Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

סטנדרטי שיטה לניתוח של תאי הכבד סינוסי האנדותל וFenestrations על ידי סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים

doi: 10.3791/52698 Published: April 30, 2015
* These authors contributed equally

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

תאי הכבד סינוסי האנדותל (LSECs) הם מאוד תאי האנדותל מובחנים המרפדים את הקיר של סינוסואידה הכבד. LSECs הם מחוררים עם fenestrations ש- diaphragmed עישון, transcellular נקבוביות 50-250 ננומטר בקוטר. עד 20% מהשטח של LSECs מכוסה על ידי fenestrations, שהם בדרך כלל בקבוצות של עשרות עד מאות נקראים צלחות מסננת 1-3 (איור 1). Fenestrations לאפשר העברה של פלזמה וnanosubstrates בין הדם וhepatocytes, יצירת מערכת אולטרה סינון יעילה ביותר. Fenestrations הם מבנים דינמיים - שניהם בגודל ו / או מספר ניתן לשנות בתגובה למצבים שונים פיסיולוגיים, תרופות, ומחלות. לדוגמא, fenestrations גדול יותר בצם מאשר במדינה נמאס 4; 2-די-iodoamphetamine מגדיל מספר אשנוב; 5,6 וירידה בגודל ובמספר fenestrations לכל תא מתרחש במדינות הזדקנות ומחלות רבות 7-13 1.

המחקר של fenestrations קשה. הקוטר של fenestrations נמצא מתחת לרזולוציה של מיקרוסקופ אור הרגילה, כך במיקרוסקופ אלקטרונים רק בעבר תצפית באמצעות שני בLSECs רקמת כבד או מתורבתת שלם היה אפשרי. מיקרוסקופ האלקטרונים הסורקים (SEM) יש בתדירות הגבוהה ביותר נעשה שימוש כדי ללמוד גודל אשנוב, תדירות ונקבובית (אחוז קרום LSEC שהוא מחורר ידי fenestrations) כי SEM מאפשר התצפית של שטחים גדולים של פני השטח האנדותל והמדידה של אלפים, אם לא עשרות אלפים fenestrations. למרות השירות שלה, את התוצאות המדווחים מSEM מבוססות מחקרים לפרמטרים LSEC כגון גודל אשנוב, מספר, תדירות ונקבובית להשתנות במידה רבה בספרות (טבלת 1).

Fenestrations וצלחות מסננת הן מבנים שבריריים שחוזה, לשבור, להתרחב או להתגבש במהלך הכנת דגימה, יש צורך בעיבוד ובכך הקפיד לשמור על שלמותם. לחץ זלוף גבוה 14; osmolarity שגויה של מקבע ומאגרים 15; קיבעון לקוי או קיבעון זמן; ומהירות של התייבשות לאחר קיבוע-וייבושם בכל תחומי העיבוד לSEM שעשוי לייצר חפצים המפריעים לשימור ultrastructure (איור 2). אובדן fenestrations ('defenestration') והצטמקות אשנוב יכול להתרחש כתוצאה מקיבעון עני, וכתוצאה מכך קוטר אשנוב מופחת ונקבובי תא. שיטות כדי לשפר את השימור של דגימות לניתוח SEM תוארו בעבר 15-17 ותידוננהכאן עם טיפים נוספים על איך לשפר את שימור דגימה. המטרות העיקריות של שימור הדגימה הן להסיר דם מsinusoids כך את פני השטח של LSEC ניתן דמיינו וכדי למנוע נזק LSEC משני בלחץ גבוה או קיבעון מתעכב. זלוף הכבד השלם של מקבע דרך וריד הפורטל הוא השיטה המועדפת לקיבוע כבד. כפי שתואר בפירוט במקום אחר 16,18 זלוף חייבת להתבצע בלחץ נמוך (למשל 10 סנטימטר של H 2 0), כדי למנוע חפצי זלוף הקשורים ללחץ ונזק לLSEC, בא לידי ביטוי בדרך כלל פערים גדולים כמו בקרום התא. עם זאת, לעתים קרובות ניתן להשיג קיבעון סביר באמצעות זלוף מחט של ביופסית כבד מבני האדם ובעלי חיים, כפי שתואר בפירוט במקום אחר 19. טכניקה זו כרוכה בהזרקה ישירות מקבעת לתוך הרקמה עד דם סמוק מתוך המדגם והרקמות היא מוצקות וקבוע. קיבוע של דגימות למיקרוסקופ אלקטרונים צריך להיות Performed מהר ככל האפשר הבא הפסקת זרימת דם למניעת שינויי ultrastructural מתרחשים כתוצאה מתהליכי הכבדים autolytic מאוד מהירים.

כמו כן, אנו מציגים שיטה של ​​ניתוח תמונה שממזער את ההכללה של חפצים, וסטנדרטיזציה מדידת fenestrations. וריאציה בבחירת sinusoids לmicrographs, ניתוח תמונה של חפצים, ומדידה של שטח תא לתדר נקבוביות ואשנוב הובילו לפערים גדולים בתוצאות שפורסמו. גישה סטנדרטית להערכה ומדידה של fenestrations ודרישות מינימום להצגת נתונים שלא טופלה באופן ברור בספרות בעבר 4,10,20-31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הערה: כל הנהלים הקשורים לשימוש בבעלי החיים מתבצעות בהתאם לחקיקה המקומית. העבודה שלנו היא אושרה על ידי ועדת בעלי החיים בריאות המחוזית סידני המקומי הרווחה. הנהלים אפשרו מתוארים בתיעוד רישיון פרויקט ולעקוב אחר הנחיות שתבטחנה את שלומם של בעלי החיים בכל העת. להבטיח עמידה בחקיקה על ניסויים בבעלי חיים במדינה שבן העבודה נעשית.

1. פרוטוקול להכנת EM מקבע

  1. לשל מקבע 100 מיליליטר, להכין paraformaldehyde על ידי הוספת 2 גרם של אבקת paraformaldehyde 25 מיליליטר מים מזוקקים בבקבוק חרוטי, חום עד 65 מעלות צלזיוס, תוך ערבוב עם בוחש מגנטי כל הזמן.
    הערה: Glutaraldehyde, paraformaldehyde וחיץ cacodylate נתרן כל חומרים מסוכנים וחייב תמיד להיות מטופלים בfumehood.
  2. חום על 65 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות לאחר מכן להתקרר. במידת הצורך, להוסיף dropw פתרון נתרן הידרוקסידיISE תוך ערבוב כדי לנקות פתרון לחלוטין.
    הערה: נתרן הידרוקסידי הוא מסוכן, לטפל בזהירות.
  3. להוסיף 10 מיליליטר של glutaraldehyde מניית הכיתה EM, 50 מיליליטר של חיץ cacodylate 0.2 M נתרן ו -2 גרם של סוכרוז ומערבבים עם בוחש מגנטי. הוסף 2 מיליליטר של 1.0 M CaCl 2.
  4. התאם לpH 7.4 לפני קבלת פתרון עד במים מזוקקים 100 מיליליטר. מקבע הסופי מכיל glutaraldehyde 2.5%, Paraformaldehyde 2%, 2 mmol CaCl 2, 2% סוכרוז במאגר M 0.1 cacodylate. ודא שosmolality הכולל הוא 440 mOsmol / L. השתמש בתוך 24 שעות של הכנה.

2. זלוף קיבוע של כבד

  1. מאגר חם זלוף ומקבע ל35-37 מעלות צלזיוס. הטמפרטורה הנכונה של חיץ exsanguination ומקבע עוזרת להבטיח את שלמות רקמה.
  2. לטשטש את החיה עם זריקת intraperitoneal אחת של 50 מ"ג / קילוגרם קטמין ו5 מ"ג / קילוגרם Xylazine.
  3. ברגע שבעלי החיים נמצאים תחתהרדמה עמוקה, שהוערכה על ידי נסיגת גפיים אחוריות וקמצוץ זנב, חתך Y הוא עשה עם מספריים קהים הסתיים בבטנו של בעל החיים כדי לחשוף את הווריד הכבד ופורטל.
    הערה: ודא שהציוד הוא נקי, כדי למנוע זיהום של דגימות עם מיקרואורגניזמים וכללי פסולת שניתן לראות בקלות על SEM.
  4. לקשור שני תפרים רופפים מאוד מסביב לוריד הפורטל הפרוקסימלי אחד בכבד, יותר האחרים distally אל הכבד.
  5. Cannulate וריד השער עם צינורית בגודל המתאימה IV (18 G לחולדות, 22 G לעכברים) תפרי .Tighten לאבטח צינורית.
  6. להתחיל זלוף עם נאגר מלוח פוספט חימם עד 37 מעלות צלזיוס, ובלחץ של 10 סנטימטרים של H 2 0. בין 5 ל 20 מיליליטר של PBS נדרש בדרך כלל ללגרום לדימום מחודש הכבד.
    הערה: אל תאפשר לבועות אוויר להיכנס הכבד דרך הצינורות מחוברים לצינורית כפי שהם לגרום לחפצים משניים לאמבוליזציה ולחץ; נזק לhepatocytes, סיnusoids וfenestrations LSEC מתרחש אם לחץ זלוף הוא גבוה מדי.
  7. לנתק את הווריד נבוב בטן ובית חזה על מנת לאפשר לחיץ כדי לצאת באופן חופשי מהכבד. זה מונע נזק בחזרה בלחץ גבוה לLSECs.
  8. ברגע שהכבד הוא ללא דם, להחליף PBS עם מקבע EM וינקב עבור כ 5 דקות, עד שהכבד קשוח ומאוד חיוור.
  9. להפסיק זלוף ולחתוך את הכבד הקבוע ל1-2 מ"מ 3 בלוקים באמצעות אזמל חד.
  10. רקמה שלאחר תיקון במקבע EM ל24-72 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: באופן כללי, underfixation גורמת יותר מאשר חפצי overfixation.
  11. לשנות מקבע הבאים תקופה שלאחר תיקון לחיץ 0.1 cacodylate M נתרן לאחסון ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: דוגמאות מאוחסנות בדרך זו תישמר לתקופה משמעותית של זמן (עד 12 חודשים), קיבעון המשני בזמן זאת ובדיקה מומלצת לתוצאות הטובות ביותר.

3. המחט Perfusion

הערה: קיבוע מחט הנו נגזר של קיבעון זלוף שכרוך בהזרקה של מקבע ישירות לתוך רקמת כבד ביופסיה. המטרה היא למקבע להיות סמוקה דרך כלי הדם כדי לגרום לדימום המחודש ולחשוף את כל גוש הרקמה למקבע. יש להקפיד לשמור על לחץ הזרקה נמוך, כדי למנוע פגיעה בלחץ 18,19.

  1. הסר חתיכה קטנה של כבד מבעלי החיים או הנושא ולשטוף בתמיסת מלח כדי להסיר דם ופסולת.
  2. לצייר מלח הרגיל למצויד במחט עדינה מד (בדרך כלל מזרק אינסולין) מזרק.
  3. להזריק המלוח מאוד לאט לתוך הכבד עד דם סמוק מהרקמה. זריקות מרובות ייתכן שתידרש.
  4. צייר את מקבע EM למצויד במחט עדינה מד (בדרך כלל מזרק אינסולין) מזרק אחר.
  5. הזרק מקבע מאוד לאט לתוך הכבד עד שהוא הופך קשה ושיזוף בצבע. הזרקה מרובהים עשוי להידרש.
  6. חותך את הכבד הקבוע ל1-2 מ"מ 3 בלוקים באמצעות אזמל חד. דגירה במקבעת EM ל24-72 שעות 4 מעלות צלזיוס. לשטוף 3 פעמים ב 0.1 חיץ cacodylate M נתרן לפני תחילת קיבעון המשני.

4. הכנה לסריקה מיקרוסקופית אלקטרונים

  1. מדגם לשטוף 3 פעמים במאגר cacodylate 0.1 M נתרן. כדי לתקן שומנים, לאחר לתקן את המדגם ב 2% tetroxide אוסמיום במאגר cacodylate 0.1 M נתרן לשעה 2.
    הערה: שטיפה מלאה היא מאוד חשובה כמו צלב tetroxide glutaraldehyde ואוסמיום להגיב וליצור חפצים על SEM.
  2. יש לשטוף את הדגימות בהגדלת ריכוזים של אתנול להתחיל התייבשות. שטיפה ראשונה באתנול 50% במשך 5 דקות; 3 פעמים ולאחר מכן ל5 דקות עם 70% אתנול; לשטוף 3 פעמים במשך 5 דקות עם 90% אתנול; לשטוף 2 פעמים במשך 5 דקות ב 100% אתנול; ולבסוף לשטוף 2 פעמים במשך 10 דקות ב 100% אתנול (מסננת מולקולרית).
  3. הסר את כל אתנול מהדגימות ולהחליף עם hexamethyldisilazane (HMDS) בfumehood ולהשאיר למשך 10 דקות. הסר HMDS מדגימות הרקמה ולאפשר להתאדות.
    הערה: HMDS הוא hygroscopic מאוד כאשר קר ולכן מאפשרים להגיע RT לפני השימוש לצעד התייבשות סופי.
  4. לחלופין, הר הדגימות באופן מיידי או להכניס אותם לתוך תא ייבוש עד מוכן לעלות לSEM.

5. הרכבה

הערה: הרכבת דגימה נכונה תהיה למקסם את מספר sinusoids מסומן בצורה ברורה לניתוח תחת SEM.

  1. תווית הבסיס של ספחי SEM מתכת ולהחיל קלטת פחמן מוליך דו-צדדית לחלק העליון של הספחים.
  2. דמיינו דגימות באמצעות מיקרוסקופ לנתח לזהות את פני השטח עם sinusoids הטוב ביותר עבור SEM שלאחר מכן. מניחים משטח שכלפי מעלה על פני השטח קלטת פחמן של הבדל.
  3. דגימות מקל היטב לבדל, דגימות מוכנות לציפוי גמגום עכשיו.
> 6. ציפוי ove_title "

הערה: ציפוי הדגימה עם סרט משובח של מוליך מתכת (זהב או פלטינה) בטענת coater גמגום הדגימה ומגנה עליו מפני נזקי קרן האלקטרונים. אם הציפוי הוא מבנים עבים מדי של ריבית עשויים להיות מוסתרים.

  1. ספחי מקום לתא הוואקום של coater גמגום קנס האוטומטי, להגדיר את המצב לסיבוב וציפוי גמגום אוטומטי במשך 45 שניות. השתמש ציפוי פלטינה לעדין המפרט, אבל הזהב מתאים גם.
  2. למרוח שכבה דקה של צבע פחמן למשטחים החיצוניים של הדגימות כבד רכובים, נזהר שלא מעיל משטחי סינוסי.
  3. ברגע שהדגימות מצופות בפלטינה וצבע פחמן התייבש הם מוכנים לתצפית על SEM. דוגמאות ניתן לאחסן בתא ייבוש.

7. שימוש במיקרוסקופ אלקטרוני הסורק

  1. מקום דגימות למיקרוסקופ אלקטרונים סורק ולחזור מיקרוסקופ כדי ואקום. </ Li>
  2. באמצעות נהלי הפעלה מיקרוסקופ רגילים להדמיה של דגימות על ידי החל בהגדלה נמוכה, להגדיל בהדרגה הגדלה.
  3. ודא מיקרוסקופ מותאם כראוי לעבודת מרחק, גודל נקודה ואסטיגמציה.
  4. בדקו את שלמות קיבעון. אם LSEC הוא לרוב ללא תשלום מפערים ומכיל fenestrations מדידת 30-250 קוטר ננומטר זה בדרך כלל מצביע על כך שהכנת הדגימה הייתה מוצלחת.
  5. אם sinusoids מלא של פערים או נטול fenestrations הכנת הדגימה לא הייתה מוצלחת או שיש פתולוגיה המשמעותית. במקרה זה, פורס את המדגם בסכין גילוח עדין מאוד, ומשטחי חיתוך שכבה על גבי שכבה ונותחו לsinusoids הקבוע בהצלחה.
  6. בכ 15,000-20,000 × הגדלה לבחור משטחי LSEC שטוחים שהם ללא פסולת עם קיבעון טוב ובי fenestrations גלוי לעין (בדרך כלל מכיל לפחות 10 fenestrations).
  7. לשמור תמונות של לפחות 10 sinusoids לכבד, מאזורים השונים של בלוקים, באמצעות לפחות שני רחובות לכבד. דגימת 10 micrographs ב15,000 - 20,000 × הגדלה לכל בעלי חיים היא בדרך כלל מספיק לכימות של fenestrations להיות נציג של כל הכבד.

8. ניתוח

הערה: תוכנת ImageJ אשר ניתן להוריד בחינם מNIH מנוצלת לכמת קוטר אשנוב ותדר (www.imagej.nih.gov/ij).

  1. תמונה הפתוחה J ולהגדיר את היקף שימוש בסרגל קנה המידה המוטבע בתמונה (צילום המסך 1).
  2. שימוש בכלי המצולע בImageJ, עקבות באזור השטוח של כל LSEC כוללים אזורי fenestrated וחלונות. פשוט לא זכר את צלחות המסננת כמו זה בטעות יהיה לנפח נקבוביות. תכלול כל חתיכות גדולות של פסולת שנמצאות על פני התא שעשויה להיות obscurifenestrations ng.
  3. כדי למדוד קוטר אשנוב, לעקוב אחר קו בקוטר הארוך ביותר של כל אשנוב על ידי בחירה בכלי השורה, ולחץ על "M" כדי למדוד את הקו, ו" ד "(לצייר) למתוח את הקו בתמונה באופן קבוע. קו זה מוגדר כקוטר אשנוב. אורך הקו יהיה זמין כעת בתיבת תוצאות ImageJ (צילום מסך 2).
  4. למדוד את כל הפערים שהם חורים גדולים יותר בציטופלסמה LSEC מעל 250 ננומטר, כמו גם fenestrations. פערים הם לעתים קרובות חפצים המשקפים זלוף העני או קיבעון, אולם פערים יכולים להתרחש גם כתוצאה ממחלה והרעילות. נתונים לפערים יהיו פטור מחישוב הפרמטרים אשנוב מאוחר יותר בניתוח.
  5. האזור של פערים שאינם מעגליים צריך להיות מחושב על ידי התחקות סביב הפערים וחישוב השטח שלהם על ImageJ.
  6. הדבק את הנתונים מתיבת התוצאות בImageJ לתוך גיליון אלקטרוני Excel למעיל-הפרווהניתוח r.

9. חישובים

  1. קוטר ממוצע = אשנוב הממוצע של כל קטרי אשנוב (לא כוללים פערים, שבו פערים ≥ 250 ננומטר).
  2. אשנוב אזור = πr 2, שבו r, הרדיוס, מחושב מקוטר fenestrations הבודד (r = ד / 2) הפערים, לא כולל.
  3. נקבוביות (%) = (Σ (πr 2) / שטח כולל ניתח - אזור Σ (פערים =)) (מיקרומטר 2)) × 100.
  4. תדירות אשנוב = מספר כולל של fenestrations / (שטח כולל ניתח-Σ (שטח של פערים) (מיקרומטר 2).

10. הצגת אשנוב נתונים

הערה: במידת האפשר, פרסומים כוללים כימות של נתונים אשנוב צריכים לכלול את הפרטים הבאים

  1. קוטר אשנוב, עם הצהרה המאשר את מה שקטרי גבול שבו משמשים להגדרת fenestrations (בדרך כללבין 50-250 ננומטר), תדירות אשנוב (מספר / מיקרומטר 2) ונקבובי (%).
  2. הצהרה המאשרת אם פערים נכללו בניתוח, גרף התפלגות תדירות קוטר אשנוב והמספר של כבדים, בלוקים, תמונות וfenestrations צריך להיכלל בניתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הדמיה ראשונית בהגדלה נמוכה על ידי סריקה מיקרוסקופי אלקטרונים מגלה משטח שטוח של דגימת הכבד בשטח חשוף גדול מספיק כדי להתבונן רבים כלי כבד גדולים וsinusoids (איור 1 א). הבטחת מיקום בלוק כבד נכון על בדל ההרכבה היא חיונית לקבלת תמונות ברורות של sinusoids והכמוסה של Glisson של הכבד יש להימנע מסיבה זו (איור 1). הגדלת ההגדלה מאפשרת בדיקה מדוקדקת יותר של כלי הדם הצפופים של הכבד וחושפת את צלחות תא בודדות של hepatocytes שמחלק את כלי (איור 1 ג). קיבעון עני של תוצאות הכבד באיכות ירודה תמונה, תאי דם ופסולת לטשטש את המבט של הכבד (1D איור).

בהמשך הגדלת ההגדלה מאפשרת תצפית של fenestrations LSEC (איור 2 א). זה חיוני כי sinusoids הוא קור זיהה ectly - הצלחות של hepatocytes יכולות, בנסיבות מסוימות נראות כמו כלי דם, אך תכונות כגון המרה canaliculi לסייע בהתמצאות (איור 2). לחץ זלוף גבוה יכול לגרום לחפצים כגון פערים גדולים בהאנדותל, חשבו להיגרם על ידי התמזגות של צלחות מסננת LSEC. אלה מזוהים בקלות תחת SEM (איור 2 ג). הימנעות קרום תא ישירות מעל הגרעינים תסייע עם דיוק של צפיפות אשנוב וחישובים נקבוביות (איור 2 ד).

ניתוח של LSEC עם ImageJ מאפשר כימות של קוטר אשנוב, צפיפות והתדירות (איור 3 א) LSEC. ממדים אלה מספקים מדידה אמפירית של fenestrations ולאפשר מדידות של שינויים הנגרמים על ידי הזדקנות, מחלה, רעלים או טיפולים (איור 3).

קבצים / ftp_upload / 52,698 / 52698fig1.jpg "/>
איור 1. לדמיין את הכבד עם SEM. בדיקה ראשונית תחת SEM () מגלה sinusoids של הכבד וכלי גדול יותר כולל אלו של מערכת הפורטל וvenules המרכזי; (ב) הכמוסה של Glisson מכסה את כל הפרטים של sinusoids; (ג) כלי דם הצפופים של הכבד ו צלחות תא בודדות של hepatocytes ששוכב בין כלי;. (ד) תוצאות קיבעון גרועות בsinusoids התמוטט והפיתוח של חפצי ultrastructural אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. ultrastructure של הכבד. Fenestrations () LSEC בקלות לראות n ברקמה קבועה היטב; (ב) המשטח של hepatocyte עם canaliculi המרה השתמר היטב; (ג) פערים גדולים בהאנדותל הנגרם על ידי לחץ זלוף גבוה; (ד) LSEC גרעינים שצוינו על ידי החצים בליטה מתחת לפני השטח של LSEC ודק לא צריך להיות כלול באזור לניתוח נקבוביות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. ניתוח של LSEC עם ImageJ. (א) כלי המצולעים מאפשר מדידה של השטח הכולל למדידה וכלי השורה משמש למדידת קוטר אשנוב; (ב) היסטוגרמה תדר שנוצרה על ידי הנתונים צברו מניתוח J תמונה."Target =" _ 2698fig3large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

קוטר (ננומטר) תדר (לum2) נקבוביות (%) התייחסות
נה נה 60 ± 12 20
127 ± 4 ננומטר 6.5 ± 0.5 4.6 ± 0.4 21
נה נה 40.5 22
נה 0.6 ± 1.4 0.01 ± 0.03
נה 2.5 ± 0.5 .047 ± 0.012 24
87.25 ± 1.4 נה 9.22 ± 0.7 25
100-200 4.49 ± 0.69 2.55 ± 0.54 26
נה נה 23 ± 2 27
85 ± 17 11 ± 0.4 6.6 ± 0.2 28
נה 2.7 ± 1.1 4.1 ± 2.3 10
68 ± 1 8 ± 0.6 3.4 ± 0.2 29
נה נה 3.9 ± 0.2 30
73.3 ± 0.4 נה 2.2 ± 0.2 31
90.7 ± 11.7 8.45 ± 2.43 5.93 ± 2.05 4
110.7 ± 0.25 9 6 3
104.8 ± 0.22 13 8 3

טבלת 1.

רכיב חֵפֶץ שֶׁנֶעֱשָׂה בְּיָדֵי אָדָם
Osmolarity של מקבע וחיץ נמוך מדי (hypotonic) נפיחות תא
Osmolarity של מקבע וחיץ גבוה מדי (hypertonic) הצטמקות תא
דגימת הגודל גדולה מדי מקבע לא יכול לחדור רחוק מספיק במהלך דגירה = autolysis / קיבעון לקוי
pH של מקבע וחיץ לפני אוסמיום פחות מ 7.2 או מעל 7.4 denaturation חלבון ועיוותים מבניות
זמן קיבוע קצר מדי Autolysis
זמן קיבוע ארוך מדי עלול לגרום להתכווצות תאים
טמפרטורה גבוהה מגביר את מהירות קיבעון עם זאת יכולה לפגל חלבונים
טמפרטורה נמוכה קיבעון לקוי
לחץ זלוף גבוה מדי פערים, מרחב של הגדלת Disse, vacuoles בhepatocytes, אובדן צלחות מסננת, מתרחב בקוטר אשנוב
נזק מכאני כאשר מיותר ו / או באמצעות מלקחיים ריסוק של מבנים תאיים אם הרקמה לא קשוחה מספיק טוב על ידי מקבע
זמן ממושך לקיבוע לאחר המוות, ביופסית דגימה, או exsanguination Ischaemia, autolysis, היווצרות פער, defenestration
מקבע נמוך דגירה נפח פחות מ -20 פעמים את דגימת הנפח = חדירה מספקת של מקבע וautolysis במרכז של בלוקים.
Fריכוז ixative גבוה מדי ריכוז משפיע על השיעור של קיבעון וחדירה של מקבע. היווצרות artefact.
ריכוז מקבע נמוך מדי מיצוי מקבע לפני תהליך הקיבעון הוא blebbing תא ייצור מלא וחפצים אחרים.
סימנים של קיבעון שלם בכבד blebbing תא (microvilli הנפוח או שמקורם בציטופלסמה), defenestration, פערים, אובדן microvilli, מיטוכונדריה הנפוחה, נפיחות תא, לומן סינוסואידה התמוטט או דחוס, דם בלומן סינוסי, גרעיני hepatocyte בצורה סדירה
זיהום דם של המקבע מבטל מקבע
זלוף מלוכלך וציוד הכנה דגימת זיהום בפסולת וחיידקים
התייבשות חלקית של הדגימות או האחסון ללא יבוש לאחר ציפוי ספציפיגברים לחייב-על SEM. הוספת צבע פחמן לבלוק עשויה לעזור להפחית תשלום

טבלת 2. טיפים לפתרון בעיות לדגימה עניה ואיכות תמונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

היכולת מדויקת וreproducibly למדוד את מעמדו של האנדותל סינוסי הכבד היא צעד חשוב בהבנת הביולוגיה של תאים מאוד מיוחדים אלה. טכניקות חדשות כגון מיקרוסקופיה המובנה התאורה 32, מיקרוסקופיה כוח אטומית 33 וד-STORM (ישיר סטוכסטיים אופטי Reconstrucion מיקרוסקופית) 34 תהיה להקנות מידע חשוב בנוגע למורפולוגיה של תאים אלה במבחנה אבל SEM נשאר המתודולוגיה העיקרית לחזות ולמדוד את המבנה שלהם ב אתרם.

הצעד החשוב ביותר ומאתגר מבחינה טכנית הוא הקיבעון הראשוני: אם הכבד נשמר היטב את הצעדים הבאים יהיו לייצר בקלות לצפייה ואכן, יפה, תמונות של סינוסואידה הכבד. זלוף כבד השלם הוא השיטה היעילה ביותר על מנת להבטיח קיבוע טוב, אבל תוצאות דומות אפשריות בדגימות זלוף מחט שתוקנו במהירותותחת לחץ נמוך. ספיגה של מים על ידי הדגימות כבד המיובשים היא עוד סיבה נפוצה לתמונות SEM עניות, אבל זה יכול להימנע בקלות על ידי אחסון נכון של הדגימות בתא ייבוש עם יבוש.

יש צורך בסטנדרטיזציה של כימות של fenestrations כך שניתן להשוות את הלימודים מקבוצות מחקר שונים ולפרש. בעבר חלה וריאציה רחבה בערכים המתפרסמים עם מידע מתודולוגיים מעט מאוד על איך ערכים אלו נתקבלו. כאן אנו מספקים גישה סטנדרטית לקביעה והצגת ערכים המתארים ultrastructure אשנוב.

במידת האפשר, פרסומים כוללים כימות של נתונים אשנוב צריך לכלול את הפרטים הבאים: קוטר אשנוב, עם הצהרה המאשר את מה שקטרי גבול שבו משמשים להגדרת fenestrations (בדרך כלל בין 50-250 ננומטר); תדירות אשנוב (מספר / ו181 #; מ '2) ונקבובי (%); הצהרה המאשרת אם פערים נכללו בניתוח; וגרף התפלגות תדירות קוטר אשנוב. בנוסף, המספר של כבדים, בלוקים, תמונות וfenestrations צריך להיכלל בניתוח.

קוטר אשנוב, תדירות ונקבובית הם אינדיקטורים חשובים של מצב כבד ותקנון האוסף של נתונים זה יהיה מועיל לשדה. השיטות שנדונו כאן לספק מסגרת להבטחה כי מחקרים של ultrastructure של LSEC וfenestrations מבוצעים והציגו באופן דומה בכל קבוצות מחקר שונות. מתודולוגיה מותאמת בקלות למדידת fenestrations בLSECs המבודדת ותרבותי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25% EM grade Glutaraldehyde ProSciTech C001 Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze
Paraformaldehyde powder Sigma Aldrich 158127 Always prepare Paraformaldehyde fresh
Sodium Cacodylate powder Sigma Aldrich C0250 Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution
Calcium Chloride Sigma Aldrich C1016 Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O
Osmium tretroxide ProSciTech C011 Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle
Ethanol- Absolute Sigma Aldrich 459836  100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve
Other grades of Ethanol Labtech EL5 Prepare graded Ethanols with dH2O
Hexamethyldisilazane Sigma Aldrich 52619  Allow to reach room temperature before use
Cannulas Terumo TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C 18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice
Conductive Carbon tape ProSciTech IA0201
Carbon Paint ProSciTech I003
Ketamine Must be obtained under license
Xylazine Must be obtained under license
Molecular Sieve Sigma Aldrich 208647 Removes water from the 100 % Ethanol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cogger, V. C., Le Couteur, D. G., et al. The Liver: Biology and Pathobiology. Arias, I. M., et al. John Wiley & Sons, Ltd. 387-404 (2009).
  2. Fraser, R., Dobbs, B. R., Rogers, G. W. Lipoproteins and the liver sieve: the role of fenestrated sinusoidal endothelium in lipoprotein metabolism, atherosclerosis, and cirrhosis. Hepatology. 21, 863-874 (1995).
  3. Wisse, W., De Zanger, R. B., Charels, K., Van Der Smissen, P., McCuskey, R. S. The liver sieve: considerations concerning the structure and function of endothelial fenestrae, the sinusoidal wall and the space of Disse. Hepatology. 5, (4), 683-692 (1985).
  4. Reilly, J. N., Cogger, V. C., Fraser, R., Le Couteur, D. G. The effect of feeding and fasting on fenestrations in the liver sinusoidal endothelial cell. Pathology. 42, (3), 255-258 (2010).
  5. Tian, Y., et al. Activation of serotonin receptor-2B rescues small-for-size liver graft failure in mice. Hepatology. 53, (1), 253-262 (2011).
  6. Cogger, V. C., Mitchell, S. J., Warren, A., de Cabo, R., Le Couteur, D. G. Age-Related Loss of Responsiveness to 2,5-Dimethoxy-4-Iodoamphetamine in Liver Sinusoidal Endothelial Cells. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69, (5), 514-518 (2013).
  7. Reilly, J. N., Cogger, V. C., Le Couteur, D. G. Old age is associated with ultrastructural changes in isolated rat liver sinusoidal endothelial cells. J Electron Microsc. 59, (1), 65-69 (2010).
  8. Le Couteur, D. G., et al. Calorie Restriction, Aging and Longevity. Rattan, A. E., Le Couteur, D. G., de Cabo, R., et al. 191-216 (2010).
  9. McLean, A. J., et al. Age-related pseudocapillarization of the human liver. J Pathol. 200, (1), 112-117 (2003).
  10. Le Couteur, D. G., et al. Pseudocapillarization and associated energy limitation in the aged rat liver. Hepatology. 33, (3), 537-543 (2001).
  11. Cogger, V. C., et al. The effect of acute oxidative stress on the ultrastructure of the perfused rat liver. Pharmacol Toxicol. 89, (6), 306-311 (2001).
  12. Horn, T., Christoffersen, P., Henriksen, J. H. Alcoholic liver injury: defenestration in noncirrhotic livers-a scanning electron microscopic study. Hepatology. 7, (1), 77-82 (1987).
  13. Jamieson, H. A., et al. Alterations in liver sinusoidal endothelium in a baboon model of type 1 diabetes. Diabetologia. 50, (9), 1969-1976 (2007).
  14. Fraser, R., et al. High perfusion pressure damages the sieving ability of sinusoidal endothelium in rat livers. Br J Exp Pathol. 61, (2), 222-228 (1980).
  15. Wisse, E. An electron microscopic study of the fenestrated endothelial lining of rat liver sinusoids. J Ultrastruct Res. 31, (1), 125-150 (1970).
  16. Wisse, E. An ultrastructural characterization of the endothelial cell in the rat liver sinusoid under normal and various experimental conditions, as a contribution to the distinction between endothelial and Kupffer cells. J Ultrastruct Res. 38, (5), 528-562 (1972).
  17. Fahimi, H. D. Perfusion and immersion fixation of rat liver with glutaraldehyde. Lab Invest. 16, (5), 736-750 (1967).
  18. Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World J Gastroenterol. 16, (23), 2851-2866 (2010).
  19. Vreuls, C., et al. Jet-fixation: a novel method to improve microscopy of human liver needle biopsies. Hepatology. 59, (2), 737-739 (2014).
  20. Furrer, K., et al. Serotonin reverts age-related capillarization and failure of regeneration in the liver through a VEGF-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 108, (7), 2945-2950 (2011).
  21. Zhang, Q., et al. OxLDL induced injury and defenestration of HLSECs via LOX-1. J Mol Endocrinol. (2014).
  22. May, D., et al. A transgenic model for conditional induction and rescue of portal hypertension reveals a role of VEGF-mediated regulation of sinusoidal fenestrations. PLoS One. 6, (7), e21478 (2011).
  23. Funyu, J., Mochida, S., Inao, M., Matsui, A., Fujiwara, K. VEGF can act as vascular permeability factor in the hepatic sinusoids through upregulation of porosity of endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 280, (2), 481-485 (2001).
  24. Venkatraman, L., Tucker-Kellogg, L. The CD47-binding peptide of thrombospondin-1 induces defenestration of liver sinusoidal endothelial cells. Liver Int. 33, (9), 1386-1397 (2013).
  25. Wack, K. E., et al. Sinusoidal ultrastructure evaluated during the revascularization of regenerating rat liver. Hepatology. 33, (9), 363-378 (2001).
  26. Morsiani, E., Mazzoni, M., Aleotti, A., Gorini, P., Ricci, D. Increased sinusoidal wall permeability and liver fatty change after two-thirds hepatectomy: An ultrastructural study in the rat. Hepatology. 21, (2), 539-544 (1995).
  27. Straub, A. C., et al. Arsenic-stimulated liver sinusoidal capillarization in mice requires NADPH oxidase–generated superoxide. J Clin Invest. 118, (12), 3980-3989 (2008).
  28. Barberá-Guillem, E., Arrue, J. M., Ballesteros, J., Vidal-Vanaclocha, F. Structural changes in endothelial cells of developing rat liver in the transition from fetal to postnatal life. JJ Ultrastruct Mol Struct Res. 97, (1-3), 197-206 (1986).
  29. Jamieson, H. A., et al. Caloric restriction reduces age-related pseudocapillarization of the hepatic sinusoid. Exp Gerontol. 42, (4), 374-378 (2007).
  30. Cogger, V. C., et al. Hyperlipidemia and surfactants: the liver sieve is a link. Atherosclerosis. 189, (2), 273-281 (2006).
  31. Cogger, V. C., et al. The effects of oxidative stress on the liver sieve. J Hepatol. 41, (3), 370-376 (2004).
  32. Cogger, V. C., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J Struct Biol. 171, (3), 382-388 (2010).
  33. Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells. J Electron Microsc. 50, (4), 283-290 (2001).
  34. Monkemoller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Phys Chem Chem Phys. 16, (24), 12576-12581 (2014).
סטנדרטי שיטה לניתוח של תאי הכבד סינוסי האנדותל וFenestrations על ידי סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cogger, V. C., O'Reilly, J. N., Warren, A., Le Couteur, D. G. A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (98), e52698, doi:10.3791/52698 (2015).More

Cogger, V. C., O'Reilly, J. N., Warren, A., Le Couteur, D. G. A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (98), e52698, doi:10.3791/52698 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter