-dGuo per 10 7 dGuo detekteras i A549-celler (Figur 7A). Detta kan jämföras med 4,5 molekyler av 8-oxo-dGuo / 10 7 dGuo upptäckts i A549-celler som observerats med hjälp av en alternativ, masspektrometri baserat tillvägagångssätt som syftar till att åtgärda eventuella brister i HPLC-ED-metoden 9. DBC behandling (dvs dagligen 20,0 mg DBC / kg kroppsvikt per dag under tre dagar) ökade med 8-oxo-dGuo nivåer i musmjälte DNA. Detta är också ett förväntat resultat, eftersom ROS är känt för att produceras under metabolismen av polycykliska aromatiska kolväten in vivo 8. De relativa nivåerna av 8-oxo-dGuo i mjälten av unstressed djur var 8,3-9,4 8-oxo-dGuo / 10 6 dGuo (Figur 7B), vilket är i utmärkt avtal:t med publicerade värden av fyra 8-oxo-dG-molekyler / 10 6 dGuo mätt i murina mjältceller under standardbetingelser med HPLC-ED-18. Figurerna 6 och 7 visar att nivåerna av 8-oxo-dGuo ovanför baslinjen är mycket små . Alltså, om DNA oxideras till lägre nivåer än vad som observerats här, kan nivåerna av 8-oxo-dGuo vara omöjlig att skilja från baslinjen, vilket bör hållas i åtanke av potentiella protokoll användare.
Figur 1. Struktur av 8-oxo-dGuo och dess tautomer 8-OH-dGuo. Observera att 8-oxo-dGuo snarare än 8-OH-dGuo är den huvudsakliga tautomeren vid pH 7,4.
Figur 2. Retentionstider för dGuo (A) och 8-oxo-dGuo (B). HPLC-ED kromatogram erhölls från 10,0 il injektion av antingen dGuo, (1,0 nmol totalt) eller 8-oxo-dGuo (1.000 fmol totalt) och detekteras vid 0,9 V (A) eller 0,5 V (B). Retentionen toppen för dGuo var ca 4,7 min (A) och att för 8-oxo-dGuo var ca 6,4 min (B). Den breda toppen vid 2-3 min är sannolikt orsakas av injektions störningar och är opåverkad (dvs alltid närvarande vid liknande intensitet) av koncentrationen av 8-oxo dGuo. (C) överlagrade kromatogram från två separata injektioner som beskrivs i (A) och (B) detekterades genom UV (260 nm). Standarderna kördes på samma dag med identiska kör förhållanden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
es / ftp_upload / 52697 / 52697fig3.jpg "/>
Figur 3. Optimera detektorspänningen. (A) voltammogram av dGuo (slutkoncentration 1 nmol) detekterades genom HPLC-DE-analys vid ett intervall av 0,7-1,1 V. (B) voltammogram av 8-oxo-dGuo (slutkoncentration 500 fmol) detekterades genom HPLC-DE-analys vid ett intervall av 0,3-0,7 V. Medel för tre oberoende försök (N = 3) ± standardavvikelse visas. I vissa fall felstaplar är mindre än de plotting symboler.
Figur 4. Standardkurva för dGuo (A) och 8-oxo-dGuo (B). Tio mikroliter av endera dGuo eller 8-oxo-dGuo injicerades och uppmätt genom HPLC-ED på 0,9 V (A) eller 0,6 V (B ). Medel för tre oberoende försök (N = 3) ± standardavvikelse visas. I vissa fall felstaplar är smaller än plottning symboler.
Figur 5. Optimering av DNA-digerering. (A) Åttio mikrogram av lax testiklar DNA digererades såsom beskrivits 8 i Tris-HCl, glycin-acetatbuffert (vänster) eller natriumfosfatbuffert (höger). Agarosgelelektrofores (1,0%) kördes vid 150 V under 45 minuter. Spår 1 och 8: DNA-stege; banorna 2, 4, och 6: osmält-DNA; banorna 3, 5, och 7: digererad DNA; banorna 9, 11 och 13: osmält-DNA (fosfatbuffert); Banorna 10, 12, och 14:. digererad DNA (fosfatbuffert) (B) Salmon testiklar DNA (80 | ig) digererades häri genom inkubation med DNas I, PDE I, och AP för 0,5-2,5 h för varje steg, i 50 mM fosfatbuffert innehållande magnesiumklorid och DFO. Femtio mikroliter av varje prov, innehållande 7,3 | ig av digererat DNA, analyserades med HPLC (dvs 0,9 V och en ml / min flow) för att upptäcka dGuo. Figuren visar hjälp av tre oberoende experiment (N = 3) ± standardfel av medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Kromatogram för 8-oxo-dGuo detektion i odlade celler (A) eller djurvävnad (B). (A) digererade DNA från A549-celler, behandlade eller obehandlade med KBrO 3. (B) digererade DNA från mjälten hos DBC -behandlade möss. Peaks skiftat till vänster på grund av avlägsnandet av skyddskolonn (på grund av tryckuppbyggnad i apparaten, deras ställning bekräftades med standarder). Standarder och prover kördes på samma dag med samma körning skicks och 10 ml injektionsvolymer, vid 1 ml / min flödeshastighet och 0,5 och 0,9 V för dGuo och 8-oxo-dGuo, respektive. Klicka här för en större version av panel A, här för panel B.
Figur 7. Kvantifiering av 8-oxo-dGuo i biologiska prover. Toppar integrerades och jämfördes med standardkurvor (se tilläggs Figur 2 för fler detaljer) för att ge 8-oxo-dGuo nivåer i DNA från A549-celler, behandlade med KBrO 3 ( A), eller 8-oxo-dGuo nivåer i DNA från mjälten hos DBC-behandlade möss (B). Stjärnor (*) indikerar statistisk signifikans (p <00,05, en-vägs variansanalys (ANOVA) (A), t-test (B)). Medel för tre (A) eller fem (B) oberoende experiment ± standardfel för medelvärdet visas. Prover samlades in 4 eller 24 h efter den 3-dagars behandling.
| Mobil fas | 50,0 mM Na-fosfatbuffert, pH 6,2, innehållande 6% MeOH och 2,0 mM KCl |
| Mobil fas flödeshastighet | 1,0 ml / min |
| Kolonntyp | YMC-BASIC med bunden sfärisk kiseldioxid |
| Kolumn längd | 15 cm |
| Kolumn innerdiameter | 3,5 mm |
| Kolonntemperatur | 35 ° C |
| Detektortemperatur | 29 ° C |
| Spänning inställning för 8-oxo-dGuo | +0,5 V |
| Spänningsinställning för dGuo | 0,9 V |
| Injektionsvolym | 10,0 ml |
Tabell 1. Instrument parametrar för detektion och kvantifiering av 8-oxo-dGuo av HPLC-ED.
| nmol | 100 nM standarden, il | HPLC mobil fas, il | Utspädning, vik |
| 5 | 300 | 0 | 1 |
| 2,5 | 150 | 150 | 2 |
| 1 | 60 | 240 | 5 |
| 0,5 | 30 | 270 | 10 |
| 0,25 | 15 | 285 | 20 |
| 0,1 | 6 | 294 | 50 |
Tabell 2. </ Strong> Beredning av standardkurva för dGuo.
| fmol | 250 nM standarden, il | HPLC mobil fas, il | Utspädning, vik |
| 2500 | 300 | 0 | 1 |
| 1000 | 120 | 180 | 2,5 |
| 500 | 150 | 150 | 5 |
| 250 | 150 | 150 | 10 |
| 100 | 120 | 180 | 25 |
| 50 | 150 | 150 | 50 |
Tabell 3. Framställning av standardkurva för 8-oxo-dGuo.
Sup terande Figur 1. Jämförelse av elektro (EG) och UV-baserad detektering av dGuo. Standardkurva skapades för dGuo detektering av elektrokemisk detektion (EG) eller UV-detektion (260 nm). Toppområden integrerades för dGuo topp vid approximativt 4,7 min med båda metoderna. N = 3, medelvärde ± standardavvikelse visas.
Kompletterande Figur 2. Kvantifiering av dGuo från sin standardkurva. Ett exempel på användning av standardkurvan för att bestämma koncentrationen av dGuo visas. (A) topparea kan bestämmas genom integrering med hjälp av standardmjukvara. (B) Denna information används att konstruera en standardkurva för att använda ekvationen för linjen för att beräkna den okända analytkoncentrationen i provet.52697 / 52697fig9large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även 8-oxo-dGuo har rapporterats som en användbar biomarkör av DNA oxidation, kan dess pålitliga kvantifiering utgör en utmaning. Även om flera publicerade metoder finns, det finns ett behov av en omfattande, beskrivande översikt över protokoll för att tillåta forskare att använda metoden i sina laboratorier. Här presenterar vi en detaljerad översikt över ett HPLC-baserat protokoll som kommer att tillåta nya användare att upprätta en effektiv metod för 8-oxo-dGuo detektion och kvantifiering.
Tre viktiga metoder som har beskrivits för kvantifiering av 8-oxo-dGuo. Dessa innefattar enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA) -baserade kommersiella kit 19, vätskekromatografi / masspektrometri (MS) metoder (t.ex., såsom beskrivs på annat håll 9 och HPLC-ED metoder, såsom den som beskrivs häri. ELISA-förfaranden kan drabbas av störningar med vissa föreningar i biologiska prover 19. I allmänhet resultat som erhållits med hjälp av Chromatographic tekniker anses vara mer pålitligt för 8-oxo-dGuo kvantifiering jämfört med ELISA-baserade metoder 20. Vid jämförelse av HPLC-ED metoder med MS-baserade metoder, är fördelen med den tidigare relativt billig utrustning (dvs., ungefär en storleksordning mindre kostsamt än utrustning för MS-baserade metoder). Dessutom, HPLC-MS är överlägsna HPLC-ED metoder eftersom den förstnämnda inte är benägna att eventuella interferenser med elektroaktiva föreningar och ge entydiga kvantitativa mätningar med hjälp av isotoper 21.
Farhågor har framförts när det gäller användningen av traditionella fenolextraktion metoder för utvinning av genomiskt DNA som ska användas för 8-oxo-dGuo kvantifiering 22. Flera forskare har noterat att de villkor som är förknippade med standard fenolextraktion kan införa oönskade dGuo oxidation vilket ökar baslinjenivåer 1,9. För att ta itu med detta problem, cell- och animal genomiskt DNA kan extraheras och renas med användning av ett modifierat DNAzol protokoll 22. DNAzol innehåller höga koncentrationer av guanidintiocyanat, och tidigare studier 9 har noterat lägre basnivå 8-oxo-dGuo bildning när DNAzol används jämfört med traditionell fenol- och Nal-baserade extraktionsmetoder. Den järnkelaterande föreningen DFO användes för att minimera ROS produktion och DNA-oxidation under provberedning. Såsom noterats ovan är de 8-oxo-dGuo nivåer i ostressade A549-celler (figur 7A) var mycket likt det som mättes med en MS-baserad metod 13. Detta tyder på att införlivandet av försiktighetsåtgärder som beskrivs för MS-baserade metoder 13 tillåtna minimering av oönskade DNA oxidation under beredning och analysprov för att uppnå exakt 8-oxo-dGuo kvantifiering av HPLC-ED. Tidpunkt för obduktions eller skörda odlingsceller efter pro-oxidant behandling kan vara en annan viktig faktor, som kan ses här av sjunkande 8-oxo-dGuo nivåeri mjälten vid 24 h vs 4 h efter den sista behandlingen (figur 7B). Detta kan bero på aktivering av basen excision reparation för att eliminera DNA-skada.
De två uppenbara begränsningar av den beskrivna metoden är: (1) kravet på ganska stora kvantiteter av DNA (cirka 80 | j, g per prov för att uppnå tre tekniska replikat), och (2) risken för störningar från sam-eluerande föreningarna. Det visade sig att endast en mycket liten (dvs., ungefär 15 mg) stycke av mjälte (ca 15% av den totala vävnadsvikt) var tillräcklig för att erhålla 80 | j, g av DNA, vilket ger en tillräcklig mängd vävnad för andra (t.ex., genuttryck) analyser. Mängden extraherat DNA är en annan viktig parameter som påverkar artefaktuella DNA oxidation 23,24,25. Därför arbetar med ganska stor (~ 80 mg / prov) som vi föreslår här är i linje med tidigare rekommendationer att använda> 30 mg för att minimera artefaktuella DNA oxidation 25.För mindre vävnader (t.ex. hippocampus), kan man skala ner protokollet att börja med 20-30 mikrogram DNA, eftersom detta bör vara tillräckligt för 2-3 körningar. Större mängder av DNA skulle förmodligen underlätta upplösning av toppar över bakgrundsljud, men detta återstår att experimentellt verifierade Förekomsten av potentiellt störande ämnen kan tas upp på en bedömning från fall till fall, och det är viktigt att alltid inkludera DNA-prov från samtidigt in vitro eller in vivo behandlingar med en positiv kontroll som är känt för att framkalla oxidativ DNA-skada (se figur 7).
Även om fosfat i fosfatbuffertar har rapporterats att minska aktiviteten av alkaliskt fosfatas, metod optimeringsexperiment (Figur 5) bekräftade att fosfatbuffert lätt skulle kunna användas. Eftersom fosfatbuffert ingår i den mobila fasen, dess användning i provberedning minskade detektor buller på grund av solvent blandning. Således spänning, buffertkomposition, DNA-extraktion och matsmältning optimerades och positiva kontroller inkluderades. Dessutom är en sammanfattning beskriver hur dessa variabler kan optimeras ytterligare genom enskilda laboratorierna tillgänglig. Vårt mål var att ta fram en metod som kan vara till nytta för specialiserade laboratorier som syftar till att utveckla en analys för 8-oxo-dGuo detektion och kvantifiering.
Vi noterar dock att formell validering av metoden krävs, som beskrivs i valideringar steg som rekommenderas av den internationella konferensen om harmonisering av tekniska krav för registrering av humanläkemedel (ICH) för validering av analytiska förfaranden (dvs ICH Q2 ( R1) 26). I korthet bör de delar av kvantitativ validering undersöka analysens: 1) noggrannhet (vilket kan åstadkommas genom att inkludera prover med olika mängder av 8-oxo-dGuo spetsade-in, 2) räckvidd och linjäritet (linjär respons över extended analytkoncentration; 3) precision (repeterbarhet och reproducerbarhet); 4) Detektionsgräns (i allmänhet, vid vilken signalbrusförhållandet är större än eller lika med 2-3 punkten, vilket kan vara matrisberoende); 5) kvantifieringsgränsen (koncentration vid vilken svaret uppfyller vissa förutbestämda nivåer, såsom 2 x standardavvikelsen för kontroll, kan vara matrisberoende); 6) selektiv / särskild (förmåga att detektera analyt i komplexa prover kontra fiffiga lösningar); 7) reproducerbarhet (förmågan att få samma resultat i olika laboratorier med olika operatörer); och 8) robusthet och system lämplighet. Eftersom syftet med valideringen rekommenderas av ICH är att visa att det är "lämplig för det avsedda ändamålet" och många laboratorier kommer troligen att ha olika syften, skulle de tilltänkta användarna av denna analys måste bekräfta detta i den utsträckning som det anses nödvändigt. Exakt kvantifiering av 8-oxo-dGuo är önskvärd i toxikologi och molekylär medicin syndce det kan öka förståelsen för hur oxidativ stress, och mer specifikt DNA oxidation, är mekaniskt och empiriskt kopplat till negativa hälsoeffekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denna forskning har finansierats av Health Canada Genomics forskning och utveckling Initiative (GRDI) och den kanadensiska läkemedels strategi för bioteknik (CRSB). Författarna har ingen intressekonflikt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-oxo-dGuo standard | Cayman Chemical Company | 89320 | Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine"; see Fig. 1 and text for details. |
| Alkaline phosphatase | Sigma-Aldrich | P5931 | From E. coli |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | Chelates heavy metals |
| Desferoxamine mesylate | Sigma-Aldrich | D9533 | |
| dGuo standard | Sigma-Aldrich | D7145 | |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| DNA from salmon sperm | Sigma-Aldrich | D1626 | Sodium salt |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | TypeII, from bovine pancreas |
| DNAzol | Invitrogen | 10503-27 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 (e.g. with NaOH) |
| F12-K media | ATCC | 30-2004 | |
| Foetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Guard column | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 0204GC | Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Monobasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | 15190-250 | |
| Phosphodiesterase I enzyme | Sigma-Aldrich | P3243 | Type II from Crotalus adamaneus venom |
| Teflon homogenizer | Thomas Scientific | 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively | Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed. |
| Trypsin | Invitrogen | 15050-065 | |
| YMC-BASIC column with bonded spherical silica | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 1546WT |
References
- Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine. Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).
- Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. 8-hydroxy-2' -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis. J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).
- Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features. J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).
- Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature. Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).
- Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine. Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).
- Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., Møller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA. Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).
- Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3rd, Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair. Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).
- Park, J. -H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).
- Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).
- Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up. Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).
- Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).
- Test No. 488: Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays. , Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD). Available from: http://www.oecd-ilibrary.org (2015).
- Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat. Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).
- European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods. Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).
- Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in the presence of uric acid. Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).
- Ravanat, J. -L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay. Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).
- Kawanishi, S., Murata, M. Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress. Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).
- Tahara, S., Kaneko, T. Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation. Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).
- Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA. Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).
- Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).
- Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA. Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).
- Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA. Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).
- Collins, A. R., Cadet, J., Möller, L., Poulsen, H. E., Viña, J. Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells. Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).
- Badouard, C., Ménézo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. Determination of new types of DNA lesions in human sperm. Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).
- Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features. Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).
- Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH), 2015 Mar 1, San Diego, CA, , Available at: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf (2015).
