Introduction
De lever sinusoïdale endotheelcellen (LSECs) sterk gedifferentieerde endotheelcellen die de wand van de hepatische sinusoïde lijn. LSECs worden geperforeerd met fenestraties die niet diaphragmed, transcellulaire poriën 50-250 nm in diameter. Tot 20% van het oppervlak van LSECs onder fenestrations, die meestal in groepen van tientallen tot honderden genoemd zeefplaten 03/01 (figuur 1). Fenestraties mogelijk overdracht van plasma en nanosubstrates tussen bloed en hepatocyten, zodat een efficiëntere ultrafiltratiesysteem. Fenestraties zijn dynamische structuren - zowel hun afmeting en / of het aantal kan worden veranderd in reactie op verschillende fysiologische toestanden, drugs en ziekte. Bijvoorbeeld, fenestraties zijn groter in de nuchtere dan in de gevoede toestand 4; 2-di-joodamfetamine vergroot fenestration nummer, 5,6 en minder grootte en het aantal fenestraties per cel voorkomt bij veroudering en vele ziektetoestanden 7-13 1.
De studie fenestraties moeilijk. De diameter van fenestraties ligt onder de resolutie van conventionele lichtmicroscopie, dus voorheen alleen observatie met behulp van elektronenmicroscopie, zowel in intacte leverweefsel of gekweekte LSECs mogelijk is geweest. De scanning elektronenmicroscoop (SEM) is het meest frequent gebruikt raamopeningen grootte, frequentie en porositeit (het percentage LSEC membraan dat is geperforeerd door fenestrations) bestuderen omdat SEM zorgt voor waarneming van grote gebieden van het endotheliale oppervlak en meting van duizenden, zoniet tienduizenden fenestraties. Ondanks het nut, de resultaten die zijn gemeld uit SEM-gebaseerde studies voorLSEC parameters zoals fenestratie grootte, aantal en frequentie porositeit verschillen sterk in de literatuur (Tabel 1).
Fenestraties en zeefplaten zijn kwetsbare structuren die overeenkomst, te breken, verwijden of samensmelten tijdens het prepareren, is dus zorgvuldige verwerking die nodig is om hun integriteit te bewaren. Verhoogde perfusiedruk 14; incorrect osmolariteit van het fixeermiddel en de buffers 15; onvoldoende fixatie of fixatie tijd; en de snelheid van post-fixatie dehydratatie en drogen worden alle gebieden van de verwerking SEM die artefacten die interfereren met behoud van ultrastructuur (figuur 2) kunnen veroorzaken. Verlies van fenestraties (doorvallen) raamstellingen krimp kan optreden als gevolg van slechte fixatie resulteert in verminderde diameter fenestratie en cellen porositeit. Werkwijzen voor het behoud van specimens SEM analyse te verbeteren zijn eerder beschreven en 15-17 worden besprokenhier met extra tips over hoe om specimen behoud te verbeteren. De hoofddoelen van het monster bewaring bloed van de sinusoïden verwijderd zodat het oppervlak van de LSEC worden gevisualiseerd en LSEC beschadiging van zowel hoge druk of vertraagd fixatie te voorkomen. Hele leverperfusie fixeermiddel via de poortader is de voorkeursmethode voor lever fixatie. Zoals elders in detail 16,18 perfusie moet plaatsvinden bij lage druk (bijvoorbeeld 10 cm H 2 0) tot drukgerelateerde perfusie artefacten en schade aan de LSEC voorkomen, meestal manifesteert als grote gaten in het celmembraan. Echter, redelijke fixatie vaak worden verkregen met behulp naald perfusie van de lever biopten van mensen en dieren, zoals elders in detail beschreven 19. Deze techniek omvat het direct inspuiten fixatief in het weefsel totdat het bloed wordt gespoeld uit het monster en het weefsel is stevig en vast. Fixatie van monsters voor elektronenmicroscopie perf moet wordenormed zo snel mogelijk na het stoppen van de bloedstroom naar ultrastructurele veranderingen optreden als gevolg van de levers uiterst snelle autolytisch processen voorkomen.
We stellen ook een werkwijze voor beeldanalyse die het opnemen van voorwerpen minimaliseert en standaardiseert het meten van fenestrations. Variatie in de keuze van sinusoïden voor microfoto, beeldanalyse van artefacten, en meting van celoppervlak voor porositeit en fenestration frequentie hebben geleid tot grote verschillen in gepubliceerde resultaten. Een gestandaardiseerde aanpak voor de evaluatie en meting van fenestraties en de minimale vereisten voor de presentatie van gegevens niet duidelijk zijn behandeld in de literatuur eerder 4,10,20-31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Alle procedures die het gebruik van dieren worden uitgevoerd volgens de lokale wetgeving. Ons werk is goedgekeurd door de Sydney Local Health District Animal Welfare Committee. De toegestane procedures zijn beschreven in het project licentie documentatie en volgt richtlijnen die het welzijn van de dieren te allen tijde te garanderen. Zorg ervoor dat de naleving van de wetgeving op de dierproeven van het land waar het werk wordt uitgevoerd.
1. Protocol voor het voorbereiden van EM Fixatief
- Voor 100 ml fixeermiddel, bereid door toevoeging paraformaldehyde 2 g paraformaldehyde poeder aan 25 ml gedestilleerd water in een erlenmeyer, warmte 65 * C, onder voortdurend roeren met een magnetische roerder.
OPMERKING: Glutaaraldehyde, paraformaldehyde en natriumcacodylaat buffer zijn alle gevaarlijke stoffen en moeten altijd in zuurkast worden behandeld. - Verhit bij 65 ° C gedurende 2 minuten, laat afkoelen. Voeg indien nodig natriumhydroxideoplossing dropwise terwijl roeren tot oplossing volledig te wissen.
OPMERKING: natriumhydroxide is gevaarlijk, met zorg te behandelen. - Voeg 10 ml EM rang stock glutaaraldehyde, 50 ml 0,2 M natrium cacodylaatbuffer en 2 g sucrose en roeren met een magnetische roerder. Voeg 2 ml van 1,0 M CaCl 2.
- Pas op pH 7,4 voorafgaand aan het maken oplossing met gedestilleerd water 100 ml. De laatste fixeermiddel bevat 2,5% glutaaraldehyde, 2% paraformaldehyde, 2 mmol CaCl2, 2% sucrose in 0,1 M cacodylaatbuffer. Zorg ervoor dat de totale Osmolaliteit is 440 mOsmol / L. Gebruik binnen de 24 uur van voorbereiding.
2. Perfusie Fixatie van Liver
- Warm perfusie buffer en fixeer naar 35-37 ºC. De juiste temperatuur van het uitbloedstation buffer en fixatief helpt weefselintegriteit te verzekeren.
- Verdoven van het dier met een enkele intraperitoneale injectie van 50 mg / kg ketamine en 5 mg / kg xylazine.
- Zodra het dier onderdiepe narcose, beoordeeld door achterpoot terugtrekking en de staart knijpen, is een Y-incisie gemaakt met stompe eindigde een schaar in de buik van het dier naar de lever en de poortader bloot.
OPMERKING: Zorg dat de apparatuur schoon is om besmetting van specimens met micro-organismen en algemene puin die gemakkelijk zal worden gezien op SEM voorkomen. - Bind twee zeer losse hechtingen rond de poortader ene proximaal van de lever, de ander meer distaal naar de lever.
- Canule de poortader met een geschikt formaat IV canule (18 G voor ratten, 22 G voor muizen) .Draai hechtingen aan canule veilig te stellen.
- Begin perfusie met fosfaat gebufferde zoutoplossing verwarmd tot 37 ° C en bij een druk van 10 cm H 2 0. Tussen 5 en 20 ml PBS gewoonlijk vereist om de lever exsanguinate.
LET OP: Weet niet toe te staan luchtbellen naar de lever door de buizen aangesloten op de canule omdat ze artefacten secundair aan embolisatie en druk veroorzaken te gaan; Beschadiging van de hepatocyten, sinusoids en LSEC fenestraties treedt op als de perfusie druk te hoog. - Scheid de buik- en thoracale vena cava om de buffer vrij verlaten de lever. Dit voorkomt hoge tegendruk schade aan LSECs.
- Zodra de lever vrij is van bloed, vervangen door PBS met EM fixatief en perfuseren ongeveer 5 minuten, tot de lever is gehard en erg bleek.
- Staak perfusie en snijd de vaste lever in 1-2 mm 3 blokken met een scherp scalpel.
- Post-fix weefsel in EM fixeermiddel voor 24-72 uur bij 4 ºC.
LET OP: In het algemeen, underfixation veroorzaakt meer artefacten dan overfixation. - Wijzig fixatief volgende post-fix periode tot 0,1 M natriumcacodylaat buffer voor opslag bij 4 ºC.
OPMERKING: Modellen opgeslagen op deze manier zullen worden bewaard voor een aanzienlijke periode (maximaal 12 maanden), maar tijdig secundaire fixatie en het onderzoek wordt aanbevolen voor de beste resultaten.
3. Naald Perfusion
OPMERKING: Naald fixatie is een variant van perfusiefixatie dat injectie van fixeermiddel omvat direct in biopsie leverweefsel. Het doel is fixatief wordt gespoeld door de bloedvaten om ze exsanguinate en bloot alle weefselblokje aan fixeermiddel. Zorg moet worden genomen om de injectie druk lage druk verwondingen 18,19 vermijden houden.
- Verwijder een klein stukje lever van het dier of voorwerp en spoel in zoutoplossing om bloed en vuil te verwijderen.
- Trek de normale saline in injectiespuit voorzien van een fijne naald (gewoonlijk een insulinespuit).
- Spuit de zoute heel langzaam in de lever, totdat het bloed wordt gespoeld uit het weefsel. Meerdere injecties nodig zijn.
- Trek de EM fixeermiddel in een injectiespuit voorzien van een fijne naald (gewoonlijk een insulinespuit).
- Spuit de fixerende heel langzaam in de lever tot het hard en bruin van kleur wordt. Meervoudige injecties kan worden verlangd.
- Snijd de vaste lever in 1-2 mm 3 blokken met een scherp scalpel. Incubeer in EM fixatief 24-72 uur 4 ° C. Was 3 keer in 0,1 M natriumcacodylaat buffer voordat u begint secundaire fixatie.
4. Voorbereiding voor Scanning Electron Microscopy
- Wassen Voorbeeld 3 maal in 0,1 M natriumcacodylaat buffer. Om lipiden repareren, na oplossen van het monster in 2% osmiumtetroxide in 0,1 M natriumcacodylaat buffer gedurende 2 uur.
OPMERKING: Compleet wassen is belangrijk glutaaraldehyde en osmiumtetroxide kruisreageren en genereren artefacten op SEM. - Spoel de monsters in toenemende concentraties ethanol uitdroging beginnen. Spoel in 50% ethanol gedurende 5 minuten; vervolgens 3 maal gedurende 5 minuten met 70% ethanol; spoel 3 maal gedurende 5 minuten met 90% ethanol; spoelen 2 maal gedurende 5 min in 100% ethanol; en tenslotte spoelen 2 maal gedurende 10 min in 100% ethanol (moleculaire zeef).
- Verwijder alle ethanol uit de monsters en vervang met hexamethyldisilazaan (HMDS) in zuurkast en laat 10 min. Verwijder HMDS uit de weefselmonsters en laat verdampen.
OPMERKING: HMDS is sterk hygroscopisch als het koud dus mogelijk om RT te bereiken voordat u voor de uiteindelijke uitdroging stap. - Eventueel, monteer de monsters onmiddellijk of plaats ze in een exsiccator totdat klaar om mount voor SEM.
5. Montage
OPMERKING: Correcte specimen montage zal het aantal duidelijk afgebakende sinusoiden beschikbaar voor analyse onder de SEM te maximaliseren.
- Label de bodem van de metalen SEM stubs en dubbelzijdige tape geleidende carbon toepassing op de top van de stubs.
- Visualiseren monsters met behulp van een dissectie microscoop om het oppervlak met de beste sinusoïden voor daaropvolgende SEM identificeren. Leg dat oppervlak boven op de carbon tape oppervlak van de stomp.
- Stick exemplaren stevig aan de stomp, exemplaren zijn nu klaar voor sputter coating.
OPMERKING: Coating het monster met een fijne film van geleidend metaal (goud of platina) in een sputter coater terrein van het monster en beschermt tegen schade als gevolg van de elektronenbundel. Als de coating te dik structuren van belang kunnen worden verduisterd.
- Plaats stubs in de vacuümkamer automatische fijne sputter coater, ingesteld modus en automatische rotatie sputter coating 45 sec. Gebruik platina coating voor fijnere detaillering, maar goud is ook geschikt.
- Breng een dun laagje koolstof verf aan de buitenkant van de gemonteerde exemplaren lever, zorg ervoor dat u de vacht van de sinusvormige oppervlakken.
- Nadat de monsters zijn bekleed met platina en koolstof droging- ze klaar voor waarnemingen aan de SEM. Monsters kunnen worden opgeslagen in een exsiccator.
7. Met behulp van de Scanning Electron Microscope
- Plaats specimens in scanning elektronenmicroscoop en terug te keren microscoop om vacuüm. </ Li>
- Met behulp van standaard microscoop operationele procedures voor visualisatie van specimens door beginnend bij een lage vergroting, geleidelijk toenemende vergroting.
- Zorg ervoor dat de microscoop wordt afgestemd op het werken op afstand, spot grootte en astigmatisme.
- Controleer voor bevestiging integriteit. Als de LSEC is meestal vrij van lacunes en bevat fenestraties meten 30-250 nm diameter zou dit over het algemeen aangeven dat prepareren is succesvol geweest.
- Als de sinusoïden zijn vol gaten of zonder fenestraties het prepareren is niet succesvol geweest of er significante pathologie. In dit geval, snijd het monster met een zeer fijne scheermesje en de snijvlakken overschilderbaar en succesvolle vaste sinusoïden geanalyseerd.
- Bij ongeveer 15.000-20.000 x vergroting selecteren LSEC vlakke oppervlakken die vrij van vuil met goede fixatie en wanneer de fenestraties goed zichtbaar (en bevat kenmerkend ten minste 10 fenestrations zijn).
- Afbeeldingen opslaan van ten minste 10 per lever sinusoïden, uit verschillende gebieden van de blokken met behulp van tenminste twee blokken per lever. Bemonstering 10 microfoto bij 15.000 - 20.000 x vergroting per dier in het algemeen voldoende voor de kwantificering van fenestrations representatief zijn voor de gehele lever.
8. Analyse
OPMERKING: ImageJ software die gratis kan worden gedownload van de NIH wordt gebruikt om fenestratie diameter en frequentie (kwantificeren www.imagej.nih.gov/ij ).
- Open Image J en zet de schaal met de schaal bar ingebed in de foto (Screen shot 1).
- Met behulp van de veelhoek instrument in ImageJ, sporen rond het hele vlak gebied van de LSEC waaronder gefenestreerde en defenestrated gebieden. Niet alleen sporen van de zeef platen als deze ten onrechte wordt opgeblazen porositeit. Uitsluiten iedere grote brokstukken die op het celoppervlak die obscuri misschienng fenestraties.
- Om fenestratie diameter meten, traceren een lijn door de langste diameter van elke fenestratie door het selecteren van de line tool, en druk op "m" om de lijn te meten en "d" (trekken) om de lijn op de foto vast te trekken. Deze lijn wordt gedefinieerd als de fenestratie diameter. De lengte van de lijn zal nu beschikbaar zijn in de doos resultaten van ImageJ (Screen shot 2).
- Meet de gaten die grotere gaten in het cytoplasma LSEC dan 250 nm, en fenestrations zijn. Hiaten vaak artefacten reflecterende slechte perfusie of fixatie echter spleten kan ook optreden als gevolg van ziekten en toxiciteit. De gegevens voor hiaten zal uit de berekening van fenestratie parameters later in de analyse worden uitgesloten.
- Het gebied van de lacunes die niet rond zijn berekend moet worden door het traceren van rond de lacunes en de berekening van hun gebied op ImageJ.
- Plak de gegevens uit de doos resultaten in ImageJ in een Excel spreadsheet voor further analyse.
9. Berekeningen
- Gemiddeld fenestratie diameter = gemiddelde van alle fenestratie diameters (niet met inbegrip van gaten, waar de hiaten zijn ≥ 250 nm).
- Fenestration area = πr 2, waarbij r de straal, wordt berekend uit de individuele fenestrations diameter (r = d / 2), exclusief gaten.
- Porositeit (%) = (Σ (πr 2) / totale oppervlakte geanalyseerd - Σ (gebied gaps =)) (2 micrometer)) x 100.
- Fenestration frequentie = totaal aantal fenestrations / (totale oppervlakte geanalyseerd-Σ (oppervlakte van openingen) (micrometer 2).
10. Presentatie van Fenestration Gegevens
NB: Waar mogelijk, publicaties, waaronder kwantificering van fenestratie gegevens moeten de volgende informatie bevatten
- Fenestration diameter, met een verklaring waarin wordt bevestigd wat grens diameters, waar vroeger fenestrations typisch define (tussen 50-250 nm), Fenestration frequentie (aantal / um 2) en porositeit (%).
- Een verklaring waarin wordt bevestigd of hiaten zijn opgenomen in de analyse, frequentieverdeling grafiek van fenestratie diameter en het aantal levers, blokken, afbeeldingen en fenestraties moeten worden opgenomen in de analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Initial visualisatie bij een lage vergroting door het scannen van elektronenmicroscopie onthult een vlak oppervlak van de lever exemplaar met een blootgestelde gebied groot genoeg om vele grote lever schepen en sinusoiden (figuur 1A) te observeren. Zorgen voor correcte lever blok plaatsing op de montage stomp is essentieel voor het verkrijgen van duidelijke beelden van de sinusoïden en Glisson het kapsel van de lever dient vermeden te worden om deze reden (Figuur 1B). Het verhogen van de vergroting kunt nadere inspectie van de dichte vasculatuur van de lever en onthult de cel platen van hepatocyten die de vaten (figuur 1C) verdelen. Slechte fixatie van de lever, een slechte beeldkwaliteit, bloedcellen en resten bepalen het aanzicht van de lever (Figuur 1D).
Een verdere verhoging van de vergroting mogelijk observatie van LSEC fenestrations (Figuur 2A). Het is essentieel dat de sinusoïden zijn corr ectly geïdentificeerd - de platen van hepatocyten kunnen, onder bepaalde omstandigheden verschijnen als bloedvaten maar functies zoals de galcanaliculi te helpen bij de oriëntatie (Figuur 2B). Hoge perfusiedruk kunnen artefacten veroorzaken, zoals grote gaten in het endotheel, verondersteld te worden veroorzaakt door coalescentie van de LSEC zeefplaten. Deze zijn gemakkelijk te herkennen onder de SEM (Figuur 2C). Het vermijden celmembraan direct boven de kernen zal helpen nauwkeurig raamstroken dichtheid en porositeit berekeningen (figuur 2D).
Analyse van de LSEC met ImageJ maakt kwantificering van LSEC fenestratie diameter, dichtheid en frequentie (Figuur 3A). Deze afmetingen leveren een empirische meting fenestraties en maken metingen van de veranderingen bij veroudering, ziekte, toxines of therapieën (Figuur 3B).
bestanden / ftp_upload / 52.698 / 52698fig1.jpg "/>
Figuur 1. Het visualiseren van de lever met SEM. (A) Eerste inspectie onder de SEM onthult de sinusoïden van de lever en de grotere schepen, waaronder die van de portal-darmkanaal en centrale venulen; (B) De Glisson's capsule omvat alle details van de sinusoïden, (C) De dichte vaatstelsel van de lever en enkele cel platen van hepatocyten dat tussen de schepen liggen,. (D) Slechte fixatie resultaten in stortte sinusoïden en de ontwikkeling van ultrastructurele artefacten Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. De ultrastructuur van de lever. (A) LSEC fenestrations gemakkelijk te bekijken n in goed vast weefsel, (B) Het oppervlak van een hepatocyt met goed bewaard gebleven galcanaliculi, (C) grote gaten in het endotheel door hoge perfusiedruk, (D) LSEC kernen aangeduid door de pijlen uitpuilen onder het oppervlak van de dunne LSEC en mag niet worden opgenomen in het gebied voor porositeit analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Analyse van de LSEC met ImageJ. (A) De veelhoekige tool maakt het mogelijk de meting van de totale oppervlakte voor de meting en de lijn tool wordt gebruikt om fenestratie diameter meten; (B) een frequentie histogram gegenereerd door de gegevens verkregen uit Image J analyse.2698fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Diameter (nm) | Frequentie (per UM2) | Porositeit (%) | Verwijzing |
| na | na | 60 ± 12 | 20 |
| 127 ± 4 nm | 6.5 ± 0.5 | 4.6 ± 0.4 | 21 |
| na | na | 40.5 | 22 |
| na | 0,6 ± 1.4 | 0.01 ± 0.03 | |
| na | 2,5 ± 0,5 | 0,047 ± 0,012 | 24 |
| 87.25 ± 1.4 | na | 9.22 ± 0,7 | 25 |
| 100-200 | 4.49 ± 0.69 | 2.55 ± 0.54 | 26 |
| na | na | 23 ± 2 | 27 |
| 85 ± 17 | 11 ± 0,4 | 6.6 ± 0.2 | 28 |
| na | 2.7 ± 1.1 | 4,1 ± 2,3 | 10 |
| 68 ± 1 | 8 ± 0,6 | 3.4 ± 0.2 | 29 |
| na | na | 3.9 ± 0.2 | 30 |
| 73,3 ± 0,4 | na | 2.2 ± 0.2 | 31 |
| 90,7 ± 11,7 | 8.45 ± 2.43 | 5.93 ± 2.05 | 4 |
| 110,7 ± 0.25 | 9 | 6 | 3 |
| 104,8 ± 0,22 | 13 | 8 | 3 |
Tabel 1. Tabel 2. Problemen tips voor arme monster en beeldkwaliteit. Bestanddeel Artefact Osmolariteit van fixatief en buffer te laag (hypotoon) Celzwelling Osmolariteit van fixatief en buffer te hoog (hypertone) Cell krimp Specimen te groot Fixatief kan niet ver genoeg doordringen tijdens incubatie = autolyse / onvoldoende fixatie pH van het fixeermiddel en buffer vóór osmium minder dan 7,2 of meer dan 7,4 Eiwitdenaturatie en structurele misvormingen Fixatie tijd te kort Autolyse Fixatie te lang Kan cel krimp veroorzaken Temperatuur hoog Verhoogt fixatie snelheid kan echter eiwitten denatureren Temperatuur laag Onvoldoende fixatie Perfusiedruk te hoog Hiaten, ruimte van Disse uitbreiding, vacuolen in hepatocyten, verlies van zeefplaten, verbreding van fenestratie diameter Mechanische schade wanneer hakken en / of met behulp van een tang Breken van cellulaire structuren als het weefsel niet goed genoeg is gehard door de fixerende Langdurige tijd om fixatie na de dood, monster biopsie of verbloeding Ischemie, autolyse, gap formatie, defenestration Low fixeermiddel incubatievolume Minder dan 20 maal het monstervolume = onvoldoende doorlassing van het fixeermiddel en autolyse in het centrum van blokken. Fixative concentratie te hoog Concentratie van invloed op de snelheid van de fixatie en penetratie van fixatief. Artefact formatie. Fixatief concentratie te laag Uitputting van het fixeermiddel voor het fixeren is voltooid producerende cel blebbing en andere voorwerpen. Tekenen van onvolledige fixatie in de lever Cell blebbing (gezwollen microvilli of afkomstig van het cytoplasma), defenestration, gaten, verlies van microvilli, gezwollen mitochondria, cel zwelling, sinusoid lumens ingestort of gecomprimeerd, bloed in sinusvormige lumen, onregelmatig gevormde hepatocyte kernen Bloedcontaminatie van het fixeermiddel Deactiveert fixatief Dirty perfusie en voorbereiding apparatuur Specimen besmetting met puin en bacteriën Onvolledige uitdroging van de monsters of opslag zonder droogmiddel na coating Specimannen opladen-up op SEM. Het toevoegen van koolstof verf aan het blok kan helpen kosten te verminderen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mogelijkheid om de status van de lever sinusoïdale endotheel nauwkeurig en reproduceerbaar te meten is een belangrijke stap in begrip van de biologie van deze zeer gespecialiseerde cellen. Nieuwere technieken zoals gestructureerde verlichting microscopie 32, atomic force microscopie 33 en d-STORM (direct Stochastic Reconstrucion Optische microscopie) 34 levert belangrijke informatie geven over de morfologie van deze cellen in vitro, maar SEM blijft de belangrijkste methode visualiseren en meten hun structuur situ.
De meest cruciale en technisch uitdagende stap is de initiële fixatie: als de lever goed bewaard is gebleven de volgende stappen zal produceren gemakkelijk waarneembaar en inderdaad, mooi, beelden van de lever sinusoïde. Whole leverperfusie is de meest effectieve methode om een goede fixatie, maar vergelijkbare resultaten mogelijk naald perfusie monsters die snel waren vastgestelden onder lage druk. Resorptie van water door de gedroogde lever monsters is een andere veel voorkomende reden voor de slechte SEM beelden, maar dit kan gemakkelijk worden voorkomen door de juiste opslag van de monsters in een exsiccator met droogmiddel.
Er is behoefte aan standaardisering van de kwantificering van fenestrations zodat studies van verschillende onderzoeksgroepen kunnen worden vergeleken en geïnterpreteerd. In het verleden is er grote verschillen in de waarden gepubliceerd weinig methodologische informatie over deze waarden werden verkregen. Hier hebben we een gestandaardiseerde aanpak voor het bepalen en presenteren waarden die fenestratie ultrastructuur beschrijven verstrekt.
Waar mogelijk, publicaties, waaronder kwantificering van fenestratie gegevens moeten de volgende informatie bevatten: Fenestration diameter, met een verklaring waarin wordt bevestigd wat grens diameters, waar vroeger fenestrations definiëren (meestal tussen de 50-250 nm); fenestratie frequentie (aantal / &# 181, m 2) en porositeit (%); een verklaring waarin wordt bevestigd of hiaten zijn opgenomen in de analyse; en een frequentieverdeling grafiek van fenestratie diameter. Bovendien moet het aantal levers, blokken, afbeeldingen en fenestraties worden opgenomen in de analyse.
Fenestration diameter, de frequentie en de porositeit zijn belangrijke indicatoren van de status van de lever en standaardiseren van het verzamelen van deze gegevens zal gunstig zijn voor het veld. De methoden die hier besproken bieden een kader om ervoor te zorgen dat de studies van de ultrastructuur van de LSEC en fenestrations worden uitgevoerd en gepresenteerd op een vergelijkbare manier in de verschillende onderzoeksgroepen. De methodologie is gemakkelijk aangepast aan het meten fenestrations in geïsoleerde en gekweekte LSECs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25% EM grade Glutaraldehyde | ProSciTech | C001 | Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze |
| Paraformaldehyde powder | Sigma Aldrich | 158127 | Always prepare Paraformaldehyde fresh |
| Sodium Cacodylate powder | Sigma Aldrich | C0250 | Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C1016 | Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O |
| Osmium tretroxide | ProSciTech | C011 | Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle |
| Ethanol- Absolute | Sigma Aldrich | 459836 | 100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve |
| Other grades of Ethanol | Labtech | EL5 | Prepare graded Ethanols with dH2O |
| Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 52619 | Allow to reach room temperature before use |
| Cannulas | Terumo | TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C | 18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice |
| Conductive Carbon tape | ProSciTech | IA0201 | |
| Carbon Paint | ProSciTech | I003 | |
| Ketamine | Must be obtained under license | ||
| Xylazine | Must be obtained under license | ||
| Molecular Sieve | Sigma Aldrich | 208647 | Removes water from the 100 % Ethanol |
References
- Cogger, V. C., Le Couteur, D. G., et al. The Liver: Biology and Pathobiology. Arias, I. M., et al. , John Wiley & Sons, Ltd. 387-404 (2009).
- Fraser, R., Dobbs, B. R., Rogers, G. W. Lipoproteins and the liver sieve: the role of fenestrated sinusoidal endothelium in lipoprotein metabolism, atherosclerosis, and cirrhosis. Hepatology. 21, 863-874 (1995).
- Wisse, W., De Zanger, R. B., Charels, K., Van Der Smissen, P., McCuskey, R. S. The liver sieve: considerations concerning the structure and function of endothelial fenestrae, the sinusoidal wall and the space of Disse. Hepatology. 5 (4), 683-692 (1985).
- Reilly, J. N., Cogger, V. C., Fraser, R., Le Couteur, D. G. The effect of feeding and fasting on fenestrations in the liver sinusoidal endothelial cell. Pathology. 42 (3), 255-258 (2010).
- Tian, Y., et al. Activation of serotonin receptor-2B rescues small-for-size liver graft failure in mice. Hepatology. 53 (1), 253-262 (2011).
- Cogger, V. C., Mitchell, S. J., Warren, A., de Cabo, R., Le Couteur, D. G. Age-Related Loss of Responsiveness to 2,5-Dimethoxy-4-Iodoamphetamine in Liver Sinusoidal Endothelial Cells. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (5), 514-518 (2013).
- Reilly, J. N., Cogger, V. C., Le Couteur, D. G. Old age is associated with ultrastructural changes in isolated rat liver sinusoidal endothelial cells. J Electron Microsc. 59 (1), 65-69 (2010).
- Le Couteur, D. G., et al. Calorie Restriction, Aging and Longevity. Rattan, A. E., Le Couteur, D. G., de Cabo, R., et al. , 191-216 (2010).
- McLean, A. J., et al. Age-related pseudocapillarization of the human liver. J Pathol. 200 (1), 112-117 (2003).
- Le Couteur, D. G., et al. Pseudocapillarization and associated energy limitation in the aged rat liver. Hepatology. 33 (3), 537-543 (2001).
- Cogger, V. C., et al. The effect of acute oxidative stress on the ultrastructure of the perfused rat liver. Pharmacol Toxicol. 89 (6), 306-311 (2001).
- Horn, T., Christoffersen, P., Henriksen, J. H. Alcoholic liver injury: defenestration in noncirrhotic livers-a scanning electron microscopic study. Hepatology. 7 (1), 77-82 (1987).
- Jamieson, H. A., et al. Alterations in liver sinusoidal endothelium in a baboon model of type 1 diabetes. Diabetologia. 50 (9), 1969-1976 (2007).
- Fraser, R., et al. High perfusion pressure damages the sieving ability of sinusoidal endothelium in rat livers. Br J Exp Pathol. 61 (2), 222-228 (1980).
- Wisse, E. An electron microscopic study of the fenestrated endothelial lining of rat liver sinusoids. J Ultrastruct Res. 31 (1), 125-150 (1970).
- Wisse, E. An ultrastructural characterization of the endothelial cell in the rat liver sinusoid under normal and various experimental conditions, as a contribution to the distinction between endothelial and Kupffer cells. J Ultrastruct Res. 38 (5), 528-562 (1972).
- Fahimi, H. D. Perfusion and immersion fixation of rat liver with glutaraldehyde. Lab Invest. 16 (5), 736-750 (1967).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World J Gastroenterol. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Vreuls, C., et al. Jet-fixation: a novel method to improve microscopy of human liver needle biopsies. Hepatology. 59 (2), 737-739 (2014).
- Furrer, K., et al. Serotonin reverts age-related capillarization and failure of regeneration in the liver through a VEGF-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 108 (7), 2945-2950 (2011).
- Zhang, Q., et al. OxLDL induced injury and defenestration of HLSECs via LOX-1. J Mol Endocrinol. , (2014).
- May, D., et al. A transgenic model for conditional induction and rescue of portal hypertension reveals a role of VEGF-mediated regulation of sinusoidal fenestrations. PLoS One. 6 (7), e21478 (2011).
- Funyu, J., Mochida, S., Inao, M., Matsui, A., Fujiwara, K. VEGF can act as vascular permeability factor in the hepatic sinusoids through upregulation of porosity of endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 280 (2), 481-485 (2001).
- Venkatraman, L., Tucker-Kellogg, L. The CD47-binding peptide of thrombospondin-1 induces defenestration of liver sinusoidal endothelial cells. Liver Int. 33 (9), 1386-1397 (2013).
- Wack, K. E., et al. Sinusoidal ultrastructure evaluated during the revascularization of regenerating rat liver. Hepatology. 33 (9), 363-378 (2001).
- Morsiani, E., Mazzoni, M., Aleotti, A., Gorini, P., Ricci, D. Increased sinusoidal wall permeability and liver fatty change after two-thirds hepatectomy: An ultrastructural study in the rat. Hepatology. 21 (2), 539-544 (1995).
- Straub, A. C., et al. Arsenic-stimulated liver sinusoidal capillarization in mice requires NADPH oxidase–generated superoxide. J Clin Invest. 118 (12), 3980-3989 (2008).
- Barberá-Guillem, E., Arrue, J. M., Ballesteros, J., Vidal-Vanaclocha, F. Structural changes in endothelial cells of developing rat liver in the transition from fetal to postnatal life. JJ Ultrastruct Mol Struct Res. 97 (1-3), 197-206 (1986).
- Jamieson, H. A., et al. Caloric restriction reduces age-related pseudocapillarization of the hepatic sinusoid. Exp Gerontol. 42 (4), 374-378 (2007).
- Cogger, V. C., et al. Hyperlipidemia and surfactants: the liver sieve is a link. Atherosclerosis. 189 (2), 273-281 (2006).
- Cogger, V. C., et al. The effects of oxidative stress on the liver sieve. J Hepatol. 41 (3), 370-376 (2004).
- Cogger, V. C., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J Struct Biol. 171 (3), 382-388 (2010).
- Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells. J Electron Microsc. 50 (4), 283-290 (2001).
- Monkemoller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Phys Chem Chem Phys. 16 (24), 12576-12581 (2014).
