Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Taramalı Elektron Mikroskobu Karaciğer Sinüs Endotel Hücreleri Analizi ve Bunların fenestrasyonlar için Standart Yöntemi

Published: April 30, 2015 doi: 10.3791/52698
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2, 1,2,3, 1,2,3
1Centre for Education and Research on Ageing & ANZAC Research Institute, University of Sydney and Concord Hospital, 2Ageing and Alzheimers Institute, Concord Hospital, 3Charles Perkins Centre, University of Sydney
* These authors contributed equally

Introduction

Karaciğer sinusoidal endotelyal hücreleri (LSECs) yüksek hepatik sinusoid duvarını kaplayan endotel farklılaşmış hücrelerdir. LSECs olmayan diyaframlı olan fenestrasyonlar ile delinir, transselüler çapı 50-250 nm gözenekleri. LSECs yüzeyinin% 20 kadar elek plakalar 1-3 (Şekil 1) olarak adlandırılan yüzlerce onlarca gruplar halinde genellikle fenestrasyon, ile kaplıdır. Fenestrasyonlar bir yüksek verimli ultrafiltrasyon sistemi oluşturmak, plazma ve kan ve hepatositler arasında nanosubstrates aktarımını sağlar. Fenestrasyonlar dinamik yapıları vardır - kendi büyüklüğü ve / veya numara hem çeşitli fizyolojik devletler, uyuşturucu ve hastalığa tepki olarak değiştirilebilir. Örneğin, fenestrasyonlar tok halde 4 daha aç bırakılmış daha büyük olan; Hücre yaşlanması ve bir çok hastalık durumunda 7-13 oluşur başına 5,6 ve büyüklüğü bir azalmaya ve fenestrasyonlar sayısı; 2-di-iodoamphetamine fenestrasyon sayısını artırır 1 fenestrasyonuna modüle.

fenestrasyonlar çalışma zordur. sağlam karaciğer dokusu veya kültür LSECs hem daha önce sadece gözlem kullanılarak elektron mikroskobu mümkün olmuştur bu yüzden fenestrasyonlar çapı, geleneksel ışık mikroskobu çözünürlüğü altında yatıyor. taramalı elektron mikroskobu (SEM), en sık SEM binlerce endotel yüzeyi ve ölçüm geniş alanların gözlem için sağlar, çünkü fenestrasyon boyutu, frekans ve gözeneklilik (fenestrasyon delinmiştir LSEC membran yüzdesi) incelemek için kullanılmıştır değil onlarca fenestrasyonlar binlerce eğer. Kendi programını rağmen, rapor sonuçlara yönelik çalışmalar SEM-tabanlıBu tür fenestrasyon boyut, sayı, frekans ve gözeneklilik LSEC parametreleri literatürde (Tablo 1) geniş çapta değişebilir.

Fenestrasyonlar ve elek plakaları sözleşme, kırmak dilate veya numune hazırlanması sırasında birleşme kırılgan yapılardır, bu nedenle dikkatli işleme kendi bütünlüğünü korumak için gereklidir. Artmış perfüzyon basıncı 14; Fiksatif ve tampon 15 yanlış ozmolarite; yetersiz fiksasyon veya fiksasyon süresi; ve post-fiksasyon dehidrasyon ve kurutma hızı ultrastrüktürü korunması müdahale eserler (Şekil 2) üretebilir SEM için işleme her alanlardır. Fenestrasyonlar kaybı ("Defenestration ') ve fenestrasyon çekme indirgenmiş fenestrasyon çapı ve hücre gözeneklilik ile sonuçlanır, kötü tespitin sonucu olarak meydana gelebilir. SEM analizi için numunelerin korunmasını geliştirmek için yöntemler daha önce 15-17 tarif edilmiştir ve tartışılacaktırBurada örnek korunmasını artırmak için nasıl ek ipuçları. Numune korunması temel amaçları LSEC yüzeyi görsel böylece sinüzoidler kan kaldırmak ve yüksek basınç ya da geciktirilmiş tespit birinden LSEC zarar görmesini önlemek için vardır. Portal ven yoluyla fiksatif Whole karaciğer perfüzyon karaciğer fiksasyon için tercih edilen bir yöntemdir. Detaylı olarak tarif edildiği gibi başka bir yerde 16,18 perfüzyon düşük bir basınçta yapılmalıdır (örneğin, H 2 0 10 cm) LSEC basınçla ilgili perfüzyon eserler ve zarar gelmesini önlemek için, tipik olarak, hücre membranında içinde olduğu gibi büyük boşluklar göstermiştir. Başka bir yerde 19 detaylı bir şekilde tarif edildiği gibi Bununla birlikte, makul bir sabitleme genellikle, insan ve hayvanlarda karaciğer biyopsi iğnesi perfüzyon kullanılarak elde edilebilir. Kan örneği üzerinden temizlendi kadar bu teknik, doğrudan dokuya sabitleştirici enjekte içerir ve doku sağlam ve sabitlenir. Elektron mikroskobu için örneklerin Fixation perf olması gerekirkaraciğerleri derece hızlı otolitik süreçleri sonucunda ortaya çıkan ultrastrüktürel değişiklikleri önlemek için kan akımının kesilmesini takiben mümkün olduğunca çabuk ormed.

Biz de eserler dahil en aza indirir ve fenestrasyonlar ölçümünü standartlaştıran görüntü analizi bir yöntem mevcut. Gözeneklilik ve fenestrasyon frekansı için mikrograflar için sinüzoidler seçiminde değişimi, eserlerin görüntü analizi ve hücre alanının ölçümü geçme sonuçlarını büyük farklılıklara yol açmıştır. Değerlendirilmesi ve fenestrasyonları ve veri sunumu için minimum gereksinimleri ölçümü için bir standart yaklaşım açıkça daha önce 4,10,20-31 literatürde ele alınmamıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Hayvanların kullanımını içeren tüm işlemler yerel mevzuata uygun olarak yürütülmektedir. Çalışmalarımız Sydney İl Sağlık İlçe Hayvan Refahı Komitesi tarafından onaylanmıştır. izin prosedürleri, proje ruhsat belgelerinde açıklanan ve her zaman hayvan refahı sağlayacak yönergeleri izleyin edilir. Işin yapıldığı ülkenin hayvan deneyleri mevzuat uyumu sağlayın.

1. Protokol EM sabitleyici Hazırlama için

  1. Sabitleştirici 100 ml için, 65 ° C bir konik bir şişe içinde 25 ml distile su, ısıya paraformaldehit toz 2 g eklenerek manyetik bir karıştırıcı ile sürekli karıştırmak suretiyle paraformaldehid hazırlar.
    NOT: Glutaraldehyde, paraformaldehıt ve sodyum kakodilat tampon tüm tehlikeli maddeler ve her zaman fumehood ele alınmalıdır.
  2. Daha sonra soğumaya bırakın 65 ºC min 2 ısı. Gerekirse, sodyum hidroksit çözeltisi ekleme dropwISE tamamen çözeltinin-berraklaştırılması için karıştırılırken.
    NOT: sodyum hidroksit tehlikeli, dikkatli olun.
  3. EM notu stok glutaraldehit 10 ml, 50 ile 0.2 M sodyum kakodilat tamponu ml sükroz 2 g ekleyin ve bir manyetik karıştırıcı ile karıştırın. 1.0 M CaCl 2 2 ml ekleyin.
  4. Damıtılmış su ile 100 ml'ye solüsyonu yapmadan önce pH 7.4'e ayarlayın. Nihai sabitleyici% 2.5 glutaraldehit,% 2 paraformaldehit, 2 mmol CaCl2, 0.1 M kakodilat tampon içinde% 2 sukroz içermektedir. Toplam Osmolalite 440 mOsmol / L olduğundan emin olun. Preparat 24 saat içinde kullanın.

Karaciğer 2. perfüzyon Fixation

  1. 37 ºC - 35 Sıcak perfüzyon tampon ve fiksatif. kan kaybı tamponu ve fiksatif doğru sıcaklık doku bütünlüğünü sağlamak için yardımcı olur.
  2. 50 mg / kg ketamin ve 5 mg / kg iksilazin tek bir intraperitoneal enjeksiyon ile hayvan anestezi uygulayın.
  3. Hayvan altına alındıktan sonraarka bacak çekilmesi ve kuyruk tutam tarafından değerlendirilen derin anestezi, Y kesi karaciğer ve portal ven ortaya çıkarmak için hayvanın karın künt uçlu makas ile yapılır.
    NOT: Bu ekipman kolayca SEM görülecektir mikroorganizmalar ve genel enkaz ile örneklerin kirlenmesini önlemek için temiz olduğundan emin olun.
  4. Diğer daha distalde karaciğer, karaciğer portal ven yaklaşık bir proksimal iki çok gevşek sütür kravat.
  5. Kanül sabitlemek için .Tighten dikişler (fareler için sıçanlar için 18 G, 22 G) uygun boyutta IV kanül ile portal ven cannulate.
  6. Fosfat tamponlu tuzlu su ile perfüzyon başlar 37 ° C ısıtıldı ve H 2 0 10 cm arasında bir basınçta. PBS içinde 5 ila 20 mi, genellikle karaciğer asıl bulbus olfaktoryusları alındı ​​için gereklidir.
    NOT: hava kabarcıkları da embolizasyon ve basınca sekonder eserler neden olarak kanül bağlı tüpler aracılığıyla karaciğer girmesine izin vermeyin; Hepatositlerde hasar, siPerfüzyon basıncı fazla yüksek ise, nusoids ve LSEC fenestrasyonlar oluşur.
  7. Abdominal ve torakal vena kava tampon karaciğer serbestçe çıkmak için izin Sever. Bu LSECs yüksek geri basınç hasarını önler.
  8. Karaciğer kan ücretsizdir sonra, EM fiksatif ile PBS değiştirin ve karaciğer sertleştirilmiş ve çok solgun kadar, yaklaşık 5 dakika boyunca serpmek.
  9. Perfüzyon durdurun ve 1 sabitlenir karaciğer kesti - keskin neşter kullanılarak 2 mm 3 blok.
  10. 4 ºC'de 72 saat - 24 EM sabitleştirici sonrası düzeltme doku.
    Not: Genellikle, underfixation overfixation daha eserler neden olur.
  11. 4 ºC'de depolama için 0.1 M sodyum kakodilat tampon sonrası düzeltme dönemi izleyen sabitleyici değiştirin.
    NOT: Bu şekilde saklanan örnekler bir (12 aya kadar) önemli zaman döneminde, ancak zamanında ikincil sabitleme için korunacaktır ve sınav En iyi sonuçlar için tavsiye edilir.

3. İğne Perfusion

NOT: İğne sabitleme doğrudan biyopsi karaciğer dokusu içine fiksatif enjekte edilmesini içeren perfüzyon fiksasyon bir çeşididir. sabitleştirici onları asıl bulbus olfaktoryusları alındı ​​ve sabitleştirici doku bloğun tüm teşhir amacıyla kan damarları aracılığıyla temizlenmesi için amaçtır. Bakım basınç yaralanması 18,19 önlemek için düşük enjekte etme basıncını tutmak için alınmalıdır.

  1. Hayvan veya konunun karaciğer küçük bir parça çıkarıp kan ve enkaz kaldırmak için tuzlu suda durulayın.
  2. Ince uçlu bir iğne (tipik olarak bir insülin şırıngası) ile donatılmış bir şırınga halinde normal tuzlu su çizin.
  3. Kan dokusu dışarı kızarmış kadar karaciğere çok yavaş tuzlu su enjekte edilir. Çoklu enjeksiyonlar gerekebilir.
  4. Ince delikli bir iğnesi (tipik bir insülin şırınga) ile donatılmış bir başka şırınga içine EM fiksatif çizin.
  5. Zor ve renk tan hale gelinceye kadar karaciğere çok yavaş fiksatif enjekte edilir. Çoklu püskürtmes gerekebilir.
  6. Keskin bir neşter kullanılarak 2 mm 3 blok - 1 içine sabit karaciğer kesin. 72 saat 4 ° C - 24 EM sabitleştirici kuluçkaya yatmaktadır. İkincil fiksasyon başlamadan önce 0.1 M sodyum kakodilat tamponunda 3 kere yıkayın.

Taramalı Elektron Mikroskobu için 4. Hazırlık

  1. Yıkama örnek 0.1 M sodyum kakodilat tamponunda 3 kez. Lipidler düzeltmek için, sonrası 2 saat süreyle 0.1 M sodyum kakodilat tamponu içinde% 2 osmiyum tetroksit numuneyi düzeltin.
    NOT: glutaraldehit ve osmiyum tetroksit çapraz reaksiyona ve SEM eserler üretmek olarak komple yıkama çok önemlidir.
  2. Dehidrasyonu başlatma etanol artan konsantrasyonlarda örnekleri durulayın. 5 dakika boyunca% 50 etanol içinde ilk durulama; % 70 etanol ile 5 dakika boyunca, sonra 3 kez; % 90 etanol ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın; % 100 etanol içinde 5 dakika için 2 defa yıkayın; ve son olarak% 100 etanol (moleküler elek) içinde 10 dakika boyunca 2 kez yıkayın.
  3. Örneklerinden her etanolü çıkarmak ve fumehood içinde ve heksametildisilazan (HMDS) ile değiştirin ve 10 dakika süre ile bırakın. Doku örneklerinden HMDS 'yi çıkarın ve buharlaşmasına izin verin.
    NOT: Bu nedenle son dehidrasyon aşaması için kullanmadan önce RT ulaşmak için izin yaparken soğuk HMDS oldukça higroskopik olduğunu.
  4. İsteğe bağlı olarak, hemen örnekleri monte veya SEM mount hazır olana kadar bir kurutucu içine yerleştirin.

5. Montaj

NOT: Doğru örnek montaj SEM altında analiz için kullanılabilir açıkça belirlenen sinüzoidler sayısını en üst düzeye çıkaracaktır.

  1. Metal SEM taslakları tabanını Etiket ve taslakları üstüne çift taraflı iletken karbon bandı uygulayın.
  2. Sonraki SEM için en iyi sinüzoidlerin ile yüzeyi tanımlamak için diseksiyon mikroskop kullanılarak örnekleri gözünüzde canlandırın. Saplama karbon bant yüzeyine yukarı o yüzeyi yerleştirin.
  3. Çubuk örnekleri sıkıca saplama, numuneler artık serpme kaplama için hazırız.
ove_title "> 6.. Kaplama

NOT: Bir püskürtme kaplayıcı gerekçesiyle numune iletken metal (altın veya platin) ince bir film ile kaplanması örnek ve elektron ışını hasardan korur. Kaplama ise ilgi çok kalın yapıları gölgede olabilir.

  1. Otomatik ince püskürtme kaplayıcıda vakum odasına yerleştirin taslakları, 45 saniye boyunca rotasyona modu ve otomatik püskürtme kaplama ayarlayın. Ancak altın da uygundur, ince ayrıntılarıyla için platin kaplama kullanın.
  2. Monte karaciğer örneklerinin dış yüzeylerine karbon boya ince bir tabaka sürün kat değil sinüs yüzeyleri özen.
  3. Örnekler platin ile kaplanır ve karbon boya kuruduktan sonra da SEM ile ilgili gözlem için hazırdır. Örnekler bir kurutucu içinde saklanabilir.

7. Tarama Elektron Mikroskobu Kullanımı

  1. Yer taramalı elektron mikroskobu içine numune ve vakum mikroskop dönün. </ Li>
  2. Düşük büyütmede başlanarak numunelerin görünüm için standart mikroskop çalışma prosedürleri kullanarak, giderek artan büyütme.
  3. Mikroskop mesafe, nokta boyutunu ve astigmatizma çalışmak için uygun ayarlanır emin olun.
  4. Tespit bütünlüğü için kontrol edin. LSEC boşluklar çoğunlukla ücretsiz ve 30 ölçüm fenestrasyonlar içeriyorsa - 250 nm çapında bu genellikle o numune hazırlama başarılı olmuştur işaret eder.
  5. Sinüzoidlerinde boşlukların tamamen veya fenestrasyonlar yoksun iseniz numune hazırlama başarılı olmamıştır veya önemli bir patoloji yoktur. Bu durumda, çok ince bir jilet ile örnek dilim ve kesme yüzeyleri kaplanabilir ve başarılı bir şekilde sabit sinüzoidler için analiz edilmiştir.
  6. Yaklaşık 15.000-20.000 × büyütme iyi fiksasyon ve fenestrasyonlar açıkça (görünür nerede genellikle en az 10 fenestrasyonlar içeren enkaz ücretsiz düz LSEC yüzeyleri seçin).
  7. Karaciğer başına en az iki blok kullanılarak, blok farklı alanlarından, karaciğer başına en az 10 sinüzoidler görüntülerini kaydedin. 15.000 10 mikrografları Örnekleme - fenestrasyonlar ölçümü tüm karaciğer temsilcisi olmak için hayvan başına 20.000 × büyütme genellikle yeterlidir.

8. Analiz

NOT: NIH ücretsiz indirebilirsiniz ImageJ yazılım fenestrasyonu çap ve frekans (ölçmek için kullanılmaktadır www.imagej.nih.gov/ij ).

  1. Açık Resim J ve resim (Ekran shot 1) gömülü ölçek çubuğunu kullanarak ölçeği ayarlayın.
  2. Fenestre ve defenestrated alanlar dahil LSEC tüm düz alanı etrafında çokgen ImageJ aracını iz kullanma. Bu yanlış gözenekliliği şişirmek gibi sadece elek plakaları iz yok. Obscuri olabilir hücre yüzeyi üzerinde artıkların herhangi bir büyük parçalar hariçng fenestrasyonlar.
  3. , Fenestrasyonu çapını ölçmek satırı aracını seçerek her fenestrasyon en uzun çapı boyunca bir çizgi takip ve çizgi ölçmek için "m" basın ve "D" kalıcı resmin üzerine çizgi çizmek (berabere). Bu çizgi fenestrasyonu çapı olarak tanımlanır. hat uzunluğu artık ImageJ sonuçları kutunun (Ekran shot 2) satışa sunulacak.
  4. Daha büyük 250 nm üzerindeki LSEC sitoplazmada delikler, hem de fenestrasyonlar tüm boşlukları ölçün. Boşluklar genellikle boşluklar da hastalık ve toksisite sonucu oluşabilir, ancak kötü perfüzyon veya fiksasyon, yansıtan eserler bulunmaktadır. boşluklar verileri daha sonra analiz fenestrasyon parametrelerinin hesaplanması dışında tutulacaktır.
  5. Dairesel olmayan boşluklar alan boşlukları etrafında izleme ve ImageJ kendi alanını hesaplayarak hesaplanmalıdır.
  6. Furthe için bir EXCEL elektronik tabloya ImageJ sonuçları kutusundan verileri yapıştırınr analizi.

9. Hesaplamalar

  1. (Boşluklar ≥ 250 nm boşluklar, dahil değil) Tüm fenestrasyonu çapları ortalama fenestrasyon çapı = ortalama.
  2. R, yarıçap, tek tek fenestrasyon çapı (r = D / 2), aşağıdakileri içeren olmayan boşluklar hesaplanır fenestrasyon alan = πr 2.
  3. Gözeneklilik (%) = (Σ (πr 2) / analiz edilen toplam alan - boşlukların Σ (alan =)) (2 um)) x 100.
  4. Fenestrasyonu frekansı = fenestrasyonlar toplam sayısı / (toplam alan (boşlukların alan) (mikron 2)-Σ analiz.

Fenestrasyonlu Verilerin 10. Sunumu

NOT: fenestrasyonu verilerinin ölçümü de dahil olmak üzere Mümkün yayınlar aşağıdaki bilgileri içermelidir

  1. Kullanılan sınır çapları genellikle (fenestrasyonlar tanımlamak ne doğrulayan bir açıklama ile fenestrasyon çapı,fenestrasyonu frekans (sayı / um 2) ve porozite (%),) nm 50-250 arası.
  2. Boşluklar analizi, fenestrasyon çapı ve ciğer, bloklar, görüntü ve fenestrasyonlar sayısının frekans dağılımı grafiği analize dahil edilmelidir dahil edilip onaylayan bir açıklama.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Taramalı elektron mikroskopisi işlemiyle düşük büyütme ilk görselleştirme çok büyük karaciğer damarları ve sinüzoidlerde (Şekil 1A) gözlemlemek için yeterince büyük bir açık alan ile, karaciğer numunesinin düz bir yüzey ortaya koyar. Montaj saplama doğru karaciğer blok yerleştirme sağlanması Bu nedenle (Şekil 1B) kaçınılmalıdır sinüzoidlerin ve karaciğer Glisson kapsülü net görüntüler elde etmek için gereklidir. Büyütme artan karaciğer yoğun damar yakın denetlenmesine izin verir ve damarları (Şekil 1C) bölmek hepatositlerin tek bir hücre plakaları ortaya koymaktadır. Kötü görüntü kalitesi, kan hücreleri ve enkaz karaciğer sonuçlarının Kötü sabitleme karaciğer (Şekil 1D) görünümünü belirsiz.

Bundan başka büyütme artan LSEC fenestrasyon (Şekil 2A) gözlenmesini sağlar. Bu sinüzoidlerinde corr olması esastır ectly tespit - hepatositlerin plakaları, bazı durumlarda bu tür oryantasyon (Şekil 2B) yardımcı Kanalikülleri safra olarak kan damarları ancak özellikleri gibi görünebilir. Yüksek perfüzyon basıncı, LSEC elek levha birleşmesine sebep olduğu düşünülmektedir endotelyumda büyük boşluklar gibi kusurlara neden olabilir. Bunlar kolayca SEM (Şekil 2C) altında belirlenmiştir. Çekirdeklerin üzerinde doğrudan hücre zarı kaçınmak fenestrasyon yoğunluğu ve gözeneklilik hesaplamalar (Şekil 2D) doğruluğu ile yardımcı olacaktır.

ImageJ ile LSEC analizi LSEC fenestrasyon çapı, yoğunluğu ve frekansı (Şekil 3A) ölçümü sağlar. Bu boyutlar fenestrasyonlar ampirik ölçümünü sağlar ve yaşlanma, hastalık, toksinler ya da tedavilerin (Şekil 3B) ile uyarılan değişiklikleri ölçümleri sağlar.

files / ftp_upload / 52698 / 52698fig1.jpg "/>
SEM ile karaciğer görselleştirme Şekil 1.. (B) Glisson kapsül sinüzoidler tüm ayrıntıları kapsar; (C) Karaciğerin yoğun damarsal ve (A) SEM altında ilk muayene karaciğer sinüzoidlerde ve portal yolu ve merkezi venüllerden de dahil olmak üzere geniş damarları ortaya gemiler arasında yalan hepatositlerin tek hücre plakaları;. (D) daraltılmış sinüzoidler Yoksul tespit sonuçları ve ultrastrüktürel eserlerin geliştirilmesi , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. Karaciğer ultrastrüktür. (A) LSEC fenestrasyonlar kolayca görmek vardır n, iyi sabit bir dokuda (B) iyi korunmuş bir safra kanalcıklarının bir hepatosit yüzeyi (C) yüksek perfüzyon basıncının neden olduğu endotelyumda büyük boşluklar, (d) LSEC çekirdekleri oklarla yüzeyinin altında çıkıntı belirtilmedikçe İnce LSEC ve gözeneklilik analizi alanında dahil edilmemelidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
ImageJ ile LSEC Şekil 3. analizi. (B) Görüntü J analizinden elde edilen verilerle oluşturulan bir frekans histogramı (A) çokgen alet ölçümü ve çizgi aracı fenestrasyonu çapını ölçmek için kullanılır genel alanın ölçümünü sağlar.2698fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Çap (nm) Frekans (UM2 başına) Gözeneklilik (%) Referans
na na 60 ± 12 20
127 ± 4 nm 6.5 ± 0.5 4.6 ± 0.4 21
na na 40.5 22
na 0.6 ± 1.4 0.01 ± 0.03
na 2.5 ± 0.5 0.047 ± 0.012 24
87,25 ± 1.4 na 9.22 ± 0.7 25
100-200 4.49 ± 0.69 2.55 ± 0.54 26
na na 23 ± 2 27
85 ± 17 11 ± 0.4 6.6 ± 0.2 28
na 2.7 ± 1.1 4.1 ± 2.3 10
68 ± 1 8 ± 0.6 3.4 ± 0.2 29
na na 3.9 ± 0.2 30
73.3 ± 0.4 na 2.2 ± 0.2 31
90.7 ± 11.7 8.45 ± 2.43 5.93 ± 2.05 4
110.7 ± 0.25 9 6 3
104.8 ± 0.22 13 8 3

Tablo 1.

Bileşen Yapay doku
Fiksatif ozmolaritesi ve çok düşük tampon (hipotonik) Hücre şişmesi
Fiksatif ozmolaritesi ve çok yüksek tampon (hipertonik) Hücre büzülme
Numune çok büyük boyutu Sabitleme inkübasyon = autolysis / yetersiz fiksasyon sırasında yeterince nüfuz edemez
fiksatif pH ve osmiyum önce tampon az 7.2 veya üzerinde 7,4 Protein denatürasyonu ve yapısal deformiteler
Tespit süresi çok kısa Autolysis
Tespit süresi çok uzun Hücre daralmasına yol açabilir
Yüksek sıcaklık Sabitleme hızı ancak proteinler denatüre olabilir artırır
Düşük sıcaklık Yetersiz fiksasyon
Perfüzyon basıncı çok yüksek Boşluklar, Disse genişleme alanı hepatositlerde vakuoller, elek plakaları kaybı, fenestrasyon çapının genişletilmesi
Mekanik hasar forseps kıyma ve / veya kullanırken Doku fiksatif tarafından yeterince sertleşmiş değilse hücresel yapılarının Kırma
Ölümden sonra fiksasyon, numune biyopsisi veya kan kaybından uzun süreli zaman İskemi, otoliz, boşluk oluşumu, Defenestration
Düşük sabitleştirici inkübasyon hacmi Az 20 kez numune hacmi = blok merkezinde fiksatif ve autolysis yetersiz penetrasyon.
Fixative konsantrasyonu çok yüksek bir Konsantrasyon sabitlemesi ve sabitleştirici nüfuz etme hızını etkiler. Artefact oluşumu.
Sabitleme konsantrasyonu çok düşük Sabitleme işleminden önce fiksatif Tüketilmesi tam üreten hücre kabanr ve diğer eserler olduğunu.
Karaciğerde eksik tespitin İşaretler Hücre blebbing (şişmiş mikrovillusları veya sitoplazmanın kaynaklanan), pencereden fırlatılma, boşluklar, mikrovillus kaybı, şişmiş mitokondri, hücre şişmesi, çökmüş veya sıkıştırılmış sinusoid lümen, sinüs lümeninde kan, düzensiz şekilli hepatosit çekirdekleri
Fiksatif Kan kirlenmesi Fiksatif devre dışı bırakır
Kirli perfüzyon ve hazırlık ekipmanları Enkaz ve bakteri ile kirlenmeyi numune
Kaplamadan sonra kurutucu olmadan numunelerin veya depolama Eksik dehidratasyon Specierkekler şarj-up SEM. Blok karbon boya ekleme şarjı azaltmaya yardımcı olabilir

Yoksul numune ve görüntü kalitesi için Tablo 2. Sorun giderme ipuçları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

doğru ve tekrarlanabilir karaciğer sinüzoidal endotel durumunu ölçmek için yeteneği, bu son derece özel hücrelerin biyolojisinin anlaşılmasında önemli bir adımdır. Böyle yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu 32, atomik kuvvet mikroskobu 33 d-STORM (doğrudan Stokastik Optik Reconstrucion Mikroskopi) 34 gibi daha yeni teknikler in vitro bu hücrelerin morfolojisi hakkında önemli bilgiler vermek, ancak SEM görselleştirmek ve onların yapısını ölçmek için birincil metodoloji kalır Yerinde.

en önemli ve teknik açıdan zorlayıcı bir adım, ilk fiksasyon ise: Karaciğer iyi korunmuş ise sonraki adımlar, karaciğer sinusoid görüntüleri kolayca gözlemlenebilir ve gerçekten güzel üretecek. Tüm karaciğer perfüzyon iyi sabitlenmesini sağlamak için en etkili yöntemdir, ancak karşılaştırılabilir sonuçlar hızla sabit olmuştur iğne perfüzyon örneklerinde mümkündürve düşük basınçta. Susuz karaciğer örnekleri ile su Resorpsiyon zavallı SEM görüntüleri için başka bir ortak nedeni, ama bu kolayca kurutucu ile bir desikatörde örneklerin uygun saklama ile önlenebilir.

Farklı araştırma gruplarından çalışmaları karşılaştırılarak yorumlanmıştır böylece fenestrasyonlar miktarının standartlaştırılması için bir ihtiyaç vardır. Geçmişte bu değerler elde edilmiştir nasıl hakkında çok az metodolojik bilgi yayımlanan değerleri geniş bir varyasyon olmuştur. Burada fenestrasyonu ultrastrüktür tarif değerlerinin tespiti ve sunulması için standart bir yaklaşım sağlamıştır.

Mümkün olduğunda, aşağıdaki bilgileri içermelidir fenestrasyonu verilerinin ölçümü de dahil olmak üzere yayınlar: Kullanılan sınır çapları fenestrasyonlar tanımlamak ne doğrulayan bir açıklama ile Fenestrasyon çapı, (tipik olarak 50 arası - 250 nm); fenestrasyonu frekansı (sayı / &# 181; m2) ve porozite (%); boşluklar analize dahil olup olmadığını doğrulayan bir açıklamada; ve fenestrasyonu çapında bir sıklık dağılımı grafiği. Buna ek olarak, karaciğer, bloklar, görüntü ve fenestrasyonlar sayısı analizi dahil edilmelidir.

Fenestrasyon çapı, frekans ve gözeneklilik karaciğer durumunun önemli göstergeleridir ve bu verilerin toplanmasını standardizasyon alanında yararlı olacaktır. Burada tartışılan yöntemler LSEC ve fenestrasyonlar ultrastrüktürü çalışmaları yapıldı ve farklı araştırma grupları arasında karşılaştırılabilir bir şekilde sunulmaktadır sağlamak için bir çerçeve sunmaktadır. yöntem, kolayca izole edilir ve kültürlenmiş LSECs içinde deliklerinden ölçülmesi için uyarlanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25% EM grade Glutaraldehyde ProSciTech C001 Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze
Paraformaldehyde powder Sigma Aldrich 158127 Always prepare Paraformaldehyde fresh
Sodium Cacodylate powder Sigma Aldrich C0250 Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution
Calcium Chloride Sigma Aldrich C1016 Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O
Osmium tretroxide ProSciTech C011 Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle
Ethanol- Absolute Sigma Aldrich 459836  100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve
Other grades of Ethanol Labtech EL5 Prepare graded Ethanols with dH2O
Hexamethyldisilazane Sigma Aldrich 52619  Allow to reach room temperature before use
Cannulas Terumo TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C 18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice
Conductive Carbon tape ProSciTech IA0201
Carbon Paint ProSciTech I003
Ketamine Must be obtained under license
Xylazine Must be obtained under license
Molecular Sieve Sigma Aldrich 208647 Removes water from the 100 % Ethanol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cogger, V. C., Le Couteur, D. G., et al. The Liver: Biology and Pathobiology. Arias, I. M., et al. , John Wiley & Sons, Ltd. 387-404 (2009).
  2. Fraser, R., Dobbs, B. R., Rogers, G. W. Lipoproteins and the liver sieve: the role of fenestrated sinusoidal endothelium in lipoprotein metabolism, atherosclerosis, and cirrhosis. Hepatology. 21, 863-874 (1995).
  3. Wisse, W., De Zanger, R. B., Charels, K., Van Der Smissen, P., McCuskey, R. S. The liver sieve: considerations concerning the structure and function of endothelial fenestrae, the sinusoidal wall and the space of Disse. Hepatology. 5 (4), 683-692 (1985).
  4. Reilly, J. N., Cogger, V. C., Fraser, R., Le Couteur, D. G. The effect of feeding and fasting on fenestrations in the liver sinusoidal endothelial cell. Pathology. 42 (3), 255-258 (2010).
  5. Tian, Y., et al. Activation of serotonin receptor-2B rescues small-for-size liver graft failure in mice. Hepatology. 53 (1), 253-262 (2011).
  6. Cogger, V. C., Mitchell, S. J., Warren, A., de Cabo, R., Le Couteur, D. G. Age-Related Loss of Responsiveness to 2,5-Dimethoxy-4-Iodoamphetamine in Liver Sinusoidal Endothelial Cells. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (5), 514-518 (2013).
  7. Reilly, J. N., Cogger, V. C., Le Couteur, D. G. Old age is associated with ultrastructural changes in isolated rat liver sinusoidal endothelial cells. J Electron Microsc. 59 (1), 65-69 (2010).
  8. Le Couteur, D. G., et al. Calorie Restriction, Aging and Longevity. Rattan, A. E., Le Couteur, D. G., de Cabo, R., et al. , 191-216 (2010).
  9. McLean, A. J., et al. Age-related pseudocapillarization of the human liver. J Pathol. 200 (1), 112-117 (2003).
  10. Le Couteur, D. G., et al. Pseudocapillarization and associated energy limitation in the aged rat liver. Hepatology. 33 (3), 537-543 (2001).
  11. Cogger, V. C., et al. The effect of acute oxidative stress on the ultrastructure of the perfused rat liver. Pharmacol Toxicol. 89 (6), 306-311 (2001).
  12. Horn, T., Christoffersen, P., Henriksen, J. H. Alcoholic liver injury: defenestration in noncirrhotic livers-a scanning electron microscopic study. Hepatology. 7 (1), 77-82 (1987).
  13. Jamieson, H. A., et al. Alterations in liver sinusoidal endothelium in a baboon model of type 1 diabetes. Diabetologia. 50 (9), 1969-1976 (2007).
  14. Fraser, R., et al. High perfusion pressure damages the sieving ability of sinusoidal endothelium in rat livers. Br J Exp Pathol. 61 (2), 222-228 (1980).
  15. Wisse, E. An electron microscopic study of the fenestrated endothelial lining of rat liver sinusoids. J Ultrastruct Res. 31 (1), 125-150 (1970).
  16. Wisse, E. An ultrastructural characterization of the endothelial cell in the rat liver sinusoid under normal and various experimental conditions, as a contribution to the distinction between endothelial and Kupffer cells. J Ultrastruct Res. 38 (5), 528-562 (1972).
  17. Fahimi, H. D. Perfusion and immersion fixation of rat liver with glutaraldehyde. Lab Invest. 16 (5), 736-750 (1967).
  18. Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World J Gastroenterol. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  19. Vreuls, C., et al. Jet-fixation: a novel method to improve microscopy of human liver needle biopsies. Hepatology. 59 (2), 737-739 (2014).
  20. Furrer, K., et al. Serotonin reverts age-related capillarization and failure of regeneration in the liver through a VEGF-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 108 (7), 2945-2950 (2011).
  21. Zhang, Q., et al. OxLDL induced injury and defenestration of HLSECs via LOX-1. J Mol Endocrinol. , (2014).
  22. May, D., et al. A transgenic model for conditional induction and rescue of portal hypertension reveals a role of VEGF-mediated regulation of sinusoidal fenestrations. PLoS One. 6 (7), e21478 (2011).
  23. Funyu, J., Mochida, S., Inao, M., Matsui, A., Fujiwara, K. VEGF can act as vascular permeability factor in the hepatic sinusoids through upregulation of porosity of endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 280 (2), 481-485 (2001).
  24. Venkatraman, L., Tucker-Kellogg, L. The CD47-binding peptide of thrombospondin-1 induces defenestration of liver sinusoidal endothelial cells. Liver Int. 33 (9), 1386-1397 (2013).
  25. Wack, K. E., et al. Sinusoidal ultrastructure evaluated during the revascularization of regenerating rat liver. Hepatology. 33 (9), 363-378 (2001).
  26. Morsiani, E., Mazzoni, M., Aleotti, A., Gorini, P., Ricci, D. Increased sinusoidal wall permeability and liver fatty change after two-thirds hepatectomy: An ultrastructural study in the rat. Hepatology. 21 (2), 539-544 (1995).
  27. Straub, A. C., et al. Arsenic-stimulated liver sinusoidal capillarization in mice requires NADPH oxidase–generated superoxide. J Clin Invest. 118 (12), 3980-3989 (2008).
  28. Barberá-Guillem, E., Arrue, J. M., Ballesteros, J., Vidal-Vanaclocha, F. Structural changes in endothelial cells of developing rat liver in the transition from fetal to postnatal life. JJ Ultrastruct Mol Struct Res. 97 (1-3), 197-206 (1986).
  29. Jamieson, H. A., et al. Caloric restriction reduces age-related pseudocapillarization of the hepatic sinusoid. Exp Gerontol. 42 (4), 374-378 (2007).
  30. Cogger, V. C., et al. Hyperlipidemia and surfactants: the liver sieve is a link. Atherosclerosis. 189 (2), 273-281 (2006).
  31. Cogger, V. C., et al. The effects of oxidative stress on the liver sieve. J Hepatol. 41 (3), 370-376 (2004).
  32. Cogger, V. C., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J Struct Biol. 171 (3), 382-388 (2010).
  33. Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells. J Electron Microsc. 50 (4), 283-290 (2001).
  34. Monkemoller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Phys Chem Chem Phys. 16 (24), 12576-12581 (2014).

Tags

Biyofizik Sayı 98 Porozite Görüntü analizi Fiksasyon Perfüzyon Görüntü J Çap Fenestrae
Taramalı Elektron Mikroskobu Karaciğer Sinüs Endotel Hücreleri Analizi ve Bunların fenestrasyonlar için Standart Yöntemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cogger, V. C., O'Reilly, J. N.,… More

Cogger, V. C., O'Reilly, J. N., Warren, A., Le Couteur, D. G. A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (98), e52698, doi:10.3791/52698 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter