Abstract
Iskæmireperfusion (IR) skade er kendt for at bidrage væsentligt til den sygelighed og dødelighed forbundet med iskæmisk slagtilfælde. Iskæmiske cerebrovaskulære hændelser udgør 80% af alle slagtilfælde. En almindelig årsag til IR skade er den hurtige indstrømning af fluider efter en akut / kronisk okklusion af blod, næringsstoffer, ilt til vævet udløser dannelsen af frie radikaler.
Iskæmisk slagtilfælde efterfølges af blod-hjerne-barrieren (BBB) dysfunktion og vasogent hjerneødem. Strukturelt tight junctions (TJs) mellem endotelceller spiller en vigtig rolle i opretholdelse af integriteten af blod-hjerne-barrieren (BBB). IR skade er en tidlig sekundær skade, der fører til en ikke-specifik, inflammatoriske respons. Oxidativ og metabolisk stress efter inflammation udløser sekundær hjerneskade herunder BBB permeabilitet og afbrydelse af tight junction (TJ) integritet.
Vores protokol viser en in vitro </ Em> eksempel på oxygen-glucose deprivation og reoxygenering (OGD-R) på rottehjerne endotelcelle TJ integritet og stress fiberdannelse. I øjeblikket er flere eksperimentelle in vivo modeller anvendt til at undersøge effekten af IR skade; men de har flere begrænsninger, såsom de tekniske udfordringer i at udføre operationer, gen afhængige molekylære indflydelser og svært ved at studere mekanistiske relationer. Imidlertid kan in vitro-modeller hjælpe med at overvinde mange af disse begrænsninger. Den præsenterede protokol kan bruges til at undersøge de forskellige molekylære mekanismer og mekanistiske relationer for at tilvejebringe potentielle terapeutiske strategier. Resultaterne af in vitro-undersøgelser, kan imidlertid afvige fra standard in vivo-undersøgelser og bør fortolkes med forsigtighed.
Introduction
Iskæmireperfusion (IR) skade viser sig at være den hyppige årsag til forskellige svækkende komplikationer og dødsfald i forbindelse med slagtilfælde, myokardieinfarkt, traumer, perifer vaskulær sygdom og traumatisk hjerneskade 1,2. IR skade i cerebrale kar er en tidlig sekundær skade, der fører til inflammation og ødem 3. En af de alvorlige komplikationer, der opstår som et resultat af oxidativ og metabolisk stress efter inflammation er tab af homeostatiske balance fører til dannelse af frie radikaler, ændringer i blod-hjerne-barrieren (BBB) tight junctions (TJs) og mikrovaskulær permeabilitet 4,5.
Øjeblikket, in vivo modeller, der anvendes til at undersøge virkningerne af IR skade på BBB omfatter mellem-cerebral arterieokklusion (MCAO), mikroembolisme, og transgene eller knockout dyr. Men hver har sine ulemper og begrænsninger, som diskuteret af Hossmann 6. MCAO model anvendes til at studere effekts af redox stress, ændringer i forbindelsesepitoper kommunikation BBB og samspillet mellem hjerne og immunceller. Men de præsenterer forskellige tekniske udfordringer såsom behovet for præcise mikrokirurgiske procedurer og de vanskeligheder, deri. Mikroembolisme går nedbryder BBB mens anvendelsen af transgene eller knockout dyr at studere cerebral iskæmi kan have udfordringer som gen-afhængige molekylære påvirkninger af infarkt dannelse, ændringer i vaskulær anatomi og variation i legemsvægt 6. Derfor har in vitro modeller af iskæmi fundet stigende interesse i den seneste tid primært på grund af deres anvendelighed i udførelsen mekanistiske undersøgelser for narkotika. Imidlertid kan resultaterne af in vitro-undersøgelser ikke helt udgør en in vivo-undersøgelse, og skal fortolkes med forsigtighed 6.
Modsatrettede effekt af lave koncentrationer oxygen på endotheliale cellemonolag og mikrovaskulær permeabilitet har væretstuderet af Ogawa 7. Rottehjerne mikrovaskulære endotelceller (RBMECs) blev anvendt til at udvikle in vitro BBB. Den ilt-glucose afsavn og reoxygenering (OGD-R) teknik præsenteres i denne protokol er blevet tilpasset fra undersøgelser af Zulueta et al og Zhu et al 8,9. Vi udsat hjerne endotelceller til OGD-R ved at placere dem i en hypoxi / anoxi kammer indeholdende 0% O2, 5% CO2 og 95% N2. Celler blev senere vurderet for ændringer i TJ integritet og stress fiberdannelse ved hjælp immunfluorescens lokalisering og rhodamin phalloidin mærkning henholdsvis. Immunofluorescens-farvning for zonula occludens-1 (ZO-1) udføres for at bestemme TJ integritet, som ZO-1 er en vigtig stilladser membranbundet TJ protein. Rhodamin Phalloidin mærkning bestemmer filamentøse actin (f-actin) i cellen cytoskelettet og er en klar indikation af actin stress fiber dannelse i endotelceller.
<p class = "jove_content"> Målet med denne fremgangsmåde er at give indsigt i udviklingen OGD-R som en in vitro-IR model til undersøgelse BBB endotelcelle TJ integritet og f-actin stress fiberdannelse. Resultaterne vil give oplysninger om skæbne TJ protein, ZO-1 og stress fiber dannelse efter OGD-R. Forståelsen af disse forbindelser vil give mulighed for at bestemme de underliggende molekylære mekanismer, der udløses efter OGD-R og udvikle potentielle terapeutiske strategier for at forbedre BBB afbrydelse efter OGD-R behandling.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Podning af endotelceller
- Opnå primære kulturer af RBMEC er fra voksne Sprague Dawley rotter (eller få dem kommercielt).
- Dyrk RBMECs i 100 cm fibronectin (50 pg / ml) overtrukne petriskåle ved hjælp rottehjernen vækst endotelcelle medium. Skift mediet hver to dage, indtil sammenflydning er nået.
- På at nå 80-90% konfluens, forsigtigt vaske cellerne i 5 ml phosphatpufret saltopløsning (PBS) ved omrystning. Cellerne bliver derefter løsgøres ved at udsætte dem for 1 ml varmt 0,25% trypsin- ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) -opløsning, ækvilibreret til 37 ° C.
- Inkubere cellerne ved 37 ° C i 2-5 min, indtil cellerne er fritliggende og dispergeres.
BEMÆRK: Tryk dyrkningsskålen at løsne cellerne. Se celler under mikroskopet for at bekræfte fuldstændig adskillelse af celler fra overfladen af skålen. - Tilsæt 5 ml komplette medier i petriskålen for at neutralisere trypsin.Pipetteres ud mediet indeholdende løsnede celler og indsamle det i et 15 ml centrifugerør. .
- Centrifugeres medier indeholdende endothelceller ved 220 xg i 5 min.
- Aspirere supernatanten og bevare pelleten indeholdende cells.Suspend pelleten i 3-5 ml frisk rottehjerne vækst endotelcelle medium ved forsigtigt at blande det op og ned med pipette Celler vil så blive talt ved hjælp af automatiseret celletæller eller et hæmocytometer.
- Overfør cellesuspensionen i fibronectin (50 pg / ml) forbelagt 8 godt sterilt kammer slide systemet, 0,7 cm2 / brønd med en podningsdensitet på mellem 10.000-15.000 celler pr. Dyrke cellerne ved 37 ° C, indtil konfluens opnås
BEMÆRK: udførelse western blots eller andre eksperimenter kan celler dyrkes i 10 cm cellekultur retter eller særlige retter som krævet i eksperimentet.
2. Oxygen og Glucose Berøvelse-reoxygenering in vitroModel
BEMÆRK: Følgende protokol er blevet tilpasset fra Zulueta et al. 1997; Zhu H et al. 2012 8,9.
- Brug hypoxi cellekultursystem at undersøge virkningerne af for OGD-R på RBMECs i (se figur 1). Opsætning og kalibrering af hypoxi cellekultursystem før begynder eksperimentet, ifølge producentens instruktioner.
- Fjern sammenflydende kammerobjektglas (trin 1.8) fra 37 ° C inkubator. Erstatte det komplette medium i kammeret slide med deoxygeneret, ingen glucose, Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) og anbringes i hypoxi kammer med 95%, N2 og 5% CO2 i 2 timer ved 37 ° C, repræsenterer OGD tilstand.
- Flytte cellerne tilbage til inkubatoren med 95% O2, 5% CO2 ved 37 ° C og forsynet med frisk rottehjerne endotelcelle komplet medium og inkuberes i yderligere 1 time ved 37 ° C.
BEMÆRK: Dette trin repræsenterer en reoxygenering situation. - Brug kammer dias for immunfluorescens lokalisering og rhodamin phalloidin mærkning (se afsnit 3).
3. Immunofluorescens Lokalisering af ZO-1 og f-actin Mærkning Brug Rhodamine Phalloidin
- Udsætte kammer slides indeholder RBMEC monolag til 100 ul opti-MEM / reduceret serum media / godt for 1 time. Vask kammerskiver 3 gange i 100 pi phosphatpufret saltvand (PBS, pH 7,0-7,2).
- Fikseres cellerne under anvendelse af 100 pi 4% paraformaldehyd i PBS (pH 7,0-7,2) i 15 min og vask kammerobjektglas yderligere 3 gange i PBS (pH 7,0-7,2).
- Permeabilisere cellerne under anvendelse 100 pi 0,5% Triton X-100 i PBS, (pH 7,0-7,2) i yderligere 15 minutter. Blok med 100 pi 2% bovint serumalbumin (BSA) i PBS i en time. Efter dette trin enten plet / label celler enten til ZO-1 eller F-actin.
- For immunfluorescens stalingen inkubere cellerne med et anti-kanin-primært antistof mod ZO-1 i 1: 150, fremstillet i 2% BSA-PBS i O / N ved 4 ° C. Vask cellerne 3 gange i PBS, (pH 7,0-7,2). Inkuber med 100 pi fluoresceinisothiocyanat (FITC) -mærket anti-kanin sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur.
- For Rhodamin Phalloidin mærkning efter blokering, eksponere cellerne for 100 pi rhodamin phalloidin i 1:50, fremstillet i 2% BSA-PBS, i 20 minutter.
- Vask cellerne fra immunfluorescensfarvning og rhodamin phalloidin mærkning i PBS, (pH 7,0-7,2). Monter kamrene hjælp montering medier, der indeholder anti-fade reagens med DAPI.
- Visualisere cellerne under anvendelse af en 60 X vand nedsænkning linse og celler scannes i et enkelt optisk plan under et konfokalt mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Celler dyrket på fibronectin præcoatede Nunc II kammer slides blev udsat for OGD-R ved at placere i en Biospherix ProOx model 110 kammer. Efter at underkaste celler til OGD-R, blev de behandlet til ZO-1 junktionel farvning under anvendelse af immunofluorescens teknik som vist i figur 2 og cytoskelet montage indikerer F-actin stress fiberdannelse under anvendelse rhodamin phalloidin pletten etiket som vist i figur 3. Kontrolceller, der var ikke underkastet OGD-R viste løbende forbindelsesepitop integritet mens endotelceller udsat for OGD-R viste diskontinuerte vejkryds, hvilket indikerer tab af TJ integritet Figur 2. Kontrolceller, der ikke blev udsat for OGD-R behandling viste ingen eller minimal f-actin stress fiber dannelse mens endotelceller udsat for OGD-R demonstrerede øget formation f-actin stress fiber indikation af ændringer i actin cytoskeletal samling figur 3; Rep riv med tilladelse fra reference # 13
Figur 1. Typisk konfiguration af Hypoxi System ProOx Model 110. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Immunofluorescens Lokalisering af Tight Junction Protein (TJP) ZO-1 Demonstration Forstyrrelse af tight junctions følgende OGD-R i RBMECs, som det fremgår af hvide pile. Scale bar = 10 um. Klik her for at se en større version af dette figur.
Figur 3. Rhodamin Phalloidin Mærkning for f-actin Stress Fiber Formation Demonstration Ændringer i cytoskeletal Assembly Efter OGD-R i RBMECs, som det fremgår af hvide pile. Scale bar = 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OGD-R som en in vitro model for iskæmi-reperfusionsskade er blevet godt etableret til undersøgelse neuroner 10,11. Der er også undersøgelser, der viser effekten af OGD på hjernens endotelceller og ændringer i permeabilitet og TJ integritet 9. Vores undersøgelse viser imidlertid virkningen af OGD samt reoxygenering, som er nærmere repræsentation af iskæmisk reperfusionsskade i in vivo-betingelser, der opstår efter iskæmisk slagtilfælde.
Hypoksiske-iskæmiske tilstande vides at inducere inflammation i centralnervesystemet, hvilket fører til BBB forstyrrelser ved at øge paracellulær permeabilitet og vasogent ødem 4. Reperfusionsskade er en meget kompleks og dynamisk proces, hvor der er for stor reaktive oxygenspecies produktion, ATP depletion, stiger i ekstracellulær kalium, frigivelse af excitatoriske neurotransmittere, endotel- og neuronal hævelse, celleaktivering immune. Dette vil igen causes aktivering af forskellige inflammatoriske veje, hvilket fører til cytokinproduktion, induktion af nukleaser og proteaser, hvilket fører til ødem, som alle er vist at aktivere forskellige caspaser, hvilket fører til afbrydelse af BBB integritet 5,12. Endotelceller er særligt udsatte for iskæmisk beskadigelse, som følge af tilstedeværelsen af et stort antal mitokondrier. De omkringliggende endotelceller er forbundet til hinanden ved tætte overgange vedligeholdes af tight junction-proteiner.
ZO-1 er vist at spille en vigtig rolle i opretholdelsen af TJ integritet ved dens interaktion med andre tight junction-proteiner og actin cytoskeletal forsamling. Også er afgørende for mange udviklingsmæssige og fysiologiske processer, herunder celle-celle sammenvoksninger præcis regulering af actincytoskelettet. I endotelceller, er actin stress fiberdannelse sig at være forbundet med barriere-dysfunktion og hyperpermeabilitet 13,14. Rhodamin phalloiDIN mærkning teknik, der anvendes i den foreliggende undersøgelse at observere f-actin stress fiber dannelse er et slutpunkt undersøgelse. Imidlertid kan dynamisk og levende billeddannelse af stress fiber dannelse også udføres som vist ved Doggett og Breslin 15.
Den aktuelle undersøgelse majorly fremhæver bidraget fra ZO-1 mod BBB tight junction integritet. Imidlertid kan andre tight junction-molekyler som claudin-5, occludin, forbindelsesepitoper adhæsionsmolekyler (JAM) osv også anvendes som markører til at studere BBB tight junction integritet efter OGD-R. I denne undersøgelse anvendte vi immunfluorescens lokalisering og f-actin mærkning som en kvalitativ teknik til at bestemme den tight junction integritet. Vi kan imidlertid også studere andre vigtige egenskaber ved BBB som kvantitativ måling af permeabiliteten under anvendelse af fluorescerende markører og transendotheliale elektrisk modstand (TEER).
Den OGD-R teknik præsenteres i denne undersøgelse, under anvendelse afBiospherix systemet kan kun anvendes til hypoxi / anoksi studier ved en fast koncentration af oxygen; men vi kan ikke anvende dette system til undersøgelse af virkningen af varierende koncentrationer af oxygen på endotelceller. Til undersøgelse af virkningerne af varierende koncentrationer af oxygen på endotelceller vi nødt til at anvende andre tilgængelige modeller er egnede til formålet.
Denne teknik kan bruges til at studere de mekanistiske relationer mellem forskellige cellulære og molekylære begivenheder, der regulerer BBB hyperpermeabilitet og TJ integritet. Forståelse dem vil give indsigt for at udvikle forskellige molekylære strategier til at dæmpe BBB forstyrrelser og mikrovaskulære permeabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi anerkender Scott og White Hospital Research Grants Program for finansiel støtte og Texas A & M Health Science Center College of Medicine Integreret Imaging laboratorium for brug af konfokal laser mikroskop. Vi anerkender Mr. Glen Cryer for hjælp med manuskript redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
- Yang, X., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats. Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).
- Kaur, C., Ling, E. A. Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions. Curr Neurovasc Res. 5 (1), 71-81 (2008).
- Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke. Neurology. 79 Suppl 1. (13), S52-S57 (2012).
- Hossmann, K. A. Experimental models for the investigation of brain ischemia. Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).
- Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties. J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).
- Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation. Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).
- Zhu, H., et al. Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells. J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).
- Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation. J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).
- Gundimeda, U., et al. Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon. J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).
- Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).
- Alluri, H., et al. Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation. Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).
- Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability. Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin. J Vis Exp. (57), (2011).
