Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा जिगर Sinusoidal endothelial कोशिकाओं का विश्लेषण और उनकी Fenestrations के लिए एक मानकीकृत विधि

Published: April 30, 2015 doi: 10.3791/52698
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2, 1,2,3, 1,2,3
1Centre for Education and Research on Ageing & ANZAC Research Institute, University of Sydney and Concord Hospital, 2Ageing and Alzheimers Institute, Concord Hospital, 3Charles Perkins Centre, University of Sydney
* These authors contributed equally

Introduction

जिगर sinusoidal endothelial कोशिकाओं (LSECs) अत्यधिक यकृत sinusoid की दीवार है कि रेखा विभेदित endothelial कोशिकाओं रहे हैं। LSECs गैर diaphragmed हैं कि fenestrations के साथ छिद्रित कर रहे हैं, transcellular व्यास में 50-250 एनएम pores। LSECs की सतह का 20% तक चलनी प्लेटें 1-3 (चित्रा 1) कहा जाता सैकड़ों करने के लिए दसियों के समूह में आम तौर पर कर रहे हैं, जो fenestrations, द्वारा कवर किया जाता है। Fenestrations एक अत्यधिक कुशल ultrafiltration प्रणाली बनाने, प्लाज्मा और रक्त और hepatocytes के बीच nanosubstrates के हस्तांतरण की अनुमति है। Fenestrations गतिशील संरचनाओं हैं - उनके आकार और / या संख्या दोनों विभिन्न शारीरिक राज्यों, दवाओं, और रोग के जवाब में बदला जा सकता है। उदाहरण के लिए, fenestrations फेड राज्य में 4 से अधिक का उपवास में बड़े होते हैं; सेल उम्र बढ़ने और कई रोग राज्यों 7-13 में होता प्रति 5,6 और आकार में कमी और fenestrations की संख्या, 2-डि-iodoamphetamine गवाक्षीकरण संख्या बढ़ जाती है 1 गवाक्षीकरण-modulating।

fenestrations के अध्ययन के लिए मुश्किल है। बरकरार जिगर ऊतक या सुसंस्कृत LSECs में दोनों पहले से ही अवलोकन का उपयोग कर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी संभव हो गया है इसलिए fenestrations के व्यास, पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी के संकल्प के नीचे स्थित है। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) सबसे अधिक बार, SEM के हजारों के endothelial सतह और माप के बड़े क्षेत्रों के अवलोकन के लिए अनुमति देता है क्योंकि गवाक्षीकरण आकार, आवृत्ति और porosity (fenestrations द्वारा छिद्रित है कि LSEC झिल्ली का प्रतिशत) का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है नहीं दसियों fenestrations के हजारों की है। इसकी उपयोगिता के बावजूद, से रिपोर्ट कर रहे हैं, जो परिणामों के लिए पढ़ाई में SEM आधारितऐसे गवाक्षीकरण आकार, संख्या, आवृत्ति और porosity के रूप में LSEC मापदंडों साहित्य (1 टेबल) में व्यापक रूप से भिन्न हो।

Fenestrations और चलनी प्लेटें अनुबंध, तोड़ चौड़ा करना या नमूना तैयार करने के दौरान संगठित होना है कि कमजोर संरचनाओं हैं, इस प्रकार सावधान प्रसंस्करण उनके अखंडता की रक्षा करने की जरूरत है। ऊंचा छिड़काव दबाव 14; लगानेवाला और buffers 15 की गलत परासारिता; अपर्याप्त निर्धारण या निर्धारण समय; और बाद के निर्धारण के निर्जलीकरण और सुखाने की गति फैटी के संरक्षण के साथ हस्तक्षेप है कि कलाकृतियों (चित्रा 2) का उत्पादन हो सकता है कि SEM के लिए प्रसंस्करण के सभी क्षेत्रों रहे हैं। Fenestrations की हानि ('defenestration') और गवाक्षीकरण दबाव कम गवाक्षीकरण व्यास और सेल सरंध्रता, जिसके परिणामस्वरूप गरीब निर्धारण का एक परिणाम के रूप में हो सकता है। SEM के विश्लेषण के लिए नमूनों के संरक्षण में सुधार करने के तरीके में पहले 15-17 वर्णित किया गया है और चर्चा की जाएगीयहाँ नमूना संरक्षण को सुधारने के लिए अतिरिक्त सुझावों के साथ। नमूना संरक्षण के मुख्य लक्ष्यों LSEC की सतह से देखे जा सकते हैं ताकि sinusoids से खून निकालने के लिए और उच्च दबाव में देरी या नियतन से या तो LSEC क्षति से बचने के लिए कर रहे हैं। पोर्टल शिरा के माध्यम से लगानेवाला के पूरे जिगर छिड़काव जिगर निर्धारण के लिए पसंदीदा तरीका है। विस्तार में वर्णित के रूप में कहीं 16,18 छिड़काव कम दबाव पर किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए एच 2 0 से 10 सेमी) LSEC करने के लिए दबाव से संबंधित छिड़काव कलाकृतियों और नुकसान से बचने के लिए, आम तौर पर कोशिका झिल्ली में भीतर के रूप में बड़े अंतराल प्रकट। कहीं और 19 विस्तार से वर्णित के रूप में हालांकि, उचित निर्धारण अक्सर, मनुष्यों और पशुओं से जिगर बायोप्सी की सुई छिड़काव का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। रक्त के नमूने से बाहर प्लावित है जब तक इस तकनीक को सीधे ऊतक में लगानेवाला इंजेक्शन शामिल है और ऊतक फर्म और तय है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए नमूने के फिक्सेशन perf होने की जरूरत हैयकृत बहुत तेजी से autolytic प्रक्रियाओं का एक परिणाम के रूप में होने वाली ultrastructural परिवर्तन को रोकने के लिए रक्त के प्रवाह की समाप्ति के निम्नलिखित के रूप में संभव के रूप में जल्दी ormed।

हम यह भी कलाकृतियों को शामिल किए जाने को कम करता है, और fenestrations की माप के मानकीकरण कि छवि विश्लेषण का एक तरीका मौजूद है। Porosity और गवाक्षीकरण आवृत्ति के लिए micrographs के लिए sinusoids के चयन में भिन्नता है, कलाकृतियों की छवि विश्लेषण, और सेल क्षेत्र की माप प्रकाशित परिणामों में प्रमुख विसंगतियों के लिए नेतृत्व किया। मूल्यांकन और fenestrations और डेटा प्रस्तुति के लिए न्यूनतम आवश्यकताओं की माप के लिए एक मानकीकृत दृष्टिकोण स्पष्ट रूप से पहले से 4,10,20-31 साहित्य में संबोधित नहीं किया गया है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: जानवरों के उपयोग से जुड़े सभी प्रक्रियाओं स्थानीय कानून के अनुसार किया जाता है। हमारा काम सिडनी स्थानीय स्वास्थ्य जिला पशु कल्याण समिति ने मंजूरी दे दी है। अनुमति दी प्रक्रियाओं परियोजना लाइसेंस दस्तावेज में वर्णित है और हर समय जानवर का कल्याण सुनिश्चित करना है कि दिशा निर्देशों का पालन कर रहे हैं। काम किया जाता है, जहां देश के पशु प्रयोगों पर कानून के पालन सुनिश्चित करें।

1. प्रोटोकॉल ईएम लगानेवाला की तैयारी के लिए

  1. लगानेवाला के 100 मिलीलीटर के लिए, 65 डिग्री सेल्सियस के लिए एक शंक्वाकार फ्लास्क में आसुत जल 25 मिलीलीटर, गर्मी के लिए paraformaldehyde के पाउडर के 2 जी जोड़कर एक चुंबकीय उत्तेजक साथ लगातार सरगर्मी से paraformaldehyde तैयार करते हैं।
    नोट: glutaraldehyde, paraformaldehyde और सोडियम cacodylate बफर सभी खतरनाक पदार्थ हैं और हमेशा fumehood में नियंत्रित किया जाना चाहिए।
  2. फिर शांत करने के लिए अनुमति देने के लिए 65 डिग्री सेल्सियस न्यूनतम 2 के लिए कम से हीट। यदि आवश्यक हो, सोडियम हाइड्रोक्साइड समाधान dropw जोड़नेआईएसई पूरी तरह से समाधान स्पष्ट करने के लिए सरगर्मी है।
    नोट: सोडियम हाइड्रोक्साइड खतरनाक है, देखभाल के साथ संभाल।
  3. ईएम ग्रेड शेयर glutaraldehyde के 10 एमएल, 50 0.2 एम सोडियम cacodylate बफर के मिलीग्राम और सुक्रोज के 2 जी जोड़ें और चुंबकीय दोषी साथ हलचल। 1.0 एम 2 CaCl के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
  4. आसुत जल के साथ 100 मिलीलीटर का हल अप करने से पहले 7.4 पीएच को समायोजित करें। अंतिम लगानेवाला 2.5% glutaraldehyde, 2% paraformaldehyde, 2 mmol 2 CaCl, 0.1 एम cacodylate बफर में 2% sucrose शामिल हैं। कुल परासरणीयता 440 mOsmol / एल है कि सुनिश्चित करें। तैयारी के 24 घंटा के भीतर का उपयोग करें।

जिगर के 2. छिड़काव फिक्सेशन

  1. 37 डिग्री सेल्सियस - 35 के लिए गर्म छिड़काव बफर और लगानेवाला। exsanguination बफर और लगानेवाला का सही तापमान ऊतक अखंडता को सुनिश्चित करने में मदद करता है।
  2. 50 मिलीग्राम / किग्रा Ketamine और 5 मिलीग्राम / किग्रा Xylazine की एक एकल intraperitoneal इंजेक्शन के साथ पशु चतनाशून्य।
  3. पशु के तहत एक बारपिछले अंग वापसी और पूंछ चुटकी द्वारा मूल्यांकन गहरी संज्ञाहरण, एक वाई चीरा जिगर और पोर्टल शिरा को बेनकाब करने के लिए पशु के पेट में कुंद समाप्त हो गया कैंची के साथ किया जाता है।
    नोट: उपकरण है कि आसानी से SEM के पर देखा जाएगा जो सूक्ष्मजीवों और सामान्य मलबे के साथ नमूनों के संक्रमण से बचने के लिए साफ है सुनिश्चित करें।
  4. अन्य अधिक distally जिगर के लिए, जिगर के लिए पोर्टल नस के आसपास एक समीपस्थ दो बहुत ही ढीला टांके बाँधो।
  5. प्रवेशनी सुरक्षित करने के लिए .Tighten टांके (चूहों के लिए चूहों के लिए 18 जी, 22 ग्राम) एक उचित आकार चतुर्थ प्रवेशनी के साथ पोर्टल नस cannulate।
  6. फॉस्फेट बफर खारा के साथ छिड़काव शुरू 37 डिग्री सेल्सियस पर गरम, और एच 2 0 से 10 सेमी के दबाव में। पीबीएस के बीच 5 और 20 मिलीलीटर आमतौर पर जिगर रक्तहीन के लिए आवश्यक है।
    नोट: हवा के बुलबुले वे embolization और दबाव के लिए माध्यमिक कलाकृतियों को प्रेरित के रूप में प्रवेशनी से जुड़ा ट्यूब के माध्यम से जिगर में प्रवेश करने की अनुमति देने के लिए मत करो; Hepatocytes को नुकसान, एसआईछिड़काव दबाव बहुत अधिक है nusoids और LSEC fenestrations होता है।
  7. पेट और वक्ष वेना कावा बफर जिगर से स्वतंत्र रूप से बाहर निकलने के लिए अनुमति देने के लिए तोड़। इस LSECs करने के लिए उच्च वापस दबाव नुकसान से बचाता है।
  8. जिगर रक्त से मुक्त होने के बाद, ईएम लगानेवाला साथ पीबीएस की जगह है और जिगर कठोर और बहुत ही पीला हो जाने तक लगभग 5 मिनट के लिए छिड़कना।
  9. छिड़काव बंद और 1 में तय जिगर में कटौती - एक तेज स्केलपेल का उपयोग 2 मिमी 3 ब्लॉक।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटा - 24 के लिए EM लगानेवाला में डाक तय ऊतक।
    नोट: सामान्य में, underfixation overfixation अधिक से अधिक कलाकृतियों का कारण बनता है।
  11. 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए 0.1 एम सोडियम cacodylate बफर करने के बाद तय अवधि के बाद लगानेवाला बदलें।
    नोट: इस तरह से संग्रहीत नमूनों एक (12 महीने) के लिए समय की महत्वपूर्ण अवधि, फिर भी समय पर माध्यमिक निर्धारण के लिए संरक्षित किया जाएगा और परीक्षा अच्छे परिणाम के लिए सिफारिश की है।

3. सुई पीerfusion

नोट: सुई निर्धारण सीधे biopsied जिगर ऊतक में लगानेवाला के इंजेक्शन शामिल है कि छिड़काव निर्धारण का एक संस्करण है। लगानेवाला उन्हें रक्तहीन और लगानेवाला के लिए ऊतक ब्लॉक के सभी को बेनकाब करने के क्रम में रक्त वाहिकाओं के माध्यम से प्लावित होने के लिए उद्देश्य है। केयर दबाव चोट 18,19 से बचने के लिए कम इंजेक्शन दबाव रखने के लिए लिया जाना चाहिए।

  1. जानवर या विषय से जिगर का एक छोटा सा टुकड़ा निकालें और रक्त और मलबे को हटाने के लिए खारा में कुल्ला।
  2. एक ठीक गेज सुई (आमतौर पर एक इंसुलिन सिरिंज) के साथ लगे सिरिंज में सामान्य नमक ड्रा।
  3. रक्त ऊतक के बाहर प्लावित है जब तक जिगर में बहुत धीरे धीरे खारा इंजेक्षन। एकाधिक इंजेक्शन की आवश्यकता हो सकती है।
  4. एक ठीक गेज सुई (आमतौर पर एक इंसुलिन सिरिंज) के साथ लगे एक और सिरिंज में ईएम लगानेवाला ड्रा।
  5. यह कठिन है और रंग में तन हो जाता है जब तक जिगर में बहुत धीरे धीरे लगानेवाला इंजेक्षन। एकाधिक इंजेक्शनएस आवश्यक हो सकता है।
  6. एक तेज स्केलपेल का उपयोग 2 मिमी 3 ब्लॉक - 1 में तय जिगर काटें। 72 घंटा 4 डिग्री सेल्सियस - 24 के लिए EM लगानेवाला में सेते हैं। माध्यमिक निर्धारण शुरू होने से पहले 0.1 एम सोडियम cacodylate बफर में 3 बार धोएं।

स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए 4. तैयारी

  1. धो नमूना 0.1 एम सोडियम cacodylate बफर में 3 बार। लिपिड को ठीक करने के लिए, पोस्ट 2 घंटे के लिए 0.1 एम सोडियम cacodylate बफर में 2% आज़मियम tetroxide में नमूना तय कर लो।
    नोट: glutaraldehyde और आज़मियम tetroxide पार प्रतिक्रिया और SEM पर कलाकृतियां उत्पन्न के रूप में पूरा धोने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है।
  2. निर्जलीकरण शुरू करने के लिए इथेनॉल की सांद्रता बढ़ाने में नमूने कुल्ला। 5 मिनट के लिए 50% इथेनॉल में सबसे पहले कुल्ला; 70% इथेनॉल के साथ 5 मिनट के लिए तो 3 बार; 90% इथेनॉल के साथ 5 मिनट के लिए 3 बार कुल्ला; 100% इथेनॉल में 5 मिनट के लिए 2 बार कुल्ला; और अंत में 100% इथेनॉल (आणविक चलनी) में 10 मिनट के लिए 2 बार कुल्ला।
  3. नमूनों से सभी इथेनॉल निकालें और fumehood में hexamethyldisilazane (HMDS) के साथ की जगह है और 10 मिनट के लिए छोड़ दें। ऊतकों के नमूनों से HMDS निकालें और लुप्त हो जाना करने की अनुमति।
    नोट: इसलिए अंतिम निर्जलीकरण कदम के लिए उपयोग करने से पहले आर टी तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं जब ठंड HMDS अत्यधिक हीड्रोस्कोपिक है।
  4. वैकल्पिक रूप से, तुरंत नमूने माउंट या SEM के लिए माउंट करने के लिए तैयार है जब तक एक desiccator में उन्हें जगह है।

5. बढ़ते

नोट: सही नमूना बढ़ते SEM के तहत विश्लेषण के लिए उपलब्ध स्पष्ट रूप से चित्रित sinusoids की संख्या को अधिकतम जाएगा।

  1. धातु SEM के आधार के आधार लेबल और स्टब्स के शीर्ष करने के लिए दो तरफा प्रवाहकीय कार्बन टेप लागू होते हैं।
  2. बाद में SEM के लिए सबसे अच्छा sinusoids के साथ सतह की पहचान करने के लिए एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर नमूने कल्पना। ठूंठ की कार्बन टेप सतह पर ऊपर की तरफ है कि सतह रखें।
  3. स्टिक नमूनों मजबूती से ठूंठ को, नमूनों अब धूम कोटिंग के लिए तैयार हैं।
ove_title "> 6। कोटिंग

नोट: एक धूम coater मैदान में नमूना प्रवाहकीय धातु (सोने या प्लेटिनम) के ठीक एक फिल्म के साथ नमूना कोटिंग और इलेक्ट्रॉन बीम से होने वाले नुकसान से बचाता है। कोटिंग है, तो ब्याज की भी मोटी संरचनाओं छिप जा सकता है।

  1. स्वत: ठीक धूम coater के निर्वात चैम्बर में जगह स्टब्स, 45 सेकंड के लिए रोटेशन मोड और स्वत: धूम कोटिंग निर्धारित किया है। हालांकि सोना भी उपयुक्त है, महीन विवरण के लिए प्लैटिनम कोटिंग का प्रयोग करें।
  2. घुड़सवार, जिगर नमूनों की बाहरी सतह के लिए कार्बन रंग की एक पतली परत लागू कोट करने के लिए नहीं sinusoidal सतहों ख्याल रख रही है।
  3. नमूनों प्लैटिनम के साथ लेपित हैं और कार्बन रंग सूख गया है एक बार जब वे SEM के पर अवलोकन के लिए तैयार हैं। नमूने एक desiccator में संग्रहित किया जा सकता है।

7. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग

  1. प्लेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में नमूनों और वैक्यूम करने के लिए माइक्रोस्कोप वापसी। </ ली>
  2. एक कम बढ़ाई शुरू होने से नमूनों के दृश्य के लिए मानक माइक्रोस्कोप संचालन प्रक्रियाओं का उपयोग करना, धीरे-धीरे बढ़ाई बढ़ रही है।
  3. माइक्रोस्कोप दूरी, स्थान आकार और दृष्टिवैषम्य काम करने के लिए उचित रूप से समायोजित किया जाता है सुनिश्चित करें।
  4. नियतन अखंडता के लिए जाँच करें। LSEC अंतराल से ज्यादातर के लिए स्वतंत्र है और 30 को मापने fenestrations शामिल है - 250 एनएम व्यास आमतौर पर यह है कि नमूना तैयार करना सफल रहा है का संकेत होगा।
  5. Sinusoids अंतराल के पूर्ण या fenestrations से रहित हैं, तो नमूना तैयार सफल नहीं किया गया है या महत्वपूर्ण विकृति है। इस मामले में, एक बहुत ही सुन्दर धार के साथ नमूना टुकड़ा है, और कटौती सतहों recoated और सफलतापूर्वक तय sinusoids के लिए विश्लेषण किया गया।
  6. लगभग 15,000-20,000 × बढ़ाई में अच्छा कर निर्धारण और fenestrations स्पष्ट रूप से (दिखाई दे रहे हैं, जहां आम तौर पर कम से कम 10 fenestrations को रोकने के साथ मलबे से मुक्त कर रहे हैं कि फ्लैट LSEC सतहों का चयन)।
  7. जिगर के अनुसार कम से कम दो ब्लॉकों का उपयोग कर, ब्लॉक के विभिन्न क्षेत्रों से, जिगर के अनुसार कम से कम 10 sinusoids की छवियों को बचाओ। 15,000 से कम 10 micrographs नमूना - fenestrations की मात्रा का ठहराव पूरे जिगर के प्रतिनिधि होने के लिए प्रति पशु 20,000 × बढ़ाई आम तौर पर पर्याप्त है।

8. विश्लेषण

नोट: एनआईएच से मुफ्त डाउनलोड किया जा सकता है, जो ImageJ सॉफ्टवेयर गवाक्षीकरण व्यास और आवृत्ति (यों के लिए उपयोग किया जाता है www.imagej.nih.gov/ij )।

  1. ओपन छवि जम्मू और चित्र (स्क्रीन 1 शॉट) में एम्बेडेड पैमाने पट्टी का उपयोग पैमाने पर सेट।
  2. Fenestrated और defenestrated क्षेत्रों सहित LSEC के पूरे फ्लैट के आसपास के क्षेत्र बहुभुज ImageJ में उपकरण, का पता लगाने का उपयोग करना। इस झूठा सरंध्रता बढ़ जाएगा के रूप में बस चलनी प्लेटें ट्रेस न करें। Obscuri हो सकता है कि कोशिका की सतह पर कर रहे हैं कि मलबे के किसी भी बड़े टुकड़ों को बाहर निकालेंएनजी fenestrations।
  3. , गवाक्षीकरण व्यास मापने पंक्ति उपकरण का चयन करके प्रत्येक गवाक्षीकरण के सबसे लंबे समय तक व्यास के माध्यम से एक लाइन का पता लगाने, और रेखा को मापने के लिए 'एम' दबाएँ, और 'डी' के लिए स्थायी रूप से तस्वीर पर लाइन आकर्षित करने के लिए (आकर्षित)। इस लाइन गवाक्षीकरण व्यास के रूप में परिभाषित किया गया है। लाइन की लंबाई अब ImageJ के परिणामों बॉक्स (2 स्क्रीन शॉट) में उपलब्ध हो जाएगा।
  4. बड़े 250 एनएम से अधिक LSEC कोशिका द्रव्य में छेद है, साथ ही fenestrations हैं जो सभी अंतराल उपाय। अंतराल अक्सर अंतराल भी रोग और विषाक्तता का एक परिणाम के रूप में हो सकता है लेकिन गरीब छिड़काव या निर्धारण को दर्शाती कलाकृतियां हैं। अंतराल के लिए डेटा बाद में विश्लेषण में गवाक्षीकरण मापदंडों के हिसाब से बाहर रखा जाएगा।
  5. परिपत्र नहीं कर रहे हैं कि अंतराल के क्षेत्र अंतराल के आसपास अनुरेखण और ImageJ पर अपने क्षेत्र की गणना की गणना की जानी चाहिए।
  6. Furthe के लिए एक एक्सेल स्प्रेडशीट में ImageJ में परिणाम बॉक्स से डेटा चिपकानेआर विश्लेषण।

9. गणना

  1. (अंतराल ≥ 250 एनएम हैं जहां अंतराल, सहित) सभी गवाक्षीकरण व्यास का औसत गवाक्षीकरण व्यास = औसत।
  2. आर, त्रिज्या, व्यक्तिगत fenestrations व्यास (आर = डी / 2), सहित नहीं अंतराल से गणना की है, जहां Fenestration क्षेत्र = πr 2,।
  3. Porosity (%) = (Σ (πr 2) / विश्लेषण किया कुल क्षेत्रफल - अंतराल के Σ (क्षेत्र =)) (माइक्रोन 2)) 100 ×।
  4. Fenestration आवृत्ति = fenestrations की कुल संख्या / (कुल क्षेत्र (अंतराल के क्षेत्र) (माइक्रोन 2)-Σ का विश्लेषण किया।

Fenestration डाटा के 10 प्रस्तुति

नोट: गवाक्षीकरण डेटा की मात्रा का ठहराव सहित जब भी संभव हो, प्रकाशन निम्न जानकारी शामिल करना चाहिए

  1. प्रयोग किया जाता है, जहां सीमा व्यास आम तौर पर (fenestrations परिभाषित करने के लिए क्या इस बात की पुष्टि एक बयान के साथ Fenestration व्यास,Fenestration आवृत्ति (संख्या / माइक्रोन 2) और porosity (%),) एनएम 50-250 के बीच।
  2. अंतराल विश्लेषण, गवाक्षीकरण व्यास और यकृत, ब्लॉक, छवियों और fenestrations की संख्या की आवृत्ति वितरण ग्राफ विश्लेषण में शामिल किया जाना चाहिए में शामिल किया गया है कि क्या इस बात की पुष्टि एक बयान।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग द्वारा कम बढ़ाई प्रारंभिक दृश्य कई बड़े जिगर वाहिकाओं और sinusoids (चित्रा 1 ए) के निरीक्षण करने के लिए काफी बड़े एक उजागर क्षेत्र के साथ जिगर नमूना के एक फ्लैट सतह का पता चलता है। बढ़ते ठूंठ पर सही जिगर ब्लॉक नियुक्ति सुनिश्चित करना इस कारण (चित्रा 1 बी) के लिए बचा जाना चाहिए sinusoids और जिगर की Glisson कैप्सूल का स्पष्ट चित्र प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। बढ़ाई बढ़ाने से जिगर के घने vasculature की करीब निरीक्षण की अनुमति देता है और वाहिकाओं (चित्रा 1C) विभाजित है कि hepatocytes की एकल कोशिका प्लेटों का पता चलता है। गरीब छवि गुणवत्ता, रक्त कोशिकाओं और मलबे में जिगर परिणामों के गरीब निर्धारण जिगर (चित्रा -1) के मद्देनजर अस्पष्ट।

इसके अलावा बढ़ाई बढ़ रही LSEC fenestrations (2A चित्रा) के अवलोकन की अनुमति देता है। यह sinusoids Corr हैं कि आवश्यक है ectly पहचान - hepatocytes की प्लेटें, कुछ परिस्थितियों के तहत इस तरह के अभिविन्यास (चित्रा 2 बी) के साथ सहायता canaliculi पित्त के रूप में रक्त वाहिकाओं लेकिन सुविधाओं की तरह प्रकट हो सकते हैं। उच्च छिड़काव दबाव ऐसे LSEC चलनी प्लेटों के एकीकरण की वजह से होने लगा अन्तःचूचुक में बड़े अंतराल के रूप में कलाकृतियों का कारण बन सकता है। ये आसानी से SEM (चित्रा -2) के तहत पहचाने जाते हैं। नाभिक से ऊपर सीधे कोशिका झिल्ली से बचना गवाक्षीकरण घनत्व और porosity गणना (चित्रा 2 डी) की सटीकता के साथ मदद करेंगे।

ImageJ के साथ LSEC का विश्लेषण LSEC गवाक्षीकरण व्यास, घनत्व और आवृत्ति (चित्रा 3) की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है। इन आयामों fenestrations की एक अनुभवजन्य माप प्रदान करते हैं और उम्र बढ़ने, रोग, जहर या उपचारों (3B चित्रा) द्वारा प्रेरित परिवर्तन की माप अनुमति देते हैं।

फ़ाइलें / ftp_upload / 52,698 / 52698fig1.jpg "/>
SEM के साथ जिगर Visualizing चित्रा 1। (बी) Glisson कैप्सूल sinusoids के सभी विवरण शामिल किया गया,, (ग) जिगर के घने vasculature और (ए) SEM के तहत प्रारंभिक निरीक्षण जिगर की sinusoids और पोर्टल पथ और केंद्रीय venules के उन सहित बड़े जहाजों का पता चलता है जहाजों के बीच झूठ है कि hepatocytes की एकल कोशिका प्लेटों;। (डी) ढह sinusoids में गरीब निर्धारण परिणाम और ultrastructural कलाकृतियों के विकास के इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. जिगर के फैटी। (ए) LSEC fenestrations आसानी से देख रहे हैं एन अच्छी तरह से निश्चित ऊतक में, (बी) अच्छी तरह से संरक्षित पित्त canaliculi के साथ एक hepatocyte की सतह, (ग) उच्च छिड़काव दबाव की वजह से अन्तःचूचुक में बड़े अंतराल (घ) LSEC नाभिक तीर द्वारा की सतह के नीचे उभार संकेत दिया पतली LSEC और porosity के विश्लेषण के लिए क्षेत्र में शामिल नहीं किया जाना चाहिए। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
ImageJ के साथ LSEC चित्रा 3. विश्लेषण। (बी) के छवि जम्मू विश्लेषण से प्राप्त डेटा द्वारा उत्पन्न की आवृत्ति हिस्टोग्राम, (ए) बहुभुज उपकरण मापन और पंक्ति उपकरण गवाक्षीकरण व्यास को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है के लिए समग्र क्षेत्र की माप की अनुमति देता है।2698fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

व्यास (एनएम) फ्रीक्वेंसी (um2 के अनुसार) Porosity (%) संदर्भ
NA NA 60 ± 12 20
127 ± 4 एनएम 6.5 ± 0.5 4.6 ± 0.4 21
NA NA 40.5 22
NA 0.6 ± 1.4 0.01 ± 0.03
NA 2.5 ± 0.5 0.047 ± 0.012 24
87.25 ± 1.4 NA 9.22 ± 0.7 25
100-200 4.49 ± 0.69 2.55 ± 0.54 26
NA NA 23 ± 2 27
85 ± 17 11 ± 0.4 6.6 ± 0.2 28
NA 2.7 ± 1.1 4.1 ± 2.3 10
68 ± 1 8 ± 0.6 3.4 ± 0.2 29
NA NA 3.9 ± 0.2 30
73.3 ± 0.4 NA 2.2 ± 0.2 31
90.7 ± 11.7 8.45 ± 2.43 5.93 ± 2.05 4
110.7 ± 0.25 9 6 3
104.8 ± 0.22 13 8 3

तालिका 1।

अवयव मूर्ति
लगानेवाला के परासारिता और बहुत कम बफर (hypotonic) सेल सूजन
लगानेवाला के परासारिता और बहुत अधिक बफर (अतिपरासारी) सेल संकोचन
नमूना भी बड़े आकार लगानेवाला ऊष्मायन = स्वलयन / अपर्याप्त निर्धारण के दौरान काफी दूर तक प्रवेश नहीं कर सकता
लगानेवाला का पीएच और आज़मियम करने से पहले बफर कम से कम 7.2 या अधिक 7.4 प्रोटीन विकृतीकरण और संरचनात्मक विकृति
फिक्सेशन समय भी कम Autolysis
फिक्सेशन समय बहुत लंबा सेल सिकुड़न के कारण हो सकता है
उच्च तापमान निर्धारण गति हालांकि प्रोटीन denature सकता है बढ़ता
कम तापमान अपर्याप्त निर्धारण
छिड़काव दबाव बहुत अधिक अंतराल, Disse वृद्धि के अंतरिक्ष, hepatocytes में रिक्तिकाएं, चलनी प्लेटों की हानि, गवाक्षीकरण व्यास को चौड़ा
यांत्रिक क्षति संदंश नख़रेबाज़ और / या का उपयोग करते समय ऊतक लगानेवाला से काफी अच्छी तरह से कठोर नहीं है, तो सेलुलर संरचनाओं की पेराई
मौत के बाद निर्धारण, नमूना बायोप्सी, या exsanguination के लिए दीर्घ समय Ischaemia, स्वलयन, अंतर गठन, defenestration
कम लगानेवाला ऊष्मायन मात्रा कम से कम 20 बार नमूना मात्रा = ब्लॉकों के केंद्र में लगानेवाला और स्वलयन की अपर्याप्त पैठ।
एफixative एकाग्रता बहुत अधिक एकाग्रता निर्धारण और लगानेवाला के प्रवेश की दर को प्रभावित करता है। मूर्ति गठन।
लगानेवाला एकाग्रता भी कम निर्धारण की प्रक्रिया से पहले लगानेवाला की थकावट पूरा उत्पादन सेल blebbing और अन्य कलाकृतियों है।
जिगर में अधूरा निर्धारण के लक्षण सेल blebbing (सूजन माइक्रोविली या कोशिका द्रव्य से होने वाले), defenestration, अंतराल, माइक्रोविली की हानि, सूजन माइटोकॉन्ड्रिया, सेल सूजन, ध्वस्त हो या संकुचित sinusoid lumens, sinusoidal लुमेन में रक्त, अनियमित आकार hepatocyte नाभिक
लगानेवाला के रक्त संदूषण लगानेवाला निष्क्रिय
गंदा छिड़काव और तैयारी उपकरण मलबे और बैक्टीरिया के साथ संदूषण नमूना
कोटिंग के बाद desiccant के बिना नमूनों या भंडारण के अपूर्ण निर्जलीकरण Speciपुरुषों चार्ज-अप में SEM पर। ब्लॉक करने के लिए कार्बन रंग जोड़ना प्रभारी कम करने में मदद कर सकते हैं

गरीब नमूना और छवि गुणवत्ता के लिए तालिका 2. समस्या निवारण युक्तियाँ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

सही ढंग से और reproducibly जिगर sinusoidal अन्तःचूचुक की स्थिति को मापने की क्षमता इन अति विशिष्ट कोशिकाओं के जीव विज्ञान को समझने में एक महत्वपूर्ण कदम है। ऐसे संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी 32, परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी 33 और डी-तूफान (प्रत्यक्ष Stochastic ऑप्टिकल Reconstrucion माइक्रोस्कोपी) 34 के रूप में नए तकनीक इन विट्रो में इन कोशिकाओं की आकृति विज्ञान के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करेगा लेकिन SEM के लिए कल्पना और में उनकी संरचना को मापने के लिए प्राथमिक पद्धति बनी हुई है सीटू।

सबसे महत्वपूर्ण और तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण कदम प्रारंभिक नियतन है: जिगर अच्छी तरह से संरक्षित है अगर बाद के चरणों, जिगर sinusoid की छवियों को आसानी से दिखाई और वास्तव में, सुंदर उत्पादन होगा। पूरे जिगर छिड़काव अच्छा निर्धारण सुनिश्चित करने के लिए सबसे प्रभावी तरीका है, लेकिन तुलनीय परिणाम जल्दी से तय किया गया है कि सुई छिड़काव नमूनों में संभव हो रहे हैंऔर कम दबाव के तहत। निर्जलित जिगर के नमूनों से पानी का अवशोषण गरीब SEM छवियों के लिए एक आम कारण है, लेकिन यह आसानी से desiccant के साथ एक desiccator में नमूने के उचित भंडारण से बचा जा सकता है।

विभिन्न अनुसंधान समूहों से पढ़ाई की तुलना में और व्याख्या की जा सकती है, ताकि fenestrations की मात्रा का ठहराव के मानकीकरण के लिए एक की जरूरत नहीं है। अतीत में इन मूल्यों को प्राप्त किया गया है कि कैसे बारे में बहुत कम पद्धति की जानकारी के साथ प्रकाशित मूल्यों में व्यापक बदलाव किया गया है। यहाँ हम गवाक्षीकरण फैटी का वर्णन है कि मूल्यों को निर्धारित करने और पेश करने के लिए एक मानकीकृत दृष्टिकोण प्रदान की है।

जब भी संभव हो, तो निम्न जानकारी शामिल करना चाहिए गवाक्षीकरण डेटा की मात्रा का ठहराव सहित प्रकाशन: प्रयोग किया जाता है, जहां सीमा व्यास fenestrations परिभाषित करने के लिए क्या इस बात की पुष्टि एक बयान के साथ Fenestration व्यास, (आमतौर पर 50 के बीच - 250 एनएम); गवाक्षीकरण आवृत्ति (संख्या / &# 181; मी 2) और porosity (%); अंतराल के विश्लेषण में शामिल किया गया है कि क्या इस बात की पुष्टि एक बयान; और गवाक्षीकरण व्यास की एक आवृत्ति वितरण ग्राफ। इसके अलावा, यकृत, ब्लॉक, छवियों और fenestrations की संख्या विश्लेषण में शामिल किया जाना चाहिए।

Fenestration व्यास, आवृत्ति और porosity जिगर की स्थिति का महत्वपूर्ण संकेतक हैं और इस डेटा के संग्रह का मानकीकरण क्षेत्र के लिए फायदेमंद होगा। यहाँ पर चर्चा की विधियों LSEC और fenestrations के फैटी का अध्ययन किया और विभिन्न अनुसंधान समूहों में एक तुलनीय तरीके से प्रस्तुत कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक रूपरेखा प्रदान करते हैं। कार्यप्रणाली आसानी से अलग किया और सुसंस्कृत LSECs में fenestrations को मापने के लिए अनुकूल है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25% EM grade Glutaraldehyde ProSciTech C001 Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze
Paraformaldehyde powder Sigma Aldrich 158127 Always prepare Paraformaldehyde fresh
Sodium Cacodylate powder Sigma Aldrich C0250 Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution
Calcium Chloride Sigma Aldrich C1016 Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O
Osmium tretroxide ProSciTech C011 Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle
Ethanol- Absolute Sigma Aldrich 459836  100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve
Other grades of Ethanol Labtech EL5 Prepare graded Ethanols with dH2O
Hexamethyldisilazane Sigma Aldrich 52619  Allow to reach room temperature before use
Cannulas Terumo TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C 18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice
Conductive Carbon tape ProSciTech IA0201
Carbon Paint ProSciTech I003
Ketamine Must be obtained under license
Xylazine Must be obtained under license
Molecular Sieve Sigma Aldrich 208647 Removes water from the 100 % Ethanol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cogger, V. C., Le Couteur, D. G., et al. The Liver: Biology and Pathobiology. Arias, I. M., et al. , John Wiley & Sons, Ltd. 387-404 (2009).
  2. Fraser, R., Dobbs, B. R., Rogers, G. W. Lipoproteins and the liver sieve: the role of fenestrated sinusoidal endothelium in lipoprotein metabolism, atherosclerosis, and cirrhosis. Hepatology. 21, 863-874 (1995).
  3. Wisse, W., De Zanger, R. B., Charels, K., Van Der Smissen, P., McCuskey, R. S. The liver sieve: considerations concerning the structure and function of endothelial fenestrae, the sinusoidal wall and the space of Disse. Hepatology. 5 (4), 683-692 (1985).
  4. Reilly, J. N., Cogger, V. C., Fraser, R., Le Couteur, D. G. The effect of feeding and fasting on fenestrations in the liver sinusoidal endothelial cell. Pathology. 42 (3), 255-258 (2010).
  5. Tian, Y., et al. Activation of serotonin receptor-2B rescues small-for-size liver graft failure in mice. Hepatology. 53 (1), 253-262 (2011).
  6. Cogger, V. C., Mitchell, S. J., Warren, A., de Cabo, R., Le Couteur, D. G. Age-Related Loss of Responsiveness to 2,5-Dimethoxy-4-Iodoamphetamine in Liver Sinusoidal Endothelial Cells. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (5), 514-518 (2013).
  7. Reilly, J. N., Cogger, V. C., Le Couteur, D. G. Old age is associated with ultrastructural changes in isolated rat liver sinusoidal endothelial cells. J Electron Microsc. 59 (1), 65-69 (2010).
  8. Le Couteur, D. G., et al. Calorie Restriction, Aging and Longevity. Rattan, A. E., Le Couteur, D. G., de Cabo, R., et al. , 191-216 (2010).
  9. McLean, A. J., et al. Age-related pseudocapillarization of the human liver. J Pathol. 200 (1), 112-117 (2003).
  10. Le Couteur, D. G., et al. Pseudocapillarization and associated energy limitation in the aged rat liver. Hepatology. 33 (3), 537-543 (2001).
  11. Cogger, V. C., et al. The effect of acute oxidative stress on the ultrastructure of the perfused rat liver. Pharmacol Toxicol. 89 (6), 306-311 (2001).
  12. Horn, T., Christoffersen, P., Henriksen, J. H. Alcoholic liver injury: defenestration in noncirrhotic livers-a scanning electron microscopic study. Hepatology. 7 (1), 77-82 (1987).
  13. Jamieson, H. A., et al. Alterations in liver sinusoidal endothelium in a baboon model of type 1 diabetes. Diabetologia. 50 (9), 1969-1976 (2007).
  14. Fraser, R., et al. High perfusion pressure damages the sieving ability of sinusoidal endothelium in rat livers. Br J Exp Pathol. 61 (2), 222-228 (1980).
  15. Wisse, E. An electron microscopic study of the fenestrated endothelial lining of rat liver sinusoids. J Ultrastruct Res. 31 (1), 125-150 (1970).
  16. Wisse, E. An ultrastructural characterization of the endothelial cell in the rat liver sinusoid under normal and various experimental conditions, as a contribution to the distinction between endothelial and Kupffer cells. J Ultrastruct Res. 38 (5), 528-562 (1972).
  17. Fahimi, H. D. Perfusion and immersion fixation of rat liver with glutaraldehyde. Lab Invest. 16 (5), 736-750 (1967).
  18. Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World J Gastroenterol. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  19. Vreuls, C., et al. Jet-fixation: a novel method to improve microscopy of human liver needle biopsies. Hepatology. 59 (2), 737-739 (2014).
  20. Furrer, K., et al. Serotonin reverts age-related capillarization and failure of regeneration in the liver through a VEGF-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 108 (7), 2945-2950 (2011).
  21. Zhang, Q., et al. OxLDL induced injury and defenestration of HLSECs via LOX-1. J Mol Endocrinol. , (2014).
  22. May, D., et al. A transgenic model for conditional induction and rescue of portal hypertension reveals a role of VEGF-mediated regulation of sinusoidal fenestrations. PLoS One. 6 (7), e21478 (2011).
  23. Funyu, J., Mochida, S., Inao, M., Matsui, A., Fujiwara, K. VEGF can act as vascular permeability factor in the hepatic sinusoids through upregulation of porosity of endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 280 (2), 481-485 (2001).
  24. Venkatraman, L., Tucker-Kellogg, L. The CD47-binding peptide of thrombospondin-1 induces defenestration of liver sinusoidal endothelial cells. Liver Int. 33 (9), 1386-1397 (2013).
  25. Wack, K. E., et al. Sinusoidal ultrastructure evaluated during the revascularization of regenerating rat liver. Hepatology. 33 (9), 363-378 (2001).
  26. Morsiani, E., Mazzoni, M., Aleotti, A., Gorini, P., Ricci, D. Increased sinusoidal wall permeability and liver fatty change after two-thirds hepatectomy: An ultrastructural study in the rat. Hepatology. 21 (2), 539-544 (1995).
  27. Straub, A. C., et al. Arsenic-stimulated liver sinusoidal capillarization in mice requires NADPH oxidase–generated superoxide. J Clin Invest. 118 (12), 3980-3989 (2008).
  28. Barberá-Guillem, E., Arrue, J. M., Ballesteros, J., Vidal-Vanaclocha, F. Structural changes in endothelial cells of developing rat liver in the transition from fetal to postnatal life. JJ Ultrastruct Mol Struct Res. 97 (1-3), 197-206 (1986).
  29. Jamieson, H. A., et al. Caloric restriction reduces age-related pseudocapillarization of the hepatic sinusoid. Exp Gerontol. 42 (4), 374-378 (2007).
  30. Cogger, V. C., et al. Hyperlipidemia and surfactants: the liver sieve is a link. Atherosclerosis. 189 (2), 273-281 (2006).
  31. Cogger, V. C., et al. The effects of oxidative stress on the liver sieve. J Hepatol. 41 (3), 370-376 (2004).
  32. Cogger, V. C., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J Struct Biol. 171 (3), 382-388 (2010).
  33. Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells. J Electron Microsc. 50 (4), 283-290 (2001).
  34. Monkemoller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Phys Chem Chem Phys. 16 (24), 12576-12581 (2014).

Tags

बायोफिज़िक्स अंक 98 porosity छवि विश्लेषण फिक्सेशन छिड़काव छवि जम्मू व्यास Fenestrae
स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा जिगर Sinusoidal endothelial कोशिकाओं का विश्लेषण और उनकी Fenestrations के लिए एक मानकीकृत विधि
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cogger, V. C., O'Reilly, J. N.,… More

Cogger, V. C., O'Reilly, J. N., Warren, A., Le Couteur, D. G. A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (98), e52698, doi:10.3791/52698 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter