Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En standardiseret metode til analyse af Liver Sinusformet endotelceller og deres fenestrationer af Scanning Electron Microscopy

doi: 10.3791/52698 Published: April 30, 2015
* These authors contributed equally

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De lever sinusformede endotelceller (LSECs) er stærkt differentierede endotelceller denne linje væggen i hepatisk sinusoid. LSECs er perforeret med fenestrationer, som er ikke-diaphragmed, transcellulær porer 50-250 nm i diameter. Op til 20% af overfladen af LSECs er dækket af fenestrationer, som normalt i grupper af ti til hundrede kaldet sieve plader 1-3 (figur 1). Fenestrationer muliggøre overførsel af plasma og nanosubstrates mellem blod og hepatocytter, hvilket skaber en yderst effektiv ultrafiltrering system. Fenestrationer er dynamiske strukturer - både deres størrelse og / eller nummer kan ændres som reaktion på forskellige fysiologiske tilstande, narkotika og sygdom. For eksempel fenestrationer er større i fastende end i fastende tilstand 4; 2-di-iodoamphetamine øger fenestration nummer, 5,6 og en reduktion i størrelsen og antallet af fenestrationer per celle forekommer i aldring og mange sygdomstilstande 7-13 1.

Studiet af fenestrationer er vanskelig. Diameteren af ​​fenestrationer ligger under løsningen af ​​konventionel lysmikroskopi, så hidtil eneste observation under anvendelse af elektronmikroskopi både i intakte lever væv eller dyrkede LSECs har været muligt. Scanning elektronmikroskop (SEM) er oftest blevet anvendt til at undersøge fenestration størrelse, frekvens og porøsitet (procentdelen af ​​LSEC membran, der er perforeret af fenestrationer), fordi SEM muliggør observation af store områder af endoteloverfladen og måling af tusinder, hvis ikke titusinder af fenestrationer. På trods af sin nytte, de resultater, der er rapporteret fra SEM-baserede undersøgelser forLSEC parametre som vindues størrelse, antal, hyppighed og porøsitet varierer meget i litteraturen (tabel 1).

Fenestrationer og si plader er skrøbelige strukturer, kontrakt, bryde, spile eller flyder sammen under prøven forberedelse, er der behov derfor omhyggelig behandling for at bevare deres integritet. Forhøjet perfusionstryk 14; ukorrekt osmolaritet af fiksativ og buffere 15; utilstrækkelig fiksering eller fiksering tid; og hastigheden af post-fiksering dehydrering og tørring er alle områder af behandling til SEM, der kan producere artefakter, som interfererer med bevarelse af ultrastruktur (figur 2). Tab af fenestrationer (defenestration «) og fenestration krympning kan forekomme som et resultat af dårlig fiksering, hvilket resulterer i reduceret fenestration diameter og celle porøsitet. Metoder til forbedring af bevarelsen af enheder til SEM-analyse er blevet beskrevet tidligere 15-17 og vil blive drøftether med yderligere tips om hvordan man kan forbedre modellen konservering. De vigtigste mål for prøven konservering er at fjerne blod fra sinusoids så overfladen af ​​LSEC kan visualiseres og undgå LSEC skader fra enten højt tryk eller forsinket fiksering. Hel lever perfusion af fiksativ på portalen vene er den foretrukne metode til leveren fiksering. Som beskrevet nærmere andetsteds 16,18 perfusion skal foretages ved lavt tryk (f.eks 10 cm H 2 0) for at undgå tryk-relateret perfusion artefakter og skader på LSEC, typisk manifesteret som store huller inden i cellemembranen. Imidlertid kan rimelig fiksering ofte opnås ved anvendelse nål perfusion af leverbiopsier fra mennesker og dyr, som beskrevet detaljeret andetsteds 19. Denne teknik indebærer direkte indsprøjtning fiksativ i vævet, indtil blodet skylles ud af prøven, og vævet er fast og fast. Fiksering af prøver til elektronmikroskopi skal være performed så hurtigt som muligt efter ophør af blodgennemstrømning at forhindre ultrastrukturelle forandringer som følge af leverne ekstremt hurtige autolytiske processer.

Vi præsenterer også en fremgangsmåde til billedanalyse, der minimerer optagelsen af ​​artefakter, og standardiserer målingen af ​​fenestrationer. Variation i udvælgelsen af ​​sinusoids for mikrografier, billedanalyse af artefakter, og måling af celle område for porøsitet og fenestration frekvens har ført til store forskelle i offentliggjorte resultater. En standardiseret metode til evaluering og måling af fenestrationer og minimumskravene for datapræsentation er ikke blevet tydeligt behandlet i litteraturen tidligere 4,10,20-31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

BEMÆRK: Alle procedurer, der involverer brug af dyr gennemføres i overensstemmelse med den lokale lovgivning. Vores arbejde er godkendt af Sydney Local Health District Dyrevelfærd udvalget. De tilladte fremgangsmåder er beskrevet i dokumentationen projektet licens og følge retningslinjer, der sikrer velfærd dyret på alle tidspunkter. Sikre overholdelse af lovgivningen om dyreforsøg i det land, hvor arbejdet udføres.

1. Protokol til Forberedelse EM Fixative

  1. For 100 ml fixativ, forberede paraformaldehyd ved tilsætning af 2 g paraformaldehyd pulver til 25 ml destilleret vand i en konisk kolbe, opvarmes til 65 ºC under konstant omrøring med en magnetomrører.
    BEMÆRK: Glutaraldehyd, paraformaldehyd og natriumcacodylatbuffer er alle farlige stoffer og skal altid håndteres i stinkskab.
  2. Varme ved 65 ºC i 2 min og derefter afkøles. Hvis det er nødvendigt, tilsættes natriumhydroxidopløsning dropwise under omrøring at rydde opløsning fuldstændigt.
    BEMÆRK: natriumhydroxid er farligt, håndtag med omhu.
  3. Der tilsættes 10 ml EM klasse lager glutaraldehyd, 50 ml 0,2 M natriumcacodylatbuffer og 2 g saccharose og rør med magnetomrører. Tilsæt 2 ml 1,0 M CaCl2.
  4. Justeres til pH 7,4 inden du gør opløsning op til 100 ml med destilleret vand. Den endelige fikseringsmiddel indeholder 2,5% glutaraldehyd, 2% paraformaldehyd, 2 mmol CaCI2, 2% saccharose i 0,1 M cacodylatbuffer. Sørg for, at den samlede Osmolalitet er 440 mOsmol / l. Anvendes inden 24 timer til forberedelse.

2. Perfusion Fiksering af Liver

  1. Varm perfusionsbuffer og fiksativ til 35-37 * C. Den korrekte temperatur af afblødning puffer og fiksativ med til at sikre vævsintegritet.
  2. Bedøve dyret med en enkelt intraperitoneal injektion af 50 mg / kg ketamin og 5 mg / kg xylazin.
  3. Når dyret er underdyb anæstesi, vurderet ved tilbagetrækning bagben og hale knibe, er en Y indsnit med stumpe endte saks i dyrets mave at afsløre leveren og portal vene.
    BEMÆRK: Sørg for, at udstyret er rent for at undgå forurening af prøver med mikroorganismer og generel snavs, som vil let ses på SEM.
  4. Bind to meget løse suturer omkring portvenen en proximal til leveren, den anden mere distalt til leveren.
  5. Kanyle portalen vene med en passende størrelse IV kanyle (18 G for rotter, 22 G i mus) .Spænd suturer for at sikre kanylen.
  6. Begynd perfusion med phosphatbufret saltvand opvarmet til 37 * C, og ved et tryk på 10 cm H 2 0. Mellem 5 og 20 ml PBS er normalt forpligtet til at exsanguinate leveren.
    BEMÆRK: Du må ikke at tillade luftbobler at komme ind i leveren gennem rørene er forbundet med kanylen, da de inducerer artefakter sekundært til embolisering og pres; Skader på hepatocytter, sinusoids og LSEC fenestrationer opstår, hvis perfusionen trykket er for højt.
  7. Skille de abdominale og thorakale vena cava at tillade bufferen for at forlade frit fra leveren. Dette forhindrer højt modtryk skader på LSECs.
  8. Når leveren er fri for blod, erstatte PBS med EM fiksativ og perfundere i ca. 5 minutter, indtil leveren er hærdet og meget bleg.
  9. Afbryde perfusion og sender det faste leveren til 1 - 2 mm 3 blokke med en skarp skalpel.
  10. Post-fix væv i EM fiksativ for 24-72 timer ved 4 ºC.
    BEMÆRK: Generelt underfixation forårsager flere artefakter end overfixation.
  11. Skift fiksativ efter post-fix periode til 0,1 M natriumcacodylatbuffer til opbevaring ved 4 ºC.
    BEMÆRK: Prøver, der er gemt på denne måde vil blive bevaret i en længere periode (op til 12 måneder), men rettidig sekundær fiksering og anbefales undersøgelse for de bedste resultater.

3. Needle Perfusion

BEMÆRK: Nål fiksering er en variant af perfusion fiksering, der involverer injektion af fiksativ direkte i biopsi levervæv. Målet er for fiksativ kan skylles gennem blodkarrene for at exsanguinate dem og udsætte alle af vævet blok til fiksativ. Skal man være omhyggelig for at holde intravenøs presset lavt for at undgå pres skade 18,19.

  1. Fjerne et lille stykke af leveren fra dyret eller emnet og skylles i saltvand for at fjerne blod og efterladenskaber.
  2. Tegn normalt saltvand i sprøjte forsynet med en fin gauge nål (typisk en insulinsprøjte).
  3. Injicere saltvand meget langsomt ind i leveren, indtil blodet er skyllet ud af vævet. Kan være behov for flere injektioner.
  4. Tegn EM fiksativ ind i en anden sprøjte monteret med en fin kanyle (typisk en insulinsprøjte).
  5. Injicere fiksativ meget langsomt ind i leveren indtil det bliver hårdt og tan farve. Multiple injektions kan være påkrævet.
  6. Skær det faste leveren til 1 - 2 mm 3 blokke med en skarp skalpel. Inkuber i EM fiksativ i 24-72 timer 4 ° C. Vask 3 gange i 0,1 M natriumcacodylatbuffer før de påbegynder sekundær fiksering.

4. Forberedelse til scanning Electron Microscopy

  1. Vask prøve 3 gange i 0,1 M natriumcacodylatbuffer. For at rette lipider, post fix prøven i 2% osmiumtetroxid i 0,1 M natriumcacodylatbuffer i 2 timer.
    BEMÆRK: Komplet vask er meget vigtigt, da glutaraldehyd og osmiumtetroxid tværs reagerer og generere artefakter på SEM.
  2. Skyl prøverne i stigende koncentrationer af ethanol til at påbegynde dehydrering. Første skylning i 50% ethanol i 5 minutter; derefter 3 gange i 5 minutter med 70% ethanol; skyl 3 gange i 5 minutter med 90% ethanol; skylles 2 gange i 5 minutter i 100% ethanol; og endelig skylles 2 gange i 10 minutter i 100% ethanol (molekylsigte).
  3. Fjern alle ethanol fra prøverne og erstatte med hexamethyldisilazan (HMDS) i stinkskab og orlov til 10 minutter. Fjern HMDS fra vævsprøver og lad det fordampe.
    BEMÆRK: HMDS er meget hygroskopisk, når kold derfor gøre det muligt at nå RT, før du bruger til endelig dehydrering trin.
  4. Eventuelt montere prøverne straks eller placere dem i en ekssikkator, indtil klar til at montere for SEM.

5. Montering

BEMÆRK: Korrekt eksemplar montering vil maksimere antallet af klart afgrænsede sinusoids rådighed til analyse under SEM.

  1. Mærk bunden af ​​metal- SEM stubs og anvende dobbeltsidet ledende carbon tape til toppen af ​​tappene.
  2. Visualisere prøver ved anvendelse af et dissektionsmikroskop for at identificere overfladen med de bedste sinusoids til efterfølgende SEM. Placere denne overflade opad på carbon tape overflade af stubben.
  3. Stick prøver fast på stubben, eksemplarer er nu klar til sputter belægning.
ove_title "> 6. Coating

BEMÆRK: Coating prøven med en fin film af ledende metal (guld eller platin) i et pådampningsbelægningsmaskinen grunde prøven og beskytter den mod skader fra elektronstråle. Hvis belægningen er for tykke strukturer af interesse kan skjules.

  1. Placer stubbe ind i vakuumkammer automatiske fine pådampningsbelægningsmaskine, sæt mode til rotation og automatisk sputter belægning for 45 sek. Brug platin belægning for finere detaljer, men guld er også velegnet.
  2. Påfør et tyndt lag carbon maling til de ydre overflader af de monterede lever- prøver, pas på ikke at belægge sinusformede flader.
  3. Når enhederne er belagt med platin og carbon malingen er tørret de er klar til observation på SEM. Prøver kan opbevares i en ekssikkator.

7. Brug af Scanning Electron Microscope

  1. Sted prøver i scanning elektronmikroskop og returnere mikroskop til vakuum. </ Li>
  2. Ved hjælp af standard mikroskop operationelle procedurer for visualisering af prøver ved begyndende ved lav forstørrelse, gradvist stigende forstørrelse.
  3. Sørg mikroskopet justeres korrekt for at arbejde afstand, spot størrelse og bygningsfejl.
  4. Check for fiksering integritet. Hvis LSEC er for det meste fri for huller og indeholder fenestrationer måler 30-250 nm i diameter vil det generelt indikerer, at prøven forberedelse har været en succes.
  5. Hvis sinusoider er fulde af huller eller blottet for fenestrationer præparatet prøven ikke har været en succes, eller der er betydelig patologi. I dette tilfælde, slice prøven med en meget fin barberblad, og snitfladerne overmales og analyseret for succes faste sinuskurver.
  6. På cirka 15.000-20.000 × forstørrelse vælge flade LSEC overflader, der er fri for snavs med god fiksering og hvor fenestrationer er klart synlige (typisk indeholder mindst 10 fenestrationer).
  7. Gemme billeder af mindst 10 sinusoids pr leveren, fra forskellige områder af blokkene ved hjælp af mindst to blokke pr leveren. Prøveudtagning 10 mikrografier på 15.000 - 20.000 × forstørrelse per dyr er generelt tilstrækkelig til kvantificering af fenestrationer at være repræsentative for hele leveren.

8. Analyse

BEMÆRK: ImageJ software, som kan downloades gratis fra NIH er udnyttet til at kvantificere fenestration diameter og frekvens ( www.imagej.nih.gov/ij ).

  1. Åbn billede J og indstil skalaen ved hjælp af skalaen bar indlejret i billedet (Screen shot 1).
  2. Brug af polygon værktøjet i ImageJ, spor rundt om hele flade område af LSEC herunder fenestrerede og defenestrated områder. Må ikke bare spore sien plader som dette falsk vil puste porøsitet. Udelukke nogle store stykker af vragdele, der er på celleoverfladen, der kan være obscuring fenestrationer.
  3. For at måle fenestration diameter, spore en linje gennem den længste diameter af hver fenestration ved at vælge linje værktøj, og tryk "m" for at måle den linje, og "d" (uafgjort) permanent trække grænsen på billedet. Denne linje er defineret som fenestrationen diameter. Længden af linjen vil nu være tilgængelige i boksen resultater af ImageJ (Screen shot 2).
  4. Mål alle huller, der er større huller i LSEC cytoplasmaet end 250 nm, samt fenestrationer. Huller er ofte artefakter afspejler dårlig perfusion eller fiksering imidlertid huller også kan forekomme som et resultat af sygdom og toksicitet. Dataene for huller vil blive udelukket fra beregningen af ​​fenestration parametre senere i analysen.
  5. Det område af huller, der ikke er cirkulære bør beregnes ved at spore omkring hullerne og beregne deres område på ImageJ.
  6. Indsæt data fra kassen resulterer i ImageJ i et Excel-regneark til further analyse.

9. Beregninger

  1. Gennemsnitlig fenestration diameter = gennemsnit af alle fenestration diametre (ikke inklusive mellemrum, hvor huller er ≥ 250 nm).
  2. Fenestration areal = πr 2, hvor r er radius, ud fra den enkelte fenestrationer diameter (r = d / 2), ikke inklusive huller.
  3. Porøsitet (%) = (Σ (πr 2) / samlet areal analyseret - Σ (område med huller =)) (um 2)) × 100.
  4. Fenestration frekvens = samlet antal fenestrationer / (samlet areal analyseret-Σ (område af mellemrum) (um 2).

10. Præsentation af Fenestration data

BEMÆRK: Når det er muligt, publikationer, herunder kvantificering af fenestration data bør indeholde følgende oplysninger

  1. Fenestration diameter, med en erklæring, der bekræfter, hvad grænsen diametre, hvor der bruges til at definere fenestrationer (typiskmellem 50-250 nm), Fenestration hyppighed (antal / um 2) og porøsitet (%).
  2. En erklæring, der bekræfter, om huller er medtaget i analysen, bør frekvensfordeling graf over fenestration diameter og antallet af lever, blokke, billeder og fenestrationer indgå i analysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Initial visualisering ved lav forstørrelse ved scanning elektronmikroskopi afslører en flad overflade af leveren prøve med et eksponeret areal stort nok til at observere mange store lever fartøjer og sinusoids (figur 1A). Er afgørende for at opnå klare billeder af sinusoiderne og Glisson kapslen af leveren bør undgås af denne grund (figur 1B) sikre korrekt liver blok placering på monterings stub. Øge forstørrelsen tillader nærmere eftersyn af den tætte vaskulatur af leveren og afslører de encellede plader af hepatocytter som inddeler skibe (figur 1C). Dårlig fiksering af leveren resulterer i dårlig billedkvalitet, blodceller og snavs tilslører visningen af leveren (figur 1D).

Yderligere forøgelse af forstørrelsen tillader observation af LSEC fenestrationer (figur 2A). Det er vigtigt, Sinuskurverne corr rekte identificeret - plader hepatocytter kan, under visse omstændigheder fremstå som blodkar men funktioner såsom galden canaliculi hjælpe med orientering (figur 2B). Høj perfusionstryk kan forårsage artefakter såsom store huller i endotel, menes at være forårsaget af sammensmeltning af de LSEC si plader. Disse er let identificeres under SEM (figur 2C). Undgå cellemembran direkte over kernerne vil hjælpe med nøjagtigheden af fenestration densitet og porøsitet beregninger (Figur 2D).

Analyse af LSEC med ImageJ tillader kvantificering af LSEC fenestration diameter, densitet og frekvens (figur 3A). Disse dimensioner giver en empirisk måling af fenestrationer og tillade målinger af forandringer som følge af aldring, sygdom, toksiner eller behandlinger (figur 3B).

filer / ftp_upload / 52698 / 52698fig1.jpg "/>
Figur 1. Visualisere leveren med SEM. (A) indledende inspektion under SEM afslører sinusoider i leveren og større fartøjer, herunder dem af portalen tarmkanalen og centrale venuler, (B) Den Glisson kapsel dækker alle detaljer om de sinusoider, (C) Den tætte kar af leveren og encellede plader af hepatocytter, der ligger mellem de fartøjer. (D) Dårlig fiksering resulterer i kollapsede sinusoider og udvikling af ultrastrukturelle artefakter Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Ultrastrukturen af leveren. (A) LSEC fenestrationer let se n i godt fikseret væv, (B) Overfladen af en hepatocyt med velbevaret galde-canaliculi, (C) Store huller i endotelet forårsaget af høj perfusionstryk, (D) LSEC kerner angivet ved pilene bule under overfladen af den tynde LSEC og bør ikke indgå i området til porøsitet analyse. Venligst klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Analyse af LSEC med ImageJ. (A) Den polygonale værktøj tillader måling af det samlede område for måling og linien værktøjet bruges til at måle fenestration diameter (B) En frekvens histogram genereret af data opnået fra Billede J analyse.2698fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Diameter (nm) Frekvens (per UM2) Porøsitet (%) Henvisning
na na 60 ± 12 20
127 ± 4 nm 6,5 ± 0,5 4,6 ± 0,4 21
na na 40.5 22
na 0,6 ± 1,4 0,01 ± 0,03
na 2,5 ± 0,5 0,047 ± 0,012 24
87,25 ± 1,4 na 9,22 ± 0,7 25
100-200 4,49 ± 0,69 2,55 ± 0,54 26
na na 23 ± 2 27
85 ± 17 11 ± 0,4 6,6 ± 0,2 28
na 2,7 ± 1,1 4,1 ± 2,3 10
68 ± 1 8 ± 0,6 3,4 ± 0,2 29
na na 3,9 ± 0,2 30
73.3 ± 0.4 na 2,2 ± 0,2 31
90,7 ± 11,7 8,45 ± 2,43 5,93 ± 2,05 4
110,7 ± 0,25 9 6 3
104,8 ± 0,22 13 8 3

Tabel 1.

Komponent Artefakt
Osmolariteten af ​​fiksativ og puffer for lav (hypotonisk) Celle hævelse
Osmolariteten af ​​fiksativ og puffer for højt (hypertonisk) Celle krympning
Prøvestørrelse for stor Fiksativ ikke kan trænge langt nok under inkubering = autolyse / utilstrækkelig fiksering
pH af fiksativ og buffer før osmium mindre end 7,2 eller over 7,4 Proteindenaturering og strukturelle deformiteter
Fiksering tid for kort Autolyse
Fiksering tid for lang Kan forårsage celle svind
Temperatur høj Øger fiksering hastighed kan dog denaturere proteiner
Temperatur lav Utilstrækkelig fiksering
Perfusionstryk for højt Huller, plads for These udvidelsen vakuoler i hepatocytter, tab af si plader, udvidelse af fenestration diameter
Mekanisk beskadigelse, når hakning og / eller med en pincet Knusning af cellulære strukturer, hvis vævet ikke er hærdet godt nok af fiksativ
Længere tid til fiksering efter døden, eksemplar biopsi eller forblødning Iskæmi, autolyse, gap formation, defenestration
Lav fiksativ inkubationsmængde Mindre end 20 gange prøvevolumenet = utilstrækkelig penetration af fiksativ og autolyse i centrum af blokke.
Fixative koncentration for høj Fusion påvirker hastigheden af ​​fiksering og penetration af fiksativ. Artefact formation.
Fiksativ koncentration for lav Konsumption af fiksativ før fiksering er fuldført producerende celle blebbing og andre artefakter.
Tegn på ufuldstændig fiksering i leveren Celle blebbing (hævede mikrovilli eller stammer fra cytoplasmaet), defenestration, huller, tab af mikrovilli, hævede mitokondrier, celle hævelse, sinusoiden lumen kollapsede eller komprimeret, blod i sinusformede lumen, uregelmæssigt formede hepatocyt kerner
Blod kontaminering af fiksativ Deaktiverer fiksativ
Dirty perfusion og forberedelse udstyr Specimen forurening med snavs og bakterier
Ufuldstændig dehydrering af prøver eller opbevaring uden tørremiddel efter belægning Specimænd opkræve op på SEM. Tilføjelse carbon maling til blokken kan bidrage til reduktion ladning

Tabel 2. Fejlfinding tips til fattige eksemplar og billedkvalitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Evnen til nøjagtigt og reproducerbart måle status for leveren sinusformede endotel er et vigtigt skridt i forståelsen af ​​biologien for disse højt specialiserede celler. Nyere teknikker såsom struktureret belysning mikroskopi 32, atomic force mikroskopi 33 og d-STORM (direkte Stochastic Optical reconstrucion Microscopy) 34 vil give vigtige oplysninger om morfologi af disse celler in vitro, men SEM er fortsat den primære metode til at visualisere og måle deres struktur i situ.

Det mest afgørende og teknisk udfordrende skridt er den indledende fiksering: Hvis leveren er bevaret godt de efterfølgende trin vil producere let observerbare og ja, smukke, billeder af leveren sinusoid. Hel lever perfusion er den mest effektive metode til at sikre god fiksering, men sammenlignelige resultater er mulige i nål perfusion prøver, der er blevet fastsat hurtigtog under lavt tryk. Resorption af vand fra de dehydrerede leverprøver er en anden almindelig årsag til fattige SEM billeder, men dette kan let undgås ved korrekt opbevaring af prøverne i en ekssikkator med tørremiddel.

Der er behov for en standardisering af kvantificeringen af ​​fenestrationer så studier fra forskellige forskergrupper kan sammenlignes og fortolkes. I fortiden har der været stor variation i de værdier, der offentliggøres med meget lidt metodologiske oplysninger om, hvordan disse værdier blev opnået. Her har vi givet et standardiseret tilgang til bestemmelse og præsentere værdier, der beskriver fenestration ultrastruktur.

Når det er muligt, publikationer, herunder kvantificering af fenestration data bør indeholde følgende oplysninger: Fenestration diameter, med en erklæring, der bekræfter, hvad grænsen diametre, hvor der bruges til at definere fenestrationer (typisk mellem 50-250 nm); fenestration frekvens (nummer / &# 181; m 2) og porøsitet (%); en erklæring, der bekræfter, om huller er medtaget i analysen; og en frekvensfordeling graf over vindues diameter. Endvidere bør antallet af lever, blokke, billeder og fenestrationer indbefattes i analysen.

Fenestration diameter, frekvens og porøsitet er vigtige indikatorer for lever- status og standardisere indsamlingen af ​​disse data vil være til gavn for området. De diskuteret her metoder giver en ramme for at sikre, at undersøgelser af ultrastruktur af LSEC og fenestrationer udføres og præsenteres på en sammenlignelig måde på tværs af forskellige forskergrupper. Den metode er let tilpasses til måling fenestrationer i isolerede og dyrkede LSECs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25% EM grade Glutaraldehyde ProSciTech C001 Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze
Paraformaldehyde powder Sigma Aldrich 158127 Always prepare Paraformaldehyde fresh
Sodium Cacodylate powder Sigma Aldrich C0250 Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution
Calcium Chloride Sigma Aldrich C1016 Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O
Osmium tretroxide ProSciTech C011 Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle
Ethanol- Absolute Sigma Aldrich 459836  100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve
Other grades of Ethanol Labtech EL5 Prepare graded Ethanols with dH2O
Hexamethyldisilazane Sigma Aldrich 52619  Allow to reach room temperature before use
Cannulas Terumo TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C 18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice
Conductive Carbon tape ProSciTech IA0201
Carbon Paint ProSciTech I003
Ketamine Must be obtained under license
Xylazine Must be obtained under license
Molecular Sieve Sigma Aldrich 208647 Removes water from the 100 % Ethanol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cogger, V. C., Le Couteur, D. G., et al. The Liver: Biology and Pathobiology. Arias, I. M., et al. John Wiley & Sons, Ltd. 387-404 (2009).
  2. Fraser, R., Dobbs, B. R., Rogers, G. W. Lipoproteins and the liver sieve: the role of fenestrated sinusoidal endothelium in lipoprotein metabolism, atherosclerosis, and cirrhosis. Hepatology. 21, 863-874 (1995).
  3. Wisse, W., De Zanger, R. B., Charels, K., Van Der Smissen, P., McCuskey, R. S. The liver sieve: considerations concerning the structure and function of endothelial fenestrae, the sinusoidal wall and the space of Disse. Hepatology. 5, (4), 683-692 (1985).
  4. Reilly, J. N., Cogger, V. C., Fraser, R., Le Couteur, D. G. The effect of feeding and fasting on fenestrations in the liver sinusoidal endothelial cell. Pathology. 42, (3), 255-258 (2010).
  5. Tian, Y., et al. Activation of serotonin receptor-2B rescues small-for-size liver graft failure in mice. Hepatology. 53, (1), 253-262 (2011).
  6. Cogger, V. C., Mitchell, S. J., Warren, A., de Cabo, R., Le Couteur, D. G. Age-Related Loss of Responsiveness to 2,5-Dimethoxy-4-Iodoamphetamine in Liver Sinusoidal Endothelial Cells. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69, (5), 514-518 (2013).
  7. Reilly, J. N., Cogger, V. C., Le Couteur, D. G. Old age is associated with ultrastructural changes in isolated rat liver sinusoidal endothelial cells. J Electron Microsc. 59, (1), 65-69 (2010).
  8. Le Couteur, D. G., et al. Calorie Restriction, Aging and Longevity. Rattan, A. E., Le Couteur, D. G., de Cabo, R., et al. 191-216 (2010).
  9. McLean, A. J., et al. Age-related pseudocapillarization of the human liver. J Pathol. 200, (1), 112-117 (2003).
  10. Le Couteur, D. G., et al. Pseudocapillarization and associated energy limitation in the aged rat liver. Hepatology. 33, (3), 537-543 (2001).
  11. Cogger, V. C., et al. The effect of acute oxidative stress on the ultrastructure of the perfused rat liver. Pharmacol Toxicol. 89, (6), 306-311 (2001).
  12. Horn, T., Christoffersen, P., Henriksen, J. H. Alcoholic liver injury: defenestration in noncirrhotic livers-a scanning electron microscopic study. Hepatology. 7, (1), 77-82 (1987).
  13. Jamieson, H. A., et al. Alterations in liver sinusoidal endothelium in a baboon model of type 1 diabetes. Diabetologia. 50, (9), 1969-1976 (2007).
  14. Fraser, R., et al. High perfusion pressure damages the sieving ability of sinusoidal endothelium in rat livers. Br J Exp Pathol. 61, (2), 222-228 (1980).
  15. Wisse, E. An electron microscopic study of the fenestrated endothelial lining of rat liver sinusoids. J Ultrastruct Res. 31, (1), 125-150 (1970).
  16. Wisse, E. An ultrastructural characterization of the endothelial cell in the rat liver sinusoid under normal and various experimental conditions, as a contribution to the distinction between endothelial and Kupffer cells. J Ultrastruct Res. 38, (5), 528-562 (1972).
  17. Fahimi, H. D. Perfusion and immersion fixation of rat liver with glutaraldehyde. Lab Invest. 16, (5), 736-750 (1967).
  18. Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World J Gastroenterol. 16, (23), 2851-2866 (2010).
  19. Vreuls, C., et al. Jet-fixation: a novel method to improve microscopy of human liver needle biopsies. Hepatology. 59, (2), 737-739 (2014).
  20. Furrer, K., et al. Serotonin reverts age-related capillarization and failure of regeneration in the liver through a VEGF-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 108, (7), 2945-2950 (2011).
  21. Zhang, Q., et al. OxLDL induced injury and defenestration of HLSECs via LOX-1. J Mol Endocrinol. (2014).
  22. May, D., et al. A transgenic model for conditional induction and rescue of portal hypertension reveals a role of VEGF-mediated regulation of sinusoidal fenestrations. PLoS One. 6, (7), e21478 (2011).
  23. Funyu, J., Mochida, S., Inao, M., Matsui, A., Fujiwara, K. VEGF can act as vascular permeability factor in the hepatic sinusoids through upregulation of porosity of endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 280, (2), 481-485 (2001).
  24. Venkatraman, L., Tucker-Kellogg, L. The CD47-binding peptide of thrombospondin-1 induces defenestration of liver sinusoidal endothelial cells. Liver Int. 33, (9), 1386-1397 (2013).
  25. Wack, K. E., et al. Sinusoidal ultrastructure evaluated during the revascularization of regenerating rat liver. Hepatology. 33, (9), 363-378 (2001).
  26. Morsiani, E., Mazzoni, M., Aleotti, A., Gorini, P., Ricci, D. Increased sinusoidal wall permeability and liver fatty change after two-thirds hepatectomy: An ultrastructural study in the rat. Hepatology. 21, (2), 539-544 (1995).
  27. Straub, A. C., et al. Arsenic-stimulated liver sinusoidal capillarization in mice requires NADPH oxidase–generated superoxide. J Clin Invest. 118, (12), 3980-3989 (2008).
  28. Barberá-Guillem, E., Arrue, J. M., Ballesteros, J., Vidal-Vanaclocha, F. Structural changes in endothelial cells of developing rat liver in the transition from fetal to postnatal life. JJ Ultrastruct Mol Struct Res. 97, (1-3), 197-206 (1986).
  29. Jamieson, H. A., et al. Caloric restriction reduces age-related pseudocapillarization of the hepatic sinusoid. Exp Gerontol. 42, (4), 374-378 (2007).
  30. Cogger, V. C., et al. Hyperlipidemia and surfactants: the liver sieve is a link. Atherosclerosis. 189, (2), 273-281 (2006).
  31. Cogger, V. C., et al. The effects of oxidative stress on the liver sieve. J Hepatol. 41, (3), 370-376 (2004).
  32. Cogger, V. C., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J Struct Biol. 171, (3), 382-388 (2010).
  33. Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells. J Electron Microsc. 50, (4), 283-290 (2001).
  34. Monkemoller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Phys Chem Chem Phys. 16, (24), 12576-12581 (2014).
En standardiseret metode til analyse af Liver Sinusformet endotelceller og deres fenestrationer af Scanning Electron Microscopy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cogger, V. C., O'Reilly, J. N., Warren, A., Le Couteur, D. G. A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (98), e52698, doi:10.3791/52698 (2015).More

Cogger, V. C., O'Reilly, J. N., Warren, A., Le Couteur, D. G. A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (98), e52698, doi:10.3791/52698 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter